CN115989414A - 用于诊断、分类和/或监测儿童肿瘤的装置和方法 - Google Patents

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雅各布斯·约翰内斯·玛丽亚·范·东根
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Abstract

本发明涉及医学诊断领域，尤其涉及通过使用单个管的多参数流式细胞术(MFC)来检测和监测儿童肿瘤的方法和试剂。提供了用于流式细胞术检测儿童肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包含荧光染料缀合的抗体，所述抗体针对细胞表面标记物CD45、CD56、GD2、CD99、CD8、EpCAM、CD4、smCD3、CD19和CD271，细胞质标记物cyCD3和核标记物nuMyogenin和/或nuMyoD1，其中(i)针对标记物CD99/CD8的抗体与相同的荧光染料缀合，作为第一标记物对CD99/CD8；(ii)针对标记物EpCAM/CD4的抗体与相同的荧光染料缀合，作为第二标记物对EpCAM/CD4；(ii)针对CD271的抗体与针对cyCD3或smCD3的抗体缀合至相同的荧光染料，作为第三标记物对CD271/cyCD3或CD271/smCD3；其中在第一、第二和第三标记物对之间荧光染料是可区分的；并且其中针对所述细胞质标记物和所述核标记物的抗体与针对所述细胞表面标记物的所述抗体物理分离。

Description

用于诊断、分类和/或监测儿童肿瘤的装置和方法
本发明涉及医疗诊断领域。特别地，本发明涉及使用流式细胞术对儿童肿瘤的诊断。本发明提供了使用单个管通过多参数流式细胞术(MFC)来检测和监测儿童肿瘤的方法和试剂。还提供了同时表征浸润肿瘤组织的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和肿瘤浸润单核细胞/树突细胞(TIM)的工具。除了检测和表征原发肿瘤部位中的肿瘤细胞之外，本发明的试剂组合物还允许通过分析患者的外周血、骨髓、脑脊液、转移性肿瘤组织和任何其它组织样本来检测除原发肿瘤以外的组织中的肿瘤细胞，并对治疗有效性进行评价。还提供了与试剂组合物相关的试剂盒和方法。
儿童实体瘤包括主要在0-15岁的年龄范围内发生的一组异质性疾病。在世界范围内，发病率估计为每年超过175,000例并且死亡率为每年96,000例儿童。实体瘤占所有儿童癌症的约75％，并且包括淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经母细胞瘤、软组织肉瘤、肾母细胞瘤、骨肿瘤、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、生殖细胞肿瘤和癌(Ward E，CA Cancer JCLIN 2014；64:83).
已知对儿童癌症的正确诊断是复杂而困难的。尽管经典的组织学特征通常高度暗示特定的肿瘤类型，但大多数儿童肿瘤可能仅通过光学显微镜和免疫组织化学而无法区分。在患有癌症的儿童中，早期的准确诊断、分类和风险分级至关重要，特别是由于不同的诊断实体需要不同的和高度特异性的治疗。
目前，用于儿童实体瘤诊断筛查和分类的常规方法依赖于福尔马林固定的、石蜡包埋的实体肿瘤样本的形态学和免疫组织化学分析。大多数儿童实体瘤被归入“小圆细胞瘤”这一描述性类别。小圆细胞肿瘤包括由未分化的、小尺寸细胞形成的肿瘤，其具有稀少的细胞质和呈圆形的深染的核。由于这些肿瘤通过光学显微镜显示出相似的形态学特征，在没有进一步分析的情况下，儿童实体瘤的精确诊断常常具有挑战性，有可能出现误诊(Magro G,Acta Histochem。2015；117:397)。因此，进一步的免疫组织化学研究是必需的。尽管如此，但是还没有一个统一推荐的抗体组可应用于这种免疫组织化学分析，来对大多数儿童癌症亚型进行高度灵敏和特异性的诊断和分类。更进一步地，目前还没有基于免疫组织化学或流式细胞术的、可用的或者已经描述的技术方案，以同时评估所有信息标记物来进行肿瘤直接诊断和分类。
因此，在儿童白血病的诊断工作中，MFC免疫表型对疾病的快速诊断、分类和监测至关重要，但相反地，MFC免疫表型并不常用于儿童实体瘤的诊断工作。事实上，迄今为止，MFC免疫表型限于评估有限数量的标记物来识别特定的诊断实体，所述诊断实体包括表达高度特征性表型的那些实体，例如神经内分泌肿瘤中的CD45-CD56+表型谱(Bryson GJ,JClin Pathol.2002；55:535)、神经母细胞瘤的CD45-CD56+GD2+免疫表型(Bozzi F,Anticancer Res.2006；26:3281)、原始神经外胚层肿瘤中的CD57+CD56+CD99+CD45-特征(Dubois SG,Pediatr Blood Cancer.2010；54:13)和横纹肌肉瘤中的CD45-CD56+nuMyogenin+特征(Almazán-Moga A,.Cytometry A.2014；85:1020).
然而，尽管这些表型特征被认为是儿童癌症中特定诊断实体的特征，但是当在临床环境中进行前瞻性测试时，由于它们无法准确区分不同的肿瘤类型，因此它们针对基于4-6色抗体组合的组的传统诊断程序而显示出相对较低的效率。此外，儿童实体肿瘤组织的诊断性MFC分析不能同时提供关于在同一样本中肿瘤内共存的肿瘤浸润炎性和免疫细胞的类型和数量的信息。
在2013年，Ferreira-Facio等(Ferreira-Facio,PLoS One.2013；8:e55534)在多达8色的多个管中使用一大组抗体组合通过MFC免疫表型研究了52种儿童实体瘤的肿瘤细胞的染色模式，所述抗体组合含有33种不同的抗体特异性。在上述研究中，所有按常规组织病理学标准分类的反应性/炎性样本也都能仅通过MFC正确诊断。类似地，除了两个不常见的淋巴瘤样本外，所有的肿瘤细胞都被MFC检测到。在此研究基础上，可以推断出除了其他特定的B细胞和T细胞标记物外，CD45、CD56、CD81、CD99、EpCAM、GD2、核nuMyoD1、nuMyogenin和CD271的联合评估可以用于肿瘤诊断和分类的抗体组。然而，作者未能提供将所有的信息性标记物组合到单一抗体组合中的方法，以便可以：i)识别儿童癌症肿瘤细胞；ii)它们的诊断分类和iii)详细分析共存于同一样本中的肿瘤浸润性免疫细胞。此外，也没有系统性地识别一些肿瘤亚型，如霍奇金淋巴瘤。
与此同时，在WO2010/140885中，van Dongen等报道了与荧光化合物缀合的一组抗体试剂，用于正常、反应性、再生和肿瘤性白细胞群体的免疫表型表征。然而，该组抗体组合完全局限于白血病和淋巴瘤患者，而没有对儿童癌症中关于非造血性实体瘤和血液恶性肿瘤(例如儿童淋巴瘤)的诊断、分类和监测进行类似尝试。
因此，本发明人着手设计抗体试剂的单一组合，其允许对儿童实体瘤样本中的肿瘤细胞进行系统识别和分类，并同时对共存于同一样本中的浸润性免疫细胞提供详细表征。此外，他们旨在提供一种MFC方案，该方案包括单一和独特的抗体试剂组合，用于诊断性筛查和分类儿童患者的实体肿瘤以及同时详细分析肿瘤的免疫细胞微环境。
这些目标通过开发一种新型的≥8色/荧光色抗体组合来同时检测≥12种不同的蛋白质而令人惊讶地得以实现，这些蛋白质在儿童实体瘤样本中存在的各个肿瘤细胞中表现出不同但具有特征性的表达谱，并且可将儿童癌症识别和分类成不同的诊断实体并同时评估肿瘤浸润免疫细胞。更特别地，发现这可以通过染色(i)细胞表面标记物CD45、CD56、GD2、CD99、CD8、EpCAM、CD4、smCD3、CD19和CD271；(ii)细胞质标记物cyCD3；和(iii)核标记物nuMyogenin和/或nuMyoD1来实现，其中针对标记物CD99/CD8的抗体与第一荧光染料缀合，作为第一标记物对CD99/CD8；针对标记物EpCAM/CD4的抗体与第二荧光染料缀合，作为第二标记物对EpCAM/CD4，针对CD271的抗体与作为针对cyCD3或smCD3的抗体的第三荧光染料缀合，作为第三标记物对CD271/cyCD3或CD271/smCD3。为了能在测试样本的等分试样中对完整细胞上的细胞表面标记物进行分步染色，随后对同一等分试样进行透化(permeabilization)，并对细胞内和核标记物进行染色，因此将针对细胞质和核标记物的抗体与针对细胞表面标记物的抗体物理分离(即不混合)。
