CN115887657A - Jak2/stat3抑制剂单独或联合卡铂在制备乳腺癌治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了JAK2/STAT3抑制剂单独/联合卡铂在制备乳腺癌药物中的应用。本发明在PI3K/AKT激活的乳腺癌中发现,AKT介导的SIK1磷酸化,抑制了SIK1的激酶活性和生物学功能,并最终激活了JAK2/STAT3信号通路,促进了乳腺癌的进展;而采用JAK2/STAT3抑制剂可以抑制AKT活化引起的SIK1降解导致的STAT3活化,从而达到靶向抑制乳腺癌发生的作用。同时发现联合使用JAK2/STAT3抑制剂与化疗药物卡铂对AKT激活的乳腺癌治疗具有很好的协同效果,针对PI3K‑AKT异常激活的乳腺癌的靶向治疗提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,更具体地,涉及JAK2/STAT3抑制剂单独/联合卡铂在制备乳腺癌药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是全球最常见的恶性肿瘤,发病率逐年上升,是危害女性生命的“头号杀手”。靶向治疗特异性地针对肿瘤细胞改变的基因或者蛋白,具有特异性强、疗效显著、毒副反应小等优点,成为继手术、放疗、化疗三大传统治疗手段之外的一种全新的治疗手段,为广大乳腺癌患者带来了福祉。传统上我们根据雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、HER2和Ki67的表达情况,分为Luminal A、Luminal B、HER2阳性与三阴性乳腺癌等多种亚型以指导乳腺癌的治疗。但随着肿瘤标记物检测、基因测序等技术手段的普遍应用,人们对乳腺癌的发病机制理解愈加深入。传统的乳腺癌分型难以指导乳腺癌患者的精准治疗。有研究利用TCGA数据库,综合病理分型、分子分型、增殖改变、DNA拷贝数变异、p53突变、免疫分型将乳腺癌重新分为12种分型,包括IDC-Basal,IDC-LumA,IDC-LumB,IDC-HER2E,ILC-Luminal,CRIB,MCPAP,PAP-Luminal,META-CLOW,META,MUC,和MED,每种分型有特定的分子特征改变,从而实现对不同类型乳腺癌进行更为深入的研究。根据乳腺癌的驱动基因,可以将乳腺癌分为六型,分别为:PI3K/Akt/mTOR驱动型、生长因子受体(ERBB2、EGFR、FGFR1)驱动型、细胞周期因子(CCND1、CDK4、RB)驱动型、ER驱动型和BRCA1/2驱动型。
PI3K-Akt信号通路在乳腺癌中扮演着重要的作用,在乳腺癌中普遍激活。PIK3CA激活突变是三阴性乳腺癌(TNBC)中第二常见的分子畸变,仅次于Tp53突变。在最新的研究中,邵志敏教授团队对基于复旦队列的乳腺癌中PI3K/Akt信号通路基因(PIK3CA,PIK3R1,AKT1,AKT2,AKT3,PTEN,PDK1等)的突变进行靶向外显子组测序,获得了基于中国乳腺癌人群的该通路基因的突变谱系。研究发现60%的乳腺癌,PI3K/Akt激活。其中,PIK3CA突变频率最高(44%),与美国肿瘤和癌症基因图谱(TCGA)和肿瘤体细胞突变目录(COSMIC)数据库中西方人群类似;而PIK3R1的突变频率(17%)则明显高于西方人群。并且,PIK3CA和PIK3R1存在较高比例的多重突变(9%)。由于PI3K/Akt的高激活率和重要作用,靶向PI3K/Akt信号通路的抑制剂已投入临床试验,PI3K/Akt信号通路的抑制剂可以与CDK4/6抑制剂、抗HER2抑制剂、PARP抑制剂、免疫治疗和化疗联合应用,这为乳腺癌患者的精准治疗提供了新的策略。但是,PI3K/Akt信号通路抑制剂由于其毒性和副作用(包括低血糖、高血糖、免疫抑制、心脏毒性和腹泻)发生率较高,限制了其临床应用,导致现在技术中针对PI3K-AKT异常激活的乳腺癌缺乏靶向治疗的策略。
