CN115862733A

CN115862733A - 基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法

Info

Publication number: CN115862733A
Application number: CN202310167032.XA
Authority: CN
Inventors: 张巍; 郭祥学; 郭瑞东
Original assignee: Jiajian Guangzhou Bioengineering Technology Co ltd; Guangzhou Jiajian Medical Testing Co ltd
Current assignee: Jiajian Guangzhou Bioengineering Technology Co ltd; Guangzhou Jiajian Medical Testing Co ltd
Priority date: 2023-02-27
Filing date: 2023-02-27
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2043-02-27
Also published as: CN115862733B

Abstract

本发明公开了基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，所述方法包含以下步骤：对样本进行DNA提取与建库，并将过滤后的下机数据与人类参考基因组进行比对，将比对结果文件进行排序；对比对结果文件进行变异识别，得到变异结果文件；对变异结果文件进行测序深度过滤，然后进行滑动切割，最终得到多个bin，根据变异等位基因频率的大小进行分类并统计其个数；分别计算每个bin每个类型变异的Z_score，求其均值并分染色体绘制多类位点个数和对应Z_score的折线图。本发明可以较低的成本、准确地判别杂合性缺失，且通过Z_score的折线图可以直观地显示出AOH阴性和阳性样本的区别。

Description

基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法

技术领域

本发明涉及基因组改变检测领域，特别涉及基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法。

背景技术

DNA中的信息来源于父母两方，包含在两个等位基因上。其中杂合性缺失（即AOH）是一种基因组改变，指位于在数兆bp到整染色体层面上，一对同源染色体上的相同基因座位的两个等位基因中的一个发生缺失，导致该区域只包含纯合变异，不包含杂合变异。

针对AOH的检测，通常采用PCR测序或SNP阵列芯片检测。使用PCR法检测时，会针对感兴趣的区域设计扩增引物，之后通过qPCR判断感兴趣区域是否包含杂合突变，如不包含，则称该区域包含AOH，如包含杂合变异，则判定为未检出AOH。SNP微阵列芯片可同时检测多个预设的SNP位点的分型，如果在染色体某段区域中，大部分位于微阵列芯片上的SNP位点都被检出为纯合子，则可以据此判定上述区域为AOH阳性，否则为AOH阴性。

对于检测基因数较少的情况，可采用PCR测序法检测，但当待检测基因数目过多时，由于实验操作及PCR技术的限制，该方法将无法进行检测，原因在于：不同区域的反应温度不同，且引物数量过多之后，会造成二聚体，产生非特异性扩增，不同引物间的错配，从而导致数据中有用数据的比例变少，还会影响分析结果都准确性。

基于SNP阵列芯片，可以判别预设的临床关键区域的AOH，而不是全基因组所有区域的AOH，且SNP阵列芯片检测成本较高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，可用于检测来自个体（例如孕妇羊水，流产物或新生儿）的生物样品中杂合性缺失(aoh)，例如拷贝数中性杂合性丢失(cn-loh)的方法，可以较低的成本实现高精度的AOH检测。

本发明的另一目的在于提供基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的装置。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：

基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，包含以下步骤：

S1、对样本进行DNA提取与建库，并将过滤后的下机数据与人类参考基因组进行比对，将比对结果文件进行排序；

S2、对比对结果文件进行变异识别，得到变异结果文件；

S3、对变异结果文件进行测序深度过滤，然后进行滑动切割，最终得到多个bin，根据变异等位基因频率的大小进行分类并统计其个数；

S4、分别计算每个bin每个类型变异的Z_score，求其均值并分染色体绘制多类位点个数和对应Z_score的折线图。

步骤S1中，所述将比对结果文件进行排序是通过Samtools实现。

所述步骤S2，具体为：按比对到的基因组所在位置，找出下机数据和参考序列特定位置碱基存在的差异的碱基，统计上述存在差异的位点上合计比对上多少条读，支持ACGT四种碱基各自对应的读有多少条读，将存在碱基差异位点所在的染色体编号，染色体位置，ACGT分别对应的读的条数记录于文件中，之后找出ACGT中对应最多的碱基，将每种碱基对应的读的条数除以ACGT四种碱基总和，得到变异结果文件（即VAF，Variant AlleleFrequency）。

步骤S3中，所述对变异结果文件进行测序深度过滤之前，还需要对变异结果文件进行过滤：将变异中的Indel（插入删除）类变异删除。Indel变异准确性较低，故将其删除。

步骤S3中，所述对变异结果文件进行测序深度过滤：只保留测序深度在5x到（avg+4sd）之间的snp位点，其中，5x即5层，avg为该样本的snp位点平均深度，sd为该样本的snp位点测序深度的标准差。

