CN115927271A - 一种小型化碱基编辑器及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因编辑技术领域,涉及一种碱基编辑器及其构建方法与应用。本发明通过将脱氧腺苷脱氨酶及变体融合于Cas12f1为代表的突变型核酸酶的不同位点,得到的新融合蛋白能对位于前间隔序列不同位置的腺嘌呤实现有效且高精度的A‑G碱基突变。通过本发明的方法获得的不同的插入位点为基础的融合蛋白,其可突变范围各有差异。本发明的碱基编辑器体积更小,且活性窗口多样化,可实现更广范围、更精细且安全性更高的A‑G单碱基替换,能有效拓宽单碱基编辑工具的应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域,尤其是涉及一种碱基编辑器及其构建方法与应用。
背景技术
CRISPR/Cas9为代表的新型基因编辑技术具有编辑效率高等优势,极大的推动了基因编辑技术的进步。2016年以来,研究者在CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a(Cpf1)的基础上开发出多种DNA碱基编辑工具,可在DNA水平介导高效精准的点突变,且此过程中不会产生DNA双链断裂。目前报道的碱基编辑器主要有两种:胞嘧啶碱基编辑器(CBE,可介导C·G--T·A突变)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE,可介导A·T--G·C突变)。其中,CBE是将特定的胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)与突变型核酸酶(如携带有D10A或突变的spCas9,称为nspCas9;或是功能失活型Cas12a,称为dCas12a)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子(UGI)融合,得到的融合蛋白可在sgRNA的引导下,介导C·G--T·A突变。ABE则是将定向演化后的大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(ecTadA*)二聚体或单体与突变型核酸酶(如携带有D10A或突变的spCas9,称为nspCas9;或是功能失活型Cas12a,称为dCas12a)融合,得到的融合蛋白可在sgRNA的引导下,介导A·T--G·C突变。此外,研究者还将特定的胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)、定向演化后的大肠杆菌来源的腺苷脱氨酶(ecTadA*)、突变型核酸酶(如携带有D10A或突变的spCas9,称为nCas9)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子(UGI)融合构建出ACBE,得到的融合蛋白可在sgRNA的引导下,可介导特定位点中C·G--T·A突变和A·T--G·C突变的同时发生(Nat Biotechnol,2020.38(7):861-864;BMC Biol,2020.18(1):131;Nat Biotechnol,2020.38(7):856-860;Nat Biotechnol,2020.38(7):865-869)。现有的ABE、CBE和ACBE工具主要依赖于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a(Cpf1)系统,这两种系统体积过大,Cas9和Cas12a的蛋白均接近或超过1000个氨基酸,限制了其应用前景。
近年来,研究者发现多种新的CRISPR系统如Casd12f、Cas12j、TnpB等,其大小仅为400~700氨基酸。新的CRISPR系统在哺乳动物细胞内具有明显的DNA切割活性[1-6],因此有望用于碱基编辑器小型化研究。有研究者利用失活型Un1Casd12f1(简称为dCasd12f)构建出功能性的小型化ABE(简称为miniABEs),但其碱基编辑活性不足10%,难以满足科研和临床应用的需求。
1.Karvelis,T.et al.PAM recognition by miniature CRISPR-Casd12fnucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage.NucleicAcids Research48,5016-5023(2020).
2.Kim,D.Y.et al.Efficient CRISPR editing with a hypercompact Casd12f1and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus.NatureBiotechnology(2021).
3.Xu,X.S.et al.Engineered miniature CRISPR-Cas system for mammaliangenome regulation and editing.Mol Cell 81,4333-+(2021).
4.Karvelis,T.et al.Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.Nature(2021).
5.Altae-Tran,H.et al.The widespread IS200/IS605 transposon familyencodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.Science 374,57-65(2021).
6.Wu,Z.et al.Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Casd12fnuclease.Nat Chem Biol 17,1132-1138(2021).
