CN115876996A - 基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球,包括微球载体、荧光纳米粒子与磁性纳米粒子,微球载体为聚合物微球,微球载体内部包埋荧光纳米粒子与磁性纳米粒子;所述荧光纳米粒子为油性半导体量子点;所述磁性纳米粒子为核壳结构的Fe3O4/TiO2复合纳米粒子。本发明提供一种工艺简单、荧光强且磁性强的磁性荧光编码微球,以便获得稳定性和灵敏度更高的液相生物芯片技术。
Description
技术领域
本发明涉及微纳米生物材料和多指标免疫检测领域,尤其涉及一种基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球。
背景技术
随着单细胞分析、基因分析、疾病早期诊断等生物分析领域的快速发展,液相生物芯片技术因其反应动力学快、多重检测能力突出、灵敏度高、样品量小等特点引起了广泛关注,其技术核心是荧光编码微球。荧光微球是微球里面包埋了荧光材料或微球表面连接了荧光材料的一类发光微球。将荧光微球根据其荧光强度和荧光种类的不同组成阵列,该阵列中的任一荧光微球称为荧光编码微球。不同的荧光编码微球表面标记不同的生物探针分子后能够对多种目标物(包括核酸、蛋白、小分子化合物等)同时实现定量检测,因此,较高的编码数量对同时实现多种目标物的定量检测至关重要。
荧光编码微球中加入磁性材料即可得到磁性荧光编码微球。磁性荧光编码微球在检测应用中不需要繁琐的清洗步骤,通过其磁分离特性,不仅可以实现其与反应体系中杂质的高效分离,还可以有效提高检测灵敏度。然而,磁性材料在可见光区对荧光材料的荧光光谱具有强烈的光谱吸收作用,该光谱吸收作用引起的荧光猝灭效应会极大降低磁性荧光编码微球的荧光强度,进而显著降低磁性荧光编码微球的编码数量。因此,可见光区光谱吸收较弱的磁性材料对于提高磁性荧光编码微球的编码数量非常重要。
目前,磁性荧光编码微球的制备方法主要有直接合成法和溶胀法。专利CN02139365.6公开了一种通过在聚合物微球合成过程中引入磁性材料和荧光材料的方法制备磁性荧光编码微球;专利CN201010129442.8公开了一种通过在溶胀的聚合物微球中同时引入磁性材料和荧光材料的方法制备磁性荧光编码微球。由于磁性材料在可见光区对荧光材料的荧光光谱具有强烈的光谱吸收作用,上述方法难以获得荧光强度高、编码数量多的磁性荧光编码微球。
发明内容
发明目的:针对现有技术的不足与缺陷,本发明提供一种基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球,提供一种工艺简单、荧光强度高、编码数量多且磁性强的磁性荧光编码微球,以便获得稳定性和灵敏度更高的液相生物芯片技术。
技术方案:本发明的基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球,其特征在于:包括微球载体、荧光纳米粒子与磁性纳米粒子,微球载体为聚合物微球,微球载体内部包埋荧光纳米粒子与磁性纳米粒子;所述荧光纳米粒子为油性半导体量子点;所述磁性纳米粒子为核壳结构的Fe3O4/TiO2复合纳米粒子。
其中,所述的聚合物微球的基质成分为聚苯乙烯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种以上单体所形成的共聚物。
其中,所述的聚合物微球内部包埋亲油性荧光纳米粒子,亲油性荧光纳米粒子为半导体纳米粒子。
其中,所述的微球载体的直径为1μm~50μm。
其中,所述的荧光纳米粒子为CdSe/CdS厚壳层量子点、CdSe/Cd1-xZnx、Se1-ySy/ZnS量子点量子点中的一种或几种。
