CN115968402A - 用于检测、诊断和治疗与黏膜出血相关的疾病的生物治疗剂 - Google Patents

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Abstract

本文提供了涉及血红素响应性启动子序列、可用作益生细菌和生物治疗剂的血红素响应性阻遏物系统的实施方式，此类益生细菌和生物治疗剂在检测黏膜环境中的出血、诊断黏膜环境中的体内出血和治疗黏膜环境中的体内出血的方法中进行了描述。

Description

用于检测、诊断和治疗与黏膜出血相关的疾病的生物治疗剂
技术领域
本公开总的来说涉及在细胞中调控基因表达的方法，更具体来说涉及在有血红素存在的情况下调控基因表达。
背景技术
胃肠道(GI)出血是发病和死亡的一个主因。胃肠道出血的根本原因包括血管发育异常、肿瘤、胃溃疡、结肠炎、憩室病、食管静脉曲张、克罗恩病、肠易激综合征、痔疮和消化性溃疡。通常，几种测试例如粪便和血液分析、洗胃、内窥镜检查、肠镜检查、结肠镜检查、柔性乙状结肠镜检查和成像检查可用于确定GI出血的原因。这些测试存在缺陷，不方便，并且导致医疗保健成本上升。因此，对用于检测和诊断GI出血的快速、有效且方便的工具和方法，存在着持续不断的需求。
发明内容
一方面，本公开提供了一种血红素响应性启动子，其包含与SEQ ID NO：104具有至少70％同源性的核酸序列，可以被融合到或引入到任何组成型启动子中。
另一方面，本公开提供了一种血红素响应性阻遏物系统，其包含：第一核酸，其包含乳酸细菌的第一组成型启动子和一个或多个hrtO阻遏物结合位点；和第二核酸，其包含可操作连接到编码HrtR蛋白的基因的第二组成型启动子，其中所述HrtR蛋白能够与血红素和所述hrtO阻遏物结合位点结合，其中当结合到血红素时，所述HrtR蛋白不能与所述hrtO阻遏物结合位点结合，并且其中当未结合到血红素时，所述HrtR蛋白能够与所述hrtO阻遏物结合位点结合。
在任何实施方式中，所述HrtR蛋白可以具有与SEQ ID NO：1-100中的任一者至少90％同一性的氨基酸序列。
又一方面，本公开提供了一种血红素响应性阻遏物系统，其包含：第一核酸，其包含血红素响应性启动子，所述启动子包含融合到与SEQ ID NO：104具有至少90％同源性的氨基酸序列的第一组成型启动子；和第二核酸，其包含可操作连接到编码HrtR蛋白的基因的第二组成型启动子，所述HrtR蛋白与SEQ ID NO：104中的hrtO阻遏物结合位点结合，其中当结合到血红素时，所述HrtR蛋白不能与所述hrtO阻遏物结合位点结合，并且其中当未结合到血红素时，所述HrtR蛋白能够与所述hrtO阻遏物结合位点结合。
又一方面，本公开提供了一种工程化改造的细菌例如乳酸细菌，其包括用上述血红素响应性阻遏物系统遗传修饰的细菌。
所述工程化改造的细菌可以被并入到例如可向受试者施用的药物组合物中，用于在所述受试者的黏膜环境中检测出血。
因此，另一方面，本公开提供了一种检测受试者的黏膜环境中出血的方法，所述方法包括：向需要的受试者施用组合物，所述组合物包含用下述核酸遗传修饰的工程化改造的细菌：第一核酸，其包含血红素响应性启动子，所述启动子包含一个或多个结合血红素敏感性转录阻遏物HrtR蛋白的hrtO阻遏物结合位点；和第二核酸，其可操作连接到编码所述HrtR蛋白的基因；和检测所述受试者中所述报告蛋白的存在。
所述工程化改造的细菌也可以被并入到药物组合物中，用于将治疗性蛋白或肽递送到受试者。因此，又一方面，本公开提供了一种规范性治疗受试者的黏膜环境中的胃出血病症的方法，所述方法包括：向需要的受试者施用组合物，所述组合物包含用下述核酸遗传修饰的工程化改造的细菌：第一核酸，其包含可操作连接到治疗性蛋白的血红素响应性启动子，所述启动子包含一个或多个结合血红素敏感性转录阻遏物HrtR蛋白的hrtO阻遏物结合位点；和第二核酸，其可操作连接到编码所述HrtR蛋白的基因；和与所述黏膜环境中存在的血红素的量相称，向受试者的表现出出血的胃肠道组织产生治疗性产物。
附图说明
从下面参考附图进行的几个实施方式的详细描述，本公开的上述和其他特点将变得显而易见。
图1是示意图，示出了来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的hrtO阻遏物结合位点在来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子的转录起始位点(+1)的5’UTR区中的位置和转录调控功能。
图2提供了SEQ ID NO：102，即用两个hrtO阻遏物结合位点修饰的来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子的血红素响应性版本的核酸序列。
图3提供了SEQ ID NO：103，即来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子的5’UTR。
图4提供了SEQ ID NO：104，即用两个来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的hrtO阻遏物结合位点修饰的来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子的5’UTR。
图5提供了SEQ ID NO：105，即用来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM的slpA启动子的5’UTR修饰的来自于发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)BR11的血红素响应性启动子clpC的核酸序列。
图6描绘了在12小时时间段内遗传修饰的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)GG对血红素存在的体外响应。
图7提供了来自于图6的归一化到细菌生长的数据。
图8描绘了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG在一定血红素浓度范围内的血红素耐受。
图9提供了在向小鼠施用以本文所描述的血红素响应性阻遏物系统修饰的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)后几个小鼠结肠的图像，其中所述血红素响应性启动子被可操作连接到编码荧光蛋白的表达的报告基因。小鼠被提供正常饮用水(左)或诱导出血(右)的用％DSS处理的饮用水。
详细描述
本公开通过提供被编程以在体内黏膜环境例如GI道中对血红素作出响应表达报告蛋白的工程化改造的细菌，提出了上述检测和诊断GI出血的挑战的一种解决方案。基因表达与黏膜环境中血红素(血液)刺激物的量成正比。所述公开的细菌也可以被工程化改造，以在血红素存在下以与感应到的出血的严重程度相称的剂量递送治疗剂。
定义
提供了下述术语和方法的解释以更好地描述本公开并在本公开的实践中指导本领域普通技术人员。
当在本文中使用时，“包含”意味着“包括”，并且“一”或“一个”的单数形式包括复数指称物，除非上下文明确叙述不是如此。例如，对“包含治疗剂”的指称包括一种或多种此类治疗剂。术语“或”是指所陈述的可选要素中的单个要素或两个或更多个要素的组合，除非上下文明确叙述不是如此。例如，短语“A或B”是指A、B、或者A与B两者的组合。此外，本文中讨论的各种不同要素、特点和步骤以及每个此类要素、特点或步骤的其他已知等同物可以由本领域普通技术人员混合和匹配，以执行根据本文描述的原理的方法。在所述各种不同的要素、特点和步骤中，一些将被具体包含在特定实例中，其他的将被具体排除。
除非另有指明，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的相似或等同的方法和材料可用于本公开的实践或测试，但下文描述了适合的方法和材料。材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。本文中引用的所有参考文献整体通过参考并入本文。
在某些实例中，用于描述和要求保护某些实施方式的表示成分的量、性质例如分子量、反应条件等的数字，应该被理解为在某些情况下被术语“约”或“大约”修饰。例如，“约”或“大约”可以指示它所描述的值的+/-5％的变化。因此，在某些实施方式中，本文阐述的数值参数是可以根据特定实施方式的所需特性而变的近似值。尽管阐述某些实例的宽泛范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实例中阐述的数值被尽可能准确地报告。本文中值的范围的叙述仅打算用作各个指称落于所述范围内的每个单独的值的速记方法。
为了便于查看本公开的各种不同实施方式，提供了下述对特定术语的解释：
施用(组合物)：通过有效途径向受试者提供或给予组合物。示例性的应用途径包括但不限于口服、肠内、肠胃外和局部途径。
抗生素：能够通过抑制细菌和其他微生物的生长或通过破坏现有的菌落来治疗细菌感染的化学物质。
抗炎剂：减轻炎症和肿胀的活性药剂。
抗氧化剂：抑制氧化或由氧或过氧化物催化的反应的活性药剂。
癌症：以不受调控的细胞生长为特征的病症。癌症的实例包括但不限于鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、胃肠道癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、肾癌例如肾细胞癌和威尔姆斯瘤、基底细胞癌、黑色素瘤、前列腺癌和食道癌。
接触：放置成直接发生物理联系，包括以固体和液体形式两者。