SIK1作为AMPK家族成员之一,其主要功能是调节能量代谢相关的生理过程,如糖异生和脂质代谢。在非小细胞肺癌(NSCLC)中,LKB1可通过磷酸化并激活SIK1进而抑制肺癌的发生发展。尽管之前AMPK被认为是介导LKB1发挥肿瘤抑制作用最重要的下游基因,然而最近的研究发现,SIK1在LKB1缺陷诱导的NSCLC中具有更重要的作用,并且SIK1的低表达与乳腺癌的远端转移密切相关。此外,蛋白激酶PKA也可磷酸化SIK1上多个丝/苏氨酸位点,从而影响SIK1与接头蛋白14-3-3的相互作用及自身在胞内的易位。另外,SIK1作为上游蛋白激酶可通过磷酸化HDAC和CRTC参与调节葡萄糖和脂质代谢,抑制肺癌与肝癌的发生。随着对SIK1的深入研究,SIK1作为潜在的肿瘤抑制因子开始受到更多的关注。然而SIK1在乳腺癌中的上游调控机制、下游效应分子及其如何发挥抑癌功能仍有待进一步阐明。
鲁索利替尼(Ruxolitinib)具有非特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂的作用,(R)-3-(4-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-1H-pyrazol-1-yl)-3-cyclopentylpropanenitrile,Ruxolitinib是一种吡唑,在1位被2-氰基-1-环戊基乙基取代,3位被pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl group取代。其磷酸盐用于治疗中高危骨髓纤维化患者,包括原发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症后骨髓纤维化和原发性血小板增多症后骨髓纤维化。
卡铂(carbonplatin,CBP),化学名为顺-1,1-环丁烷二羧酸二氨基合铂,作用于DNA鸟嘌呤的N7和O6原子上,引起DNA链间及链内交联,破坏DNA分子,阻止其螺旋解链,干扰DNA合成,而产生细胞毒作用。卡铂目前广泛应用于乳腺癌的治疗,但具有缺乏靶向指标等缺点。
现有报导全球应用Ruxolitinib在乳腺癌治疗的临床试验共53项,包括单独使用或者联合化疗使用,用于早期,晚期或转移乳腺癌。然而目前,还未见JAK2/STAT3抑制剂在制备PI3K/AKT激活的乳腺癌药物中的报道,也未见JAK2/STAT3抑制剂联合卡铂在制备PI3K/AKT异常激活的乳腺癌药物中的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足,提供JAK2/STAT3抑制剂单独/联合卡铂在制备乳腺癌药物中的应用。
本发明发现了一种通过调节SIK1-STAT3发挥Akt致癌作用的途径。Akt1结合并磷酸化SIK1,SIK1激酶活性被抑制,磷酸化的SIK1与14-3-3蛋白结合,促进了SIK1蛋白的核转运,最终导致原癌基因STAT3(Signal transducer and activator of Transcription 3,STAT3)的异常激活。从而提出针对AKT激活或者SIK1低表达/缺失的乳腺癌,利用JAK2/STAT3抑制剂进行治疗。实验验证结果显示,JAK2/STAT3抑制剂Ruxolitinib可以显著抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞,进一步发现Ruxolitinib联合卡铂可以明显抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞系在体内的生长速率。因此,本发明提出了通过联合使用JAK2/STAT3抑制剂与卡铂对PI3K-AKT异常激活的乳腺癌进行靶向治疗的策略。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
本发明在前期基于蛋白质谱的鉴定实验中,发现AKT1,STAT3和14-3-3可以与SIK1相互作用。进一步研究发现,AKT1可以与SIK1的C末端结构域结合,并且直接磷酸化SIK1的S435位点进而抑制SIK1的激酶活性。此外,14-3-3可与被磷酸化后的SIK1蛋白结合,帮助其从细胞核转运至细胞质中。通过转录组测序发现AKT1介导的SIK1磷酸化明显激活JAK2/STAT3信号通路,同时证实了SIK1通过直接结合STAT3来抑制STAT3的磷酸化和二聚体形成及转录活性。从而推测在PI3K-AKT异常激活的乳腺癌中,AKT1可作为SIK1的上游激酶,通过直接磷酸化SIK1,进而抑制SIK1的抑癌功能,促进乳腺癌的进展。