其中,所述的油性半导体量子点的发射波长相差大于30nm,量子点表面带有疏水功能基团,量子点与磁性纳米粒子能分散于油溶性溶剂中。
其中,所述的量子点包括绿色量子点(RQDs)、黄色量子点(YQDs)和红色量子点(RQDs),优选的RQDs发射波长为525nm的CdSe/ZnS,优选的YQDs发射波长为585nm的CdSe/ZnS,优选的RQDs发射波长为650nm的CdSe/ZnS。
其中,根据量子点的发射波长调整荧光信号,不同的荧光信号通过流式细胞仪检测所述磁性荧光编码微球得到FL1-FL3(绿色荧光-红色荧光)的二维散点图的信号分布来区分。
其中,所述的磁性材料为Fe3O4、Fe2O3、FeO中的一种或几种。
其中,所述的核壳结构的Fe3O4/TiO2复合纳米粒子的壳为TiO2,核为不含有TiO2的磁性材料,磁性材料包括铁、钴、镍的氧化物及其合金。
其中,所述的核壳结构磁性纳米粒子Fe3O4/TiO2对荧光的猝灭效应较小。
基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球阵列,其特征在于:包括至少两种如权利要求1-6中任一项所述的磁性荧光编码微球,各种磁性荧光编码微球间具有不同的编码信息。
基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球阵列在一种或者多种目标物检测中的应用。
其中,所述的目标物包括蛋白质、DNA与RNA。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有以下显著优点:本发明提供一种工艺简单、荧光强度高、编码数量多且磁性强的磁性荧光编码微球,以便获得稳定性和灵敏度更高的液相生物芯片技术。本发明制备出高荧光强度的磁性荧光编码微球,解决了磁性荧光编码微球荧光弱的问题,构建了磁性荧光条码库,利用这种磁性荧光编码微球对目标物进行高通量、高灵敏的多元定量分析,在高灵敏液相生物芯片检测技术中具有重要的意义和广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明的磁性荧光编码微球示意图;
图2为本发明的Fe3O4、Fe3O4/TiO2和TiO2的紫外吸收光谱与量子点(GQDs、YQDs和RQDs)的荧光发射光谱图之间的光谱重叠图;图a为Fe3O4的紫外吸收光谱与量子点GQDs的荧光发射光谱之间的光谱重叠图、图b为Fe3O4/TiO2的紫外吸收光谱与量子点GQDs的荧光发射光谱之间的光谱重叠图、图c为TiO2的紫外吸收光谱与量子点GQDs的荧光发射光谱之间的光谱重叠图、图d为Fe3O4的紫外吸收光谱与量子点YQDs的荧光发射光谱之间的光谱重叠图、图e为Fe3O4/TiO2的紫外吸收光谱与量子点YQDs的发射光谱之间的光谱重叠图、图f为TiO2的紫外吸收光谱与量子点YQDs的荧光发射光谱之间的光谱重叠图、图g为Fe3O4的紫外吸收光谱与量子点RQDs的荧光发射光谱之间的光谱重叠图、图h为Fe3O4/TiO2的紫外吸收光谱与量子点RQDs的荧光发射光谱之间的光谱重叠图、图i为TiO2的紫外吸收光谱与量子点RQDs的荧光发射光谱之间的光谱重叠图;
图3为本发明的Fe3O4和Fe3O4/TiO2的TEM图及其对量子点(GQDs、YQDs和RQDs)荧光强度的影响图;图a为Fe3O4和Fe3O4/TiO2的结构示意图及其相应的TEM图、图b为Fe3O4对GQDs、YQDs和RQDs荧光强度的影响、图c为Fe3O4/TiO2对GQDs、YQDs和RQDs荧光强度的影响、图d为Fe3O4和Fe3O4/TiO2对GQDs荧光强度影响的比较、图e为Fe3O4和Fe3O4/TiO2对YQDs荧光强度影响的比较、图f为Fe3O4和Fe3O4/TiO2对RQDs荧光强度影响的比较;
