CN115960782B - 一株海洋聚乙烯塑料降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株海洋聚乙烯塑料降解菌及其应用。Evansella clarkii SCSIO 43802，该菌株于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO：M 20221020。本发明的SCSIO 43802是分离来自于海草床生态系统，通过以聚乙烯塑料为唯一碳源而生长，并且可以降解聚乙烯塑料。可以用于降解聚乙烯塑料，特别是在海洋生境中降解塑料。具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株海洋来源的具有聚乙烯降解作用的及其应用。
背景技术
随着化工产业的发展，塑料制品由于轻便、耐用、便宜和方便等，被广泛应用于各种包装材料（聚乙烯PE）、饮料瓶（聚酯类塑料、PET）和泡沫衬垫及快餐饭盒（聚苯乙烯塑料PS）等方面。全球塑料产量以每年约4%的速度增长。2020年发表在《科学》杂志上的一项研究表明，未来全球塑料排放量可能达到3500万吨，这是联合过标准（800万吨）的6.6倍。由于对塑料制品处理不妥，导致了海洋环境中塑料垃圾越来越多，全球每年高达1200万吨塑料垃圾进入海洋环境，造成的经济损失每年高达130亿美元。海洋塑料在太阳辐射（如光辐射、脆化等）或者波浪作用，直径越来越小。由于塑料绝大部分由稳定的长链高分子聚合物组成，其在环境中不易降解，并且降解过程其缓慢。2004年，英国科学家Thompson在《科学》杂志上首次提出了微塑料的概念。海洋环境中的微塑料（< 5 mm）作为一种新型污染物受到越来越多的关注，其对海洋生态系统的物理、化学、生物方面存在不同程度影响。由于其颗粒小、数量多并且分布广，能够被很多海洋生物如海洋鱼类、贝类等生物摄食。微塑料还被海洋生物当作饵料误食，缠绕海洋生物造成海洋生物的窒息死亡，其还会吸附环境中持久性有机污染物、抗生素等；同时，微塑料容易与从周围环境中吸附有机污染物，并在表面进行富集，可能会造成海洋生物的窒息死亡，并且还可以传播病原菌等，对海洋生态系统的健康造成极大的威胁。
塑料的生物降解首先是通过光、热、氧化和微生物等综合作用将高分子聚合物降解为单体后，在通过微生物的作用生成CO2和H2O的过程，该过程对生态环境无影响，为理想的降解方式。2016年日本科学家首次从垃圾回收站污泥中筛选到一株革兰氏阴性的β-变形菌 Ideonella sakaiensis 细菌，能够降解苯二甲酸乙二醇酯PET薄膜的能力，它们附着的PET薄膜，在显微镜上出现大量的空洞。该项研究工作为通过生物治理塑料污染问题提供了新的契机和方向。由于人类活动频繁造成的各种污染直接或者间接威胁着滨海湿地生态系统的健康与稳定。已有研究表明滨海湿地海草床对环境中的微塑料具有拦截作用，海草床生态系统中存在微塑料的聚集现象，其提高了对海草床海洋生物在微塑料污染方面的高暴露风险。海草床生态系统蕴含丰富的微生物资源，是获得挖掘高效塑料降解菌的重要来源地。通过从原生境中分离获得具有塑料降解的应用微生物进行塑料降解，是进行海洋污染保护和修复的有效可持续发展的途径。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株具有聚乙烯塑料降解功能的Evansella clarkiiSCSIO 43802，该菌株于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO：M 20221020。
本发明的 SCSIO 43802具有能够以聚乙烯塑料为唯一碳源进行生长的能力，因此能够在聚乙烯塑料为唯一碳源的培养基进行培养。
通过失重称量法，对以聚乙烯膜为唯一碳源培养的菌株实验组的膜降解情况分析，其降解效率为5.35%。
通过扫描电镜法对微生物进行塑料降解表征进行分析，结果显示 SCSIO 43802的添加能够在塑料表面形成明显的凹槽和坑洞，菌体在塑料表明大量聚集生长。
通过应用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析 SCSIO 43802添加组可以检测到大量的长链烷烃，其可能为塑料降解形成的副产物，从而为该细菌可以降解聚乙烯塑料提供了直接的有利证据。
因此，本发明的第二个目的是提供SCSIO 43802在降解塑料中的应用。
优选，SCSIO 43802在海洋生境中降解塑料中的应用。
优选，所述的塑料可以是聚乙烯塑料。
本发明的第三个目的是提供一种降解塑料的制剂，其含有上述SCSIO 43802或其菌剂作为活性成分。
本发明的第四个目的是提供一种降解塑料的方法，其是利用SCSIO 43802降解塑料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的SCSIO 43802是分离来自于海草床生态系统，通过以聚乙烯塑料为唯一碳源而生长，并且可以降解聚乙烯塑料。可以用于降解聚乙烯塑料，特别是在海洋生境中降解塑料。具有广阔的应用前景。
Evansella clarkia SCSIO 43802，该菌株于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO：M20221020。
