CN115920987B - 一种基于细菌富集的药敏检测芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于细菌富集的药敏检测芯片，属于离心微流控领域，包括：N个分离检测单元，废液池，流体通道，M个定量池，M条流体气路以及检测试剂废液池；分离检测单元包括：加样池，以及设置于加样池远心端的富集池；加样池的近心端设置有加样池加样孔；废液池设置于分离检测单元下方，且二者之间设置有第一阀门；流体通道呈螺旋状，定量池沿流体通道间隔设置，流体通道远心端和近心端分别设置检测试剂废液池和检测试剂加样孔；流体气路的近心端设置有通气孔，远心端与富集池连通；定量池通过第二阀门与流体气路连通；第一阀门和第二阀门均由弹性材料制成，呈片状，且中间设置有切口。本发明能够缩短药敏检测的流程和用时，并降低成本。

Description

一种基于细菌富集的药敏检测芯片

技术领域

本发明属于离心微流控领域，更具体地，涉及一种基于细菌富集的药敏检测芯片。

背景技术

微流控(Microfluidics)是指在亚毫米尺度上操控液体。它将生物和化学领域所涉及的基本操作单位，甚至于把整个化验室的功能，包括采样、稀释、反应、分离、检测等集成在一个小型芯片上，故又称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)。这种芯片一般是由各种储液池和相互连接的微通道网络组成，能很大程度缩短样本处理时间，并通过精密控制液体流动，实现试剂耗材的最大利用效率。微流控为生物医学研究、药物合成筛选、环境监测与保护、卫生检疫、司法鉴定、生物试剂的检测等众多领域的应用提供了极为广阔的前景。特别地，微流控能很好地满足即时诊断(Point-of-care testing，POCT)小型化仪器的需求，所以被广泛的应用在POCT中。在产业化中，微流控一般分为以下几大类型：压力(气压或者液压)驱动式微流控、离心微流控、液滴微流控、数字化微流控、纸质微流控等。

离心微流控隶属于微流控的一个分支，通过离心力来驱动液体的流动，特指通过转动离心微流控装置来使用离心力在亚毫米尺度上操控液体的装置。它将生物和化学领域所涉及的基本操作单位集成在一个小型碟式的芯片上。除了微流控所特有的优点外，由于离心微流控只需要一个电机来提供液体操控所需要的力，所以整个设备更为简洁紧凑。

在离心式微流控中常会添加各种主动或者被动阀控，通过这些阀门对液体流动进行控制，从而完成液体的转移、混合以及反应。主动阀控技术是通过在平台上外设其他机械结构，通过物理方法来阻断或开启流道。主动阀控技术需要附带复杂的外部机械结构来实现开关功能，这极大的增加了整个平台的成本，同时也让离心平台的便携性大打折扣，在离心平台上外设机械结构也会给平台带来安全隐患，这些高成本、复杂的因素都影响了主动阀控技术的实际应用。目前应用更为广泛的是直接装载在芯片上被动阀，而应用最多的被动阀是基于液体表面张力的毛细阀和虹吸阀，毛细被动阀依靠截面或表面润湿性质的突变使液体的自由液面产生阻力，从而阻止液体继续向下游流动，只有当转速超过临界值时，液体才能突破毛细被动阀，从而形成一个通过离心转速控制的流体开关。但是当液体突破毛细阀后液体会将经过的微通道润湿进而破坏毛细阀本身疏水特性，若液体中内容物过大也可能直接将毛细阀堵死，这些潜在破坏毛细阀的因素都增加了芯片的加工工艺、表面处理和长期保存等方面的困难。虹吸阀依赖于毛细力和离心力的平衡关系，在离心力小的时候，腔室内液体由毛细力牵引没过虹吸管道最高处即最靠近离心圆心处，直至虹吸管道内充满液体；随后增大离心速度，在离心力的作用下，虹吸管道内部虹吸流动发生，液体全部流入后面的腔室内，进而完成液体的顺序分发或样本的分离。因此，毛细流动是虹吸阀对液体操作的必要前提。由于聚合材料表面的疏水性，虹吸管道中的毛细力比较小，往往需要进行亲水处理增加管道的毛细力，常见的亲水处理的方法主要包括离子束辐射、等离子体处理、化学处理的方法。但是这些复杂的处理方式难以保证虹吸阀的重复性和可靠性。