图4为本发明的磁性荧光编码微球的光学显微镜图;
图5为本发明的磁性荧光编码微球的粒径分布统计图;
图6为本发明的磁性荧光编码微球的制备示意图和激光共聚焦扫描显微镜荧光照片;图a为膜乳化法制备磁性荧光编码微球的示意图、图b为绿色荧光微球(ⅰ为Fe3O4@GQDs微球,ⅱ为Fe3O4/TiO2@GQDs微球,ⅲ为GQDs微球)、图c为黄色荧光微球(ⅰ为Fe3O4@YQDs微球,ⅱ为Fe3O4/TiO2@YQDs微球,ⅲ为YQDs微球)、图d为红色荧光微球(ⅰ为Fe3O4@RQDs微球,ⅱ为Fe3O4/TiO2@RQDs微球,ⅲ为RQDs微球)、图e和图f分别为自然光和紫外光下荧光微球悬浮液的光学照片(1为绿色微球,2为黄色微球,3为红色微球)、图g为紫外光下荧光微球悬浮液被磁分离后的光学照片(1为绿色微球,2为黄色微球,3为红色微球);
图7为本发明的磁性荧光编码微球的荧光稳定性测试图;图a为温度对磁性荧光编码微球荧光强度的影响、图b为pH对磁性荧光编码微球荧光强度的影响、图c为溶液对磁性荧光编码微球荧光强度的影响;
图8为本发明的磁性荧光编码微球编码得到的6重单色编码微球阵列和30重双色编码微球阵列所对应的流式解码结果图;图a为Fe3O4/TiO2@GQDs磁性荧光编码微球构建的单色(绿色)条码库、图b为Fe3O4/TiO2@YQDs磁性荧光编码微球构建的单色(黄色)条码库、图c为Fe3O4/TiO2@RQDs磁性荧光编码微球构建的单色(红色)条码库、图d为Fe3O4/TiO2@QDs磁性荧光编码微球构建的双色(绿色和红色)条码库;
图9为本发明的磁性荧光编码微球和非磁性荧光编码微球分别对卵巢癌肿瘤标志物(CA125),胰腺癌肿瘤标志物(CA199),肝癌肿瘤标志物(AFP),小细胞肺癌肿瘤标志物(NSE)的免疫检测标准曲线图;图a为卵巢癌肿瘤标志物(CA125)的免疫检测标准曲线图、图b为胰腺癌肿瘤标志物(CA199)的免疫检测标准曲线图、图c为肝癌肿瘤标志物(AFP)的免疫检测标准曲线图、图d为小细胞肺癌肿瘤标志物(NSE)的免疫检测标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
本发明的编码微球,其所采用的一组微球载体具备直径相近且材质不同或直径不同(直径相差3μm以上)且材质相同。微球载体的直径选择范围是1μm~50μm,优选范围是2μm~20μm。微球载体的基质成分包括无机物和聚合物。无机物包括二氧化硅。聚合物包括聚苯乙烯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种以上单体所形成的共聚物。
为了在流式细胞仪FL1-FL3的二维散点图中有效区分微球载体的荧光信号群,本发明优选以下两类荧光材料:
(1)发射波长为525nm的绿色CdSe/ZnS量子点(GQDs);
(2)发射波长为650nm的红色CdSe/ZnS量子点(RQDs)。
本发明的微球载体、荧光纳米粒子和磁性纳米粒子的种类,并不限于本文所描述的优选参数和实施例。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
主要试剂和耗材如下:
氧化镉(CdO,99.5%)、乙酸锌(99.9%)、硒粉(Se,99.9%),硫粉(S,99.99%)、油酸(OA,90%)、1-十八烯(ODE,90%),三辛基膦(TOP,97%)、聚(苯乙烯-马来酸酐)(PSMA,MW=1900)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC),牛血清白蛋白(BSA)和油胺购自Sigma-Aldrich。缓冲液制备用丙酮、氯仿、乙醇、甲苯、十二烷基硫酸钠(SDS)和无机盐(Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl、NaOH、KCl、KH2PO4、HCl)均来自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1:
本实施例中核壳结构磁性米粒子的制备方法如下:
步骤1、制备Fe3O4
将FeCl3·6H2O(1.350g)、乙酸铵(3.854g)和柠檬酸钠(0.400g)与70mL乙二醇在烧瓶中混合,并在170℃下剧烈搅拌1h。然后,将混合物转移到内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中,并加热至200℃反应16h,以获得Fe3O4纳米颗粒。其形貌如图3a左所示,Fe3O4由纳米晶组成,粒径为150nm。为了准备稍后使用,混合物用乙醇洗涤三次。
步骤2、在Fe3O4核的表面包覆TiO2壳
在室温下,将制备的Fe3O4纳米颗粒超声分散在90mL乙醇和30mL乙腈的混合溶液中,将0.5mL NH3·3H2O加到上述混合溶液。然后,向上述悬浮液中加入1mL正硅酸四乙酯(TBOT)后反应1.5h。最后,将产物(Fe3O4/TiO2)在乙醇和乙腈中洗涤后备用。其形貌如图3a右所示,Fe3O4/TiO2为核/壳结构,粒径为225nm。
实施例2:
本实施例中油溶性荧光纳米粒子的制备方法如下:
步骤1、将0.1mmol CdO、4mmol无水醋酸锌溶解于5mL油酸和15mL十八烯混合溶液中,加热至150℃,通N2脱气30分钟。
步骤2、将上述混合溶液物加热至300℃,直到其变清,然后加入3mL含0.4mmol硒粉和4mmol硫粉的三辛基膦溶液。将上述溶液保持在300℃以促进CdSe/ZnS量子点的生长。
步骤3、将溶液冷却至室温,加入丙酮后沉淀得到CdSe/ZnS,用甲苯和丙酮洗涤三次。最后,将产物CdSe/ZnS分散在甲苯中。
如图2(a-c)所示,Fe3O4、Fe3O4/TiO2和TiO2的吸收光谱与GQD(绿色CdSe/ZnS)发射光谱的重叠度依次减小。如图2(d-f)所示,Fe3O4、Fe3O4/TiO2和TiO2的吸收光谱与YQD(黄色CdSe/ZnS)发射光谱的重叠度依次减小。如图2(g-h)所示,Fe3O4、Fe3O4/TiO2和TiO2的吸收光谱与RQD(红色CdSe/ZnS)发射光谱的重叠度依次减小。上述结果表明,TiO2外壳能有效降低Fe3O4在可见光区的强光谱吸收作用。
为了验证光谱吸收弱且光谱重叠程度较小的磁纳米粒子能够有效抑制荧光猝灭效应,分别在溶液中研究了Fe3O4和Fe3O4/TiO2磁纳米粒子对GQDs、YQDs和RQDs荧光强度的影响。如图3b所示,在GQDs、YQDs和RQDs溶液中分别加入Fe3O4磁纳米粒子时,随着Fe3O4浓度的增加,GQDs、YQDs和RQDs的荧光强度依次降低,表明Fe3O4猝灭了GQDs、YQDs和RQDs的荧光。如图3c所示,在GQDs、YQDs和RQDs溶液中分别加入Fe3O4/TiO2磁纳米粒子时,随着Fe3O4/TiO2浓度的增加,GQDs、YQDs和RQDs的荧光强度也依次降低,表明Fe3O4/TiO2对GQDs、YQDs和RQDs也有一定程度的猝灭作用。但与Fe3O4相比,Fe3O4/TiO2对GQDs、YQDs和RQDs的猝灭程度较低。值得注意的是,在Fe3O4添加量相同的情况下,GQDs的荧光强度明显低于RQDs,这表明较小的光谱重叠有利于抑制磁纳米粒子对荧光纳米粒子发射光谱的吸收作用。