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种碱基编辑器及其构建方法与应用,通过将脱氧腺苷脱氨酶及突变体融合于以dCas12f为代表的突变型小型核酸酶的不同位点(N-末端、C-末端和内部插入位点),得到产生基因点突变的新融合蛋白。本发明开发出小型化的碱基编辑器ABE(简称为miniABEs),不仅可以有效实现A-G单碱基替换,而且根据脱氨酶和在以dCas12f为代表的突变型小型核酸酶中融合位点的不同,新构建的碱基编辑器还具有不同的活性窗口,因此,本发明能有效拓宽单碱基编辑工具的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明的第一个目的是提供一种碱基编辑器,为胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶置于基础dCasd12f或突变型核酸酶dCasd12f的N-末端、内部不同位点或C-末端的融合位点形成的融合蛋白miniABEs;所述基础dCasd12f的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一个实施方式中,所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*;所述TadA*的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明的一个实施方式中,所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*突变体,其中,TadA*突变体是指TadA*的V106W、V82G、K20AK21A、F148A突变。
V106W表示在第106位氨基酸位点由氨基酸V突变为W,其他做类似解释。
在本发明的一个实施方式中,所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*或TadA*突变体的5’和3’分别添加NLS序列和linker序列后获得NLS-TadA*-linker,
所述NLS-TadA*-linker置于dCasd12f的N-末端、C-末端或内部的融合位点融合形成的融合蛋白miniABEs-8e;NLS-TadA*-linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一个实施方式中,所述突变型核酸酶dCasd12f是指对基础dCasd12f进行D143R-T147R-E151A点突变组合,获得基于dCasd12f点突变的蛋白。
上述D143R-T147R-E151A表示在第143位氨基酸位点由氨基酸D突变为R,并且在第147位氨基酸位点由氨基酸T突变为R,并且在第151位氨基酸位点由氨基酸E突变为A,即表示三个位点同时突变
在本发明的一个实施方式中,所述基础dCasd12f或突变型核酸酶dCasd12f内部不同的插入位点包括第128和130位融合位点,具有明显A-G编辑活性。
在本发明的一个实施方式中,为在dCasd12f的N-末端、内部不同位点或C-末端引入酶切位点SpeI-BamHI-Xba,并融合不同的胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶,获得的融合蛋白miniBEs。
在本发明的一个实施方式中,为dCasd12f的N-末端、内部不同位点或C-末端引入酶切位点SpeI-BamHI-Xba,并融合TadA*-TadA*后,获得的融合蛋白miniABEs-2-8e;TadA*-TadA*的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的第二个目的是提供一种碱基编辑器的构建方法,包括以下步骤:将脱氧腺苷脱氨酶和dCasd12f不同位点融合,构建得到碱基编辑器。
在本发明的一个实施方式中,还可以将脱氧腺苷脱氨酶5’和3’分别添加NLS序列和linker序列。
本发明的第三个目的是提供一种碱基编辑器ABE的应用,所述碱基编辑器ABE介导A·T--G·C突变,用于DNA水平特定位点特定碱基的突变。
本发明的第六个目的是提供一种多核苷酸,编码所述碱基编辑器中。
本发明的第四个目的是提供一种载体,含有所述的多核苷酸。
本发明的第五个目的是提供一种宿主细胞,含所述碱基编辑器,或含有所述载体。
本发明的第六个目的是提供一种试剂盒,包含用于构建所述碱基编辑器的试剂。