因此，本发明涉及用于流式细胞术检测儿童肿瘤细胞的试剂盒，该试剂盒包含荧光染料缀合的抗体，这些抗体针对细胞表面标记物CD45、CD56、GD2、CD99、CD8、EpCAM、CD4、smCD3、CD19和CD271、细胞质标记物cyCD3和核标记物nuMyogenin和/或nuMyoD1，其中
(i)针对标记物CD99/CD8的抗体与相同的荧光染料缀合，作为第一标记物对CD99/CD8；
(ii)针对标记物EpCAM/CD4的抗体与相同的荧光染料缀合，作为第二标记物对EpCAM/CD4，
(ii)针对CD271的抗体与针对cyCD3或smCD3的抗体缀合至相同的荧光染料，作为第三标记物对CD271/cyCD3或CD271/smCD3；
其中所述试剂盒包含与≥8种可区分的荧光染料缀合的抗体(至少8色抗体组合)；
并且其中在所述第一、第二和第三标记物对之间，所述荧光染料是可区分的；并且其中针对所述抗细胞质和所述核标记物的抗体与针对所述抗细胞表面标记物的抗体物理分离。
用于染色单细胞悬浮液的等分试样的该试剂盒含有针对一组12个“骨干标记物(backbone markers)”的独特的荧光染料缀合的抗体组合，其中针对某些所选定的标记物的抗体各自缀合至独特的、不同的荧光染料，而针对其它所选定的标记物的抗体是“配对的”，即针对不同标记物的抗体缀合至相同的荧光染料。
例如，在本发明的试剂盒中，针对4个选择的标记物CD45、CD56、GD2和nuMyogenin的抗体各自缀合至不同的荧光染料(即分别为荧光染料1至4)，而针对标记物对CD99/CD8、EpCAM/CD4、CD271/cy/smCD3中的每一对的抗体与另外的但不同的荧光染料(即分别为荧光染料5至8)(即表1中的抗体组合1)组合。
涵盖了各种包括至少两个容器(试剂管)的试剂盒设计。例如，试剂盒可以包含两个以上的容器，容器的总数包含本文提供的独特的抗体组。在一个实施例中，针对细胞表面标记物的缀合抗体被分在两个或更多个容器中。同样，针对细胞质标记物cyCD3和核标记物nuMyogenin和/或nuMyoD1的缀合抗体可以存在于单独的容器中。为方便起见，所述试剂盒优选包含第一试剂组合物和第二试剂组合物，所述第一试剂组合物包括含在第一容器中的针对细胞表面标记物CD45、CD56、GD2、CD99、CD8、EpCAM、CD4、smCD3、CD19和CD271的缀合抗体的混合物，所述第二试剂组合物包括含在第二容器中的针对细胞质标记物cyCD3和核标记物nuMyogenin和/或nuMyoD1的缀合抗体。
根据本发明，细胞质(cy)和表面膜(sm)形式的CD3被用作标记物，标记物CD271总是与cyCD或smCD3配对。标记物cyCD3可以是独特的标记，或者它可以与CD271形成标记物对，而标记物smCD3可以与CD271或CD19形成标记物对。
在一个实施例中，所述试剂盒包含针对第三标记物对CD271/cyCD3的抗体，并且针对标记物smCD3/CD19的抗体与相同荧光染料缀合以形成第四标记物对smCD3/CD19，并且其中在不同对之间荧光染料是可区分的。参见例如表1中的组合1-3、7-16和18-29中的任一个组合。在另一个实施例中，所述试剂盒包含第三标记物对CD271/smCD3，并且针对标记物CD19和cyCD3的抗体各自与不同的荧光染料缀合。参见例如表1中的组合4-6、17和30中的任一个组合。
本发明的试剂盒的特征还在于存在针对核标记物nuMyogenin和nuMyoD1之一或两者的抗体。在一个实施例中，仅使用了标记物nuMyogenin。参见例如表1中的组合1、4、7、9、11、13、15、18、23-26中的任一个组合。因此，12个标记物可以与总共9个荧光染料缀合：6个标记物(CD45、CD56、GD2、nuMyogenin、CD19和cyCD3)各自与不同的荧光染料缀合，而其它6个标记物被置于多个抗体对(CD99/CD8、EpCAM/CD4和smCD3/CD271)中，每对与不同的荧光染料组合。在另一个实施例中，仅使用了标记物nuMyoD1。参见例如表1中的组合2、5、8、10、16、17、19、21、27、29-30中的任一个组合。在另一个实施例中，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含针对标记物nuMyogenin和nuMyoD1的抗体，并且其中针对标记物nuMyogenin/nuMyoD1的抗体与相同的荧光染料缀合以形成另外的标记物对nuMyogenin/nuMyoD1，并且其中在不同的对(即CD99/CD8对、EpCAM/CD4对、CD271/(cy/sm)CD3和nuMyogenin/nuMyoD1对)之间荧光染料是可区别的。参见例如表1中的组合3、6、12、14、20、22和28中的任一个组合。
本发明的其它实施例涉及任何上述抗体组合，其被扩展为包括与多达5种不同的、另外的荧光染料(总共多达12-14种不同颜色(即荧光染料))缀合的其它标记物，用于进一步识别和表征霍奇金淋巴瘤细胞、生殖细胞肿瘤和/或骨肿瘤。对于霍奇金淋巴瘤细胞，一种或多种标记物可以选自以下蛋白质：HLADR、CD30、CD71、CD40和CD95。为了进一步表征生殖细胞肿瘤，可以使用OCT-3/4、BAP和/或PLAP标记物，而对于骨肿瘤，除了先前的12个骨干标记物之外，还可以使用骨桥蛋白(osteopontin)和/或骨碱性磷酸酶。
因此，在一些实施例中，本发明的试剂盒还包含针对霍奇金淋巴瘤细胞表面标记物HLA-DR、CD30、CD71、CD40和CD95中的一种或多种的荧光染料缀合抗体。如表1的示例性抗体组合11-14、17-30所示，将独特的荧光团用于其它抗体中的每一种。在试剂盒中，它们可以适当地与针对细胞表面标记物CD45、CD56、GD2、CD99、CD8、EpCAM、CD4、smCD3、CD19和CD271的抗体混合。
替代地或另外地，本发明的试剂盒还可包含针对生殖细胞肿瘤细胞表面标记物OCT-3/4、BAP和PLAP中的一种或多种的荧光染料缀合抗体。在一个方面，该试剂盒包含针对标记物OCT-3/4和PLAP的抗体，并且其中针对标记物OCT-3/4/PLAP的抗体与相同的荧光染料缀合以形成标记物对OCT-3/4/PLAP，并且其中在不同对之间荧光染料是可区分的。参见表1的示例性抗体组合7、8、25-29。
替代地或另外地，试剂盒还可包含针对骨肿瘤细胞表面标记物骨桥蛋白和骨碱性磷酸酶(BAP)中的一种或两种的荧光染料缀合抗体。在一个方面，该试剂盒包含针对标记物骨桥蛋白和BAP的抗体，并且其中针对标记物骨桥蛋白/BAP的抗体与相同的荧光染料缀合以形成标记物对骨桥蛋白/BAP，并且其中在不同的对之间荧光染料是可区分的。参见表1的示例性抗体组合7、8、21、22、24、26-29。
在一个具体的实施例中，四个霍奇金淋巴瘤标记物(即HLADR、CD30、CD40和CD95)加上一个或两个或三个上述生殖细胞肿瘤标记物(例如OCT-3/4、BAP和/或PLAP)加上一个或两个骨肿瘤标记物在六个另外的荧光染料位置与组合1、3和5中列出的骨干标记物组合(例如表1中的抗体组合18至29)。
本发明的优选方面涉及包含一种或多种选自表1的抗体组合1至30的抗体组合的试剂盒。
任何上述抗体组合可以与排除碎片和/或非裂解细胞的试剂组合，例如能够检测有核细胞的染料。因此，还提供了一种试剂盒，其还包含有核细胞完整性染料(nucleatedcell integrity dye)。
与本发明使用的抗体缀合的特定荧光染料可选自本领域已知的多种荧光染料和/或有待开发的荧光染料。在一个实施例中，使用以下(组)荧光染料或者荧光染料和/或荧光染料串(fluorochrome tandems)的任何其它组合，其中这些荧光染料可以在>8色流式细胞仪中同时测量：