为了进一步证明Fe3O4/TiO2对GQDs、YQDs和RQDs的荧光猝灭效果要弱于Fe3O4,我们比较了Fe3O4和Fe3O4/TiO2在一系列GQDs、YQDs和RQDs浓度下对GQDs、YQDs和RQDs荧光强度的影响。如图3(d-f)所示,与Fe3O4相比,当Fe3O4/TiO2加入到GQDs、YQDs和RQDs中时,GQDs、YQDs和RQDs的荧光强度降低较少,结果表明光谱重叠程度较小且光谱吸收较弱的Fe3O4/TiO2磁纳米粒子能够有效抑制荧光猝灭效应。
实施例3:
本实施例中一种编码微球的制备方法如下:
步骤1、选择微球载体。根据微球载体的基质成分和直径可以限定编码微球的散射信号编码信息。如在本实施例中,选择如上所述的一类微球载体。
步骤2、采用膜乳化溶剂挥发法制备磁性荧光编码微球。用选择的聚苯乙烯马来酸酐共聚物(PSMA)包埋荧光纳米粒子和磁性纳米粒子。
将0.25g PSMA、一定量的CdSe/ZnS和Fe3O4/TiO2分散在含有4mL甲苯溶液中,将混合物通过膜乳化器乳化成液滴,接着在室温下搅拌24h固化液滴。最后,用水和乙醇清洗上述样品并离心分离得到聚苯乙烯马来酸酐包埋CdSe/ZnS和Fe3O4/TiO2的磁性荧光微球。
经检测,获得的编码微球如图4和图5所示,编码微球的粒径分布范围较窄,平均粒径为19.98μm。如图6a所示,可以通过膜乳化法制备一系列不同荧光强度和荧光种类的磁性荧光编码微球。
如图6(b-d)和(h-j)所示,GQDs、YQDs和RQDs编码微球的荧光共聚焦显微镜图表明其内部的荧光均匀性良好。同时,从图6(b-d)可以看出,(ⅰ)Fe3O4@QDs编码微球、(ⅱ)Fe3O4/TiO2@QDs编码微球和(ⅲ)QDs编码微球的荧光强度依次下降。上述结果表明,在微球内部,Fe3O4/TiO2对量子点的荧光猝灭作用也弱于Fe3O4。TiO2作为Fe3O4的壳层,能够很好地屏蔽Fe3O4对可见光的吸收。因此,Fe3O4/TiO2可以显著缓解荧光猝灭,并提高磁性量子点微珠的编码能力。此外,如图6(e-f)所示,Fe3O4@QDs编码微球和Fe3O4/TiO2@QDs编码微球水溶液中能形成良好的悬浮,在外加磁场作用下,几乎所有Fe3O4/TiO2@QDs编码微球在3分钟内被分离。上述结果表明磁性荧光编码微球具有良好的分散性和磁分离性能。
如图7所示,磁性荧光编码微球(标记为Barcode G1、Barcode Y1和Barcode R1)在不同的温度、pH和溶液中均具有良好的荧光稳定性,表明本发明提供的磁性荧光编码微球可用于实际检测。如图8(a-c)所示,通过Fe3O4/TiO2@GQDs、Fe3O4/TiO2@YQDs和Fe3O4/TiO2@RQDs构建的单色条码库的编码数量为6。如图8d所示,通过Fe3O4/TiO2@QDs构建的双色(绿色和红色)条码库的编码数量为30。本发明提供的磁性荧光微球的编码数量优于现有技术(直接合成法和溶胀法)获得的编码数量。
实施例4:
本实施例对聚苯乙烯马来酸酐共聚物磁性荧光微球应用于肿瘤标记物的免疫分析检测,构建液相悬浮生物芯片体系。步骤如下:
步骤1、将捕获抗体连接在磁性微球表面。四种不同荧光强度的绿色磁性荧光微球分别标记为G1、G2、G3和G4。G1、G2、G3和G4分别连接捕获抗体CA125、CAS99、AFP和NSE。以G1与CA125的生物偶联为例,用NHS和EDC溶液活化2×104个微球,然后用PBS洗涤。接下来,将上述活化的微球与一定量的CA125捕获抗体在500μL PBS中于孵育12h,以获得连接了捕获抗体的微球(cAbs-MBs)。
步骤2、抗原(肿瘤标记物)与cAbs-MBs孵育。将100μL不同浓度(0、0.001KU/L、0.01KU/L、0.1KU/L、1KU/L、10KU/L、100KU/L、1000KU/L)的CA125抗原(Ags-CA125)溶液与cAbs-MBs孵育,以获得Ags-cAbs-MBs。