此外，现有的药敏检测芯片，往往需要先通过细菌培养的方式使样品中的细菌浓度达到一定的水平，再利用检测试剂进行检测，但该细菌培养的过程耗时较长，且成本较高。

发明内容

针对现有技术的缺陷和改进需求，本发明提供了一种基于细菌富集的药敏检测芯片，其目的在于，缩短药敏检测的流程和用时，并降低成本。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种基于细菌富集的药敏检测芯片，包括：N个分离检测单元，废液池，流体通道，M个定量池，M条流体气路以及检测试剂废液池；

分离检测单元包括：加样池，以及设置于加样池远心端且与加样池连通的富集池；加样池的近心端设置有用于添加细菌样本的加样池加样孔；

废液池设置于分离检测单元下方，且废液池与分离检测单元之间设置有第一阀门；

流体通道呈螺旋状，M个定量池沿流体通道间隔设置，检测试剂废液池设置于流体通道远心端且与流体通道连通；流体通道近心端设置有检测试剂加样孔；

流体气路的近心端设置有通气孔，远心端与富集池连通；每一个定量池通过第二阀门与一条流体气路连通；

其中，M≥1，N≥1。

进一步地，第一阀门和第二阀门均为不具有各向异性的弹性阀；弹性阀由弹性材料制成，呈片状，且中间设置有切口。

进一步地，分离检测单元中，加样池和富集池不在同一水平面，且二者之间通过斜面相连。

进一步地，加样池和富集池之间通过连接块相连，且斜面为连接块的底面。

进一步地，连接块为三角柱，且通过三角柱小块拼接而成。

进一步地，本发明提供的基于细菌富集的药敏检测芯片，还包括：与废液池和检测试剂废液池均连通的放射气路，放射气路还通过通气孔与空气连通。

进一步地，本发明提供的药敏检测芯片为圆盘式芯片，且从上至下依次为顶盖、加样层、富集层、阀门层、功能层和底盖层；

通气孔、加样池加样孔以及检测试剂加样孔设置于顶盖；

加样池设置于加样层；

富集池以及流体气路设置于富集层；

第一阀门和第二阀门设置于阀门层；

定量池、废液池、流体通道、检测试剂废液池以及放射气路设置于功能层。

进一步地，加样池为纺锤形。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案，能够取得以下有益效果：

(1)本发明提供的基于细菌富集的药敏检测芯片，在加样池的远心端设置富集池，向加样池中加入细菌样本后，细菌会在离心场作用下，在富集池中完成富集；由于富集池同时通过流体气路与检测试剂定量池连通，因此，检测试剂进入富集池后，即可与富集后的细菌混合并反应，完成检测；由于本发明提供的药敏检测芯片，通过细菌富集而非培养的方式实现细菌检测，检测时间大为缩短，检测成本也大大降低。

(2)本发明提供的基于细菌富集的药敏检测芯片，在其优选方案中，设置于分离检测单元与废液池之间的阀门，以及设置于检测试剂定量池与流体气路之间的阀门，均为不具有各向异性的弹性阀，该弹性阀具体由弹性材料制成，呈片状且中间设有切口，当所受压力超过弹性阀的阈值时，其中的切口会张开，使弹性阀处于打开的状态；当所受压力未超过弹性阀的阈值时，切口会重新闭合，使弹性阀处于关闭的状态。基于该弹性阀，本发明无需在局部进行亲疏水处理，也无需集成大量阀控，仅需借助离心功能托盘即可控制阀们的打开或关闭，大大简化了芯片加工工艺，并进一步降低了芯片加工成本。

(3)本发明提供的基于细菌富集的药敏检测芯片，在其优选方案中，分离检测单元中的加样池和富集池不在同一水平面，由此能够通过离心有效实现细菌样本中细菌固体与液体的分离，使细菌固体在富集池中完成浓缩；同时，由于离心作用会使样本沿向外运动，本发明利用一斜面连接加样池和富集池，能够较好地引导细菌固体进入富集池。