i)Pacific Blue(PacB)、brilliant violet(BV)421、Cascade blue、Alexa fluor(AF)405、eFluor(EF)450、Horizon V450(HV450)、Vio-Blue、Dylight 405、Super Bright436、BV480；
ii)Pacific Orange(PacO)、OC515、BV510、BV480、Cascade yellow、BV570、VioGreen、AF430、Amcyan、HV500、khrome orange(KO)、BUV496、EF506、Qdot 525、Qdot 545、BUV563、Qdot 565；
iii)Super Bright 600、BV605、eVolve 605Qdot 585、Qdot 605；
iv)BV650、EF625NC、EF700NC、Super Bright 645eVolve 655、Qdot 655；
v)Qdot 700、Super Bright 702；
vi)BV711、Qdot 705；
vii)BV750、BV785、BV786、Qdot 800；
viii)异硫氰酸荧光素(FITC)，AF488、BB515、VioBright FITC、VioBright515、Cy2、Oregon Green 488、Dylight488、AF500、EF 525NC、AF514、AF532；
ix)藻红蛋白(PE)；
x)Cy3、AF555、AF546、Dylght550；
xi)PE-CF594、PE-EF610、PE-Vio615、PE/Dazzle 594、AF568、PE-alexa594；
xii)EF585NC、EF605NC、PE-Texas red(ECD)、PE-AF610；
xiii)多甲藻叶绿素蛋白(peridinin chlorophyll protein，PerCP)、PerCP-EF710、PerCP-Vio700、PerCPCy5.5、多甲藻花色素苷()(peridinin cyanin 5，PE-cy5)、BB660、BB700；
xiv)PEcy7、PE-Vio770、PE-AF750、PE-AF700、PERCP-EF710、BB790；
xv)别藻蓝蛋白(APC)、AF647、Cy5、EF660、AF660、AF633、EF625NC、APC-Cy5.5、EF700NC；APC-R700；；
xvi)AF680、APC-A680、AF700、APC-A700；
xvii)APC-hilite7(APCH7)、APC-R700、APC/Fire 750、APC-Vio 770、AF680、APC-A750、APC-C750、AF700、APC-EF780、APC-cy7、Cy7、AF750、AF790。
本文提供的试剂盒还可以包含用于固定和透化细胞的试剂或溶液，任选地连同使用说明书、缓冲液和/或对照样本一起。在一个实施例中，固定物试剂含有约0.3至1.5％w/v，例如0.5％或1％w/v的多聚甲醛(PFA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH＝7.4)溶液。示例性透化试剂含有在PBS中稀释的约0.1％至0.5％的w/v皂苷。
本发明的另一方面涉及一种用于识别和分类儿童(实体)肿瘤的多色流式细胞术方法，包括以下步骤：
(a)用包含在根据本发明的试剂盒中的针对细胞表面标记物的荧光染料缀合抗体对包含或疑似包含儿童期肿瘤细胞的生物样本的等分试样进行染色；接着
(b)使染色的细胞与固定溶液接触；接着
(c)用透化溶液使固定和染色的细胞透化；接着
(d)用包含在根据本发明的试剂盒中的针对细胞内(细胞质和核)标记物的荧光染料缀合抗体对透化的细胞进行染色；
(e)在流式细胞仪中分析所述等分试样中的染色细胞；和
(f)存储和评估所获得的数据。
尽管以下根据原发肿瘤组织的研究来举例说明试剂盒和建议的抗体组合，但是也可以用于分析骨髓、外周血、胸腔积液、腹水、心包积液、脑脊液、玻璃体液、滑膜液、支气管肺泡灌洗液、尿液和任何其它类型的生物样本，这些样本来自于接受小儿肿瘤检查的小儿患者，如非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、Wilms肿瘤、生殖细胞肿瘤、软组织肉瘤(例如横纹肌肉瘤、尤因肉瘤肿瘤家族的肿瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤)和上皮细胞肿瘤。
在一个实施例中，生物样本是原发性肿瘤组织样本、外周血、骨髓、组织样本如淋巴结、腺样体、脾脏或肝脏，或其它类型的体液如脑脊液、玻璃体液、滑膜液、最终针吸出液、胸腔积液或腹水，所述样本均获自儿童患者。
例如，将组织等分试样置于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并进行机械分解(disaggregation)以制备适于进一步流式细胞术分析的单细胞悬浮液，以达到最大的细胞活力和细胞恢复。为此目的，将组织适当地放置(例如放入Petri培养皿中)在含有0.5％w/v牛血清白蛋白的PBS中，然后切成小块(2-4mm)并用无菌针机械分解。可以将所得肿瘤细胞悬浮液依次过滤(例如使用120mm孔径的无菌注射器)以消除细胞团块和碎片，离心并重新悬浮在PBS/0.5w/v％BSA中，最终浓度≥5×105个细胞/管。然后可以将50μL(即50,000个细胞)单细胞悬浮液的等分试样置于单独的管中。
作为另一个实例，例如为了对存在于转移部位的恶性细胞进行免疫分型，收集腹水样本、胸膜液样本(pleural fluid sample)和/或尿液样本。通过无菌注射器依次过滤样本(细胞悬浮液)以消除细胞团块和碎片；离心并重新悬浮，最终浓度为≥5×105个细胞/管。
然后，将单细胞悬浮液的等分试样与包含在如上文所定义的试剂盒中的针对细胞表面标记物的每一个荧光染料缀合抗体接触。将细胞和抗体试剂充分混合，并例如在室温下避光孵育30分钟，从而允许抗体与细胞表面标记物(如果存在于细胞上)结合。在孵育后，洗涤细胞并离心以除去未结合的抗体，每个管中留下约50μL的残留体积，用于进一步染色根据本发明的细胞内(即细胞质和核)标记物。
为此，通过与固定剂试剂(例如Fix&PermTM试剂盒(An der Grub，维也纳，奥地利)的试剂A(含有PFA的固定剂))轻轻混合，然后在室温下避光再孵育15分钟，将细胞沉淀(cell pellet)重新悬浮。随后，洗涤细胞，并通过在透化溶液(例如含有透化剂如皂苷的Fix&PermTM试剂盒的试剂B)中轻轻混合使细胞沉淀重新悬浮。轻轻混合后，加入适当体积的包含在本发明试剂盒中的针对细胞内标记物的每种抗体，混合并在室温下避光孵育15分钟。
通过使用例如含有0.09％ NaN3和0.5％w/v BSA的PBS洗涤除去未结合的抗体，每个管中残留约50μL的残留体积。在充分混合后，将残留体积的细胞沉淀适当地重新悬浮于200μL含有0.09％ NaN3和0.5％w/v BSA的PBS中，并立即在多色流式细胞仪中测量，所述多色流式细胞仪例如配备有4个激光器和13个荧光检测器的流式细胞仪，例如配备有4个激光器和13个荧光检测器的BD LSRFortessa X-20流式细胞仪。
对于数据分析，可以通过流式细胞仪软件程序，使用常规的手动布尔门控策略或自动聚类分析，结合或不结合与软件数据库的直接比较，从而允许手动和/或自动门控和分析FCS文件。
例如，首先对SSClo/FSClo/CD45hi细胞进行门控(G1)以识别淋巴细胞。然后可以通过绘制4个另外的门控(gates)以以下方式进一步细分该G1-细胞群体，用于识别淋巴细胞亚群：用于T细胞的CD45hi/smCD3+/cyCD3+(G1A)，用于B细胞的CD45hi/CD19+(G1B)，用于浆细胞的CD45+lo/CD19+(G1C)和用于NK细胞(G1D)的CD45+/smCD3-/cyCD3-/CD56+。T细胞可进一步细分为CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+和CD4-/CD8-T-细胞亚群。