药物或活性药剂：诱导所需药理或生理效应的化学物质或化合物，并包括治疗有效、预防有效或美容有效的药剂。所述术语还涵盖本文中具体提到的那些活性药剂的可药用的、具有药理活性的衍生物和类似物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药物、活性代谢物、包合物、类似物等。适合的活性药剂可以包括但不限于戒酒药、氨基酸、氨解毒剂、同化剂、兴奋剂、止痛剂、雄激素类药剂、麻醉剂、食欲减退化合物、食欲抑制剂、拮抗剂、抗过敏剂、抗阿米巴药剂、抗贫血药剂、抗心绞痛药、抗焦虑药、抗关节炎药物、抗动脉粥样硬化药剂、抗细菌剂、抗癌药剂包括抗肿瘤药物和抗癌补充增强剂、抗胆碱能药物、抗胆结石药剂、抗凝剂、抗球虫剂、抗惊厥药、抗抑郁药、抗糖尿病药剂、止泻药、抗利尿剂、解毒剂、抗运动障碍药剂、止吐剂、抗癫痫药、抗雌激素药剂、抗纤维蛋白溶解剂、抗真菌剂、抗青光眼剂、抗血友病药剂、抗出血药剂、抗组胺药、抗高血脂药、抗高脂蛋白血症药、抗高血压药、抗低血压药、抗感染药剂例如抗生素和抗病毒剂、甾类和非甾类消炎药、抗角化剂、抗疟药、抗微生物剂、抗偏头痛药、抗有丝分裂剂、抗真菌剂、止呕药、抗肿瘤药、抗中性粒细胞减少症药剂、抗强迫症药剂、抗寄生虫剂、抗帕金森氏病药物、抗肺囊肿药、抗增殖剂、抗前列腺肥大药物、抗原生动物剂、止痒药、抗银屑病药物、抗精神病药、退烧药、解痉药、抗风湿剂、抗血吸虫剂、抗脂溢药物、抗痉挛剂、抗血栓剂、抗结核药、镇咳剂、抗溃疡药、抗尿石药、抗病毒剂、GERD药物、抗焦虑药、食欲抑制剂、注意力缺陷障碍(ADD)和注意力缺陷多动障碍(ADHD)药、抑菌剂和杀菌剂、良性前列腺增生治疗药物、血糖调节剂、骨吸收抑制剂、支气管扩张剂、碳酸酐酶抑制剂、心血管制剂包括抗心绞痛药、抗心律失常药、β-受体阻滞剂、钙通道阻滞剂、心脏抑制剂、心血管药物、心脏保护剂和强心剂、中枢神经系统(CNS)药物、中枢神经系统兴奋剂、利胆剂、胆碱能药物、胆碱能激动剂、胆碱酯酶钝化剂、抑球孢子剂、认知辅助剂和认知增强剂、咳嗽和感冒制剂包括减充血剂、镇静剂、诊断助剂、利尿剂、多巴胺能药物、杀外寄生虫剂、催吐剂、抑制牙菌斑、结石或龋齿形成的酶、酶抑制剂、雌激素类、纤维蛋白溶解剂、防龋氟化物/抗腐烂剂、氧自由基清除剂、胃肠动力药物、遗传物质、糖皮质激素、性腺刺激精化、止血剂、草药、组胺H2受体拮抗剂、激素、激素分解剂、催眠药、低胆固醇血症药物、降血糖药、降血脂药、降压药、免疫剂、免疫调节剂、免疫调控剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、阳痿治疗辅助剂、抑制剂、角质溶解剂、白三烯抑制剂、肝脏障碍治疗、金属螯合剂例如乙二胺四乙酸四钠盐、有丝分裂抑制剂、情绪调节剂、粘液溶解剂、黏膜保护剂、肌肉松弛剂、散瞳剂、麻醉药拮抗剂、精神安定药、神经肌肉阻滞剂、神经保护剂、烟碱、NMDA拮抗剂、非激素甾醇衍生物、营养剂例如维生素、必需氨基酸和脂肪酸、眼科药物例如抗青光眼药物、催产剂、止痛药、副交感神经抑制剂、多肽类药物、纤溶酶原激活剂、血小板活化因子拮抗剂、血小板聚集抑制剂、中风后和头部创伤后治疗、增效剂、孕激素类、前列腺素类、前列腺生长抑制剂、作为伤口清洁剂的蛋白水解酶、促甲状腺激素药物、精神兴奋剂、精神药物、放射活性药剂、调控剂、松弛剂、重新分配剂、杀疥疮剂、硬化剂、镇静剂、镇静催眠剂、选择性腺苷A1拮抗剂、血清素拮抗剂、血清素抑制剂、血清素受体拮抗剂、甾类包括孕激素、雌激素、皮质类固醇、雄激素和合成代谢剂、戒烟药、兴奋剂、抑制剂、拟交感神经药、增效剂、甲状腺激素、甲状腺抑制剂、拟甲状腺素药剂、镇静剂、牙齿脱敏剂、牙齿美白剂例如过氧化物、金属亚氯酸盐、过硼酸盐、过碳酸盐、过氧酸及其组合、不稳定型心绞痛药、尿酸排泄剂、血管收缩剂、血管扩张剂包括一般冠状动脉、外周和脑、外伤药、伤口愈合剂、黄嘌呤氧化酶抑制剂等。
有效量：活性药剂(单独的或与一种或多种其他活性药剂一起)的足以诱导所需反应例如预防、治疗、减轻和/或改善病症的量。单独或与一种或多种其他活性药剂一起的活性药剂的有效量可以通过许多不同方式确定，例如测定受试者中与病症相关的一种或多种体征或症状的减轻，或测量与待治疗病症相关的一种或多种分子的水平。
表达：从DNA生产蛋白质或肽的过程。所述过程涉及基因转录成mRNA和所述mRNA翻译成蛋白质或肽。
基因：作为启动子活性的结果经历转录的核酸序列。基因可以编码特定蛋白质或肽。
黏膜：衬于体内的各种不同腔中并覆盖内部器官的表面的膜。它由覆盖一层松散的结缔组织的一层或多层上皮细胞组成。黏膜主要是内胚层起源的，并在各个身体开口例如眼、耳、鼻内、口内、唇、阴道、尿道口和肛门处与皮肤是连续的。某些黏膜分泌黏液，这是一种黏稠的保护性体液。所述膜的功能是阻止病原体和灰尘进入身体并防止身体组织脱水。
黏膜施用(组合物)：通过受试者的口、鼻、阴道、眼和耳施用(组合物)。
可操作连接的：描述了遗传元件以使它们能够执行其正常功能的方式联结。例如，当基因的转录在启动子的控制下并且这种转录产生通常由所述基因编码的蛋白质时，所述基因与所述启动子可操作连接。
口服施用(组合物)：通过口递送活性药剂。
pH调节剂：用于在制剂中实现所需pH控制的分子或缓冲剂。示例性的pH调节剂包括酸(例如乙酸、己二酸、碳酸、柠檬酸、富马酸、磷酸、山梨酸、琥珀酸、酒石酸)、碱性pH调节剂(例如氧化镁、磷酸三钾)及其可药用盐。
益生菌：当以足够的量施用时为宿主提供健康益处的活的微生物。一个实例是乳酸细菌。可以在本文公开的任何实施方式或情况中使用的乳酸细菌细胞的实例包括乳杆菌目(Lactobacillales)内，进一步来自于乳酸杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、小球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)或魏氏菌属(Weisella)的细菌细胞。例如，适合的细菌细胞包括来自于下述物种的细菌细胞：耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)，Lactobacillus acidifarinae，酸鱼乳杆菌(Lactobacillus acidipiscis)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，阿吉利斯乳杆菌(Lactobacillus agilis)，Lactobacillus algidus，消化乳杆菌(Lactobacillusalimentarius)，阿尔韦乳杆菌(Lactobacillus alvei)，阿尔维乳杆菌(Lactobacillusalvi)，解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)，嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylophilus)，Lactobacillus amylotrophicus，食淀粉乳杆菌(Lactobacillusamylovorus)，动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)，Lactobacillus animata，胃窦乳杆菌(Lactobacillus antri)，Lactobacillus apinorum，Lactobacillus apis，田鼠乳杆菌(Lactobacillus apodemi)，水生乳杆菌(Lactobacillus aquaticus)，鸟乳杆菌(Lactobacillus aviarius)，Lactobacillus backii，双发酵乳杆菌(Lactobacillusbifermentans)，Lactobacillus bombi，Lactobacillus bombicola，Lactobacillusbrantae，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，Lactobacillus brevisimilis，布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)，可可乳杆菌(Lactobacillus cacaonum)，Lactobacilluscamelliae，多毛乳杆菌(Lactobacillus capillatus)，干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)，Lactobacillus catenefornis，Lactobacillus ceti，Lactobacillus coleohominis，Lactobacillus colini，丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus collinoides)，堆肥乳杆菌(Lactobacillus composti)，Lactobacillus concavus，棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，Lactobacillus crustorum，雷氏乳杆菌(Lactobacillus curieae)，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)，德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，糊精乳杆菌(Lactobacillus dextrinicus)，Lactobacillus diolivorans，马乳杆菌(Lactobacillus equi)，Lactobacillusequicursoris，Lactobacillus equigenerosi，Lactobacillus fabifermentans，粪乳杆菌(Lactobacillus faecis)，Lactobacillus faeni，Lactobacillus farciminis，Lactobacillus farraginis，发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，Lactobacillusfloricola，Lactobacillus florum，Lactobacillus formosensis，Lactobacillusfornicalis，食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)，Lactobacillus frumenti，Lactobacillus fuchuensis，Lactobacillus furfuricola，Lactobacillus futsaii，Lactobacillus gallinarum，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，Lactobacillusgastricus，加纳乳杆菌(Lactobacillus ghanensis)，Lactobacillus gigeriorum，Lactobacillus ginsenosidimutans，Lactobacillus gorillae，草乳杆菌(Lactobacillusgraminis)，贵州乳杆菌(Lactobacillus guizhouensis)，嗜盐乳杆菌(Lactobacillushalophilus)，黑氏乳杆菌(Lactobacillus