SIK是AMPK相关家族蛋白激酶,可以广泛参与调控糖脂代谢和炎症代谢,在多种实体肿瘤扮演着重要的抑癌基因作用,然而SIK1在乳腺癌中的作用尚不清楚。本发明发现了AKT在乳腺癌中的新底物SIK1,SIK1在乳腺癌中扮演着重要的抑癌作用。而AKT介导的SIK1磷酸化,抑制了SIK1的激酶活性和生物学功能,并最终激活了JAK2/STAT3信号通路,促进了乳腺癌的进展。我们发现SIK1在乳腺癌中低表达,且低表达SIK1预示着更差的预后和肿瘤分期。因此,猜测靶向JAK2/STAT3的JAK2/STAT3抑制可以用于治疗PI3K/AKT异常激活的乳腺癌;同时可将AKT在乳腺癌中的新底物SIK1作为治疗靶点,制备乳腺癌治疗药物,可通过过表达SIK1或抑制SIK1的磷酸化,恢复其抑癌基因功能。
为了检测这一假设,本发明利用JAK2/STAT3的抑制剂Ruxolitinib,通过细胞CCK-8增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验和小鼠体内成瘤实验,发现Ruxolitinib可以显著的抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞。所述Ruxolitinib结构式如式(I)所示:
由于卡铂是目前广泛应用于乳腺癌的化疗方案,因此,本发明利用Ruxolitinib联合卡铂进行了细胞和裸鼠成瘤实验进行验证,结果显示,Ruxolitinib联合卡铂可以明显抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞系在体内的生长速率。
所述卡铂结构式如式(II)所示:
本发明研究表明,使用JAK2/STAT3抑制剂可以抑制AKT活化引起的SIK1降解和STAT3活化,从而达到靶向抑制乳腺癌发生的作用。同时发现联合使用JAK2/STAT3抑制剂与化疗药物卡铂对PI3K-AKT异常激活的乳腺癌治疗具有很好的协同效果。
因此,本发明提供了JAK2/STAT3抑制剂单独/联合卡铂在制备PI3K/AKT激活或SIK1缺失的实体肿瘤治疗药物中的应用。具体地,所述JAK2/STAT3抑制剂为阻断JAK2-STAT3信号通路的小分子化合物、抗体或核酸类药物。具体地,所述JAK2-STAT3信号通路为活化的JAK2(Janus Kinase 2)磷酸化修饰STAT3(Signal transducer and activator ofTranscription 3),磷酸化的STAT3以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合,调控基因的转录。
本发明还提供JAK2/STAT3抑制剂联合卡铂在制备PI3K/AKT或SIK1低表达的实体肿瘤治疗中的应用。
优选地,所述JAK2/STAT3抑制剂为抑制JAK2表达或活性的小分子化合物、抗体或核酸类药物,即JAK2抑制剂。
优选地,所述JAK2抑制剂为Ruxolitinib,其结构如式(I)所示。
优选地,所述实体肿瘤为乳腺癌或卵巢癌。乳腺癌和卵巢癌均是严重危害女性健康的恶性肿瘤,且乳腺癌和卵巢癌中PI3K/AKT发生突变概率均较高。
本发明还提供一种治疗PI3K/AKT激活的乳腺癌的组合物,包括JAK2/STAT3抑制剂和卡铂。
优选地,所述JAK2/STAT3抑制剂为鲁索利替尼。
本发明还提供检测SIK1激酶表达量的试剂在制备乳腺癌预后和肿瘤分期的诊断产品中的应用。
本发明还提供SIK1激酶作为治疗靶点在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
本发明还提供SIK1激酶的表达促进剂或SIK1激酶的磷酸化抑制剂在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