可绘制包括SSCint/hi/FSCint/hi/CD45+细胞的第二门控(G2)，用于识别髓样细胞(myeloid cell)。通过对CD45+/CD4+髓样细胞建立门控(gate)可以实现髓样细胞群体的进一步亚群，以识别单核细胞和树突细胞与嗜中性粒细胞(neutrophils)和嗜酸性粒细胞(SSChi/CD45+)。
最后，可以在CD45-细胞上进行门控(G3)以选择肿瘤细胞、成红细胞(erythroblasts)、内皮细胞和间充质基质细胞(mesenchymal stromal cell)，其中Wilms肿瘤细胞(图1)的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271+/GD2-/EpCAM-/+/CD99-/nuMyogenin-表型(图1)，横纹肌肉瘤细胞的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271+hi/GD2-/EpCAM-/CD99-/nuMyogenin+谱(图2)，神经母细胞瘤细胞的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271-/+/GD2+hi/EpCAM-/CD99-/nuMyogenin(图3)和PNET细胞的特征在于CD45-/CD56+/CD271+hi/GD2+lo/EpCAM-/CD99+/nuMyogenin-。图1示出了Wilms肿瘤样本中的所有示例性数据分析步骤。表2显示了在所分析的不同儿童实体瘤样本中肿瘤细胞和免疫细胞的百分比。
如本领域技术人员将理解的，根据本发明的抗体组、试剂盒或试剂盒有利地用于儿童癌症诊断领域；例如，在早期诊断中，在原发肿瘤组织部位和转移部位(例如腹水、胸腔积液、尿液、骨髓、脑脊髓液、淋巴结和支气管肺泡灌洗、以及其它肿瘤标本)和外周血液处的诊断性亚分类、分级和/或监测儿童癌症。它既能准确地区分样本中的肿瘤细胞和其它残留细胞，又能表征同一样本中与肿瘤细胞共存的免疫细胞的不同亚组。此外，本发明提供了具有高灵敏度的用于快速分类儿童实体瘤(在样本中的其它细胞中检测到10-1至10-5个肿瘤细胞)的工具，并且本发明还提供了关于肿瘤相关微环境的数值和表型信息，因为本发明允许识别和计数浸润或未浸润的患者样本中的主要淋巴细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突细胞群以及间充质细胞。
该方法包括以下顺序步骤：i)从疑似患有儿童癌症的患者中获得生物样本；ii)在8色抗体染色中用与8种不同荧光染料缀合的一组≥12个抗体(例如，根据表1的组合)对这种生物样本进行染色，旨在识别和分类样本中共存的肿瘤细胞以及浸润免疫细胞；iii)在常规的>8色流式细胞仪中测量染色的细胞；iv)使用专用软件工具分析获得的流式细胞仪数据，以清楚地识别样本中共存的肿瘤细胞与正常细胞，进一步计数这种肿瘤细胞，定义每种标记物在每个细胞上的表达水平，根据它们的免疫表型分布将肿瘤细胞分类为不同的WHO诊断实体，并识别和计数样本中与肿瘤细胞共存的免疫细胞的不同群体及其主要亚群。
本文所述的方法可用于诊断和分类最常见类型的儿童肿瘤，包括：i)神经外胚层肿瘤，例如神经母细胞瘤、节细胞神经母细胞瘤、神经节瘤、骨外尤因肉瘤和经典尤因肉瘤，其中对这些肿瘤最有用的抗原是CD45-、CD56++、CD99-or+、GD2++和CD271+；ii)具有肌纤维母细胞分化的肿瘤，通过CD45-、CD56+、抗nuMyogenin+、抗nuMyoD1+和CD271+表型来评估；iii)识别如由例如Wilms肿瘤中的CD45-、CD56++、CD271+和EpCAM+的表达模式所定义的对多种细胞谱系的定型(commitment)；和iv)T-和B-淋巴母细胞淋巴瘤/白血病，其与CD19+CD45-/+cyCD3-肿瘤细胞相比，特征性地显示cyCD3+和CD45++CD19-。
此外，本发明还允许使用流式细胞术同时识别淋巴细胞(CD45++/SSClo细胞)，包括cyCD3+/CD3+T-细胞、CD19+B-细胞和CD19-/CD3-/CD56+NK细胞、CD19+/CD45lo浆细胞和CD4+/SSCint单核细胞和树突细胞，加上CD271++间充质细胞和内皮细胞。
基于CD56、CD4和CD8的表达，T细胞可进一步分为CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-T细胞；这些T细胞亚组中的每一个可以进一步被分成表达或不表达CD56的亚组。同时，CD56+NK细胞可进一步细分为CD56+hi、CD56+lo/CD8-、CD56+lo/CD8+NK亚组。
值得注意的是，本文提供的用于识别和分类肿瘤细胞群体的每种试剂盒和抗体组合还提供了量化每种肿瘤细胞的蛋白表达水平的手段；因此，它不仅为儿童实体瘤的诊断、分类和监测提供关键信息，而且为选择合适的靶向治疗(例如GD2+神经母细胞瘤和其它GD2+肿瘤中的抗GD2)提供关键信息。本发明还可以用于在自体干细胞移植之前检测和计数骨髓和外周血样本中的肿瘤细胞，或者用于在对患者进行任何类型的治疗之后监测目的。此外，本发明还可用于识别小型和/或寡细胞(paucicellular)样本例如玻璃体液、脑脊液和细针抽吸的组织样本中的肿瘤细胞和非肿瘤细胞，用于分级目的、诊断疾病复发或监测患者的残留疾病水平。
本发明的流式细胞术方法的诊断结果有利地用于帮助选择适当的(靶向的)治疗，例如基于抗GD2的抗体或嵌合抗原受体(CAR)T-细胞治疗。
本发明还提供了本文公开的试剂盒在诊断和分类一种或多种儿童肿瘤中的用途。例如，儿童肿瘤选自：i)神经外胚层肿瘤，例如神经母细胞瘤、节细胞神经母细胞瘤、神经节瘤、骨外尤因肉瘤和经典尤因肉瘤；ii)具有肌纤维母细胞分化的肿瘤；iii)识别对多种细胞谱系的定型；和iv)T-和B-淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病。
附图说明
图1：使用二维点图进行顺序门控策略分析，以识别肿瘤块样本中的主要亚群。图片(panel)A显示了三组细胞群的识别：G1(SSClo/CD45+hi)代表淋巴细胞，G2(SSCint/hi/CD45+)代表髓样细胞和G3(SSCint-hi/CD45-)代表肿瘤细胞。在G1-细胞门控(图片B)上，4个另外的门控允许识别主要淋巴细胞群：C)CD45+hi/CD19+B-细胞(G1B)和D)CD45+lo/CD19+浆细胞(G1C)；和F)CD45+/smCD3-/cyCD3-/CD56+NK细胞(G1D)。另外的T-细胞(CD45+hi/smCD3+/cyCD3+T-细胞-G1A)，其中在图片E中细分为：CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+和CD4-/CD8-T-细胞亚群。在G2-细胞门控(图片G)上，基于1个双变量点图(SSC/CD45)的另外3个门控允许识别嗜酸性粒细胞(SSChi/CD45+)、嗜中性粒细胞(SSCint/CD45+lo)和单核细胞(SSCint/CD45+)；此外，在图片H中，双变量点图(SSC/CD4)允许更好地区分G2-细胞门控上的嗜中性粒细胞/嗜酸性粒细胞(SSCint/CD4-)和单核细胞/巨噬细胞/树突细胞(SSCint/CD4+)。最后，在G3-细胞门控下，肿瘤细胞被表征为CD45-/CD56+hi/CD271+/GD2-/EpCAM-/+/CD99-/nuMyogenin表型(Wilms肿瘤)。