(4)本发明提供的基于细菌富集的药敏检测芯片，在其优选方案中，利用三角柱状的连接块提供用于连接分离检测单元中的加样池和富集池的斜面，并且通过三角柱小块拼接加工该连接块，在保证实现相关功能的同时简化加工。

(5)本发明提供的用于细菌富集的药敏检测芯片，在其优选方案中，设计了用于连通空气和废液池/检测试剂加样池的放射气路，由此能够避免在检测过程，废液池/检测试剂废液池中产生负压，保证了检测的顺利进行。

(6)本发明提供的用于细菌富集的药敏检测芯片，在其优选方案中，加样池设计为纺锤形，该结构设计既能保证细菌在富集池中富集的效果，又能避免细菌在加样池内壁残留而造成样本浪费。

附图说明

图1为本发明实施例提供的基于细菌富集的药敏检测芯片的三维结构图；

图2为本发明实施例提供的单个分离检测单元示意图；

图3为本发明实施例提供的检测试剂流通路径示意图；

图4为本发明实施例提供的单个检测试剂定量池与富集池的连接关系示意图；

图5为本发明实施例提供的芯片的多层结构示意图；

图6为本发明实施例提供的弹性阀示意图；其中，(a)为弹性阀关闭的状态，(b)为弹性阀打开的状态，(c)为弹性阀打开后又关闭的状态；

图7为本发明实施例提供的细菌富集和药敏检测示意图；

图8为本发明实施例提供的3种不同浓度细菌检测结果示意图；

图9为本发明实施例提供的浓度为1×101CFU/mL的细菌检测结果；

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或者结构，其中：

1-关闭状态下的弹性阀，2-打开状态下的弹性阀，3-重新关闭后的弹性阀；

11-顶盖；111-通气孔，112-加样池加样孔，113-检测试剂加样孔；

12-加样层；121-加样池，122-连接块；

13-富集层；131-富集池，132-流体气路；

14-阀门层；141-第二阀门，142-第一阀门；

15-功能层；151-定量池，152-废液池，153-流体通道，154-检测试剂废液池，155-放射气路；

16-底盖层。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

在本发明中，本发明及附图中的术语“第一”、“第二”等(如果存在)是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。

为了解决现有的药敏检测芯片在进行检测之前需要先进行细菌培养，因而检测时间长、检测成本高的技术问题，本发明提供了一种基于细菌富集的药敏检测芯片，其整体思路在于：在芯片中设计同时与细菌样本加样池和检测试剂定量池连通的富集池，使细菌样本中的细菌固体能够从细菌悬液中分离出并在富集池中富集浓缩，再与检测试剂进行混合反应，该过程不依赖于细菌培养，从而能够有效缩短检测时间并降低检测成本。

以下为实施例。

实施例1：

一种基于细菌富集的药敏检测芯片，如图1～图5所示，包括：6个分离检测单元，废液池152，流体通道153，6个定量池151，6条流体气路132以及检测试剂废液池154。

参阅图1和图2，分离检测单元包括：加样池121，以及设置于加样池121远心端且与加样池121连通的富集池131；加样池121的近心端设置有用于添加细菌样本的加样池加样孔112；通过加样池加样孔112向加样池121中添加细菌样本后，通过离心，细菌样本中的细菌会在离心场的作用下，从细菌样本中分离出来，并进入富集池131，在富集池131中完成富集浓缩。

如图2所示，为了便于细菌的分离和富集，本实施例，加样池121的水平位置高于富集池131的水平位置，并且考虑到在离心作用下，细菌会受到向外的力，为了较好地引导加样池121中的细菌进入富集池131，加样池121与富集池131之间通过一斜面相连；具体地，如图2所示，通过在加样池121与富集池131设置一三角柱状的连接块122，由该连接块122的底面提供二者之间的连接斜面；连接块122可以使用包括但不限于CNC(ComputerisedNumerical Control Machine)、二氧化碳激光切割机、3D打印和注模成型等加工方法，或使用三角柱小块进行拼接，为便于加工，本实施例中，该三角柱状的连接块122具有由三角柱小块拼接而成。应当说明的是，在本发明其他的一些实施例中，在提供连接斜面的情况下，连接块也可设置为其他易于加工的形状，具体的加工方式也可根据实际需要灵活选择。