本发明通过将脱氧腺苷脱氨酶及突变体融合于Cas12f1为代表的突变型核酸酶的不同位点,得到的新融合蛋白能对位于前间隔序列不同位置的腺嘌呤实现有效的A-G碱基突变。通过本发明的方法获得的不同的插入位点为基础的融合蛋白,其可突变范围各有差异。与现有技术相比,本发明的碱基编辑器体积更小,且活性窗口多样化,可实现更广范围、更精细且安全性更高的C-T单碱基替换和A-G单碱基替换,能有效拓宽单碱基编辑工具的应用,具有很高的应用价值。
与现有技术相比,本发明技术方案的有益效果主要体现在以下方面:
1、与已知报道相比,本发明中的以dCasd12f为基础的小型化ABE(miniABEs)具有更高的碱基编辑活性和更精准多样的活性窗口;
2、本发明找到了dCasd12f为代表的突变型小型化核酸酶内部用于脱氨基酶融合的插入位点,通过与脱氧腺苷脱氨酶及变体组合,得到的新融合蛋白能对位于前间隔序列不同位置的腺嘌呤(前间区序列邻近基序(PAM)的TTTR序列定为-3~0位,TTTR后的前间隔序列定为1-20位)实现有效的A-G碱基突变;
3、不同脱氨酶和不同插入位点为基础的融合蛋白,其可突变范围各有差异;4、提供了新的基因编辑组合物,可实现更广范围、更精细的A-G单碱基替换。
附图说明
图1为各类融合蛋白构建示意图(dCasd12f的N-和C-末端分别融合有入核信号NLS);
图2为脱氨酶为TadA*及各类突变体时构建的miniABEs--TadA*的碱基编辑特征;
图3为脱氨酶为TadA*-TadA*dimer及特定突变体时构建的miniABEs--TadA*dimer的碱基编辑特征;
图4为HEK293T细胞中利用高通量测序分析RRA d12f N-TadA*(82G)和RRA d12fCL-TadA*(82G)在>10个内源性位点的编辑活性及窗口。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例中,核苷酸序列如下所示:
dCasd12f的氨基酸序列,序列如SEQ ID NO.1所示:
MAKNTITKTLKLRIVRPYNSAEVEKIVADEKNNREKIALEKNKDKVKEACSKHLKVAAYCTTQVERNACLFCKARKLDDKFYQKLRGQFPDAVFWQEISEIFRQLQKQAAEIYNQSLIELYYEIFIKGKGIANASSVEHYLSDVCYTRAAELFKNAAIASGLRSKIKSNFRLKELKNMKSGLPTTKSDNFPIPLVKQKGGQYTGFEISNHNSDFIIKIPFGRWQVKKEIDKYRPWEKFDFEQVQKSPKPISLLLSTQRRKRNKGWSKDEGTEAEIKKVMNGDYQTSYIEVKRGSKICEKSAWMLNLSIDVPKIDKGVDPSIIGGIAVGVKSPLVCAINNAFSRYSISDNDLFHFNKKMFARRRILLKKNRHKRAGHGAKNKLKPITILTEKSERFRKKLIERWACEIADFFIKNKVGTVQMENLESMKRKEDSYFNIRLRGFWPYAEMQNKIEFKLKQYGIEIRKVAPNNTSKTCSKCGHLNNYFNFEYRKKNKFPHFKCEKCNFKENAAYNAALNISNPKLKSTKEEP;
SV-40-NLS的氨基酸序列,序列如SEQ ID NO.2所示:
PKKKRKVGIHGVPAA;
Nucleoplasmin NLS的氨基酸序列,序列如SEQ ID NO.3所示:
KRPAATKKAGQAKKKK;
Nucleoplasmin NLS-linker的氨基酸序列,序列如SEQ ID NO.4所示:
KRPAATKKAGQAKKKKEFTSGSG;
sgRNA的骨架序列,序列如SEQ ID NO.5所示:
ACCGCTTCACCGAGTGAAGGTGGGCTGCTTGCATCAGCCTAATGTCGAGAAGTGCTTTCTTCGGAAAGTAACCCTCGAAACAAAgaaaGGAATGCAACNNNNNNNttttatttttt;
NLS-TadA*-linker的氨基酸序列,序列如SEQ ID NO.6所示:
TSGSGPKKKRKVAAARSGPKKKRKVAAAGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGAR;
TadA*-TadA*的氨基酸序列,序列如SEQ ID NO.7所示:
TSGSGPKKKRKVAAAGSGPKKKRKVAAAGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGSSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTDAR;
TadA*的氨基酸序列,序列如SEQ ID NO.8所示:
MSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD。