图2：使用二维点图进行顺序门控策略，以识别胸腔积液样本中主要亚群。图片A显示了三组细胞群的识别：G1(SSClo/CD45+hi)代表淋巴细胞，G2(SSCint/hi/CD45+)代表髓样细胞和G3(SSChi/CD45-)代表肿瘤细胞。在G1-细胞(图片B)上，4个另外的门控允许识别主要淋巴细胞群：C)CD45+hi/CD19+B-细胞(G1B)和CD45+lo/CD19+浆细胞(G1C)；和D)CD45+/smCD3-/cyCD3-/CD56+NK细胞(G1D)。另外的T-细胞(CD45+hi/smCD3+/cyCD3+T-细胞-G1A)在图片E中细分为CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+和CD4-/CD8-T-细胞亚群。G)在选择G2-细胞之后，基于1个双变量点图(SSC/CD45)的3个另外的门控允许识别嗜酸性粒细胞(SSChi/CD45+)、嗜中性粒细胞(SSCint/CD45+lo)和单核细胞(SSCint/CD45+)；H)G2群体的另外的双变量点图(SSC/CD4)分析允许更好的区分嗜中性粒细胞(SSCint/CD4-)和单核细胞/树突细胞(SSCint/CD4+)。最后，分析所选择的G3群体用于选择和识别最相关的细胞标记物，以分类由CD45-/CD56+hi/CD271+hi/GD2-/EpCAM-/CD99-/nuMyoD1+表型表征的肿瘤细胞(横纹肌肉瘤)。
图3：使用二维点图进行顺序门控策略，以识别骨髓中的主要亚群。图片A显示了三组细胞群的识别：G1(SSClo/CD45+hi)代表淋巴细胞，G2(SSCint/hi/CD45+)代表髓样细胞和G3(SSChi/CD45-)代表肿瘤细胞。在G1细胞门控(图片B)上，4个另外的门控允许识别主要淋巴细胞群：C)CD45+hi/CD19+B-细胞(G1B)和CD45+lo/CD19+浆细胞(G1C)；和，D)CD45+/smCD3-/cyCD3-/CD56+NK细胞(G1D)。另外的T细胞(CD45+hi/smCD3+/cyCD3+T-cells-G1A)细分为图片E)CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+和CD4-/CD8-T-细胞亚群。G)在选择G2-细胞之后，基于1个双变量点图(SSC/CD45)的3个另外的门控允许识别嗜酸性粒细胞(SSChi/CD45+))、嗜中性粒细胞(SSCint/CD45+lo)和单核细胞(SSCint/CD45+)；H)G2群体的另外的双变量点图(SSC/CD4)分析允许更好的区分嗜中性粒细胞(SSCint/CD4-)和单核细胞/树突细胞(SSCint/CD4+)。最后，在G3-细胞门控上，肿瘤细胞的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271-/+/GD2++/EpCAM-/CD99-/nuMyoD1-表型(神经母细胞瘤)，而有核红细胞表现为SSClo/CD45-/CD56-且间充质细胞表现为SSChi/CD45-/CD56-/+lo/CD271+hi。
实验部分
本发明通过下面的例子来举例说明，这些例子是为了说明的目的而提供的，而不以任何方式限制范围。
例子1：肿瘤块样本的分析
样本收集。在手术室采集55例儿童患者的实体肿瘤标本；将肿瘤样本送往病理科，并由有经验的病理学专家将它们分成两个等分试样：一个用于常规病理，另一个用于流式细胞仪。立即将用于流式细胞仪的组织等分试样置于湿冰中的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并运送至流式细胞仪实验室。标本到达后，对其进行称重，记录物理描述，并将样本进一步分成两个小片段(fragments)：一个在-80℃下新鲜冷冻储存，另一个立即机械分解。
肿瘤标本的机械分解。将55个肿瘤组织样本立即分解成单细胞悬浮液，该单细胞悬浮液适于进一步的流式细胞术分析，旨在最大限度地提高细胞活力和细胞恢复(cellrecovery)。为此目的，将组织置于含0.5％牛血清白蛋白(BSA；Calbiochem,La Jolla,CA)的2ml PBS的Petri培养皿中。然后用手术刀将肿瘤样本切成小片(2-4mm)并用无菌针机械分解。然后，通过无菌Filcon注射器(120mm孔径)依次过滤肿瘤细胞悬浮液以消除细胞团块和碎片，离心(在540g下10分钟)并重新悬浮于500μl含有0.5％ BSA的PBS中，最终浓度≥5×105个细胞/管。然后将50μL(即50,000个细胞)单细胞悬浮液的等分试样置于不同的管中。每管总共对4个不同的等分试样/每个样本进行染色以获得。
样本的染色。将50μl样本(分解组织的单细胞悬浮液)添加至4个管等分试样中的每一个，接着添加适当体积(饱和浓度)的相应试剂组合物中的每一种，其包含针对细胞表面标记物的抗体，如针对此单管组所推荐的那样：
i)CyCD3 BV421+CD271 BV421/CD45 BV510 CD99 FITC+CD8 FITC/nuMyogeninPE/EpCAM PERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/CD56 PEcy7/GD2 AF647/csmD3APC-H7+CD19 APC-H7(即表1中的抗体组合1)；
ii)CyCD3 BV421+CD271 BV421/CD45 PO/CD99 FITC+CD8 FITC/nuMyoD1 PE/EpCAM PERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/CD56 PEcy7/GD2 AF647/cyCD3 APC-H7+CD19APC-H7(表1中的抗体组合2)；
iii)CyCD3 BV786+CD271 BV786/HLADR APC/CD45 AF700/CD30 APCH7/CD71BV650/CD95 BV421/CD99 FITC+CD8 FITC/nuMyoD PE/CD40 BV711/EpCAM PERCPcy5.5+CD4PERCPcy5.5/CD56 PEcy7/GD2 BV510/smCD3 APC-H7+CD19 APC-H7(表1中的抗体组合17)
iv)CyCD3 BV786+CD271 BV786/HLADR PECF594/CD45 AF700/CD30BV650/CD99FITC+CD8 FITC/GD2 BV510/osteopontin APC/numyogenin PE/CD40 BV711/EpCAMPERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/CD56 PEcy7/OCT3 APCH7/CD95 BV421/smCD3 BV605+CD19BV605(表1中的抗体组合18)。
随后，将细胞和抗体试剂充分混合，并将它们在室温下避光孵育30分钟。在孵育后，将含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的2mL PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540xg下离心5分钟。然后，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀，每个管中留下约50μL的残留体积。通过轻轻混合使细胞沉淀重新悬浮，并添加Fix&PermTM试剂盒(Ander Grub，维也纳，奥地利)的100μL的试剂A(含有PFA的固定剂)，随后在室温下避光再孵育15分钟。随后，将2mL含有0.09％ NaN3含有0.5％ BSA的PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540g离心5分钟。
然后，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液而不干扰细胞沉淀，每个管中留下约50μL的残留体积；通过轻轻混合使细胞沉淀重新悬浮，并添加Fix&PermTM试剂盒的100μL的试剂B(含有皂苷的透化溶液)。轻轻混合后，加入适当体积的每种针对细胞内标记物(nuMyoD1,nuMyogenin,OCT3和cyCD3)的抗体，混合并在室温下避光孵育15分钟。然后，将含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的2mL PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540g下离心5分钟，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀，每个管中留下约50μL的残留体积。在充分混合后，将残留体积的细胞沉淀重新悬浮于200μL具有0.09％NaN3和0.5％ BSA的PBS中，并立即在配备有4个激光器和13个荧光检测器的BD LSRFortessa X-20流式细胞仪中测量。