优选地,所述乳腺癌为PI3K/AKT激活的乳腺癌。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了JAK2/STAT3抑制剂单独/联合卡铂在制备乳腺癌药物中的应用。本发明在PI3K/AKT激活的乳腺癌中发现,AKT介导的SIK1磷酸化,抑制了SIK1的激酶活性和生物学功能,并最终激活了JAK2/STAT3信号通路,促进了乳腺癌的进展;而采用JAK2/STAT3抑制剂可以抑制AKT活化引起的SIK1降解和STAT3活化,从而达到靶向抑制乳腺癌发生的作用。同时发现联合使用JAK2/STAT3抑制剂与化疗药物卡铂对AKT激活的乳腺癌治疗具有很好的协同效果,针对PI3K-AKT异常激活的乳腺癌的靶向治疗提供了新的策略。同时本发明研究发现SIK1在乳腺癌中低表达,且低表达SIK1预示着更差的预后和肿瘤分期,可通过检测SIK1激酶表达量来进行乳腺癌预后和肿瘤分期,通过提高SIK1表达量或抑制其磷酸化来治疗乳腺癌。
附图说明
图1为SIK1在乳腺癌中的表达情况;其中A:TCGA数据库分析SIK1在正常乳腺组织、原位乳腺癌及转移乳腺癌中的表达情况;B:TCGA数据库分析SIK1在乳腺癌不同分期中的表达情况;C:生存曲线分析SIK1在乳腺癌病人中高表达与病人预后差相关;D:免疫印迹法检测SIK1等蛋白在不同乳腺癌组织中的表达情况;E:免疫组织化学的方法检测SIK1等蛋白在不同乳腺癌组织中的表达情况。
图2为AKT直接结合并磷酸化SIK1,抑制SIK1激酶活性;其中,A:免疫共沉淀结果,显示SIK1与AKT1直接结合;B:通过制备特异性识别SIK1-pS435的磷酸化抗体,发现AKT1可以在体外和细胞内明显促进SIK1-S435的磷酸化;C:敲低AKT可以减少SIK1磷酸化;D:体外激酶实验结果,AKT1抑制了SIK1的激酶活性。
图3为AKT磷酸化SIK1来促进SIK1胞浆定位和降解;其中,A:浆核分离只有利用免疫印迹实验证实活化的AKT可以促进SIK1的膜定位;B:细胞荧光染色证明活化的AKT1促进了SIK1蛋白的胞浆转运,而模拟不能磷酸化的SIK1在胞核内定位;C:泛素化实验证实活化的AKT1可以促进SIK1泛素化;D:蛋白半衰期实验证实活化的AKT1促进SIK1降解;E:对图D进行定量,证实AKT1促进了SIK1蛋白降解。
图4为AKT1介导的SIK1磷酸化明显激活JAK2/STAT3信号通路;其中,A:稳定过表达野生型和模拟磷酸化突变的SIK1乳腺癌细胞RNA测序结果,证实JAK2-STAT3通路被SIK1负向调控;B:免疫沉淀实验证实SIK1与STAT3相互作用;C:GST pulldown实验证实STAT3形成的同源二聚体可以被SIK1抑制,这种抑制可以被活化的AKT1激活;D:免疫沉淀实验证实模拟磷酸化突变的SIK1不能抑制STAT3二聚体的形成;E:敲低AKT1引起的STAT3磷酸化减低可以被敲低SIK1所拮抗,证实AKT1经过抑制SIK1来调控STAT3磷酸化;F:野生型和非磷酸化模拟SIK1可以抑制而磷酸化模拟的SIK1可以促进STAT3的转录活性;G:野生型和非磷酸化模拟SIK1可以抑制而磷酸化模拟的SIK1可以促进STAT3的转录基因。
图5为AKT磷酸化SIK1来行使其在乳腺癌中的促癌基因功能;其中,A:免疫印迹方法检测SIK1敲低的乳腺癌细胞系MCF7中STAT3磷酸化增强;B:克隆形成实验发现敲低SIK1可以促进乳腺癌细胞系克隆形成能力;C:裸鼠成瘤实验证实敲低SIK1可以促进乳腺癌MCF7细胞在小鼠体内的成瘤能力;D:裸鼠成瘤实验中敲低SIK1可以促进乳腺癌MCF7细胞的瘤体大小;E:对肿瘤大小进行定量分析;F:免疫印迹的方法检测小鼠肿瘤中各种蛋白的表达,发现敲低SIK1可以促进肿瘤中STAT3磷酸化的增强;G:克隆形成实验发现过表达野生型和非磷酸化修饰的SIK1可以抑制而模拟磷酸化修饰的SIK1可以促进乳腺癌BT549的克隆形成能力;H:裸鼠成瘤实验发现过表达野生型和非磷酸化修饰的SIK1可以抑制而模拟磷酸化修饰的SIK1可以促进乳腺癌BT549的克隆形成能力;敲低SIK1可以促进乳腺癌细胞系克隆形成能力;I:裸鼠成瘤实验中过表达野生型和非磷酸化修饰的SIK1可以抑制而模拟磷酸化修饰的SIK1可以促进乳腺癌BT549细胞的瘤体大小。
