CN115887670A - 协同增效的携带p53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物及其用途，包括：酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)、血管生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂，药学、保健品学或食品学上可接受的载体或赋形剂。血管生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂能够抑制肿瘤细胞形成血管生成拟态(VM)。本发明将非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)联合血管生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂用药，与单独使用酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗相比，显著提高携带P53构象型突变非小细胞肺癌的治疗作用。该发现在治疗非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)耐药的研究中属于极大的进步，临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种具有携带P53构象型突变的非小细胞肺癌协同增效作用的药物组合物，包含酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和血管生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂，在抑制肿瘤，尤其是在TKIs耐药的非小细胞肺癌治疗方面具有显著的增效作用。
背景技术
肺癌是全球范围内造成肿瘤患者死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)约占所有肺癌病例的85％，肺腺癌和肺鳞癌是非小细胞肺癌常见的亚型。表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有胞质激酶活性的跨膜蛋白，鉴于超过60％的非小细胞肺癌表达EGFR以及大约15％的白种人和近50％的亚洲晚期非小细胞肺癌患者存在EGFR酪氨酸激酶结构域激活突变，EGFR已成为非小细胞肺癌的重要治疗靶标。虽然非小细胞肺癌中EGFR突变有多种类型，但约90％的突变是19外显子缺失或21外显子L858R点突变，通常称之为“经典”EGFR突变。
非小细胞肺癌中EGFR的激活突变是表皮生长因子受体酪氨酸激酶受体抑制剂(EGFR-TKI)治疗的有利预测因素，对于“经典”EGFR突变的肺癌患者，标准一线治疗是第一代(吉非替尼、埃洛替尼)或第二代(阿法替尼)的TKIs。尽管EGFR敏感突变的非小细胞肺癌患者在无进展生存期和总生存期均优于常规化疗，但这种反应并不是永久性的，大多数患者最终会在约一年的治疗过程中发展为进行性疾病(progressivedisease,PD)，这给非小细胞肺癌的治疗带来新的挑战。综上所述，尽管EGFR-TKIs在非小细胞肺癌治疗方敏取得了突破性进展，但其不可避免的耐药现象成为进一步提高靶向药物疗效的瓶颈。因此，详细探究非小细胞肺癌耐药的分子机制，进而找到EGFR-TKIs用药的新策略，不仅是临床非小细胞肺癌靶向治疗研究领域的热点，也有助于延长EGFR突变人群总生存时间。
肿瘤血管生成拟态(vasculogenicmimicry,VM)不同于经典的血管生成，是一种全新的肿瘤血供模式，这种供血模式没有血管内皮细胞的参与，肿瘤细胞通过自身变形与细胞外多种成分相互作用，模仿血管壁结构，形成输送血液的管道系统，建立特殊的肿瘤微循环。有研究表明VM可能是导致目前抗血管生成疗法失败的重要生存机制。多种因素都会影响VM的形成，包括肿瘤微环境、上皮间质转化、VE-钙黏蛋白(VE-Cadherin)、血管内皮生长因子受体1/2(VEGFR1/2)等，其中VE-Cadherin是肿瘤细胞形成VM的主要标记物。另外，虽然VEGFR1/2在正常内皮细胞的生理性血管生成过程中表达，但是肿瘤细胞也可以表达VEGFR1/2以促进肿瘤VM的形成。综上所述，VM可能是一种重要的肿瘤存活机制，其与恶性肿瘤进展和不良预后密切相关，而VEGFR1/2是抗肿瘤VM形成的潜在靶点，如何将抗VM治疗与其他分子靶向治疗策略相结合而达到最佳疗效值得我们进一步探索。
抑癌基因TP53在约50％的人类肿瘤中发生突变，现有研究表明，突变不仅会消除P53的肿瘤抑制功能，表现为功能缺失(lossoffunction,LOF),而且，突变后的P53还可以赋予突变蛋白新的功能(gainoffunction,GOF),这种新形态的P53蛋白能够显著改变肿瘤细胞的生物学行为。P53突变最常见的是DNA结合区域的错义突变，这些突变大致分为2类，第一类是“接触型突变体”，其突变残基无法与DNA结合位点内的元件进行特异性接触，其折叠状态良好，如R273H、R248W；另一类是“构象型突变体”，其突变残基无法与DNA结合位点内的元件进行特异性结合，如“R175H、R249S”。
虽然P53/EGFR双重突变的患者对TKIs治疗预后不佳，但不同类型的突变P53(接触型或构象型)，在EGFR突变非小细胞肺癌患者TKIs获得性耐药中的确切作用及机制还尚不清楚。
我们的研究表明，构象型突变P53可能参与EGFR突变的非小细胞肺癌患者的TKIs耐药，具有构象型P53突变/EGFR突变的非小细胞肺癌细胞具有VEGFR2的高表达，并且促进非小细胞肺癌的肿瘤血管生成拟态，介导非小细胞肺癌的TKIs耐药。因此联合VEGFR2抑制剂和TKIs疗法治疗构象型P53突变/EGFR突变的非小细胞肺癌具有显著的协同作用，临床应用前景良好。
发明内容
本发明目的是提供一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物及其用途。