数据分析。首先，在SSClo/FSClo/CD45hi细胞上进行门控(G1)以识别淋巴细胞；然后选择，这种G1-细胞通过绘制4个另外的门控进一步细分用于识别淋巴细胞亚群，如下：用于T细胞的CD45hi/smCD3+/cyCD3+(G1A),用于B细胞的CD45hi/CD19+(G1B)，用于浆细胞的CD45+lo/CD19+(G1C)和用于NK细胞的CD45+/smCD3-/cyCD3-/CD56+(G1D)。T细胞进一步细分为CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+和CD4-/CD8-T细胞亚群(图1中的图片E)。绘制包括SSCint/hi/FSCint/hi/CD45+细胞的第二门控(G2)用于识别髓样细胞。通过在CD45+/CD4+髓样细胞上建立门控(gate)实现髓样细胞群体的进一步亚群，以识别单核细胞和树突细胞与嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(SSChi/CD45+)。最后，在CD45-细胞上进行门控(G3)以选择肿瘤细胞、成红细胞、内皮细胞和间充质基质细胞，其中Wilms肿瘤细胞(图1)的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271+/GD2-/EpCAM-/+/CD99-/nuMyogenin-表型(图1)，横纹肌肉瘤细胞的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271+hi/GD2-/EpCAM-/CD99-/nuMyogenin+分布图(图2)，神经母细胞瘤细胞的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271-/+/GD2+hi/EpCAM-/CD99-/nuMyogenin-(图3)和PNET细胞的特征在于CD45-/CD56+/CD271+hi/GD2+lo/EpCAM-/CD99+/nuMyogenin-。图1显示了Wilms肿瘤样本中所有的数据分析步骤，表2显示了所分析的不同儿童实体瘤样本中肿瘤细胞和免疫细胞的百分比。
例子2：腹水、胸膜液和尿液样本的分析。
样本收集。为了对转移部位中存在的恶性细胞进行免疫分型，研究了以前诊断的患有儿童癌症的5个儿童的样本：1份腹水，3份胸膜液和1份尿样。样本在手术室或在重症监护病房收集，并在诊断时或复发时按照以下所述的顺序步骤进行处理。首先，将样本(细胞悬浮液)依次通过无菌Filcon注射器(120mm孔径)过滤以消除细胞团块和碎片；然后，将其离心(在540g下10分钟)，并重新悬浮于500μl含有0.5％ BSA的PBS中，最终浓度≥5×105个细胞/管。然后制备单细胞悬浮液的50μL(即50,000个细胞)的四个等分试样并置于不同的管中。
样本的染色。将50μl样本(不同体液的单细胞悬浮液)加入到4个管等分试样的每一个中，然后加入适当体积(饱和浓度)的每种针对细胞表面标记的相应抗体，如以下所推荐的单管荧光染料缀合的抗体组合：i)CyCD3 BV421+CD271 BV421/CD45 BV510/CD99 FITC+CD8 FITC/nuMyogenin PE/EpCAM PERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/CD56 PEcy7/GD2 APC/smCD3 APCH7/CD19 APC-H7(表1中的抗体组合1)；ii)smCD3 BV421+CD271 BV421/CD45BV510/CD99 FITC+CD8 FITC/nuMyoD1 PE/EpCAM PERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/CD56PEcy7/GD2 APC/cyCD3 APCH7/CD19 BV786(即表1中的抗体组合4)iii)CyCD3BV421+CD271BV421/HLADR APC/CD45 AF700/CD30 APCH7/CD71 BV650/CD99 FITC+CD8 FITC/numyogenin PE/CD40 BV711/EpCAM PERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/CD56PEcy7/GD2 AF647/smCD3 APC-H7+CD19 APC-H7(即表1中的抗体组合13)和CyCD3BV786+CD271 BV786/HLADRPECF594/CD45 AF700/CD30 BV650/CD99 FITC+CD8FITC/GD2 BV510/osteopontin APC+BAPAPC/nuMyogenin PE+nuMyoD1 PE/CD40 BV711/EpCAM PERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/CD56PEcy7/PLAP APCH7/CD95 BV421/smCD3BV605+CD19 BV605(即表1中的抗体组合22)。然后，将细胞和抗体试剂充分混合，并在室温下避光孵育30分钟。孵育后，将含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的2mL PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540g下离心5分钟。然后，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀，每个管中留下约50μL的残留体积。通过轻轻混合使细胞沉淀重新悬浮，并添加Fix&PermTM试剂盒(An der Grub，维也纳，奥地利)的100μL试剂A(含有PFA的固定剂)，随后在室温下避光再孵育15分钟。随后，将含有0.09％NaN3和0.5％BSA的2mL PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540g下离心5分钟。然后，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液而不干扰细胞沉淀，并且在每个管中留下约50μL的残留体积；通过轻轻混合使细胞沉淀重新悬浮，并添加Fix&PermTM试剂盒的100μL的HB(含有皂苷的透化溶液)。在轻轻混合后，加入适当体积的每种细胞内抗体(nuMyoD1,nuMyogenin，骨桥蛋白，BAP,PLAP和cyCD3 APC-H7)，混合并在室温下避光孵育15分钟。然后，将含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的2mL PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540g下离心5分钟，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液而不干扰细胞沉淀，并且每个管中留下约50μL的残留体积。在充分混合后，将残留体积的细胞沉淀重新悬浮于含有0.09％ NaN3和0.5％BSA的200μL PBS中，并立即在配备有5个激光器和48个荧光检测器的BD Symphony X-20流式细胞仪中测量。