图6为Ruxolitinib可以显著的抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞;其中A:细胞克隆形成实验证实敲低SIK1可以增强乳腺癌MCF7细胞对Ruxolitinib的敏感性;B:凋亡实验证实敲低SIK1可以增强Ruxolitinib对乳腺癌MCF7细胞的杀伤作用;C:细胞克隆形成实验证实过表达野生型和非磷酸化SIK1可以降低,而过表达磷酸化模拟SIK1可以增强乳腺癌BT549细胞对Ruxolitinib的敏感性;D:凋亡实验证实过表达野生型和非磷酸化SIK1可以增加,而过表达磷酸化模拟SIK1可以降低Ruxolitinib对乳腺癌BT549细胞的杀伤作用;E:裸鼠成瘤实验中证实模拟磷酸化突变SIK1表达的BT549细胞系增强Ruxolitinib对肿瘤细胞的杀伤作用;F:E中的肿瘤被分离出来;G:F中的肿瘤被称重定量;H:免疫印迹法检测肿瘤中STAT3磷酸化。
图7为Ruxolitinib联合卡铂可以明显抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞系在体内的生长速率。其中,A:细胞克隆形成实验证实敲低SIK1可以增强乳腺癌BT549细胞对Ruxolitinib和卡铂(CBP)联用的敏感性;B:细胞克隆形成实验证实敲低SIK1可以增强乳腺癌MDA-MB-468细胞对Ruxolitinib和卡铂(CBP)联用的敏感性;C:裸鼠成瘤实验中证实联合使用Ruxolitinib和卡铂(CBP)可以促进对乳腺癌细胞BT549的抑制效果;D:C中的肿瘤被分离出来;E:D中的肿瘤被称重定量;F:免疫组化的方法检测小鼠肿瘤组织中不同蛋白的表达;G:免疫印迹法检测肿瘤中STAT3磷酸化。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1SIK1表达与AKT激活及乳腺癌预后负相关
(1)生物信息学分析:从美国TCGA肿瘤数据库中分析SIK1在不同乳腺癌组织中的mRNA表达情况,结果图如图1A所示,经TCGA数据库分析,SIK1在乳腺组织中的表达明显低于在原位癌和转移癌中的表达。但如图1B所示,在不同乳腺癌分期中,SIK1的表达没有明显相关性。同时利用Kaplan-Meier分析方法分析SIK1的mRNA表达与乳腺癌病人预后的相关性,结果如图1C所示,SIK1的表达与乳腺癌病人的预后显著负相关,即SIK1高表达病人,其预后较好。
(2)乳腺癌组织标本中蛋白印迹检测SIK1表达及AKT磷酸化。不同类型的乳腺癌组织标本经裂解后,利用western blot的方法检测相关蛋白的表达,结果如图1D所示,SIK1表达在Her2阳性和三阴乳腺癌(Basal)中较低,伴随着SIK1和STAT3磷酸化增强及AKT活性增强。
(3)免疫组化实验:通过收取不同的乳腺组织及乳腺癌标本,通过甲醛固定、包埋之后进行组织化学染色,检测SIK1等蛋白表达及AKT底物的磷酸化,结果如图1E所示,SIK1表达在Her2阳性和三阴乳腺癌(Basal)中较低,伴随着SIK1和STAT3磷酸化增强。
上述结果表明,SIK1表达与AKT激活及乳腺癌预后负相关,SIK1在乳腺癌中低表达,且低表达SIK1预示着更差的预后和肿瘤分期。
实施例2AKT直接结合并磷酸化SIK1,抑制SIK1激酶活性
(1)免疫共沉淀实验:收取乳腺癌细胞裂解液,在裂解液中加入AKT1或SIK1蛋白抗体,4℃翻转过夜。第二天加入Protein A/G beads,4℃翻转2小时后,用缓冲液洗去非特异性结合的蛋白,最后进行Western blot检测,用特异性抗体检测相应蛋白表达情况。
(2)通过pLKO.1-shAKT1病毒载体构建AKT1敲低的乳腺癌细胞系,探究敲低AKT1对SIK1磷酸化的影响。
在生理条件下用Insulin刺激,或者使用AKT的抑制剂处理条件下,探究AKT对SIK1磷酸化的影响。
(3)研究AKT对SIK1激酶活性的影响。我们将通过检测SIK1的直接底物HDAC5的磷酸化水平来反映SIK1的激酶活性。我们构建SIK1-S435A/D(A失活型磷酸化突变,D模拟磷酸化突变),比较野生型与突变型SIK1对其自身激酶活性的影响。