本发明的技术方案是：
一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，含有：
(1)酪氨酸激酶抑制剂；
(2)血管生长因子受体2抑制剂；
(3)药学、保健品学、或食品学上可接受的载体或赋形剂。
进一步的，所述酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼、安罗替尼、阿法替尼中的任意一种。
进一步的，所述血管生长因子受体2抑制剂为卡博替尼。
进一步的，所述酪氨酸激酶抑制剂和所述血管生长因子受体2抑制剂之间的重量比为1:50-50:1。
进一步的，所述酪氨酸激酶抑制剂占所述协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物总重量的10-80wt％。
进一步的，所述协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物的剂型为片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂中的任意一种。
进一步的，当所述协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物为单位剂型或多剂型时，所述酪氨酸激酶抑制剂的含量为0.5-5000mg/剂。
进一步的，所述协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物的用药顺序为先用血管生长因子受体2抑制剂，而后使用酪氨酸激酶抑制剂。
本发明的另一技术方案是：一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的用途。
进一步的，所述非小细胞肺癌的细胞是具有EGFR19外显子缺失、且携带P53构象型突变的肿瘤细胞。
本发明的优点是：本发明所述的协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，可有效抑制肿瘤细胞血管生成拟态(VM)，控制、缓解或治愈疾病的治疗，例如增加非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)治疗的效果等。
附图说明
图1显示了临床病例中具有野生型、接触型、构象型突变P53的TKIs耐药非小细胞肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)联合卡博替尼的治疗结果；
图2显示了构象型突变P53对VM形成的影响以及VEGFR2在此过程中的作用；
图3显示了血管生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)合用对EGFR/构象型突变P53的非小细胞肺癌细胞的影响。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》(纽约，冷泉港实验室出版社，NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
细胞系
人源HCC827细胞系购自ATCC，这是一种具有EGFR19外显子缺失的非小细胞肺癌细胞系；人源HCC4006细胞系购自ATCC，这是一种具有EGFR19外显子缺失，且携带P53构象型突变的非小细胞肺癌细胞系；人源PC-9细胞系购自ATCC，这是一种具有EGFR19外显子缺失，且携带P53接触型突变的非小细胞肺癌细胞系。
HCC827和HCC4006细胞系的培养方法如下：将细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640(InVitrogen公司)培养液中，置于37摄氏度、体积分数为5％的CO2培养箱中常规培养，实验前无药培养两周。
PC-9细胞系的培养方法如下：将细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM(InVitrogen公司)培养液中，置于37摄氏度、体积分数为5％的CO2培养箱中常规培养，实验前无药培养两周。
实施例1
临床实践发现与野生型、接触型突变P53相比，构象型P53/EGFR双重突变的非小细胞肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)联合卡博替尼治疗效果更好。
请参阅图1，图1显示了临床病例中具有野生型、接触型、构象型突变P53的TKIs耐药非小细胞肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)联合卡博替尼的治疗结果。如图1所示，6例EGFR-TKIs获得性耐药患者病例报告显示，病人使用卡博替尼治疗后观察到，4例携带P53突变的EGFR-TKIs获得性耐药患者中，有3例肿瘤得到控制(其中2例部分缓解(PR)，1例为疾病稳定(SD))，2例野生型P53患者治疗后出现肿瘤进展。
实施例2
构象型突变P53可以促进更多VM形成而且VEGFR2在此过程中发挥重要作用。
将处于对数生长期的HCC827细胞系接种于6孔板中，待细胞增殖到60-80％后，对细胞进行转染WT/C238F/C238Y/R175H/R273HP53，24h后，将细胞消化计数，进行管生成实验，显微镜拍照记录管生成情况，并对管分支、管节点、管分支长度进行统计。观察肿瘤细胞形成VM的能力。请参阅图2，图2显示了构象型突变P53对VM形成的影响以及VEGFR2在此过程中的作用。如图2A所示，对HCC827细胞外源性过表达WT/C238F/C238Y/R175H/R273HP53后，HCC827细胞的形成VM能力受到影响。与野生型(WT)和接触型突变P53(R273H)相比，携带构象型突变P53(C238F/C238Y/R175H)的非小细胞肺癌细胞可以形成更多的VM，表现为交叉数、节点数、分支长度都明显增加。
