CN115895927A

CN115895927A - 一种酵母中过量供应胞质乙酰辅酶a的方法及其应用

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Publication number: CN115895927A
Application number: CN202310058275.XA
Authority: CN
Inventors: 戴宗杰; 刘琪; 张媛媛; 王钦宏
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tiangong Biotechnology Tianjin Co ltd; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2023-01-17
Filing date: 2023-01-17
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2043-01-17
Also published as: CN115895927B

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及过量供应胞质乙酰辅酶A的方法及相关菌株构建方法。本发明首先从胞内乙酰辅酶A的多种去向分析，以酶工程手段降低了乙酰辅酶A流向脂质合成的通量，既有效增加了胞质乙酰辅酶A水平又不影响菌株生长；更进一步，本发明还表征了解脂耶氏酵母内源的过氧化物酶/线粒体肉碱酰基转移途径，这在有效增加胞质乙酰辅酶A的同时明晰了该酵母的转运方式；最后，本发明还通过加快脂质再利用的方式更进一步增加了胞质乙酰辅酶A含量。这些多样化的、多角度的代谢工程策略拓宽了胞质乙酰辅酶A容量，在构建生产以乙酰辅酶A为前体的化合物细胞工厂时表现优秀，应用价值广泛。

Description

一种酵母中过量供应胞质乙酰辅酶A的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及过量供应胞质乙酰辅酶A的方法及相关菌株构建方法，并用于生产倍半萜产品中的应用。

背景技术

乙酰辅酶A是细胞代谢中重要的中间代谢物，涉及TCA循环以及ATP与还原力的供应，同时，也是是合成脂肪酸、酮体等能源物质的前体物质，也是合成胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。从乙酰辅酶A出发可以合成多种高值化学品，包括脂肪酸、黄酮类和萜类化合物等。

非传统酵母解脂耶氏酵母是一种工业油脂酵母。有研究报道，发酵培养解脂耶氏酵母发酵液最终可以收获菌株干重的70%的脂质。解脂耶氏酵母以葡萄糖为碳源的天然细胞代谢通路更倾向于积累脂质作为储藏能源。但是，对解脂耶氏酵母生理代谢认识的不断深入和遗传改造技术如CRISPR/Cas、Cre/loxP等的快速发展，推动了解脂耶氏酵母代谢工程改造的进程。该传统产油酵母被开发成为多样化的化学品细胞工厂，尤其是在生产从乙酰辅酶A衍生的化合物方面具备潜力。

目前，在解脂耶氏酵母中包括强化脂质的再利用、敲除脂质合成基因以及表达外源途径来过量供应细胞质中乙酰辅酶A的方法已经取得成功。比如，β-氧化是细胞内脂酰辅酶A转化为乙酰辅酶A的主要方式，过表达β-氧化途径中关键基因包括

MFE2、 PEX10等可以增加胞质乙酰辅酶A供应，但是该方式再以非脂质作为碳源时不具备优势。再者，敲除甘油三酯合成途径基因如 DGA1和 DGA2可以增加乙酰辅酶A供应，但是伴随着细胞生长速率和生物量的降低。异源途径包括来自酿酒酵母的过氧化物酶/线粒体肉碱酰基转移途径或者来自枯草芽孢杆菌的非氧化磷酸戊糖途径的引入可以提高胞质乙酰辅酶A水平，但异源途径适用范围有限。

发明内容

本发明首先从胞内乙酰辅酶A的多种去向分析，以酶工程手段降低了乙酰辅酶A流向脂质合成的通量，既有效增加了胞质乙酰辅酶A水平又不影响菌株生长（若完全敲除脂质合成途径，则导致致死的结果）；更进一步，本发明还表征了解脂耶氏酵母内源的过氧化物酶/线粒体肉碱酰基转移途径，这在有效增加胞质乙酰辅酶A的同时明晰了该酵母的转运方式；最后，本发明还通过加快脂质再利用的方式更进一步增加了胞质乙酰辅酶A含量。由此完成了本发明。