实施例1
构建融合蛋白
合成人源密码子优化的SV-40-NLS-dCasd12f-Nucleoplasmin NLS-linker的开放阅读框(ORF),其中dCasd12f的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,SV-40-NLS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,Nucleoplasmin NLS的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,NucleoplasminNLS-linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本实施例中采用的dCasd12f是un1Casd12f1的突变体(D326A和D510A双点突变,丧失DNA切割活性),之后通过点突变在dCasd12f的N-末端、内部不同位点以及C-末端引入酶切位点(SpeI-BamHI-XbaI)以融合不同的脱氨酶(位点信息详见表1),获得融合蛋白miniBEs用于后续实验(图1)。
本文中类似“D326A”的表述中,326表示第28位氨基酸位点,D表示第326位氨基酸位点突变前的氨基酸,A表示第326位氨基酸位点突变后的氨基酸,D、A均为氨基酸的缩写表达方式,即D326A表示第326位氨基酸位点由天冬氨酸突变为丙氨酸;上文或下文中其他类似“D326A”的表达方式均做与此相似的解释。
本实施例中利用2A肽段共表达融合蛋白与绿色荧光蛋白EGFP,用以指示融合蛋白的表达情况,并用于后续的流式细胞分选。
本实施例中还构建sgRNA表达载体(sgRNA的骨架序列如SEQ ID NO.5所示,NNNN为sgRNA的靶序列),在表达特定sgRNA的同时表达UGI-2A-mCherry。UGI可以抑制尿嘧啶糖基化酶的活性,提高C-T突变效率,红色荧光蛋白mCherry用于指示载体表达情况,可用于后续的流式细胞分选。
表1 dCasd12f内部不同的插入位点
实施例2
不同miniABEs-TadA*与sgRNA表达载体转染HEK293T细胞检测点突变频率及特点
研究发现Casd12f的特定点突变及组合可增强其活性,这其中D143R-T147R-E151A点突变组合(简称为RRA d12f)效果明显。将NLS-TadA*-linker(NLS-TadA*-linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)融合在RRA d12f的N-末端、内部不同位点以及C-末端(表1)获得不同的miniABEs-TadA*。此外,TadA*中还分别引入V106W、V82G、K20AK21A、F148A突变,获得miniABEs-TadA*(106W)、miniABEs-TadA*(82G)、miniABEs-TadA*(20A21A)和miniABEs-TadA*(148A)。为评估其编辑活性,将不同的miniABEs-TadA*与单向导RNA(sgRNA)共转染至培养的293T细胞。细胞培养72小时后,通过FACS收集同时表达EGFP和mCherry的双阳性细胞。
本实施例中使用的sgRNA为d12f-sg89(序列为CACACACACAGTGGGCTACC,PAM序列为TTTG)。每组n=3个重复。
收集的双阳性细胞抽提基因组,使用可特异性扩增d12f-sg89位点信息的引物进行定向PCR。PCR产物通过sanger测序验证不同miniABEs在d12f-sg89位点的编辑效率。
结果显示,N-末端位点以及d12f内部的128和130位点融合NLS-TadA*-linker后可获得具有明显A-G编辑活性的miniABEs-TadA*,且活性窗口非常特异为A4(图2)。结果显示,N-末端位点以及d12f内部130位点融合的miniABEs-TadA*(106W)具有明显A-G编辑活性,且活性窗口非常特异为A4(图2)。结果显示,N-末端位点、C末端位点以及d12f内部128和130位点融合的miniABEs-TadA*(82G)具有明显A-G编辑活性,其中C末端位点融合的RRA d12f-CL-TadA*(82G)活性窗口为A18,其余活性窗口为A4(图2)。结果显示,C-末端位点融合的miniABEs-TadA*(20A21A)具有明显A-G编辑活性,且活性窗口非常特异为A18(图2)。结果显示,miniABEs-TadA*(148A)缺乏明显A-G编辑活性(图2)。
实施例3
不同miniABEs-TadA*dimer与sgRNA表达载体转染HEK293T细胞检测点突变频率及特点