附图说明
图1是Evansella clarkii SCSIO 43802的16S rDNA的系统进化发育树。
图2是Evansella clarkii SCSIO 43802的扫描电镜照片，展示Evansella clarkii SCSIO 43802在PE膜表面富集情况。
图3是Evansella clarkii SCSIO 43802的扫描电镜照片，展示Evansella clarkii SCSIO 43802在PE膜表面形成的凹陷和裂痕（左：实验组；右：对照组）。
图4是Evansella clarkii SCSIO 43802降解塑料PE的GC-MS图谱，展示Evansella clarkii SCSIO 43802降解PE产物的GC-MS分析（上：实验组；下：对照组）。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1 Evansella clarkii SCSIO 43802的分离、纯化和鉴定
1、Evansella clarkii SCSIO 43802的分离、纯化
海洋沉积物样品采集于海南省三亚湾珊瑚礁生态系统的泰来草Thalassia hemprichii生长区的沉积物，首先用无机盐MSM培养基对沉积物进行富集培养，10 g沉积物在含有100 mL无机盐培养基的250 mL的锥形瓶中培养，180 rpm，28℃，以聚乙烯PE为唯一碳源培养35天。培养结束后对富集样品的进行稀释涂布，28°C培养2周后挑取单菌落进行纯化，并对纯化菌进行分子生物学鉴定，获得SCSIO 43802菌株。无机盐培养基成分（MSM培养基）：(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 100g，KH2PO4 50g，MgSO4·7H2O 0 .2g，CaCl2·2H2O 0 .1g，FeSO4·7H2O 0 .005g，MnSO4·H2O 0 .003g，ZnSO4·7H2O 0 .003g，CoSO4·7H2O 0 .001g，(NH4)6MoO24·7H2O 0 .001g，pH为8.0，琼脂15g，1000mL过滤海水；将上述培养基的成分混合，灭菌即得。
2、Evansella clarkii SCSIO 43802的形态学和分子生物学鉴定
对分离出SCSIO 43802菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。应用细菌DNA提取试剂盒(OMEGA, USA)提取SCSIO 43802的基因组DNA，以通用引物27F和1492R进行扩增（Weisenburg et al., 1991，16S ribosomal DNA amplification for phylogeneticstudy., Journal of bacteriology, 1991, 173(2) :697-703），PCR反应体系见表2。将16S rRNA测序的结果（见SEQ ID NO.1）与Ezbiocloud数据库中检索，其与该数据库中最相近的序列Evansella clarkii DSM 8720(T) (KV917376)的相似度为99.52%，所述的Evansella clarkii SCSIO 43802的16S rDNA的系统进化发育树见附图1。将菌株SCSIO43802命名为（Evansella clarkii）SCSIO 43802，该菌株于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO：M20221020。
实施例2 Evansella sp.SCSIO 43802聚乙烯塑料降解的应用与分析
将商用PE膜剪成20mm × 20mm正方形片状，利用2% SDS溶液浸泡过夜，75%无水乙醇浸泡4小时以除去表面杂菌污染，用无菌水冲洗三次后，放置于烘箱30℃烘干，随机挑选3张PE膜称量后放在MSM培养基上进行培养。
以前期富集培养实验所筛选获得的潜在塑料降解菌Evansella clarkii SCSIO43802为供试菌株，为塑料PE为唯一碳源的无机盐培养基与菌株培养150 d，根据培养期间溶液光密（OD600吸光度）变化、塑料PE的失重率、塑料表面的微观形态及GC-MS结果分析。
2.1 Evansella clarkii 菌株生长
将选用菌株在2216E液体培养基中活化培养，离心后获得菌株细胞沉淀，用无菌海水反复清洗3次后，完全去除2216E液体培养基后，用MSM培养基调整菌悬液，初始的OD600吸光度为0.7。接入以0.1g PE膜为唯一碳源的无机盐培养基中（30 mL），摇床180 rpm，28℃进行暗培养，培养时间为150 d，同时以不加菌悬液的塑料PE-无机盐培养基（CK）为空白对照同时培养。分别记录实验组与对照组培养初始的OD600吸光度，并定期测量培养液的OD600吸光度进行对比，其可以作为评估菌生长情况的指标。
2.2 聚乙烯微塑料失重率计算
培养结束后，将实验组和对照组的PE膜取出，再次按初始的PE膜处理方法除去表面残留后，放于烘箱30°C烘干至恒重，称重，计算降解前后PE膜的失重率，失重率按照以下公示进行计算：