本发明提供酵母中过量供应胞质乙酰辅酶A的方法及相关菌株构建方法。

本发明提供酵母中过量供应胞质乙酰辅酶A的方法，以及以该方法为指导构建过量供应乙酰辅酶A的菌株。

本发明提供了过量供应胞质乙酰辅酶A的重组基因工程菌的构建方法，包括将酵母内源乙酰辅酶A羧化酶（ACC1）突变为ACC1^S667D、ACC1^S667E、ACC1^S1178D和ACC1^S1178E，构建出含有不同的ACC1突变体：ACC1^S667D、ACC1^S667E、ACC1^S1178D和ACC1^S1178E的突变重组基因工程菌，实现了弱化脂质合成和提高胞质的乙酰辅酶A供应。其中所述酵母是具有内源性ACC1的解脂耶氏酵母、酿酒酵母、克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母等酵母中的任一种。可选地，所述出发解脂耶氏酵母为GA-1。

本发明首次表征了解脂耶氏酵母内源的过氧化物酶/线粒体肉碱酰基转移途径，包括在所述出发菌株中过表达肉碱乙酰转移酶（CAT2），加速了乙酰辅酶A的跨膜转运。

更进一步的，为加速所述出发菌中贮存脂质再利用提高了三酰基甘油脂肪酶（TGL4）基因、脂肪酸辅酶A合成酶（FAA1）基因、多功能β氧化酶（MFE1）基因、3-酮酰基辅酶A巯基酶（POT1）基因和过氧化物酶体基质蛋白（PEX10）基因含量。例如，提高酶的含量和/或表达水平通过增加所述出发菌相应酶基因的拷贝数或转录水平实现。

更进一步的，为了增加所述出发菌中来自柠檬酸裂解的乙酰辅酶A水平，提高了柠檬酸裂解酶（ACL1和ACL2）的表达水平。

对所述出发菌株还进行如下至少一种改造，获得所述基因工程菌：A1、定点突变ACC1为ACC1^S667D、ACC1^S667E、ACC1^S1178D和ACC1^S1178E；A2、强化 CAT2基因表达；A3、强化 TGL4基因表达；A4、强化 FAA1基因表达；A5、强化 MFE1基因表达；A6、强化 POT1基因表达；A7、强化 PEX10基因表达；A8、强化 ACL1、ACL2基因表达；。

可选地，所述 ACC1基因编码的ACC1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW02694.1；和/或，所述 ACL2基因编码的ACL2蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW04580.1；和/或，所述 CAT2基因编码的CAT2蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW01502.1; 和/或，所述 TGL4基因编码的TGL4蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW06932.1；和/或，所述 FAA1基因编码的FAA1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW04223.1；和/或，所述 MFE1基因编码的MFE1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW05454.1；和/或，所述 POT1基因编码的POT1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW05614.1；和/或，所述 PEX10基因编码的PEX10蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW02173.1；和/或，所述 ACL1基因编码的ACL1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW06401.1。

更优选地，根据上述的构建方法，所述A1通过定点突变所述出发菌 ACC1基因实现；和/或，所述A2通过向所述出发菌导入 CAT2基因表达盒实现；和/或，所述A3通过向所述出发菌导入 TGL4表达盒实现；和/或，所述A4通过向所述出发菌导入 FAA1实现；和/或，所述A5通过向所述出发菌导入 MFE1基因表达盒实现；和/或，所述A6通过向所述出发菌导入 POT1基因表达盒实现；和/或，所述A7通过向所述出发菌导入 PEX10基因表达盒实现；和/或，所述A8通过向所述出发菌导入 ACL1、ACL2基因表达盒实现。

进一步优选地，所述 ACC1突变体是蛋白质ACC1的氨基酸序列第667位丝氨酸和1178位丝氨酸均被突变为天冬氨酸或谷氨酸。

另外优选地，根据上述的构建方法，所述基因表达盒包括启动子、所述基因开放阅读框和终止子，所述启动子为P_EXP1；所述终止子为T_PEX20。

优选地，根据上述的构建方法，所述基因工程改造涉及基因均为解脂耶氏酵母内源基因。

本发明由此提供上述的构建方法获得的重组基因工程菌。

本发明的还有一个目的是提供一种利用胞质乙酰辅酶A生产高附加值化学品的应用方式。

本发明还提供了下述任一一种在生产乙酰辅酶A衍生物产品相关的应用，X1、上述的构建方法或其得到重组基因工程菌在制备生产乙酰辅酶A衍生物产品中的应用；X2、上述的构建方法或其得到重组基因工程菌在生产乙酰辅酶A衍生物中的应用。