结果如图2所示,免疫共沉淀实验中SIK1与AKT1直接结合(图2A);另外通过体外激酶实验和质谱检测分析,我们发现AKT1可以直接磷酸化SIK1蛋白C端S435位点;通过制备特异性识别SIK1-pS435的磷酸化抗体,发现AKT1可以在体外和细胞内明显促进SIK1-S435的磷酸化(图2B);敲低AKT1可以减少SIK1磷酸化(图2C);进行体外激酶实验,AKT1抑制了SIK1的激酶活性(图2D)。通过体外激酶实验和质谱检测分析,发现AKT1可以直接磷酸化SIK1蛋白C端S435位点。
实施例3AKT磷酸化SIK1来促进SIK1胞浆定位和降解
(1)研究AKT磷酸化SIK1对其胞内定位的影响。我们将通过核浆分离及免疫荧光实验,研究AKT磷酸化SIK1对其细胞定位的影响,还将研究不同SIK1突变体(WT,S435A,S435D)对SIK1细胞定位的影响。
(2)研究AKT对SIK1蛋白稳定性的影响。利用蛋白质半衰期实验,用CHX处理细胞不同时间点如0,2,4,8,10小时,比较对照组与myr-AKT过表达组中SIK1蛋白稳定性差异。利用蛋白体内泛素化实验:通过在293T细胞中共转染HA-SIK1,AKT1和His-Ub,36小时后添加MG132蛋白酶体抑制剂并收取总细胞,用含有6M盐酸胍的裂解液超声裂解,与镍珠在室温条件下反应3个小时,用8%的SDS-PAGE电泳,通过Western blot验证AKT1是否会促进SIK1泛素化降解。
结果如图3所示,浆核分离只有利用免疫印迹实验证实活化的AKT可以促进SIK1的膜定位(图3A),细胞荧光染色证明活化的AKT1促进了SIK1蛋白的胞浆转运(图3B),表明AKT1促进了SIK1蛋白的胞浆转运;泛素化实验证实活化的AKT1可以促进SIK1泛素化(图3C),蛋白半衰期实验证实活化的AKT1促进SIK1降解(图3D),并对图3D进行定量,证实AKT1促进了SIK1蛋白降解(图3E),表明AKT1促进了SIK1蛋白的泛素化降解,表明AKT磷酸化SIK1来促进SIK1胞浆定位和降解。
实施例4AKT磷酸化SIK1来促进STAT3通路激活
(1)研究SIK1是否参与调控STAT3信号通路。通过对稳定过表达SIK1的乳腺癌细胞进行RNA测序,分析SIK1是否会激活STAT3信号通路。通过qPCR验证SIK1对JAK2/STAT3通路中关键因子如OSMR和IFNB1等的影响。通过荧光素酶报告实验研究SIK1野生型和不同突变型对STAT3转录活性的影响。
荧光素酶报告检测实验:构建pGL-3xSTAT3-Luc双荧光素酶报告载体,来反映STAT3的转录活性。在293T中共转SIK1,TK和pGL-3xSTAT3-Luc质粒,36小时后收取细胞裂解液,用多功能酶标仪进行读数,以萤火虫荧光素酶为报告基因,以海肾荧光素酶为内参基因,计算荧光素酶相对活性。
(2)研究SIK1调控STAT3的分子机制。通过GST-Pulldown以及免疫共沉淀实验来验证SIK1是否与STAT3蛋白结合,并进一步研究两者相互结合的结构域。研究AKT磷酸化SIK1对SIK1与STAT3相互结合的影响,以及AKT磷酸SIK1对STAT3二聚化的影响。同时研究不同SIK1突变(WT,S435A,S435D)对SIK1与STAT3相互作用的影响及对STAT3自身二聚化和DNA结合能力的影响。
结果如图4所示,通过转录组测序发现AKT1介导的SIK1磷酸化明显激活JAK2/STAT3信号通路,证实JAK2-STAT3通路被SIK1负向调控(图4A);免疫沉淀实验证实SIK1与STAT3相互作用(图4B);GST pulldown实验证实STAT3形成的同源二聚体可以被SIK1抑制,这种抑制可以被活化的AKT1激活(图4C);免疫沉淀实验证实模拟磷酸化突变的SIK1不能抑制STAT3二聚体的形成(图4D);敲低AKT1引起的STAT3磷酸化减低可以被敲低SIK1所拮抗,证实AKT1经过抑制SIK1来调控STAT3磷酸化(图4E),野生型和非磷酸化模拟SIK1可以抑制而磷酸化模拟的SIK1可以促进STAT3的转录活性(图4F);野生型和非磷酸化模拟SIK1可以抑制而磷酸化模拟的SIK1可以促进STAT3的转录基因(图4G);上述结果表明SIK1通过直接结合STAT3来抑制STAT3的磷酸化和二聚体形成及转录活性。