数据分析。首先，在SSClo/FSClo/CD45+hi细胞上执行门控(G1)以识别淋巴细胞并进行选择；然后，通过绘制4个另外的门控进一步细分这种G1-细胞，用于识别淋巴细胞亚群，如下：用于T细胞的的CD45+hi/smCD3+/cyCD3+(G1A),用于B细胞的CD45+hi/CD19+(G1B)，用于浆细胞的CD45+lo/CD19+(G1C)和用于NK细胞的CD45+/smCD3-/cyCD3-/CD56+(G1D)。T细胞进一步细分为CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+和CD4-/CD8-T细胞亚群(图2中的图片E)。其次，进行包括SSCint/hi/FSCint/hi/CD45+细胞的门控(G2)以识别髓样细胞。通过在CD45+/CD4+髓样细胞上建立门控来获得髓样细胞群的其它亚群，以识别单核细胞和树突细胞与嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。最后，在CD45-细胞上进行门控(G3)以选择肿瘤细胞，Wilms肿瘤细胞显示CD45-/CD56+/CD271+/GD2-/EpCAM-/+/CD99-/nuMyogenin-表型，横纹肌肉瘤细胞是CD45-/CD56+/CD271+/GD2-/EpCAM-/CD99-/nuMyogenin+(图2)，神经母细胞瘤细胞显示CD45-/CD56+/CD271-/GD2+hi/EpCAM-/CD99-/nuMyogenin-，和PNET细胞显示CD45-/CD56+/CD271+hi/GD2+lo/EpCAM-/CD99+/nuMyogenin-。图2示出了在数据分析期间进行的所有门控步骤，用于识别在被横纹肌肉瘤细胞浸润的胸膜液样本中的肿瘤细胞和残留的正常反应性免疫细胞；接着，表3显示了在所分析的五种体液样本中识别的肿瘤细胞的百分比。
例子3：骨髓样本的分析
样本收集。从23个癌症患者收集的23个骨髓和10个外周血样本在分级过程中研究转移性播散(metastatic dissemination)的存在。如前所述(Flores-Montero等人，Leukemia.2017Oct；31(10):2094-2103)，使用EUROFLOW批量裂解方案，对每个外周血液和骨髓样本的4个不同的管/等分试样对来自每个样本的至少10×106个有核细胞进行染色，用于采集>5×106个细胞/管。简言之，在50ml Falcon管中混合2ml各样本加上50ml氯化铵裂解溶液，并在滚筒或样本摇动器装置中孵育15分钟。然后，将样本在800g下离心10分钟，并使用巴斯德移液管丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀。弃去上清液后，用含有0.09％ NaN3和0.5％BSA的PBS将试管再填充至最终体积为50ml，并在800g下再次离心(5分钟)。在不干扰细胞沉淀的情况下，弃去上清液，将细胞沉淀重新悬浮于2mL含有0.09％ NaN3和0.5％BSA的PBS中。然后，将细胞以300μl/管的体积转移到5mL聚苯乙烯圆底Falcon管(“FACS管”)中。用含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的PBS完成该体积以达到2ml(最终体积)，轻轻混合并在540g离心5min；然后，使用巴斯德移液管除去上清液而不干扰细胞沉淀。重复该过程两次。用含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的PBS将最终细胞浓度调节至5×105个细胞/μL，并且每管使用约100μL(即，1千万个细胞)的最终细胞悬浮液/样本进行染色并在流式细胞仪中测量。
样本的染色。将100μl上述处理的细胞悬浮液加入每个样本制备的4个管等分试样的每一个中，然后加入适当体积(饱和浓度)的针对细胞表面标记物的相应抗体的每一个，如以下所推荐的单管荧光染料缀合的抗体组合：i)CyCD3 BV421+CD271 BV421/CD45BV510/CD99 FITC+CD8 FITC/nuMyogenin PE+nuMyoD1 PE/EpCAM PERCPcy5.5+CD4PERCPcy5.5/CD56 PEcy7/GD2 APC/smCD3 APC-H7+CD19 APC-H7(即表1中的抗体组合3)；ii)CyCD3 BV421+CD271 BV421/CD45 AF700/CD99 FITC+CD8 FITC/GD2 BV510/骨桥蛋白APC+BAP APC/nuMyogenin PE/EpCAM PERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/CD56PEcy7/OCT-3/4/APCH7+PLAP APCH7/smCD3 BV786+CD19 BV786(即表1中的抗体组合7)iii)CyCD3 BV421+CD271 BV421/HLADR APC/CD45 AF700/CD30 APCH7/GD2BV510/CD99 FITC+CD8 FITC/nuMyogenin PE/CD40 BV711/EpCAM PERCPcy5.5+CD4PERCPcy5.5/CD56 PEcy7/smCD3 APC-H7+CD19 APC-H7(即在表1中的抗体组合13)和iv)CyCD3 BV786+CD271 BV786/CD45 AF700/PLAP APCH7/CD99 FITC+CD8 FITC/GD2BV510/骨桥蛋白APC+BAP APC/nuMyogenin PE/CD95BV421/CD30 BV650/CD40BV711//EpCAM PERCPcy5.5+CD4 PERCPcy5.5/HLADR PECF594/CD56 PEcy7/smCD3BV605+CD19 BV605(即表1中的抗体组合24)。在充分混合细胞和针对细胞表面标记物的抗体试剂后，将它们在室温下避光孵育30分钟。孵育后，将含有0.09％NaN3和0.5％ BSA的2mL PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540g离心5分钟。然后，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀，并且在每个管中留下约50μL的残留体积。
通过轻轻混合使细胞沉淀重新悬浮，随后添加Fix&PermTM试剂盒(An der Grub，维也纳，奥地利)的100μL的试剂A(含有PFA的固定剂)，接着在室温下避光再孵育15分钟。随后，将含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的2mL PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540g离心5分钟。然后，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液而不干扰细胞沉淀，并且在每个管中留下约50μL的残留体积；通过轻轻混合使细胞沉淀重新悬浮，随后添加Fix&PermTM试剂盒的100μL的试剂B(含有皂苷的透化溶液)。在轻轻混合后，加入适当体积的每种细胞内抗体(nuMyoD1,nuMyogenin PE，骨桥蛋白，BAP,OCT-3/4,PLAP和cyCD3)，混合并在室温下避光孵育15分钟。然后，将含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的2mL PBS加入到细胞沉淀中，充分混合并在540g下离心5分钟，使用巴斯德移液管或真空系统丢弃上清液而不干扰细胞沉淀，并且每个管中留下约50μL的残留体积。在充分混合残留体积后，将细胞沉淀重新悬浮于含有0.09％ NaN3和0.5％ BSA的200μL PBS中，并立即在配备有4个激光器和13个荧光检测器的BD LSRFortessa X-20流式细胞仪中测量。