本发明首先通过对解脂耶氏酵母内源ACC1进行点突变下调其活性，实现乙酰辅酶A过量供应的同时不影响菌株正常生长。相较于文献报道，降低脂质生成不影响菌株生长是一大优势；更进一步，本发明率先表征了解脂耶氏酵母内源的过氧化物酶/线粒体肉碱酰基转移途径，这在有效增加胞质乙酰辅酶A；最后，本发明还通过加快脂质再利用的方式更进一步增加了胞质乙酰辅酶A含量。由此获得的重组基因工程菌在生产高附加值乙酰辅酶A衍生物时效果显著，应用价值广泛。

附图说明

图1增强胞质乙酰辅酶A的工程菌株倍半萜生产水平。

图2 叠加ACC1突变和关键基因过表达菌株倍半萜产量。

实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

采用Graphpadprism 9.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值表示。

YPD培养基，每升体积YPD培养基包含：20g蛋白胨，10g 酵母提取物，20g 葡萄糖，20g 琼脂粉（YPD固体培养基添加）。抗性培养基为YPD液体或固体培养基添加250 mg/L的诺尔丝菌素。

Delft液体培养基，每L体积Delft液体培养基包含：20g葡萄糖，7.5g硫酸铵，0.5 g七水硫酸镁，14.4 g磷酸二氢钾， 2 ml微量金属盐母液（1L体积中含3.0g七水硫酸铁，4.5g七水硫酸锌，4.5g二水氯化钙，0.84g二水氯化锰，0.3g六水氯化钴，0.3g五水硫酸铜，0.4g二水钼酸钠，1.0g硼酸，0.1g碘化钾，19.0g乙二胺四乙酸二钠盐），1 ml维他命母液（1L体积中含0.05g D-生物素，1.0g D-泛酸，1.0g 维生素B1，1.0g 吡哆醇，1.0g 烟酸，0.2g 4-氨基苯酸，25.0g肌醇），60mg 尿嘧啶。

实施例1、目标基因的制备

1、乙酰辅酶A改造相关基因的获得

ACC1点突变在突变点处设计引物，提取酵母基因组DNA为模板，使用表1中基因扩增所需引物进行扩增，得到符合预期大小的片段。CAT2、TGL4、FAA1、MFE1、POT1、ACL1、ACL2、EXP1启动子，pex20、CYC1终止子的获得，提取酵母基因组DNA为模板，使用表1中基因扩增所需引物进行扩增，得到符合预期大小的片段。

使用PrimSTARHS DNA polymerase配置扩增体系 (TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物各1μL，基因组DNA模板1μL，HS聚合酶(2 .5U/μL) 0.5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸2.5分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。

表1为引物序列

2、ACC1突变体片段的构建

本发明人研究发现，在酵母中，ACC1活性受到蛋白激酶SNF1调控，SNF1识别特定的磷酸化位点并磷酸化修饰丝氨酸残基。通过对比酿酒酵母和解脂耶氏酵母的ACC1，发现相关的磷酸化位点在进化上是保守的，最终确定667位丝氨酸和1178位丝氨酸是解脂耶氏酵母ACC1磷酸化修饰位点。因此，本发明将这两处丝氨酸分别定点突变为谷氨酸和天冬氨酸，达到模拟磷酸化的效果，期望实现ACC1活性的下调。

以构建ACC1^S667D为例进行说明。利用Overlap PCR技术将以上获得的片段ACC1^S667D-up和ACC1^S667D-dw进行连接扩增，使用PrimSTARHS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物ACC1^S667-up及ACC1^S667-dw各1μL，基因组DNA模板1μL（ACC1^S667D-up和ACC1^S667D-dw各片段添加摩尔比为1：1），HS聚合酶(2 .5U/μL) 0 .5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得ACC1^S667D突变体修复片段。其他ACC1突变体片段构建方法与ACC1^S667D相同，分别构建了ACC1^S667E片段、ACC1^S1178D片段和ACC1^S1178E片段。