hammesii)，仓鼠乳杆菌(Lactobacillushamsteri)，哈尔滨乳杆菌(Lactobacillus harbinensis)，Lactobacillus hayakitensis，黑龙江乳杆菌(Lactobacillus heilongjiangensis)，Lactobacillus helsingborgensis，瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)，Lactobacillus herbarum，Lactobacillusheterohiochii，希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)，Lactobacillushokkaidonensis，人乳杆菌(Lactobacillus hominis)，同型腐酒乳杆菌(Lactobacillushomohiochii)，Lactobacillus hordei，Lactobacillus iatae，惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)，Lactobacillus ingluviei，昆虫乳杆菌(Lactobacillusinsectis)，Lactobacillus insicii，中间乳杆菌(Lactobacillus intermedius)，肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)，Lactobacillus iwatensis，Lactobacillus ixorae，Lactobacillus japonicus，詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，Lactobacillus kalixensis，马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)，开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)，Lactobacillus kimbladii，Lactobacillus kimchicus，Lactobacillus kimchiensis，Lactobacillus kisonensis，Lactobacillus kitasatonis，韩国乳杆菌(Lactobacilluskoreensis)，Lactobacillus kullabergensis，昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)，幼虫乳杆菌(Lactobacillus larvae)，莱氏乳杆菌(Lactobacillus leichmannii)，Lactobacillus letivazi，Lactobacillus lindner)，Lactobacillus malefermentans，马里乳杆菌(Lactobacillus mali)，食木薯乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)，Lactobacillus mellifer，Lactobacillus mellis，Lactobacillus melliventris，Lactobacillus micheneri，明登乳杆菌(Lactobacillus mindensis)，混合乳杆菌(Lactobacillus mixtipabuli)，运动乳杆菌(Lactobacillus mobilis)，Lactobacillusmodestisalitolerans，黏膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)，牡丹江乳杆菌(Lactobacillus mudanjiangensis)，鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)，Lactobacillusnagelii，那慕尔乳杆菌(Lactobacillus namurensis)，Lactobacillus nantensis，Lactobacillus nasuensis，嫩江乳杆菌(Lactobacillus nenjiangensis)，Lactobacillusnodensis，Lactobacillus odoratitofui，Lactobacillus oeni，寡发酵乳杆菌(Lactobacillus oligofermentans)，Lactobacillus ori，米乳杆菌(Lactobacillusoryzae)，Lactobacillus otakiensis，臭氧乳杆菌(Lactobacillus ozensis)，面包乳杆菌(Lactobacillus panis)，Lactobacillus pantheris，类短乳杆菌(Lactobacillusparabrevis)，类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)，类丘状菌落乳杆菌(Lactobacillus paracollinoides)，Lactobacillus parafarraginis，Lactobacillusparakefiri，Lactobacillus paralimentarius，类植物乳杆菌(Lactobacillusparaplantarum)，巴氏乳杆菌(Lactobacillus pasteurii)，Lactobacillus paucivorans，戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)，Lactobacillus perolens，Lactobacillusplajomi，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，Lactobacillus pobuzihii，Lactobacillus pontis，Lactobacillus porcinae，Lactobacillus psittaci，Lactobacillus rapi，Lactobacillus rennanquilfy，蛋白原酶乳杆菌(Lactobacillusrennini)，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)，啮齿类乳杆菌(Lactobacillus rodentium)，Lactobacillus rogosae，Lactobacillus rossiae，瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)，Lactobacillussaerimneri，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)，唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)，旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)，Lactobacillussaniviri，Lactobacillus satsumensis，Lactobacillus secaliphilus，Lactobacillusselangorensis，Lactobacillus senioris，Lactobacillus senmaizukei，Lactobacillussharpeae，深圳乳杆菌(Lactobacillus shenzhenensis)，Lactobacillus sicerae，硅乳杆菌(Lactobacillus silagei)，Lactobacillus siliginis，Lactobacillus similis，松花江乳杆菌(Lactobacillus songhuajiangensis)，Lactobacillus spicheri，Lactobacillus sucicola，Lactobacillus suebicus，Lactobacillus sunkii，台湾乳杆菌(Lactobacillus taiwanensis)，泰国乳杆菌(Lactobacillus thailandensis)，香肠乳杆菌(Lactobacillus tucceti)，Lactobacillus ultunensis，Lactobacillus uvarum，牛痘乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)，阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)，Lactobacillus vermiforme，Lactobacillus vespulae，酒乳杆菌(Lactobacillus vini)，Lactobacillus wasatchensis，香坊乳杆菌(Lactobacillus xiangfangensis)，永宁乳杆菌(Lactobacillus yonginensis)或Lactobacillus zymae。
启动子：起始基因转录的DNA序列。启动子通常存在于基因的5’并且位于起始密码子附近。启动子可以被修饰以包含本文中所公开的一个或多个转录阻遏蛋白结合位点，以对诱导剂例如血红素做出响应调控转录。
重组体：描述了通过将核酸序列和序列元件实验重组而形成的核酸、蛋白质或肽。重组宿主是接受重组核酸的任何宿主(例如细菌)，并且术语“重组蛋白”是指由这种宿主产生的蛋白质。
阻遏物或转录阻遏蛋白：能够抑制特定核酸序列例如基因从启动子的表达的分子。实际上，所述分子“阻遏”基因从其启动子表达。
阻遏物系统包括包含用转录阻遏蛋白结合位点修饰的启动子的DNA及其相应的转录阻遏蛋白，所述转录阻遏蛋白当存在时与所述转录阻遏物结合位点结合。药剂与所述转录阻遏蛋白的结合可能诱导所述阻遏蛋白的构象变化，其进而可能影响与所述转录阻遏蛋白结合位点的结合，从而产生药剂响应性阻遏物系统。这种阻遏物系统可用于抑制可操作连接的基因的转录。尽管药剂响应性启动子通常在逻辑上可以使用任何组成型启动子序列制备，但可行序列的构建并不简单。例如，国际专利申请公布号WO2018183685公开了一种四环素响应性启动子系统，其中转录阻遏蛋白tetR与阻遏物结合位点的结合抑制了下游转录。tetR与tetO阻遏物结合位点的结合利用了不同的结合机制，所述基质高度依赖于tetR和tetO两者的结构，既与彼此有关，又与启动子序列有关。