失重率（%）=（培养前PE膜质量-培养后PE膜质量）/培养前PE膜质量×100%
2.3扫描电子显微镜观察
培养结束的PE膜干燥后剪成10mm*10mm大小，用于扫描电镜（S3400N，日立，日本）观察表面形态变化，条件如下：PE膜固定后表面喷金覆盖，观测电压为15kV。
2.4 GC-MS检测PE膜表面的降解产物
将0.05g干燥的PE膜剪成细条状放于密封的玻璃瓶中，加入10 mL氯仿后于超声仪中55°C温浴2h。将溶液用0.22μm滤膜过滤后用氮气吹扫浓缩至0.1mL即可上样GC-MS检测。检测条件如下：载气为氦气，柱子为非极性的DB-5MS柱(30m*0.25mm，0.25μm)，初始温度为40°C，以10°C/min升温至280°C，并持续4min，上样量为10μL。
以上分析得到以下结果：
失重率结果表明，实验组的平均降解率为5.348%，对照组的平均降解率为3.801%。
扫描电镜结果显示，实验组的膜表面出现了明显的裂痕、坑洞、大量细菌富集和生物被膜等现象（图2），且裂痕和坑洞有塑料膜分解的残留痕迹；而对照组的膜表面相对光滑，仅有少量的划痕和坑洞，无塑料分解的痕迹（图3）。
GC-MS结果显示，相对于对照组，实验组在25分钟后出现多个峰，经化合物文库比对显示，这些峰均为长链烷烃(约18-30个C原子)，推测是细菌降解聚乙烯后断裂生成的碳链末端（图4）。
结合分子生物学实验的测序分析结果，综合显示本发明中分离于海草床生态系统的Evansella clarkii SCSIO 43802隶属于芽孢杆菌科，其能够以聚乙烯塑料为唯一碳源生长，并且在PE膜上大量生长聚集，形成凹坑和裂痕，降解聚乙烯塑料形成长链烷烃，具有聚乙烯塑料降解的功能，该功能是首次在Evansella属细菌中发现。本发明为海洋塑料降解提供了有效的微生物资源，对海洋保护和修复具有重要的科学与现实意义。
芽孢杆菌（Evansella clarkii）SCSIO 43802的16S序列（SEQ ID NO.1）
TGCAGTCGAGCGCAGGAACAGGCTGATCCCTTCGGGGTGATGCCTGTGGAATGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCTTACAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGATCAGAAGAACCGCATGGTTCTGCTGTAAAAGTTGGGACTTGTTCCTAACACTGTAAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCATCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGTGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTCAGGGAAGAACACGTGCCGTTCGAACAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTGACCAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGTAGGAGAGGAAAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGCCTATAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTAGTGCCGCAGTTAACACATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACTCTGGAGACAGAGCGTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGACCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGTGGTACAAAGGGCAGCAAAGCCGCGAGGCCGAGCGAATCCCATAAAGCCACTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGCTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGACAG
Claims (4)
1.Evansella clarkii SCSIO 43802，保藏编号：CCTCC NO：M 20221020。
2.权利要求1所述的SCSIO 43802在降解聚乙烯塑料中的应用。
3.一种降解塑料的制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的SCSIO 43802或其菌剂作为活性成分。
4.一种降解塑料的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述的SCSIO 43802降解聚乙烯塑料。
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