6、表达元件的构建

以构建表达元件P_EXP1-CAT2-T_pex20为例进行说明。利用Overlap PCR技术将以上获得的片段P_EXP1、CAT2和T_pex20进行连接扩增，使用PrimSTARHS DNA polymerase配置扩增体系(TAKARA公司)，扩增体系为：5×PS Buffer 10μL，Dntp Mix 4μL，引物P_EXP1-f及T_pex20-r各1μL，基因组DNA模板1μL（P_EXP1、CAT2和T_pex20各片段添加摩尔比为1：3：1），HS聚合酶(2 .5U/μL)0 .5μL，补加蒸馏水至总体积50μL。扩增条件为：98℃预变性3分钟(1个循环)；98℃变性10秒、55℃退火5秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)，产物经割胶回收保存，获得P_EXP1-CAT2-T_pex20表达元件。P_EXP1-CAT2-T_pex20表达元件含有CAT2表达盒，其表达CAT2基因，表达产物为CAT2蛋白质。其他表达原件构建方法与P_EXP1-CAT2-T_pex20相同，分别获得了P_EXP1-TGL4-T_pex20表达元件、P_EXP1-FAA1-T_pex20表达元件、P_EXP1-MFE1-T_pex20表达元件、P_EXP1-POT1-T_pex20表达元件和P_EXP1-ACL1-T_CYC1-ACL1-P_EXP1表达元件。

实施例2、重组菌的构建

1、酵母感受态的制备

将具备吉玛烯A生产能力的出发菌解脂耶氏酵母GA-1甘油管划线于YPD固体培养基30℃恒温过夜培养，之后从该平板选取单菌落再次划线于新鲜的YPD固体培养基，30℃恒温过夜培养。使用无菌水将YPD固体平板中的菌落洗脱并使用无菌离心管2500rpm离心5分钟，收集细胞。弃培养液，把细胞悬浮于无菌水中，再同上离心。弃水，获得感受态细胞。之后，表达gRNA的重组质粒（质粒1-3）与表达元件或同源重组片段一同转化进该菌株中，表达gRNA的重组质粒识别并结合相应位点特定PAM区，同时激活并指导Cas9蛋白行使剪切功能，使相应位点的双链DNA断裂开，此时含有同源区的表达元件或同源重组片段通过同源重组修复被整合进入菌株DNA中。

2、含gRNA的重组质粒的构建

质粒pgRNAYL-1的构建：以pET32a载体为模板，使用对应引物扩增含片段AmpR表达框及ori片段的片段1，以解脂耶氏酵母基因组为模板，以相应引物分别扩增片段P_POT、CEN1、P_EXP1、P_tRNA和T_rpr1，诺尔丝菌素抗性基因以及tracrRNA基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成。之后，通过overlap PCR的方式，使用相应引物获得诺尔丝菌素抗性基因表达框为片段2以及gRNA表达框为片段3。之后，使用CloneExpress II试剂盒（诺唯赞），将片段1、片段2及片段3在体外重组，转化入DH5α感受态细胞进行扩增，提取质粒，获得质粒pYLgRNA-1。

质粒pgRNAYL-2和pgRNAYL-3：构建方法同上，对应靶点于表2。

表3靶序列

质粒名称	靶序列
		gRNA1	ACAAGCATACAGCCCTCGGG
gRNA2	GGAGTTAGACCTCTTTCTGA
		gRNA3	GGTGTACGAAAAGTCGGAGA

3、ACC1点突变菌株的构建

以构建菌株YLAC-1进行说明。出发菌解脂耶氏酵母GA-1于YPD固体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：80 μL PEG（50%w/v），5 μL 1.0 mol/L醋酸锂，5μL2mol/LDTT，10 μL鲑鱼精DNA (sigma）DNA（2 mg/mL），10 μL水和基因（ACC1^S667D，质粒gRNA2）；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于39℃保温1小时；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸500 μL YPD液体培养基重悬细胞，并在30℃，250 rpm条件下孵育2小时；以6000-8000rpm离心15s，除去培养基；100 μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布带有诺尔丝菌素的YPD平板，待菌落长起，挑选菌落到YPD平板，平板中长起的菌落命名为YLAC-1并保存。其他ACC1突变菌株构建方法与YLAC-1相同，分别获得了YLAC-2、YLAC-3和YLAC-4。

4、提高关键基因表达水平菌株的构建

以提高CAT2表达水平的菌株YLAC-5为例进行说明。出发菌解脂耶氏酵母GA-1于YPD固体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：80 μL PEG（50%w/v），5 μL1.0 mol/L醋酸锂，5 μL2mol/LDTT，10 μL鲑鱼精DNA (sigma）DNA（2 mg/mL），10 μL水和基因（P_EXP1-CAT2 -T_pex20表达元件，质粒gRNA1）；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于39℃保温1小时；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸500 μL YPD液体培养基重悬细胞，并在30℃，250 rpm条件下孵育2小时；以6000-8000rpm离心15s，除去培养基；100 μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布带有诺尔丝菌素的YPD平板，待菌落长起，挑选菌落到YPD平板，平板中长起的菌落命名为YLAC-5并保存。其他提高关键基因表达水平的菌株构建方法同菌株YLAC-5，构建出了菌株YLAC-6、YLAC-7、YLAC-8、YLAC-9、YLAC-10、YLAC-11。