序列：氨基酸或核苷酸的线性排列。每个氨基酸或核苷酸通过化学键连接到相邻的氨基酸或核苷酸，所述化学键分别为肽键或磷酸二酯键。应该理解，对于本公开的特定实施方式可能公开了特定的核酸或氨基酸序列，然而，与叙述的序列的偏离是容许的，例如，与本文公开的特定序列具有至少70％、80％、85％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性或至少99％同源性的序列可能是适合的。
受试者：活的多细胞脊椎生物，这一类别中包括人类和非人类哺乳动物以及鸟类(例如鸡和火鸡)、鱼类和爬行类。示例性的受试者包括哺乳动物，例如人类和非人类灵长动物、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、奶牛、猪、山羊、马等。
表面或身体表面：位于人体上或身体孔内的表面。因此“身体表面”包括例如皮肤、牙齿、黏膜组织，包括具有黏膜衬里的体腔的内表面。
局部施用：将活性药剂递送到身体表面例如皮肤或黏膜，例如在预防或治疗各种不同的皮肤病症中的局部药物施用。
转染：将包含一个或多个核酸的载体递送到细菌，例如通过质粒。
溃疡：皮肤或黏膜中的破裂，其中表面组织丧失，上皮组织崩解并坏死。黏膜溃疡具体来说发生在黏膜上。
载体(或表达载体)：一种能够运输与其相连的另一个核酸的核酸。载体和质粒是常用的，并且可以从例如Invitrogen Corp.(Carlsbad,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)、New England Biolabs,Inc.(Beverly,MA)和Addgene(Cambridge,MA)等公司商购。在本文公开的任何实施方式中，可以使用任何载体将核酸递送到细菌细胞。
例如，一种类型的载体是“质粒”，其是指一种环状双链DNA环，其中可以连接额外的DNA区段。载体包括但不限于：单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端、没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA、RNA或两者的核酸分子；以及本领域中已知的多核苷酸的其他变体。例如但不是限制性的，载体可以是单拷贝或多拷贝载体，包括但不限于BAC(细菌人工染色体)、福斯质粒、粘粒、质粒、自杀质粒、穿梭载体、P1载体、游离体或YAC(酵母人工染色体)或任何其他适合的载体。
另一种类型的载体是病毒载体，其中病毒来源的DNA或RNA序列存在于载体中，用于包装成病毒(例如反转录病毒、慢病毒、复制缺陷型反转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)。病毒载体还包括由病毒携带的用于转染到宿主细胞中的多核苷酸。病毒载体包括其中可以将额外的DNA区段连接到病毒基因组、噬菌体或病毒基因组或任何其他适合的载体中的那些病毒载体。宿主细胞可以是载体能够在其中复制的任何细胞。
某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制原点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。用于重组DNA技术的常用表达载体通常采取质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用。然而，本文公开的方法可以利用其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有等同的功能。
血红素响应性启动子和阻遏物系统
本公开在各个不同方面和实施方式中提供了血红素响应性启动子，其包含被修饰以包括一个或多个hrtO阻遏物结合位点的组成型启动子(例如任何有功能的启动子)。当阻遏物结合蛋白HrtR被结合到阻遏物结合位点hrtO时，可操作连接的下游基因的转录被抑制。当HrtR未结合到hrtO时，转录进行。HrtR与hrtO的结合受到HrtR对血红素结合做出响应的构型变化的控制。当血红素被结合到HrtR时，HrtR不能与hrtO结合，因此下游转录进行。相反，当血红素未结合到HrtR时，HrtR可以与hrtO结合并抑制下游转录。图1A示出了在不存在血红素的情况下HrtR与hrtO的结合，图1B示出了血红素与HrtR蛋白的结合，从而从hrtO释放出HrtR。为了使血红素影响HrtR与hrtO的结合，HrtR必须充分存在以有利于所述结合。
hrtO的具体核苷酸序列和HrtR的氨基酸序列随细菌菌株而变，因此每一者的确切序列可以根据将要引入血红素响应性阻遏物系统的目标细菌菌株来选择。在任何实施方式中，血红素响应性阻遏物系统应该编码依赖于血红素的共同结合可逆地与血红素响应性启动子中的hrtO阻遏物结合位点结合的HrtR蛋白的表达。
因此，本文提供了一种血红素响应性阻遏物系统，其包含血红素响应性启动子和编码与所述血红素响应性启动子中的hrtO结合的HrtR蛋白的表达的序列。具体来说，血红素响应性阻遏物系统可以包含：a)第一核酸，其包含血红素响应性启动子，所述启动子包含用一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰的组成型启动子，和b)第二核酸，其编码结合所述第一核酸中的一个或多个hrtO阻遏物结合位点的HrtR蛋白的表达。所述第二核酸可以包含可操作连接到编码所述HrtR蛋白的任何组成型启动子。根据本公开，所述驱动HrtR蛋白表达的组成型启动子有效地提供足够量的HrtR，以便于在HrtR未结合到血红素时与所述hrtO转录阻遏物结合位点结合。
例如，所述第二核酸可以诱导具有如下文表1中所示的由SEQ ID NO：1-100中的任一项表示的氨基酸序列的HrtR阻遏蛋白的表达。SEQ ID NO：1-56来自于乳球菌属物种的细菌，并且以高亲和性与乳球菌hrtO阻遏物结合位点结合，而剩余的SEQ ID NO：57-100具有足够的同源性，也允许结合。此外，由SEQ ID NO：57-100表示的HrtR蛋白可以用于在它们的内源细菌菌株中使用的血红素响应性阻遏物结合系统。例如，SEQ ID NO：60代表来自于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的HrtR阻遏物结合蛋白。在蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)中使用的血红素响应性阻遏物结合系统可以包含：第一核酸，其包含血红素响应性启动子，所述启动子包含用来自于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰的来自于蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的组成型启动子；和第二核酸，其编码由SEQ ID NO：60表示的HrtR蛋白。
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所述第一核酸和第二核酸中的组成型启动子可以是相同或不同的，并且可以在将要在其中使用所述核酸的细菌菌株的基础上选择。例如，在任何实施方式中，所述细菌菌株可以是乳酸细菌。来自于乳酸细菌的适合的组成型启动子的实例包括但不限于来自于乳杆菌细菌(例如嗜酸乳杆菌NCFM或鼠李糖乳杆菌)的slpA、来自于发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)BR11的cplC、来自于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的ldh、来自于敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)的pgm、来自于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的ermB启动子和来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的lacA。包含被修饰以包括一个或多个hrtO阻遏物结合位点的组成型启动子的血红素响应性启动子在本文中一般被表示为“Pn(hrtO)”，其中“n”是组成型启动子，并且“(hrtO)”表示用一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰。例如，SEQ ID NO：102表示血红素响应性启动子PslpA(hrtO)，其包含来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的slpA启动子，所述启动子被修饰以包括来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的一个或多个hrtO阻遏物结合位点(SEQ ID NO：101)。同样地，PclpC(hrtO)描述了一种血红素响应性启动子，其包含来自于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)BR11的clpC启动子，被修饰以包括一个或多个hrtO阻遏物结合位点。PlacA(hrtO)描述了一种hrtO修饰的来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的lacA启动子。Pldh(hrtO)描述了一种hrtO修饰的来自于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)或罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的ldh启动子。Ppgm(hrtO)描述了一种hrtO修饰的来自于敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)的pgm启动子。
所述一个或多个hrtO阻遏物结合位点可以被插入到例如乳杆菌细菌(例如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus))的slpA启动子中，在所述启动子序列内足以在HrtR被结合到hrtO阻遏物结合位点时抑制下游转录的任何位置处。本领域技术人员不需过多实验就能确定允许血红素响应性转录的一个或多个所述hrtO阻遏物结合位点的位置。