实施例5磷酸化SIK1来行使其在乳腺癌中的促癌基因功能
通过上述实施例2-4的机制研究,我们发现AKT1直接磷酸化SIK1-S435位点,改变了SIK1蛋白的细胞定位,从而激活下游的JAK2/STAT3信号通路。由于AKT是肿瘤发生和耐药的重要激酶,靶向其下游重要通路,可以缓解AKT激活引起的肿瘤发生与耐药。因此我们检测是否SIK1磷酸化和降解介导了AKT在乳腺癌中的功能。
通过pLKO.1-shSIK和pLenti-HA-SIK1病毒载体构建SIK1敲低(MCF7细胞系)和过表达(BT549细胞系)乳腺癌细胞系,利用以下实验在体内外研究SIK1对乳腺癌细胞生长等的影响。
(1)细胞平板克隆实验:分别在6孔板中按300个/每孔的细胞数接种,继续培养7-10天,PBS清洗过后用甲醇固定,并用0.1%结晶紫染色,计数比较各组细胞克隆形成数目和大小。
(2)异种移植小鼠模型。将等量细胞和matrigel混合后,经皮下注射到免疫缺陷的裸鼠前肢腋下。此后每隔两天测量肿瘤的长和宽,并利用公式(体积=长*宽^2*0.5)计算肿瘤体积大小。实验终止之后,取瘤体称重照相,提取RNA,蛋白质样品并固定包埋。并通过Western blot和免疫组化检测相关指标。
结果如图5A所示,免疫印迹方法检测SIK1敲低的乳腺癌细胞系MCF7中STAT3磷酸化增强,表明SIK1敲低细胞系构建成功;利用该SIK1敲低的细胞系shSIK1,进行体外克隆形成实验和小鼠裸鼠成瘤实验,结果如图5B-F所示,克隆形成实验发现敲低SIK1可以促进乳腺癌细胞系克隆形成能力(图5B);裸鼠成瘤实验证实敲低SIK1可以促进乳腺癌MCF7细胞在小鼠体内的成瘤能力(图5C);裸鼠成瘤实验中敲低SIK1可以促进乳腺癌MCF7细胞的瘤体大小(图5D、E);免疫印迹的方法检测小鼠肿瘤中各种蛋白的表达,发现敲低SIK1可以促进肿瘤中STAT3磷酸化的增强(图5F);上述结果表明敲低SIK1可以显著促进乳腺癌的成瘤,同时在SIK1低表达的乳腺癌细胞系中过表达不同的SIK1突变体,包括模拟磷酸化的S435D突变,不能磷酸化的S435A突变。
利用过表达SIK1的BT549细胞系进行体外克隆形成实验和小鼠裸鼠成瘤实验,结果如图5G-I所示,克隆形成实验发现过表达野生型和非磷酸化修饰的SIK1可以抑制而模拟磷酸化修饰的SIK1可以促进乳腺癌BT549的克隆形成能力(图5G);裸鼠成瘤实验发现过表达野生型和非磷酸化修饰的SIK1可以抑制而模拟磷酸化修饰的SIK1可以促进乳腺癌BT549的克隆形成能力,敲低SIK1可以促进乳腺癌细胞系克隆形成能力(图5H);裸鼠成瘤实验中过表达野生型和非磷酸化修饰的SIK1可以抑制而模拟磷酸化修饰的SIK1可以促进乳腺癌BT549细胞的瘤体大小(图5I);上述结果表明过表达野生型和S435A突变的SIK1可以显著的抑制肿瘤的形成,而表达S435D-SIK1失去了抑制肿瘤生长的能力。可见,AKT磷酸化SIK1影响了SIK1在乳腺癌中的抑癌基因功能,可通过提高SIK1的表达量或抑制SIK1的磷酸化,恢复其抑癌基因功能,从而治疗PI3K/AKT激活或SIK1低表达或缺失的乳腺癌。
实施例6JAK2抑制剂Ruxolitinib抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞
通过实施例2-5我们发现AKT通过调控SIK1来促进STAT3的转录活性和致癌功能,因此我们推测AKT可以通过抑制SIK1来促进STAT3癌基因通路,来引起乳腺癌肿瘤的发生。为了检测这一假设,我们利用JAK2/STAT3的抑制剂Ruxolitinib,通过细胞CCK-8增殖实验、克隆形成实验、细胞凋亡实验和小鼠体内成瘤实验。
(1)使用克隆形成实验探究Ruxolitinib对SIK1敲低和过表达乳腺癌细胞系增殖能力的影响。
(2)利用AnnexinV和PI双染法流式检测细胞凋亡,探究Ruxolitinib对SIK1敲低/敲除和过表达乳腺癌细胞系凋亡过程的影响。
(3)利用异种移植小鼠模型探究Ruxolitinib对SIK1过表达乳腺癌细胞系增殖能力的影响。并通过Western blot和免疫组化检测相关指标。