5、工程菌株培养与产物获取

在Delft液体培养基中分别活化本实施例制备的酵母工程菌株YLAC-1到YLAC-11以及出发菌株GA-1，于Delft液体培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含20mLDelft液体培养基及2ml正十二烷或肉豆蔻酸异丙酯作为萃取剂的100mL三角瓶中，30℃，250 rpm培养2-5天，最后，将三角瓶中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集有机相备用。

收集的有机相物质用正己烷稀释50倍，用GC-MS检测。GC-MS测定条件：进样口温度260℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时3min；色谱柱：HP-5ms(30m*0 .25mM)；色谱条件：60℃，3min，40℃/min到150℃，20℃/min到220℃，40℃/min到260℃保温2min；MS条件：FullScan:50-750 amu。用倍半萜物质的混合标准品进行定性定量。结果如表3和图1所示，结果表明本实施例获得的ACC1突变体工程菌株YLAC-3和YLAC-4；过表达关键酶菌株YLAC-5、YLAC-6和YLAC-7的乙酰辅酶A衍生物产量显著提高。说明本发明提出的ACC1突变体ACC1^S1178D，ACC1^S1178E以及关键酶CAT2、TGL4和FAA1在提高胞质乙酰辅酶A供应方面作用显著。该结果表明，本实施例提供了有效地过量供应乙酰辅酶A的方式，且在生产以乙酰辅酶A为起始底物的倍半萜化合物方面取得优秀效果。

表3工程菌株过量供应乙酰辅酶A增产倍半萜

菌株名称	倍半萜产量（mg/L）
		GA-1	2108.3±21.1
YLAC-1	2131.9±41.3
		YLAC-2	2031.9±106.2
YLAC-3	2415.2±90.7
		YLAC-4	2419.6±61.0
YLAC-5	2309.5±99.6
		YLAC-6	2379.1±36.7
YLAC-7	2329.3±45.1
		YLAC-8	2197.9±10.5
YLAC-9	2083.9±58.3
		YLAC-10	2148.6±55.3
YLAC-11	2096.4±49.6

实施例3工程菌株叠加ACC1突变体与提高关键基因表达量

1、工程菌株的构建

本实施例中，以实施例2中ACC1有益突变的菌株YLAC-3和YLAC-4作为出发菌株，在此基础上增加基因CAT2、TGL4和FAA1的表达水平。以构建菌株YLAC-12为例进行说明。出发菌解脂耶氏酵母YLAC-03于YPD固体培养基过夜培养后制备感受态细胞，按照以下顺序加入：80 μL PEG（50%w/v），5 μL 1.0 mol/L醋酸锂，5 μL2mol/LDTT，10 μL鲑鱼精DNA(sigma）DNA（2 mg/mL），10 μL水和基因（P_EXP1-CAT2 -T_pex20表达元件，质粒1）；剧烈振荡直至细胞完全混匀，置于39℃保温1小时；以6000-8000rpm离心15s，除去转化混合液；吸500 μLYPD液体培养基重悬细胞，并在30℃，250 rpm条件下孵育2小时；以6000-8000rpm离心15s，除去培养基；100 μL无菌水到反应管中，轻轻悬浮沉淀并涂布带有诺尔丝菌素的YPD平板，待菌落长起，挑选菌落到YPD平板，平板中长起的菌落命名为YLAC-12并保存。其他工程菌株构建方法与YLAC-12相同，构建了YLAC-13、YLAC-14、YLAC-15、YLAC-16和YLAC-17。

2、工程菌培养及产物提取

在Delft液体培养基中分别活化实施例2制备的酵母工程菌株YLAC-11到YLAC-17以及出发菌株YLAC-3和YLAC-4，于Delft液体培养基中制备种子液(30℃，250rpm，16h)，以1％的接种量接种于含20mLDelft液体培养基及2ml正十二烷的100mL三角瓶中，30℃，250rpm培养2-5天，最后，将三角瓶中液体转移至50ml离心管，5000rpm离心5min，收集有机相备用。收集的有机相物质用正己烷稀释50倍，用GC-MS检测。GC-MS测定条件：进样口温度260℃，进样体积1μL，不分流，溶剂延时3min；色谱柱：HP-5ms(30m*0 .25mM)；色谱条件：60℃，3min，40℃/min到150℃，20℃/min到220℃，40℃/min到260℃保温2min；MS条件：FullScan:50-750 amu。用倍半萜物质的混合标准品进行定性定量。结果如表4和图2所示。其中以YLAC-4为出发菌株，增加FAA表达水平获得的菌株YLAC-16倍半萜吉玛烯A产量进一步提高，说明本发明提出的乙酰辅酶A过量供应方式具备叠加效应。