传统ABEs的构建是将异源/同源TadA脱氨酶野生型/突变体的表达序列串联(TadA-TadA),然后融合于Cas表达序列的不同位点。因此本发明中也将TadA*以相似的方式构建成TadA*-TadA*(TadA*-TadA*的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示),融合在dCasd12f的N-末端、内部不同位点以及C-末端(表1)获得不同的miniABEs-TadA*dimer。此外,还在TadA*dimer中的特定单体中引入失活突变,获得miniABEs-TadA*(LOF)-TadA*。为评估其编辑活性,将不同的miniABEs-TadA*dimer与单向导RNA(sgRNA)共转染至培养的293T细胞。细胞培养72小时后,通过FACS收集同时表达EGFP和mCherry的双阳性细胞。本实施例中使用的sgRNA为d12f-sg89(序列为CACACACACAGTGGGCTACC,PAM序列为TTTG)。每组n=2个重复。
收集的双阳性细胞抽提基因组,使用可特异性扩增d12f-sg89位点信息的引物进行定向PCR。PCR产物通过sanger测序验证不同miniABEs-TadA*dimer在d12f-sg89位点的编辑效率。
结果显示,N-末端位点、C-末端的两种位点以及d12f内部的128和130位点融合得到的miniABEs-TadA*dimer具有明显A-G编辑活性,且活性窗口多为A4。其中N末端融合的RRA d12f N-TadA*-TadA*具有最高活性,其在A4的A-G编辑效率>30%,并在A18有>10%的编辑活性(图3)。N-末端位点以及d12f内部的128和130位点融合得到的miniABEs-TadA*(LOF)-TadA*具有明显A-G编辑活性,其活性窗口为A4(图3)。
实施例4
miniABEs-TadA*优选例在多种sgRNA位点的点突变频率及特点
本实施例中优选RRA d12f N-TadA*(82G)和RRA d12f CL-TadA*(82G),两者在d12f-sg89位点处具有不同的活性窗口(分别为A4和A18)。为评估其编辑活性,将RRA d12fN-TadA*(82G)或RA d12f CL-TadA*(82G)与单向导RNA(sgRNA)共转染至培养的293T细胞。细胞培养72小时后,通过FACS收集同时表达EGFP和mCherry的双阳性细胞。
本实施例中,RRA d12f N-TadA*(82G)使用的sgRNA包括
d12f-sg5(序列为GGCAAGGGTCTTGATGCATC),
d12f-sg53(序列为GCCATGGTGAAGGTGAAATC),
d12f-sg70(序列为ACAAGTTCAGAATCACCTTA),
d12f-sg89(序列为CACACACACAGTGGGCTACC),
d12f-sgEMX(序列为TCCTCCGGTTCTGGAACCAC),
d12f-sg13(序列为ACAAAGAAACCAGCAGTGGC),
d12f-sg18(序列为GAAATATGACTGGAAGTAAA),
d12f-sg24(序列为CTGAGATTTGCGAAGAGTTA),
d12f-sg34(序列为CATACAGGGCTCTGTACCCA),
d12f-sg46(序列为GAGAGACCGCTCAGGCTGGA),
d12f-sg55(序列为AAGAAAGCTACAGGAAAGCA),
d12f-sg87(序列为AATAAGTCTTACCACGTGTC)和
d12f-sg72(序列为CACATAGGCCATTCAGAAAC)。
RRA d12f CL-TadA*(82G)使用的sgRNA包括
d12f-sg17(序列为AGAGCAGCGATTGTAAGGAG),
d12f-sg21(序列为CCCCCACAGGATTGTAATAA),
d12f-sg5(序列为GGCAAGGGTCTTGATGCATC),
d12f-sg53(序列为GCCATGGTGAAGGTGAAATC),
d12f-sgEMX(序列为TCCTCCGGTTCTGGAACCAC),
d12f-sg24(序列为CTGAGATTTGCGAAGAGTTA),
d12f-sg34(序列为CATACAGGGCTCTGTACCCA),
d12f-sg55(序列为AAGAAAGCTACAGGAAAGCA),
d12f-sg66(序列为GAGGGAGACACAAGTTGATA),
d12f-sg6(序列为CCCTGGCTACCTCCCCTACC),
d12f-sg72(序列为CACATAGGCCATTCAGAAAC)。
收集的双阳性细胞抽提基因组,使用可特异性扩增d12f-sg89位点信息的引物进行定向PCR。PCR产物通过sanger测序验证不同miniCBEs-YE1在d12f-sg89位点的编辑效率。每组n=3个重复。