细菌富集倍数为加入加样池121的样本体积与富集池131容积的比值，相应的，可以通过设计不同体积的加样池121与富集池131完成不同倍数的富集。可选地，本实施例中，加样池121容积为700μL，富集池131的容积为0.55μL；加入样本的体积为550μL，在该条件下富集倍数为1000倍。

为了在保证细菌的富集效果，并避免细菌在加样池121的内壁上残留，造成细菌样本的浪费，如图1和图2所示，本实施例中，加样池121具体为两端细、中间粗的纺锤形，需要说明的是，此为本实施例优选的实施方式，不应理解为对本发明的唯一限定，在本发明其他的一些实施例中，加样池121也可按需设置为其他形状。

如图1所示，废液池152设置于分离检测单元下方，且废液池152与分离检测单元之间设置有第一阀门142。当细菌在富集池131中完成富集后，随着离心转速提高，提供的离心力大于该阀门的阈值时，该阀门将打开，加样池121中多余的液体能通过弹性阀进入废液池152。如图1所示，本实施例中，具体设计了3个废液池152，每一个废液池152与两个分离检测单元相连通。需要说明的是，此处关于废液池152的数量说明，仅为示例性的描述，不应理解为对本发明的唯一限定，在实际应用中，废液池152的数量、形状、容积等，可根据实际的加工要求、容纳要求的相应设定。

参阅图3，流体通道153呈螺旋状，6个定量池151沿流体通道153由近及远地间隔设置，检测试剂废液池154设置于流体通道153远心端且与流体通道153连通；流体通道153近心端设置有检测试剂加样孔113。从检测试剂加样孔113向流体通道153中加入检测试剂后，打开离心托盘，在离心力的作用下检测试剂依次填满这些检测试剂定量池151，多余的检测试剂会进入检测试剂废液池154。

参阅图1、图3和图4，流体气路132的近心端设置有通气孔111，远心端与富集池131连通；每一个定量池151通过第二阀门141与一条流体气路132连通。当检测试剂填满检测试剂定量池151后，增大离心转速，加大离心力，第二阀门141将打开，完成定量的检测试剂顺着流体气路132分别进入富集池131，与其中已经完成富集的细菌混合并完成检测。

参阅图1，为了避免废液腔/检测试剂废液腔在检测过程中出现负压，影响检测的正常进行，本实施例中，进一步在芯片中设计了放射气路155，该放射气路155与每一个废液池152，以及检测试剂废液池154相连通，同时通过通气孔111与空气相连通；该放射气路155的设计，实现了废液池152/检测试剂废液池154与空气之间的连通。

参阅图5，为了在保证功能实现的基础上，便于加工，本实施例所提供的基于细菌富集的药敏检测芯片，具体为圆盘式芯片，且从上至下依次为顶盖11、加样层12、富集层13、阀门层14、功能层15和底盖层16；

通气孔111、加样池加样孔112以及检测试剂加样孔113设置于顶盖11；

加样池121以及连接块122设置于加样层12；

富集池131以及流体气路132设置于富集层13；

第一阀门142和第二阀门141设置于阀门层14；

定量池151、废液池152、流体通道153、检测试剂废液池154以及放射气路155设置于功能层15；

同样需要说明的是，图5所示的多层结构，仅为本实施例一种可选的实施方式，在实际应用中，芯片的具体层次结构，可灵活调整，例如，加样层与富集层的上下位置可互换。同样地，芯片中，分离检测单元、流体气路、检测试剂定量池等的数量，也可在实际应用中按需设置。

总体而言，本实施例通过在芯片中设计与加样池和检测试剂定量池均连通的富集池，通过细菌富集的方式是细菌浓缩，相比于传统的基于细菌培养的检测方式，能够有效缩短检测时间，并降低检测成本。