结果如图6所示,细胞克隆形成实验证实敲低SIK1可以增强乳腺癌MCF7细胞对Ruxolitinib的敏感性(图6A);凋亡实验证实敲低SIK1可以增强Ruxolitinib对乳腺癌MCF7细胞的杀伤作用(图6B);细胞克隆形成实验证实过表达野生型和非磷酸化SIK1可以降低,而过表达磷酸化模拟SIK1可以增强乳腺癌BT549细胞对Ruxolitinib的敏感性(图6C);凋亡实验证实过表达野生型和非磷酸化SIK1可以增加,而过表达磷酸化模拟SIK1可以降低Ruxolitinib对乳腺癌BT549细胞的杀伤作用(图6D);裸鼠成瘤实验中证实模拟磷酸化突变SIK1表达的BT549细胞系增强Ruxolitinib对肿瘤细胞的杀伤作用(图6E、F、G);免疫印迹法检测肿瘤中STAT3磷酸化(图6H);上述结果表明Ruxolitinib可以显著的抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞。
实施例7JAK2抑制剂联合卡铂用于乳腺癌治疗
由于卡铂是目前广泛应用于乳腺癌的化疗方案,因此,我们猜测联合使用靶向JAK2/STAT3信号通路抑制剂和卡铂可以用于治疗PI3K/AKT激活的乳腺癌。为了证明这一猜想,进行了细胞和裸鼠成瘤实验。
(1)克隆形成实验探究Ruxolitinib联合卡铂对PI3K/AKT激活的乳腺癌增殖能力的影响。
(2)异种移植小鼠模型随机分成4组(安慰剂组、Ruxolitinib(JAK2抑制剂)组、Carboplatin(卡铂)组及联合用药组),每组10只,待肿瘤长到2×2×2mm3后隔天给药,并测量肿瘤大小。在实验终点处死小鼠分离肿瘤组织,统计并称重。并通过Western blot和免疫组化检测相关指标。
结果如图7所示,细胞克隆形成实验证实敲低SIK1可以增强乳腺癌BT549细胞对Ruxolitinib和卡铂(CBP)联用的敏感性(图7A);细胞克隆形成实验证实敲低SIK1可以增强乳腺癌MDA-MB-468细胞对Ruxolitinib和卡铂(CBP)联用的敏感性(图7B);裸鼠成瘤实验中证实联合使用Ruxolitinib和卡铂(CBP)可以促进对乳腺癌细胞BT549的抑制效果(图7C、D、E);免疫组化的方法检测小鼠肿瘤组织中不同蛋白的表达(图7F);免疫印迹法检测肿瘤中STAT3磷酸化(图7G);上述结果表明Ruxolitinib联合卡铂可以明显抑制PI3K/AKT激活的乳腺癌细胞系在体内的生长速率。从而提出联合使用JAK2/STAT3抑制剂与卡铂对PI3K-AKT异常激活的乳腺癌进行靶向治疗的策略。
Claims (10)
1.JAK2/STAT3抑制剂在制备PI3K/AKT激活或SIK1低表达的实体肿瘤治疗药物中的应用,所述JAK2/STAT3抑制剂为阻断JAK2-STAT3信号通路的小分子化合物、抗体或核酸类药物。
2.权利要求1中所述JAK2/STAT3抑制剂联合卡铂在制备PI3K/AKT或SIK1低表达的实体肿瘤治疗中的应用。
3.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述JAK2/STAT3抑制剂为鲁索利替尼。
4.根据权利要求1或2所述应用,其特征在于,所述实体肿瘤为乳腺癌或卵巢癌。
5.一种治疗PI3K/AKT激活的乳腺癌的组合物,其特征在于,包括JAK2/STAT3抑制剂和卡铂。
6.根据权利要求5所述组合物,其特征在于,所述JAK2/STAT3抑制剂为鲁索利替尼。
7.检测SIK1激酶表达量的试剂在制备乳腺癌预后和肿瘤分期的诊断产品中的应用。
8.SIK1激酶作为治疗靶点在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
9.SIK1激酶的表达促进剂或SIK1激酶的磷酸化抑制剂在制备乳腺癌治疗药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述应用,其特征在于,所述乳腺癌为PI3K/AKT激活的乳腺癌。
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