例如，可以如图2中所示将一个或多个hrtO阻遏物结合位点插入到嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子中，该图描绘了SEQ ID NO：102。在图2中，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子被来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的两个hrtO阻遏物结合位点(hrtO-1和hrtO-2)修饰。也可以使用SEQ ID NO：102的保留了血红素响应性启动子的功能的变化形式。例如，在任何实施方式中，可以使用与SEQ ID NO：102具有至少70％同源性、至少80％同源性、至少90％同源性、至少95％同源性或至少98％同源性的核酸序列。
因此，在许多实施方式中，血红素响应性阻遏物系统可以包含：a)第一核酸，其包含血红素响应性启动子，所述启动子包含用一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰的slpA启动子，和b)第二核酸，其编码由表1中所示的SEQ ID NO：1-100中的任一者表示的HrtR蛋白的表达。
使用hrtO修饰的UTR的血红素响应性启动子
某些组成型启动子包含非翻译区(UTR)，其可用于使作为启动子的血红素响应性组件的hrtO和HrtR适应于在任何细菌中使用。例如，嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NFCM的slpA启动子具有5’190个碱基对(bp)的UTR，其在图3中示出并用SEQID NO：103表示。其他乳杆菌细菌例如鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)也具有带有UTR的slpA启动子，其也可以根据本文公开的各个不同方面和实施方式使用。一个或多个hrtO阻遏物结合位点可以被插入在UTR中的任何位置处，然后将所述UTR融合到任何细菌菌株的组成型启动子，以产生血红素响应性启动子。例如，在任何实施方式中，可以将一个或多个hrtO阻遏物结合位点插入在组成型启动子转录起始位点(TSS，例如刚刚越过+1bp)处或其附近，以所表达的基因转录本的翻译所需的核糖体结合位点(RBS)结束。例如，图3描绘了SEQ ID NO：103，即来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NFCM的slpA启动子的UTR。图4描绘了SEQ ID NO：103，其具有在距TSS5个碱基对处插入的hrtO阻遏物结合位点。另一个hrtO结合位点被插入到第一hrtO结合位点下游6bp处。尽管SEQ ID NO：103展示了具有两个hrtO阻遏物结合位点的UTR，但UTR可以包括任何数量的hrtO阻遏物结合位点，例如1、2、3、4、5、6个或超过6个。此外，在任何实施方式中，可以使用UTR启动子的变体并将其用一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰。例如，可以将一个或多个hrtO阻遏物结合位点插入到与SEQ ID NO：103具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核苷酸序列中。
如上所讨论的SEQ ID NO：103示出了一个实例，其中将两个hrtO阻遏物结合位点插入到嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子的UTR中。然而，slpAUTR的使用不限于使用在slpA启动子内。已发现，在有利情况下，将所述一个或多个hrtO阻遏物结合位点插入到slpA UTR中产生的核酸序列，可以被融合到任何没有UTR的组成型启动子或代替具有UTR的组成型启动子的UTR。因此，hrtO修饰的UTR可用于任何细菌菌株以产生血红素响应性启动子和阻遏物系统。所述细菌菌株可以是嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NFCM之外的乳酸细菌或任何其他细菌。例如，图4示出了SEQ ID NO：105，其中将来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子的用两个hrtO阻遏物结合位点修饰的5’UTR融合到发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)BR11的clpC启动子。
适合的组成型启动子的其他实例包括但不限于来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的lacA启动子，来自于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)或罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)的ldh启动子，来自于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的ermB启动子或来自于敏捷乳杆菌(Lactobacillus agilis)的pgm启动子。每个所述启动子可以被融合到用来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰的slpA的UTR区。
此外，UTR的使用不仅限于slpA启动子的UTR。可以将任何细菌的UTR用一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰并融合到组成型启动子，以产生血红素响应性启动子。
因此，又一方面，本公开提供了一种血红素响应性阻遏物系统，其包含：a)第一核酸序列，其包含融合到用一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰的细菌启动子的UTR的组成型启动子，和b)第二核酸序列，其包含可操作连接到编码HrtR蛋白的基因的组成型启动子，所述HrtR蛋白与所述一个或多个hrtO阻遏物结合位点结合。在任何实施方式中，所述UTR可以是来自于slpA启动子区的UTR。在任何实施方式中，所述UTR可以是来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NFCM的slpA的5’UTR。hrtO修饰的UTR可以融合到的适合的组成型启动子的实例包括但不限于clpC、lacA、ldh、ermB和pgm。
血红素感应细菌
在上述任何实施方式或方面中，血红素响应性启动子可以被可操作连接到编码靶蛋白或肽的靶基因。因此，上述血红素响应性阻遏物系统的任何实施方式或方面，通过包含可操作连接到靶基因的血红素响应性启动子，可用于对血红素的存在做出响应选择性表达蛋白质或肽。在许多实施方式中，所述靶基因是报告基因。
因此，另一方面，本公开提供了一种血红素响应性阻遏物系统，其包含a)第一核酸序列，其包含血红素响应性启动子，所述启动子包含一个或多个hrtO阻遏物结合位点并可操作连接到报告基因；和b)第二核酸序列，其包含可操作连接到编码HrtR蛋白的基因的组成型启动子，所述HrtR蛋白与所述血红素响应性启动子中的hrtO阻遏物结合位点结合。如上文中所述的血红素响应性启动子包含任何组成型启动子，例如乳酸细菌的组成型启动子。此类启动子的实例包括但不限于slpA、cplC、lacA、pgm、ermB和ldh。在某些实施方式中，所述组成型启动子被融合到包括所述一个或多个hrtO阻遏物结合位点的与SEQ ID NO：104具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列，以产生可操作连接到报告基因的血红素响应性启动子。在其他实施方式中，将与SEQ ID NO：105具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列可操作连接到所述报告基因。
所述报告基因可以是在表达时产生报告肽或蛋白质的任何基因。例如，所述报告基因可以编码可通过荧光测量检测的绿色荧光蛋白(GFP)。本文设想的报告蛋白包括荧光蛋白、发光蛋白和酶报告物例如GusA或PepN。在任何情况下，本文描述的方法可以利用表位标签和报告基因序列作为可检测组成部分。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、麦芽糖结合蛋白、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和自体荧光蛋白包括蓝色荧光蛋白(BFP)。
在本文和任何实施方式中公开的核酸可以包含在转录期间标记基因的末端的终止子。终止子序列通过在新合成的mRNA中提供触发从转录复合物中释放mRNA的过程的信号来介导转录终止。终止过程包括mRNA二级结构与复合物的直接相互作用和/或募集的终止因子的间接活动。转录复合物的释放释放了RNA聚合酶和相关的转录机制，以开始转录新的mRNA。终止子序列包括本领域已知的和在本文中鉴定和描述的那些。Rho不依赖性的形成发夹的终止子序列在乳酸细菌中特别有用，并且有效的终止子包括但不限于由SEQ ID NO：106(ATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTAT)表示的rrnB T1终止子序列。
如上所述的血红素响应性阻遏物系统可用于在血红素存在下诱导报告基因的表达。因此，用本文中描述的包含报告基因的血红素响应性阻遏物系统遗传修饰的细菌可以起到血红素的体内生物传感器的作用，在血红素存在下产生可检测的报告蛋白。因此，另一方面，本公开提供了一种工程化改造的细菌细胞，其用下述核酸遗传修饰：a)第一核酸，其包含血红素响应性启动子，所述启动子包含一个或多个hrtO阻遏物结合位点并且可操作连接到报告基因；和b)第二核酸序列，其编码与所述血红素响应性启动子中的hrtO阻遏物结合位点结合的HrtR蛋白的表达。
一方面，血红素响应性启动子可以包含所述工程化改造的细菌细胞的任何组成型启动子，并且可以包含一个或多个hrtO阻遏物结合位点，由表1中的SEQ ID NO：1-100表示的HrtR阻遏蛋白中的任一者可以与其结合。因此，所述第二核酸可以编码由表1中的SEQ IDNO：1-100表示的HrtR阻遏蛋白的表达。