为了进一步降低检测成本，本实施例进一步对芯片中的阀门进行了改进，具体地，分离检测单元与废液池152之间的阀门，以及设置于检测试剂定量池151与流体气路132之间的阀门，均为不具有各向异性的弹性阀，该弹性阀具体由橡胶、硅胶等弹性材料制成，呈片状且中间设有切口，如图6所示；当弹性阀的上下压力不超过弹性阀的阈值的，切口闭合，弹性阀处于关闭状态，如图6中的(a)所示，左侧和右侧分别为关闭状态下的弹性阀1的主视图和侧视图，1-1为弹性阀横切面；当所受的压力当所受压力超过弹性阀的阈值时，其中的切口会张开，使弹性阀处于打开的状态，如图6中的(b)所示，左侧和右侧分别为打开状态下的弹性阀2的主视图和侧视图，2-1为弹性阀打开后的横切面；当所受压力未超过弹性阀的阈值时，切口会重新闭合，使弹性阀重新回到关闭的状态，如图6中的(c)所示，左侧和右侧分别为重新关闭状态下的弹性阀3的主视图和侧视图，3-1为弹性阀再次关闭的横切面。本实施例所采用的弹性阀可重复使用，基于该弹性阀，本实施例无需在局部进行亲疏水处理，也无需集成大量阀控，仅需借助离心功能托盘即可控制阀们的打开或关闭，大大简化了芯片加工工艺，并进一步降低了芯片加工成本。

本实施例中，在细菌富集的过程中，当离心转速为1200-2800RPM时，第一阀门142所受离心力未超过其阈值，芯片可完成固液样本的分层；当旋转转速为2000-3000RPM时，第一阀门142打开，芯片能完成多余废液的排放，达到富集的目的。

在检测的过程中，当旋转转速为500-1000RPM时，第二阀门141处于关闭的状态，芯片能完成检测试剂的定量；当旋转转速为1000-1500RPM时，第二阀门141打开，富集池131中检测试剂与富集溶液混合从而完成检测。

以下结合本实施例在两个应用实例中的应用，对本实施例所提供芯片的工作过程及效果做进一步的解释说明。

应用实施例1：

利用搭载弹性阀离心微流控芯片完成细菌富集检测，过程如图7所示，具体如下：

(1)细菌加样：通过加样池加样孔向六个加样池中加入不同浓度的大肠杆菌溶液，浓度分别为：600μL1×10¹CFU/mL，1×10²CFU/mL，1×10³CFU/mL，1×10⁴CFU/mL，1×10⁵CFU/mL，1×10⁷CFU/mL。

(2)细菌富集：启动离心至转速达到1500RPM，持续离心5分钟后停止离心；这个过程中离心压力不足以打开弹性阀，细菌在离心力的作用下，只会从加样池进入下游的5.5μL大小的富集池从而完成1000倍富集。

(3)排出废液：再次启动离心至转速达到2000RPM，该过程持续10分钟，在该离心转速下弹性阀打开，在富集池多余的细菌培养液会通过打开的弹性阀进入下游的废液池，停止离心后弹性阀再次关闭。

(4)检测试剂加入与定量：将检测试剂从检测试剂加入孔加入。启动离心托盘500RPM，持续30秒，此时离心力带来的压力不足以打开弹性阀，检测试剂将在定量池完成定量。

(5)混合检测：启动离心托盘1500RPM，持续1分钟，此时离心力带来的压力足以打开弹性阀，弹性阀打开后，检测试剂顺着流体气路进入富集池与细菌溶液混合。

(6)细菌培养与检测：芯片封装好，放入细菌培养箱，每隔半个小时观察富集腔室颜色变化。

加入检测试剂后可以通过裸眼直接观察细菌的生长情况，结果如图8所示，1×10⁵CFU/mL，1×10⁷CFU/mL等三种浓度的细菌在加入检测试剂后立即变色；1×10⁴CFU/mL培养半个小时后发生颜色变化，符合临床诊断标准的细菌浓度能够快速检出。1×10¹CFU/mL细菌在培养7个小时后颜色发生变化，说明了本实施例提供的药敏检测芯片具有极低的细菌检出限。