如图2B所示，通过免疫印迹法检测VM的标志蛋白VE-Cadherin表达水平。结果显示对HCC827细胞外源性过表达WT/C238Y/R175H/R273H/E271KP53后，携带构象型突变P53(C238Y/R175H)的HCC827细胞比野生型(WT)和接触型突变P53(R273H/E271K)表达更高水平的VE-Cadherin。
如图2C所示，通过免疫印迹法检测VEGFR2表达水平。结果显示对HCC827细胞外源性过表达WT/C238Y/R175H/R273H/E271KP53后，携带构象型突变P53(C238Y/R175H)的HCC827细胞比野生型(WT)和接触型突变P53(R273H/E271K)表达更高水平的VEGFR2。
将处于对数生长期的HCC827细胞接种于6孔板中，待细胞增殖到60-80％后，对细胞进行转染WT/C238F/C238Y/R175H/R273HP53，24h后，随机分为3组：阴性对照组，卡博替尼给药组(5nM)，安罗替尼给药组(0.4nM)。给药48h后，将细胞消化计数，进行管生成实验。如图2D所示，VEGFR2抑制剂(卡博替尼、安罗替尼)可以抑制构象型突变P53形成VM，表现为交叉数、节点数、分支长度都明显减少。
实施例3
血管生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)合用对EGFR/构象型突变P53的非小细胞肺癌细胞的影响。
将非小细胞肺癌细胞以3000个细胞/孔的密度铺96孔板培养过夜。然后，把20nM卡博替尼联合不同浓度(0、0.25、0.5、1、2μM)的吉非替尼联合加入孔中。48小时后，在每孔中加入MTT(0.5mg/ml)30μl，37摄氏度孵育3小时后吸弃上清。用100μl二甲基亚砜溶解紫色结晶后，置于酶标仪(Bio-Rad公司)，检测490nm处的吸光度。请参阅图3，图3显示了血管生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂与酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)合用对EGFR/构象型突变P53的非小细胞肺癌细胞的影响。如图3所示，与单独用药吉非替尼相比，外源性过表达构象型突变P53(C238F/R175H)的HCC827细胞、携带内源性构象型P53突变的HCC4006(Y205H)细胞都对吉非替尼+卡博替尼联合用药更敏感，细胞凋亡更多。而携带内源性接触型突变P53(R248Q)的PC-9细胞，则不会对联合用药产生更多细胞凋亡，证明了在具有P53构象型突变/EGFR19外显子缺失的非小细胞肺癌细胞中，卡博替尼可以增强吉非替尼诱导的细胞凋亡。
综上所述，本发明公开了一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物及其用途，包含酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和血管生长因子受体2(VEGFR2)抑制剂，在抑制肿瘤，尤其是在TKIs耐药的非小细胞肺癌治疗方面具有显著的协同作用，临床应用前景良好。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，其特征在于，含有：
(1)酪氨酸激酶抑制剂；
(2)血管生长因子受体2抑制剂；
(3)药学、保健品学、或食品学上可接受的载体或赋形剂。
2.根据权利要求1所述的一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，其特征在于：所述酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼、安罗替尼、阿法替尼中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，其特征在于：所述血管生长因子受体2抑制剂为卡博替尼。
4.根据权利要求1所述的一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，其特征在于：所述酪氨酸激酶抑制剂和所述血管生长因子受体2抑制剂之间的重量比为1:50-50:1。
5.根据权利要求1所述的一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，其特征在于：所述酪氨酸激酶抑制剂占所述协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物总重量的10-80wt％。
6.根据权利要求1所述的一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，其特征在于：所述协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物的剂型为片剂、胶囊、粉末剂、颗粒剂、混悬剂或注射剂中的任意一种。
7.根据权利要求6所述的一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，其特征在于：当所述协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物为单位剂型或多剂型时，所述酪氨酸激酶抑制剂的含量为0.5-5000mg/剂。
8.根据权利要求1所述的一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物，其特征在于：所述协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物的用药顺序为先用血管生长因子受体2抑制剂，而后使用酪氨酸激酶抑制剂。
9.一种协同增效的携带P53构象型突变的非小细胞肺癌治疗药物组合物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述非小细胞肺癌的细胞是具有EGFR 19外显子缺失、且携带P53构象型突变的肿瘤细胞。
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