另一方面，组成型启动子可以包括一个或多个来自于乳酸细菌的hrtO阻遏物结合位点，例如如上所述来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的hrtO阻遏物结合位点。因此，所述第二核酸可以编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。例如，所述工程化改造的细菌的组成型启动子可以被融合到与SEQ ID NO：104具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列，并且所述第二核酸编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。
在许多实施方式中，所述工程化改造的细菌细胞是革兰氏阳性细菌，并且所述革兰氏阳性细菌的组成型启动子被融合到与SEQ ID NO：104具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列，其包括所述一个或多个hrtO阻遏物结合位点，以产生可操作连接到报告基因的血红素响应性启动子。因此，所述第二核酸可以编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。
乳酸细菌是在乳制品工业中重要的工业微生物，并且由于其作为公认安全(GRAS)的益生菌的FDA地位而被大量用于体内。因此，在任何实施方式中，所述工程化改造的细菌细胞可以是乳酸细菌，并且将所述乳酸细菌的组成型启动子融合到与SEQ ID NO：104具有至少70％、80％90％或95％同源性的核酸序列，其包括所述一个或多个hrtO阻遏物结合位点，以产生可操作连接到报告基因的血红素响应性启动子。因此，所述第二核酸可以编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。
在其他实施方式中，所述工程化改造的细菌是发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)BR11，并且将具有与SEQ ID NO：105具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列的启动子可操作连接到报告基因。因此，所述第二核酸可以编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。
在任何上述方面和实施方式中，所述报告基因可以编码上文列出的任何报告蛋白，例如荧光蛋白、发光蛋白、生物发光蛋白、酶、表位标签等。
通过工程化改造的细菌的治疗剂递送
另一方面，本文所公开的血红素响应性阻遏物系统可以包含可操作连接到编码治疗性蛋白或肽的基因(本文中的“治疗性基因”)的血红素响应性启动子。因此，另一方面，本公开提供了一种血红素响应性阻遏物系统，其包含：a)第一核酸，其包含可操作连接到上游血红素响应性启动子的治疗性基因，所述启动子包含被修饰以包括一个或多个hrtO阻遏物结合位点的组成型启动子；和b)第二核酸，其编码与所述血红素响应性启动子中的一个或多个hrtO阻遏物结合位点结合的HrtR蛋白的表达。在结合血红素后，所述HrtR蛋白不能与所述一个或多个hrtO阻遏物结合位点结合，因此下游治疗性基因的转录开始，导致治疗性蛋白或肽的产生。
可以将任何细菌用如上所述的血红素响应性阻遏物系统遗传修饰，以产生工程化改造的细菌。在一种情况下，血红素响应性启动子可以包含所述工程化改造的细菌的任何组成型启动子，其用所述工程化改造的细菌本源的一个或多个hrtO阻遏物结合位点修饰，并可操作连接到治疗性基因。因此，所述第二核酸可以编码与所述本源hrtO阻遏物结合位点结合的HrtR阻遏蛋白的表达。
另一方面，血红素响应性启动子可以包含用一个或多个乳酸细菌的hrtO阻遏物结合位点、例如上文所描述的来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的hrtO阻遏物结合位点修饰的组成型启动子，其被可操作连接到治疗性基因。因此，所述第二核酸可以编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。在一个实例中，可以将所述工程化改造的细菌的组成型启动子融合到与SEQ ID NO：104具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列。所述血红素响应性阻遏物系统的第二核酸编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。
在许多实施方式中，所述工程化改造的细菌细胞是革兰氏阳性细菌，并因此用血红素响应性阻遏物系统遗传修饰，所述系统包含第一核酸，其包含可操作连接到上游血红素响应性启动子的治疗性基因，所述启动子包含融合到与SEQ ID NO：104具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列的所述革兰氏阳性细菌的组成型启动子。因此，所述血红素响应性阻遏物系统的第二核酸编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。
乳酸细菌是在乳制品工业中重要的工业微生物，并且由于其作为公认安全(GRAS)的益生菌的FDA地位而被大量用于体内。因此，在任何实施方式中，所述工程化改造的细菌细胞可以是用血红素响应性阻遏物系统遗传修饰的乳酸细菌，所述系统包含第一核酸，其包含可操作连接到上游血红素响应性启动子的治疗性基因，所述启动子包含融合到与SEQID NO：104具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列的所述乳酸细菌的组成型启动子。因此，所述血红素响应性阻遏物系统的第二核酸编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。
在其他实施方式中，所述工程化改造的细菌是发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)BR11，并且具有与SEQ ID NO：105具有至少70％、80％、90％或95％同源性的核酸序列的启动子被可操作连接到报告基因。因此，所述第二核酸可以编码与SEQ ID NO：1-100具有至少70％、至少80％、至少90％或至少95％同源性的HrtR阻遏蛋白的表达。
适合的治疗性蛋白的实例包括但不限于与益生菌功能的相关的内源蛋白(例如LGG p40、spaC、SOD)、抗体(包括IgG、IgE、IgA、IgM、scFv和camlid抗体，其靶向感染因子或宿主细胞表面蛋白，和抗体Fc)、哺乳动物、病毒和细菌来源的抗微生物肽(例如粘菌素、caerin、皮抑菌肽、LL-37、HBD-1/2/3、乳链菌肽、sakacin、溶菌酶)、抗病毒肽(例如HCV-C5A、Fuzeon)、细胞因子(例如IL-10)、过敏原(例如花粉、坚果蛋白)、蠕虫蛋白(例如钩虫蛋白)、三叶因子、膳食酶、粘蛋白结合蛋白(例如intJ、GroEL)、侵袭素、抗毒素或作为疫苗接种目标递送的源自于感染性因子的任何抗原。
可选地，并且在任何实施方式中，可以使用或不使用肽连接物(例如SEQ ID NO：107[GGGS]n、SEQ ID NO：108Gn、SEQ ID NO：109[EAAAK]n或SEQ ID NO：110PAPAP，其中n是基序重复序列的数目)，将编码治疗性肽或蛋白的基因联结到如上所述的报告基因(例如编码报告蛋白)，从而得到融合蛋白，其在存在血红素(例如GI出血)的情况下产生可检测的报告蛋白或肽，并且也产生治疗剂以治疗所述出血。
工程化改造的乳酸细菌
有利地且令人吃惊的是，已发现尽管不存在血红素转运蛋白(例如ChuA)，但用本文公开的核酸遗传工程改造的乳酸细菌可以对富含血红素的环境做出响应选择性地表达蛋白或肽。乳酸细菌在富含血红素的环境中发挥作用的能力是令人吃惊的，因为a)已知血红素对许多细菌、特别是那些没有精密系统来维持对细胞内血红素浓度的控制的细菌来说是有毒的，并且b)血红素不易扩散穿过细胞膜以用于与血红素响应性启动子相互作用。
不受任何理论限制，据信一个或多个hrtO阻遏物结合位点在乳酸启动子内(例如在slpA启动子的UTR中)的插入，使得在血红素(和铁)存在下使用本文公开的乳酸细菌成为可能，因为乳酸细菌是革兰氏阳性的。革兰氏阳性细菌的特征在于存在于单一膜层(而不是两个)和可以耐受带电荷物质例如铁的酸性细胞壁。乳酸细菌还具有与乳酸乳杆菌的HrtAB血红素外排复合体享有29％至50％之间的同源性的ABC转运蛋白，所述外排复合体阻止血红素在那些细菌细胞类型中的积累。因此，尽管所述工程化改造的乳酸细菌不具有血红素转运蛋白，但ABC转运蛋白的存在可以使所述乳酸细菌对血红素毒性更有抵抗力。可以使用但不是乳酸细菌的其他革兰氏阳性细菌包括但不限于Lactovum、黄单胞菌属(Xanthomonas)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌目(Clostridiales)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、Ezakiella、Sneathia、Helococcus、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)、Weisella、Tetragenoccus、丙酸杆菌属(Propionibacteria)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)、Carnobacteria、漫游球菌属(Vagococcus)、肠球菌属(Enterococcus)和球链菌属(Globicatella)。
然而，所述各种不同的血红素响应性启动子和阻遏物系统不限于使用在仅仅乳酸细菌或革兰氏阳性细菌中。可以在上述公开的基础上开发用于包括革兰氏阴性细菌在内的任何细菌的血红素响应性阻遏物系统，但将包括编码ChuA膜转运蛋白的共表达的第三核酸。
表达载体
可以使用表达载体，将工程化改造的乳酸细菌用上文公开的血红素响应性阻遏物系统中的任一者遗传修饰。因此，另一方面，本公开提供了一种表达载体，其包含如上所定义的血红素响应性阻遏物系统，其中血红素响应性启动子被可操作连接到报告基因和治疗性基因中的一者或多者。所述表达载体可以是上文列出的任一者，例如质粒、细菌人工染色体、福斯质粒、粘粒、穿梭载体、P1载体、游离体或病毒载体。
遗传修饰细菌的方法