表4叠加多策略供应乙酰辅酶A工程菌株倍半萜产量

菌株名称	倍半萜产量（mg/L）
		YLAC-3	2474.2±58.0
YLAC-4	2486.2±127.9
		YLAC-12	2610.9±108.1
YLAC-13	2382.6±286.2
		YLAC-14	2505.2±87.6
YLAC-15	2490.9±116.9
		YLAC-16	2793.5±67.7
YLAC-17	2505.9±189.1

3、解脂耶氏酵母发酵罐生产倍半萜

以工程菌株YLAC-16进行5L规模发酵罐发酵，通过发酵条件优化，使用Delft培养基，添加10%IPM于培养基中，培养条件为30℃，pH5.0，溶氧40%，转速为300 rpm-700 rpm，维持葡萄糖浓度在10 g/L，最终测定发酵液中吉玛烯A含量为25g/L。该结果说明，本发明提出的过量供应乙酰辅酶A的方法、构建的酵母菌株以及优化的发酵工艺，对解脂耶氏酵母中倍半萜的生产水平有明显促进作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.一种过量供应胞质乙酰辅酶A的重组基因工程菌的构建方法，其特征在于，将出发菌酵母内源乙酰辅酶A羧化酶ACC1突变为ACC1^S667D、ACC1^S667E、ACC1^S1178D和ACC1^S1178E，构建出含有相应的ACC1突变体的突变重组基因工程菌；优选地，所述酵母是具有内源性乙酰辅酶A羧化酶ACC1的解脂耶氏酵母、酿酒酵母、克鲁维酵母、巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母等酵母中的任一种。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述出发菌酵母是解脂耶氏酵母GA-1。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述出发菌酵母还进行如下至少一种改造：所述出发菌酵母中肉碱乙酰转移酶CAT2基因、三酰基甘油脂肪酶TGL4基因、脂肪酸辅酶A合成酶FAA1基因、多功能β氧化酶MFE1基因、3-酮酰基辅酶A巯基酶POT1基因、过氧化物酶体基质蛋白PEX10基因柠檬酸裂解酶ACL1基因和柠檬酸裂解酶ACL2基因、表达强化以增加所表达蛋白的含量和/或活性；优选地，其通过增加所述出发菌酵母中相应酶基因的拷贝数或转录水平实现。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述ACC1基因编码的ACC1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW02694.1；和/或，所述CAT2基因编码的CAT2蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW01502.1; 和/或，所述TGL4基因编码的TGL4蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW06932.1；和/或，所述FAA1基因编码的FAA1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW04223.1；和/或，所述MFE1基因编码的MFE1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW05454.1；和/或，所述POT1基因编码的POT1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW05614.1；和/或，所述PEX10基因编码的PEX10蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW02173.1；和/或，所述ACL1基因编码的ACL1蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW06401.1；和/或，所述ACL2基因编码的ACL2蛋白质的序列为Genbank登陆号AOW04580.1。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，通过向所述出发菌导入相应基因表达盒实现。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，，所述基因表达盒包括启动子、所述基因开放阅读框和终止子，所述启动子为P_EXP1；所述终止子为T_PEX20。

7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述出发菌酵母中ACC1基因的突变通过定点突变实现；进一步优选地，所述突变是使ACC1蛋白的氨基酸序列第667位丝氨酸和1178位丝氨酸均被突变为天冬氨酸或谷氨酸。

8.如权利要求1至7任一项所述的构建方法，其特征在于，基因工程改造所涉及基因均为来源于解脂耶氏酵母的基因。

9.如权利要求1至7任一项所述的构建方法获得的重组基因工程菌。

10.一种在生产倍半萜产品相关的应用，其选自下述应用之一：权利要求1至7任一项所述的构建方法或其得到重组基因工程菌在制备生产倍半萜的产品中的应用；权利要求1至7任一项所述的构建方法或其得到重组基因工程菌在生产倍半萜中的应用。