步骤3、孵育得到GQD-CA125-MBs。QDs标记的检测抗体(QDs-dAbs)与Ags-cAbs-MBs(QDs-d Abs-Ags-cAbs-MBs)孵育。将100μL GQDs dAbs与Ags-cAbs-MBs孵育以获得QDs-dAbs-Ags-cAbs-MBs(GQD-CA125-MBs)。最后,通过流式细胞术测量样品。
免疫分析检测结果分析如下:
如图9(a-d)所示,肿瘤标志物浓度(CA125、CAS99、AFP和NSE)与其归一化的MFI(平均荧光强度)的拟合标准曲线具有良好的线性关系。基于磁性荧光编码微球构建的生物芯片获得的CA125、CAS99、AFP和NSE的检测限(LOD)分别为0.89KU/L、0.72KU/L、0.05ng/mL和0.15ng/mL。基于非磁性荧光编码微球构建的生物芯片获得的CA125、CAS99、AFP和NSE的检测限(LOD)分别为1.03KU/L、0.96KU/L、0.12ng/mL和0.19ng/mL。说明基于本发明提供的磁性荧光编码微球构建的液相生物芯片具有更高的灵敏度。
Claims (10)
1.基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球,其特征在于:包括微球载体、荧光纳米粒子与磁性纳米粒子,微球载体为聚合物微球,微球载体内部包埋荧光纳米粒子与磁性纳米粒子;所述荧光纳米粒子为油性半导体量子点;所述磁性纳米粒子为核壳结构的Fe3O4/TiO2复合纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的磁性荧光编码微球,其特征在于:所述的聚合物微球的基质成分为聚苯乙烯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、聚丙烯酸、聚丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二乙烯基苯和/或由上述聚合物中所涉及的两种或两种以上单体所形成的共聚物。
3.根据权利要求1所述的磁性荧光编码微球,其特征在于:所述的聚合物微球内部包埋亲油性荧光纳米粒子,亲油性荧光纳米粒子为半导体纳米粒子。
4.根据权利要求1所述的磁性荧光编码微球,其特征在于:所述的微球载体的直径为1μm~50μm。
5.根据权利要求1所述的磁性荧光编码微球,其特征在于:所述的油性半导体量子点的发射波长相差大于30nm,量子点表面带有疏水功能基团,量子点与磁性纳米粒子能分散于油溶性溶剂中。
6.根据权利要求1所述的磁性荧光编码微球,其特征在于:所述的核壳结构的Fe3O4/TiO2复合纳米粒子的壳为TiO2,核为不含有TiO2的磁性材料,磁性材料包括铁、钴、镍的氧化物及其合金。
7.基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球阵列,其特征在于:包括至少两种如权利要求1-6中任一项所述的磁性荧光编码微球,各种磁性荧光编码微球间具有不同的编码信息。
8.根据权利要求7所述的磁性荧光编码微球阵列,其特征在于:所述的磁性荧光编码微球外表面生物偶联捕获抗体,捕获抗体可与抗原相连接。
9.基于可见光区光谱吸收较弱磁性材料的磁性荧光编码微球阵列在一种或者多种目标物检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述的目标物包括蛋白质、DNA与RNA。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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