如上所公开的任何血红素响应性阻遏物系统，可以使用本领域技术人员已知用于引入的任何方法引入到细菌细胞中。此类方法包括转染、转化、转导、感染(例如病毒转导)、注射、微注射、基因枪、核转染、纳米粒子轰击、转化、接合，通过施用在凝胶、油或霜剂中的核酸，通过电穿孔，使用基于脂质的转染试剂，或通过任何其他合适的转染方法。使用可容易地识别的文献来源，本领域技术人员将容易地理解和改编此类方法。
当在本文中使用时，术语“转化”和“转染”打算是指各种不同的本领域公认的用于将外来核酸引入到宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染(例如使用可商购的试剂例如
Figure BDA0003864943270000271
(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)、
Figure BDA0003864943270000272
(Invitrogen)、
Figure BDA0003864943270000273
(Roche Applied Science,Basel,Switzerland)、JETPEITM(Polyplus-transfection Inc.,New York,NY)、
Figure BDA0003864943270000281
(Qiagen,Valencia,CA)、DREAMFECTTM(OZ Biosciences,France)等)或电穿孔(例如体内电穿孔)。用于转化或转染宿主细胞的适合方法可以在Sambrook等(《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.)第2版，Cold Spring harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)和其他实验室手册中找到。
用于核酸向细胞的非病毒递送的方法和材料还包括基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质-核酸偶联物、裸DNA、人工病毒体和药剂增强的DNA摄取。脂转染被描述在美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355中，并且脂转染试剂是可商购的(例如TRANSFECTAMTM和LIPOFECTINTM)。适用于多核苷酸的高效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括在WO91/17424和WO91/16024中公开的那些。
工程化改造的细菌可以按照本领域中任何已知的方法，例如在培养基中和适合于细菌生长的环境条件下生长所需的时间。例如，细菌可以在包括MRS、TGE、APT、BHI、TSB和TSBYE在内的复杂培养基中，在约7至约9的pH和约37℃的温度下生长。本领域技术人员将会熟悉特定细菌菌株的适合的条件和/或能够为其优化生长条件。
因此，另一方面，本公开提供了一种对细菌进行遗传修饰以产生工程化改造的细菌的方法，所述方法包括提供包含如上所述的血红素响应性阻遏物系统的载体，用所述载体接种所述细菌，从而产生所述工程化改造的细菌；以及将所述细菌维持在有效促进所述工程化改造的细菌生长的条件下。所述细菌可以是任何上述细菌，例如革兰氏阳性细菌或者更具体来说乳酸细菌。也可以使用革兰氏阴性细菌，只要也诱导ChuA转运蛋白的表达即可。
药物制剂
本文提供的用可操作连接到一种或多种报告基因或治疗性基因的血红素响应性阻遏物系统遗传修饰的工程化改造的细菌，可以被配制在用于口服、局部、肠胃外或透皮施用的组合物中。这些组合物可以采取丸剂、片剂、胶囊、微胶囊、粉剂、袋剂、糖衣丸、凝胶、液体、悬液、溶液、食品、霜剂或颗粒剂的形式，并且还可以包含一种或多种可药用赋形剂，例如填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、表面活性剂、pH调节剂、调味剂、着色剂、抗氧化剂、缓冲剂等。
示例性的pH调节剂包括但不限于碳酸氢铵、碳酸铵、柠檬酸铵、氢氧化铵、磷酸铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、富马酸钙、氢氧化钙、磷酸钙、碳酸镁、柠檬酸镁、氢氧化镁、磷酸镁、硫酸镁、碳酸氢钾、碳酸钾、柠檬酸钾、富马酸钾、氢氧化钾、硫酸钾、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、富马酸钠、氢氧化钠和磷酸钠中的一者或多者。
食品可以包括但不限于乳制品、酸奶、冰淇淋、基于牛奶的饮料、基于牛奶的食品配饰、布丁、奶昔、冰茶、水果或蔬菜汁、低糖饮料、苏打水、运动饮料、果冻状食品、用于膳食补充的粉末状饮料混合物、婴儿食品、补钙橙汁、酱汁或汤。
检测、诊断和/或治疗出血的方法
本文所公开的工程化改造的细菌可用于在受试者的黏膜环境中检测、诊断和/或治疗出血。因此，另一方面，本公开提供了一种在受试者的黏膜环境中检测出血的方法，所述方法包括向需要的受试者施用包含如上文中所述用血红素响应性阻遏物系统遗传修饰的工程化改造的细菌的组合物，其中所述血红素响应性阻遏物系统包含：a)第一核酸，其包含可操作连接到报告基因的血红素响应性启动子，所述启动子包含被修饰以包括一个或多个hrtO阻遏物结合位点的组成型启动子；和b)第二核酸，其包含任何组成型启动子，并编码与所述第一核酸的血红素响应性启动子中的一个或多个hrtO阻遏物结合位点结合的HrtR蛋白；以及在所述受试者中检测所述报告蛋白的存在。所述报告基因可以是或者编码上文列出的任何报告蛋白，例如荧光蛋白、发光蛋白、生物发光蛋白、酶、表位标签等。所述报告基因的表达以及因此报告蛋白的存在于黏膜环境中血红素刺激物的量成正比。
报告蛋白的存在可以通过任何已知的测试来检测和定量，所述测试例如但不限于聚合酶链反应(PCR)分析、核酸测试、单路诊断测试、多路诊断测试、生物标志物测量和检测、成像分析及其人和组合物。报告蛋白水平的分析可以在体内、离体或体外进行。
另一方面，本公开提供了一种在受试者的黏膜环境中治疗出血的方法，所述方法包括向需要的受试者施用包含用下述核酸遗传修饰的工程化改造的细菌的组合物：a)第一核酸，其包含可操作连接到编码治疗性蛋白的报告基因的血红素响应性启动子，所述启动子包含被修饰以包括一个或多个hrtO阻遏物结合位点的组成型启动子；和b)第二核酸，其包含任何组成型启动子，并编码与所述第一核酸的血红素响应性启动子中的一个或多个hrtO阻遏物结合位点结合的HrtR蛋白。所述治疗性基因可以编码任何治疗性蛋白，例如与益生菌功能相关的内源蛋白(例如LGG p40、spaC)、抗体(包括IgG、IgE、IgA、scFv和camlid抗体，其靶向感染因子或宿主细胞表面蛋白，和抗体Fc)、哺乳动物、病毒和细菌来源的抗微生物肽(例如粘菌素、caerin、皮抑菌肽、LL-37、HBD-2)、抗病毒肽(例如HCV-C5A、Fuzeon)、细胞因子(例如IL-10)、过敏原(例如花粉、坚果蛋白)、蠕虫蛋白(例如钩虫蛋白)、三叶因子、膳食酶、粘蛋白结合蛋白(例如intJ、GroEL)、侵袭素、抗毒素或作为疫苗接种目标递送的源自于感染性因子的任何抗原。
所述黏膜环境可以是受试者的胃肠道。所述受试者可以是哺乳动物，例如动物或人类受试者。所述受试者可能患有出血疾病或病症或有发生出血疾病或病症的风险，所述出血疾病或病症例如炎症性肠病、结肠炎、消化性溃疡、胃炎、息肉、痔疮、硬化、感染和癌症。
所述组合物可以口服、局部、肠胃外或透皮向所述受试者施用，例如作为丸剂、片剂、胶囊、微胶囊、粉剂、袋剂、糖衣丸、凝胶、液体、悬液、溶液、霜剂或颗粒剂。
本文提供的传感器和方法提供了几个优点，使它们适用于在哺乳动物受试者例如人类中检测黏膜出血，并治疗、管理或预防与黏膜出血相关的各种不同病症。具体来说，所公开的益生菌生物传感器可以驱动任何感兴趣的基因的表达，并表现出与黏膜环境中的生物刺激物的量成正比的基因表达。由于这些性质，本文提供的生物传感器可以与任何生物有效载荷融合，并因此构成活体生物诊断剂和生物治疗剂。
实施例
实施例1：遗传修饰的益生细菌对血红素的体外响应。将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG菌株用包含下述核酸的载体遗传修饰：第一核酸，其包含来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM的slpA启动子，所述启动子被修饰以包括两个来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的hrtO阻遏物结合位点并可操作连接到荧光报告物mCherry基因，以对血红素做出响应驱动所述报告基因的表达；和第二核酸，其包含可操作连接到HrtR蛋白的slpA启动子。将工程化改造的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG在添加有0ppm至1250ppm血红素的培养基中生长。在12小时的时间段内分析培养基的荧光(与其中的mCherry浓度成正比)。结果示出在图6中，证实了培养基中血红素浓度越高，被血红素响应性启动子驱动的报告基因的表达越强。在图7中，将数据归一化到细菌生长，以将可能影响mCherry水平的细菌生长的任何变化考虑在内。这些数据证实了所述公开的工程化改造的细菌对血红素存在具有高度响应性，并且所述工程化改造的细菌的响应与它们暴露到的血红素的量成正比。
实施例2：细菌对血红素毒性的抗性。测量了来自于实施例1的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG随时间的生长。结果示出在图8中，并说明在除了最高(1250ppm)之外的所有血红素浓度下，细菌生长与同一细菌在不存在血红素情况下的生长相近。