结果显示,RRA d12f N-TadA*(82G)在多种位点处均有明显的A-G编辑活性,且具有精准的活性窗口A4。RRA d12f CL-TadA*(82G)在多种位点处均有明显的A-G编辑活性(图4a),其活性窗口主要为A16-A17,在A18位点有一定活性(图4b)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种碱基编辑器,其特征在于,为胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶置于基础dCasd12f或突变型核酸酶dCasd12f的N-末端、内部不同位点或C-末端的融合位点形成的融合蛋白miniABEs;所述基础dCasd12f的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种碱基编辑器,其特征在于,
所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*,所述TadA*的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示;或,
所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*突变体,其中,TadA*突变体是指TadA*的V106W、V82G、K20AK21A、F148A突变;或,
所述脱氧腺苷脱氨酶选择为TadA*或TadA*突变体的5’和3’分别添加NLS序列和linker序列后获得NLS-TadA*-linker,
所述NLS-TadA*-linker置于dCasd12f的N-末端、C-末端或内部的融合位点融合形成的融合蛋白miniABEs-8e;NLS-TadA*-linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的一种碱基编辑器,其特征在于,
所述突变型核酸酶dCasd12f是指对基础dCasd12f进行D143R-T147R-E151A点突变组合,获得基于dCasd12f点突变的蛋白;
所述基础dCasd12f或突变型核酸酶dCasd12f内部不同的插入位点包括第128和130位融合位点。
4.根据权利要求1所述的一种碱基编辑器,其特征在于,为在dCasd12f的N-末端、内部不同位点或C-末端引入酶切位点SpeI-BamHI-Xba,并融合不同的胞苷脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶,获得的融合蛋白miniBEs;
优选地,为dCasd12f的N-末端、内部不同位点或C-末端引入酶切位点SpeI-BamHI-Xba,并融合TadA*-TadA*后,获得的融合蛋白miniABEs-2-8e;TadA*-TadA*的氨基酸序列如SEQID NO.7所示。
5.权利要求1-4中任一所述的一种碱基编辑器的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:将脱氧腺苷脱氨酶和dCasd12f不同位点融合,构建得到碱基编辑器;
优选地,将脱氧腺苷脱氨酶5’和3’分别添加NLS序列和linker序列。
6.权利要求1-4中任一所述的一种碱基编辑器ABE的应用,其特征在于,所述碱基编辑器ABE介导A·T--G·C突变,用于DNA水平特定位点特定碱基的突变。
7.一种多核苷酸,其特征在于,编码权利要求1-4中任一所述的碱基编辑器。
8.一种载体,其特征在于,含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种宿主细胞,其特征在于,含权利要求1-4中任一所述的碱基编辑器,或含有权利要求8所述的载体。
10.一种试剂盒,其特征在于,包含用于构建权利要求1-4中任一所述的碱基编辑器的试剂。
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- 2022-09-29 CN CN202211204191.4A patent/CN115927271A/zh active Pending
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CN116751799A (zh) * | 2023-06-14 | 2023-09-15 | 江南大学 | 一种多位点双重碱基编辑器及其应用 |
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