应用实例2：

利用搭载弹性阀离心微流控芯片完成细菌富集并完成抗生素最小抑制剂浓度的测定，过程如图7所示，具体如下：

细菌加样：通过加样池加样孔向六个加样池中加浓度均为600μL1×102CFU/mL的大肠杆菌溶液。

细菌富集：启动离心至转速达到1500RPM，持续离心5分钟后停止离心。这个过程中离心压力不足以打开弹性阀，细菌会在离心力的作用下，只会从加样池进入下游的5.5μL大小的富集池从而完成1000倍富集，使细菌浓度到达1×105CFU/mL。

排出废液：再次启动离心至转速达到2000RPM，该过程持续10分钟，在该离心转速下弹性阀打开，在富集池多余的细菌培养液会通过打开的弹性阀进入下游的废液池，停止离心后弹性阀再次关闭。

检测试剂加入与定量：将检测试剂与抗生素的混合溶液从检测试剂加入孔加入。启动离心托盘500RPM，持续30秒，此时离心力带来的压力不足以打开弹性阀，在该实施案例下，定量池大小依次增大，混合试剂将在定量池完成定量。

混合检测：启动离心托盘1500RPM，持续1分钟，此时离心力带来的压力足以打开弹性阀，弹性阀打开后，检测试剂顺着气路进入富集腔室与细菌溶液混合，最终形成具有抗生素浓度梯度的混合溶液。

细菌培养与检测：芯片封装好，放入细菌培养箱，每隔半个小时观察富集池颜色变化。结果如图9所示，上方为包含细菌的富集池，下方为不包含细菌的对照组。通过颜色变化的断点判断该抗生素对细菌的最小抑制浓度。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于细菌富集的药敏检测芯片，其特征在于，包括：N个分离检测单元，废液池，流体通道，M个定量池，M条流体气路以及检测试剂废液池；

所述分离检测单元包括：加样池，以及设置于所述加样池远心端且与所述加样池连通的富集池；所述加样池的近心端设置有用于添加细菌样本的加样池加样孔；

所述废液池设置于所述分离检测单元下方，且所述废液池与所述分离检测单元之间设置有第一阀门；

所述流体通道呈螺旋状，所述M个定量池沿所述流体通道间隔设置，所述检测试剂废液池设置于所述流体通道远心端且与所述流体通道连通；所述流体通道近心端设置有检测试剂加样孔；

所述流体气路的近心端设置有通气孔，远心端与富集池连通；每一个定量池通过第二阀门与一条流体气路连通；

其中，M≥1，N≥1。

2.如权利要求1所述的基于细菌富集的药敏检测芯片，其特征在于，所述第一阀门和所述第二阀门均为不具有各向异性的弹性阀；所述弹性阀由弹性材料制成，呈片状，且中间设置有切口。

3.如权利要求1或2所述的基于细菌富集的药敏检测芯片，其特征在于，所述分离检测单元中，所述加样池和所述富集池不在同一水平面，且二者之间通过斜面相连。

4.如权利要求3所述的基于细菌富集的药敏检测芯片，其特征在于，所述加样池和所述富集池之间通过连接块相连，且所述斜面为所述连接块的底面。

5.如权利要求4所述的基于细菌富集的药敏检测芯片，其特征在于，所述连接块为三角柱，且通过三角柱小块拼接而成。

6.如权利要求1～5任一项所述的基于细菌富集的药敏检测芯片，其特征在于，还包括：与所述废液池和所述检测试剂废液池均连通的放射气路，所述放射气路还通过通气孔与空气连通。

7.如权利要求6所述的基于细菌富集的药敏检测芯片，其特征在于，所述药敏检测芯片为圆盘式芯片，且从上至下依次为顶盖、加样层、富集层、阀门层、功能层和底盖层；

所述通气孔、所述加样池加样孔以及所述检测试剂加样孔设置于所述顶盖；

所述加样池设置于所述加样层；

所述富集池以及所述流体气路设置于所述富集层；

所述第一阀门和所述第二阀门设置于所述阀门层；

所述定量池、所述废液池、所述流体通道、所述检测试剂废液池以及所述放射气路设置于所述功能层。

8.如权利要求1～5任一项所述的基于细菌富集的药敏检测芯片，其特征在于，所述加样池为纺锤形。