实施例3：体内研究。将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG菌株用包含下述核酸的载体遗传修饰：第一核酸，其包含来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)NCFM的slpA启动子，所述启动子被修饰以包括一个或多个来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的hrtO阻遏物结合位点并可操作连接到荧光报告物mCherry基因，以对血红素做出响应驱动所述报告基因的表达；和第二核酸，其包含可操作连接到编码来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的HrtR阻遏物结合蛋白的基因的slpA启动子。将所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG在培养基中生长到光密度为0.9，在300μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备成109个菌落形成单位(CFU)的剂量，并通过口饲管向小鼠施用。结果示出在图9中。小鼠被提供5天的正常饮用水(无结肠炎/无出血对照组；左)或5％DSS处理的饮用水(结肠炎/诱导出血实验；右)。使用龙胆紫识别近端和远端方向，它也发射荧光信号，可以在图8的图像中看到(因此也为成像提供了阳性对照信号)。在图像中鉴定了器官的近端(P)和远端(D)方向。与预期出血明显更少的对照组相比，在DSS处理的结肠炎组中清楚地看到更高的信号，指示了向这些小鼠施用的工程化改造的乳酸细菌的诱导。就在将动物处死并取下结肠之前，通过仅在5％DSS处理的小鼠中观察到直肠出血，大体上目测确认了出血。

Claims (43)

1.一种血红素响应性启动子序列，其包含与SEQ ID NO：104具有至少70％同源性的核酸序列。
2.权利要求1所述的血红素响应性启动子序列，其中所述与SEQ ID NO：104具有至少70％同源性的核酸序列被融合到乳酸细菌的组成型启动子。
3.权利要求1或权利要求2所述的血红素响应性启动子序列，其中所述组成型启动子是ldh、clpC、lacA、ermB或pgm。
4.权利要求1所述的血红素响应性启动子序列，其由SEQ ID NO：102或者与SEQ ID NO：102具有至少70％同源性的核酸序列表示。
5.权利要求1所述的血红素响应性启动子序列，其由SEQ ID NO：105或者与SEQ ID NO：105具有至少70％同源性的核酸序列表示。
6.一种血红素响应性启动子序列，其包含插入到乳酸细菌的组成型启动子中的一个或多个hrtO阻遏物结合位点。
7.权利要求6所述的血红素响应性启动子序列，其中所述组成型启动子是ldh、clpC、lacA、ermB或pgm。
8.权利要求6或权利要求7所述的血红素响应性启动子序列，其中所述一个或多个hrtO结合位点能够与由SEQ ID NO.1-100中的任一者表示的蛋白质结合。
9.一种血红素响应性阻遏物系统，其包含：
a)第一核酸，其包含乳酸细菌的第一组成型启动子和一个或多个hrtO阻遏物结合位点；以及
b)第二核酸，其包含可操作连接到编码HrtR蛋白的基因的第二组成型启动子，其中所述HrtR蛋白能够与血红素和所述hrtO阻遏物结合位点结合，
其中当所述HrtR蛋白结合到血红素时，所述HrtR蛋白不能与所述hrtO阻遏物结合位点结合，并且其中当所述HrtR蛋白未结合到血红素时，所述HrtR蛋白能够与所述hrtO阻遏物结合位点结合。
10.权利要求9所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述HrtR蛋白具有与SEQ ID NO：1-100中的任一者至少90％同一性的氨基酸序列。
11.权利要求9或权利要求10所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述血红素响应性启动子包含乳酸细菌菌株的组成型启动子。
12.权利要求9-11中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述组成型启动子是slpA、ldh、clpC、lacA、ermB或pgm。
13.权利要求9-12中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述一个或多个hrtO阻遏物结合位点被插入到所述组成型启动子中。
14.权利要求9-13中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述hrtO阻遏物结合位点被插入到与SEQ ID NO：103具有至少70％同源性的核酸序列中。
15.权利要求9-14中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述血红素响应性启动子序列包含与SEQ ID NO：104具有至少70％同源性的核酸序列。
16.权利要求9-14中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述血红素响应性启动子序列与SEQ ID NO：102具有至少70％同源性。
17.权利要求9-14中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述血红素响应性启动子序列与SEQ ID NO：102具有至少95％同源性。
18.权利要求9-14中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述血红素响应性启动子序列包含与SEQ ID NO：105具有至少70％同源性的核酸序列。
19.一种血红素响应性阻遏物系统，其包含：
a)第一核酸，其包含血红素响应性启动子，所述血红素响应性启动子包含融合到与SEQID NO：104具有至少90％同源性的氨基酸序列的第一组成型启动子；和
b)第二核酸，其包含可操作连接到编码HrtR蛋白的基因的第二组成型启动子，所述HrtR蛋白与SEQ ID NO：104中的hrtO阻遏物结合位点结合，
其中当所述HrtR蛋白结合到血红素时，所述HrtR蛋白不能与所述hrtO阻遏物结合位点结合，并且其中当所述HrtR蛋白未结合到血红素时，所述HrtR蛋白能够与所述hrtO阻遏物结合位点结合。
20.权利要求19所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述HrtR蛋白具有与SEQ IDNO：1-100中的任一者至少90％同一性的氨基酸序列。
21.权利要求19或20所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述第一组成型启动子和第二组成型启动子是相同的。
22.权利要求19-21中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述第一组成型启动子和第二组成型启动子是slpA、ldh、clpC、lacA、ermB或pgm。
23.权利要求19-22中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述血红素响应性启动子被可操作连接到靶基因。
24.权利要求23所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述靶基因是报告基因。
25.权利要求24所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述报告基因编码荧光蛋白、发光蛋白、生物发光蛋白、酶或表位标签。
26.权利要求23所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述靶基因编码治疗性蛋白的表达。
27.一种工程化改造的细菌，其包括用权利要求9-26中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统遗传修饰的细菌。
28.权利要求27所述的工程化改造的细菌，其中所述细菌是乳酸细菌。
29.权利要求17或28所述的工程化改造的细菌，其中所述细菌是乳酸杆菌属(Lactobacillus)或乳球菌属(Lactococcus)细菌。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求27-29中的任一项所述的工程化改造的细菌。
31.一种检测受试者的黏膜环境中出血的方法，所述方法包括：
a)向需要的受试者施用组合物，所述组合物包含用下述核酸遗传修饰的工程化改造的细菌：第一核酸，其包含血红素响应性启动子，所述血红素响应性启动子包含一个或多个结合血红素敏感性转录阻遏物HrtR蛋白的hrtO阻遏物结合位点；以及第二核酸，其可操作连接到编码所述HrtR蛋白的基因；以及
b)检测所述受试者中所述报告蛋白的存在。
32.一种规范性治疗受试者的黏膜环境中的胃出血病症的方法，所述方法包括：
a)向需要的受试者施用组合物，所述组合物包含用下述核酸遗传修饰的工程化改造的细菌：第一核酸，其包含可操作连接到治疗性蛋白的血红素响应性启动子，所述血红素响应性启动子包含一个或多个结合血红素敏感性转录阻遏物HrtR蛋白的hrtO阻遏物结合位点；以及第二核酸，其可操作连接到编码所述HrtR蛋白的基因；以及
b)与所述黏膜环境中存在的血红素的量相称地，向受试者的表现出出血的胃肠道组织产生治疗性产物。
33.权利要求31或32所述的方法，其中所述HrtR蛋白具有与SEQ ID NO：1-100中的任一者至少90％同一性的序列。
34.权利要求31-33中的任一项所述的血红素响应性阻遏物系统，其中所述hrtO阻遏物结合位点是来自于乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)的hrtO阻遏物结合位点。
35.权利要求31-34中的任一项所述的方法，其中所述血红素响应性启动子还包含乳酸细菌菌株的组成型启动子。
36.权利要求31-35所述的方法，其中所述组成型启动子是slpA、ldh、clpC、lacA、ermB或pgm。
37.权利要求31-36中的任一项所述的方法，其中所述血红素响应性启动子序列与SEQID NO：102具有至少70％同源性。
38.权利要求31-37中的任一项所述的方法，其中所述血红素响应性启动子序列与SEQID NO：102具有至少95％同源性。
39.权利要求31-36中的任一项所述的方法，其中所述血红素响应性启动子序列包含与SEQ ID NO：104具有至少70％同源性的核酸序列。
40.权利要求31和33-39中的任一项所述的方法，其中所述报告基因编码荧光蛋白、发光蛋白、生物发光蛋白、酶、表位标签或其任何组合。
41.权利要求32-39中的任一项所述的方法，其中所述报告基因编码治疗性蛋白。
42.权利要求31-41中的任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断为患有出血病症或疾病或处于出血病症或疾病的风险中。
43.权利要求32-41中的任一项所述的方法，其中所述出血病症或疾病是炎症性肠病、肠易激综合征、结肠炎、消化性溃疡、胃炎、息肉、痔疮、硬化、感染和癌症。
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