数据分析。首先，在SSClo/FSClo/CD45+hi细胞上进行门控(G1)以识别淋巴细胞并进行选择；然后，通过绘制4个另外的门控以进一步细分该G1-细胞，用于识别淋巴细胞亚群，如下：用于T细胞的CD45+hi/smCD3+/cyCD3+(G1A),用于B细胞的CD45+hi/CD19+(G1B)，用于浆细胞的CD45+lo/CD19+(G1C)和用于NK细胞的CD45+/smCD3-/cyCD3-/CD56+(G1D)。T细胞进一步细分为CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+和CD4-/CD8-T细胞亚群(图3中的图片E)。绘制包括SSCint/hi/FSCint/hi/CD45+细胞的第二门控(G2)用于髓样细胞的识别。通过在CD45+/CD4+髓样细胞上建立门控以实现髓样细胞群体的其它亚群，以识别单核细胞和树突细胞与嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。最后，在CD45-细胞上进行门控(G3)以选择肿瘤细胞、成红细胞，内皮细胞和间充质基质细胞，其中肿瘤细胞(图1)的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271+/GD2-/EpCAM-/+/CD99-/nuMyogenin-表型(图1)，横纹肌肉瘤细胞的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271+hi/GD2-/EpCAM-/CD99-/nuMyogenin+谱图(图2)，神经母细胞瘤细胞的特征在于CD45-/CD56+hi/CD271-/+/GD2+hi/EpCAM-/CD99-/nuMyogenin-(图3)和PNET细胞的特征在于CD45-/CD56+/CD271+hi/GD2+lo/EpCAM-/CD99+/nuMyogenin-。图3示出了在数据分析期间在被神经母细胞瘤细胞浸润的骨髓样本中应用的所有门控步骤。表4示出了根据本发明分析的诊断为患有不同儿童实体瘤的所有患者的骨髓和外周血样中肿瘤细胞和免疫细胞的百分比。
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Claims (17)

1.一种用于流式细胞术检测儿童肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒包含荧光染料缀合的抗体，所述抗体针对细胞表面标记物CD45、CD56、GD2、CD99、CD8、EpCAM、CD4、smCD3、CD19和CD271、细胞质标记物cyCD3和核标记物nuMyogenin和/或nuMyoD1，其中
(i)针对所述标记物CD99/CD8的所述抗体与相同的荧光染料缀合，作为第一标记物对CD99/CD8；
(ii)针对所述标记物EpCAM/CD4的所述抗体与相同的荧光染料缀合，作为第二标记物对EpCAM/CD4；
(ii)针对CD271的所述抗体与针对cyCD3或smCD3的所述抗体缀合至相同的荧光染料，作为第三标记物对CD271/cyCD3或CD271/smCD3；
其中所述试剂盒包含与≥8种可区分的荧光染料缀合的抗体；其中在所述第一标记物对、所述第二标记物对和所述第三标记物对之间荧光染料是可区分的；并且其中针对所述细胞质标记物和所述核标记物的所述抗体与针对所述细胞表面标记物的所述抗体物理分离。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其包含容纳于第一容器中的第一试剂组合物和容纳于第二容器中的第二试剂组合物，所述第一试剂组合物包括针对所述细胞表面标记物CD45、CD56、GD2、CD99、CD8、EpCAM、CD4、smCD3、CD19和CD271的缀合的所述抗体，所述第二试剂组合物包括针对所述细胞质标记物cyCD3和所述核标记物nuMyogenin和/或nuMyoD1的缀合的所述抗体。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其包含所述第三标记物对CD271/cyCD3，并且其中针对所述标记物smCD3/CD19的抗体与相同的荧光染料缀合以形成第四标记物对smCD3/CD19，并且其中在不同的标记物对之间荧光染料是可区分的。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其包含所述第三标记物对CD271/smCD3，并且其中针对所述标记物CD19和cyCD3的抗体各自与不同的荧光染料缀合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其包含针对所述标记物nuMyogenin和nuMyoD1的抗体，并且其中针对所述标记物nuMyogenin/nuMyoD1的所述抗体与相同的荧光染料缀合以形成第五标记物对nuMyogenin/nuMyoD1，并且其中在不同的标记物对之间荧光染料是可区分的。
6.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其中所述第一试剂组合物还包括针对霍奇金淋巴瘤细胞表面标记物HLA-DR、CD30、CD71、CD40和CD95中的一种或多种标记物的荧光染料缀合的抗体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包含针对生殖细胞肿瘤细胞表面标记物OCT-3/4、BAP和PLAP中的一种或多种标记物的荧光染料缀合的抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其包含针对所述标记物OCT-3/4和PLAP的抗体，并且其中针对所述标记物OCT-3/4/PLAP的所述抗体与相同的荧光染料缀合以形成标记物对OCT-3/4/PLAP，并且其中在不同的标记物对之间荧光染料是可区分的。
9.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包含针对骨肿瘤细胞表面标记物骨桥蛋白和骨碱性磷酸酶中的一种或多种标记物的荧光染料缀合的抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其包含针对所述标记物骨桥蛋白和BAP的抗体，并且其中针对所述标记物骨桥蛋白/BAP的所述抗体与相同的荧光染料缀合以形成标记物对骨桥蛋白/BAP，并且其中在不同的标记物对之间荧光染料是可区分的。
11.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其包含选自表1中的抗体组合1至30中的一种或多种抗体组合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包含有核细胞完整性染料。
13.根据前述权利要求中任一项所述的试剂盒，其还包含用于固定和透化细胞的试剂，可选地连同使用说明、缓冲液和/或对照样本一起。
14.一种用于识别和分类儿童肿瘤的多色流式细胞术方法，包括以下步骤：
(a)用根据权利要求1至13中任一项所述的试剂盒中包含的针对细胞表面标记物的所述荧光染料缀合的抗体，对包含或疑似包含儿童肿瘤细胞的生物样本的等分试样进行
染色；然后
(b)将染色后的细胞与固定溶液接触；然后
(c)用透化溶液对固定和染色后的细胞进行透化；然后
(d)用根据权利要求1至13中任一项所述的试剂盒中包含的针对细胞质标记物和核标记物的所述荧光染料缀合的抗体对透化后的细胞进行染色；
(e)在流式细胞仪中分析所述等分试样中的染色后的细胞；和
(f)对得到的数据进行存储和评价。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物样本是原发性肿瘤组织样本，外周血，骨髓，组织样本如淋巴结、腺样体、脾脏或肝脏，或其它类型的体液如脑脊髓液、玻璃体液、滑液、最终的针吸出物、胸腔积液或腹水，所述样本获自儿童患者。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其还包括选择合适的靶向治疗。
17.根据权利要求1至13中任一项所述的试剂盒在诊断和分类一种或多种儿童肿瘤中的用途，所述儿童肿瘤优选选自：i)神经外胚层肿瘤，例如神经母细胞瘤、节细胞神经母细胞瘤、神经节瘤、骨外尤因肉瘤和经典尤因肉瘤；ii)具有肌纤维母细胞分化的肿瘤；iii)识别对多种细胞谱系的定型；和iv)T-和B-淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病。
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