当测序深度低于5层的区域用于变异检测时，单个 SNV 检测的准确性急剧下降。低覆盖度加上随机采样比对误差、测序误差等使得信号噪声大于信号噪声，从而使得提取单个 SNV 基因型信息变得不可靠。通过去除测序深度过低的位点，可以确保对变异类型的分类是准确的，测序深度过高的点，是由于基因组GC含量，重复区域等原因造成的异常位点，引入这样的异常位点，将为下游分析带来的与AOH无关的混杂因素，因此去除深度异常高的位点。

每个所述bin分为4类，分别为：AB、B、AAB、ABB，统计每个bin中四类位点的个数；

其中，AB代表杂合位点，B代表纯合位点， AAB和ABB为检测样本为三倍体，或包含嵌合体时会出现的基因型，在不存在三倍体或嵌合体时，ABB和AAB代表了由于测序时双链的不均一性带来的噪音；

通过下式分别计算每个bin每个类型的Z_score：

B_Z_score= (B_count- B_base_bin_avg) / B_base_bin_sd；

AB_Z_score= (AB_count - AB_base_bin_avg) / AB_base_bin_sd；

ABB_Z_score= (ABB_count - ABB_base_bin_avg) / ABB_base_bin_sd；

AAB_Z_score= (AAB_count - AAB_base_bin_avg) / AAB_base_bin_sd；

其中，B_base_bin_avg，AB_base_bin_avg，AAB_base_bin_avg，ABB_base_bin_avg为健康中国人群在同一区域对应的bin中，去除极端值（即保留深度排名为10%-90%样本）的四类位点个数均值，B_base_bin_sd，AB_base_bin_sd，AAB_base_bin_sd，ABB_base_bin_sd为健康中国人群在该bin中，去除极端值（即保留深度排名为10%-90%样本）的四类位点个数的标准差。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：

基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的装置，包括比对模块、变异识别模块、多个bin获取模块、Z_score的折线图转换模块；其中：比对模块，用于对样本进行DNA提取与建库，并将过滤后的下机数据与人类参考基因组进行比对，将比对结果文件进行排序；

变异识别模块，用于对比对结果文件进行变异识别，得到变异结果文件；

多个bin获取模块，用于对变异结果文件进行测序深度过滤，然后进行滑动切割，最终得到多个bin，根据变异等位基因频率的大小进行分类并统计其个数；

Z_score的折线图转换模块，用于分别计算每个bin每个类型变异的Z_score，求其均值并分染色体绘制多类位点个数和对应Z_score的折线图。

同时，本发明提供：

一种服务器，所述服务器包括处理器和存储器，所述存储器中存储有至少一段程序，所述程序由所述处理器加载并执行以实现上述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法。

一种计算机可读存储介质，所述存储介质中存储有至少一段程序，所述程序由处理器加载并执行以实现上述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

1、本发明提供了一种可平衡临床检测准确性和低经济负担的AOH检测方法，该方法可以较低的成本，准确地判别杂合性缺失。通过分bin后四类变异绝对数量及Z_score的折线图，可以直观地显示出AOH阴性和阳性样本的区别，通过Z_score，可降低数据中由于测序随机性带来的噪音，从而使代表AOH的信号能够充分地展现，从而提升了方法的稳健性。

2、本发明通过中深度全基因组测序，可以低成本检测基因组全部区域的AOH，而不必引入PCR扩增。

3、本发明检测区域包含全基因组，可避免下游医学解读漏检，从而提高检测的价值。

附图说明

图1为AOH阴性样本分bin统计四类变异个数的折线图。

图2为AOH阴性样本分bin计算后杂合与纯合变异的Z_score折线图。

图3为全染色体AOH阳性样本四类变异分bin统计绝对个数的折线图。

图4为全染色体AOH阳性样本分bin计算后杂合与纯合变异的Z_score折线图。

图5为染色体部分区域AOH阳性样本四类变异分bin统计绝对个数的折线图。

图6为染色体部分区域AOH阳性样本分bin计算后杂合与纯合变异的Z_score折线图。

图7为本发明所述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的装置的结构示意图。

图8为本发明所述服务器的结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，包含以下顺序的步骤：

（1）采集病患和健康人的外周血样本，基于全基因组芯片测序，判定是否包含AOH；

（2）针对每个样本，使用同一管样本进行中深度（5x以上）全基因组测序，插入片段长度200-500bp，读长为双端150bp；

（3）使用fastp v0.23.2 版下的默认参数过滤下机数据，过滤后的读用于下游比对；

（4）使用bwa 0.7.17版将第三步过滤得出的数据与人类参考基因组 (GRCh37/hg19) 进行比对；

（5）使用samtools 1.13版中的sort命令，按染色体编号及位置对变异结果排序；

（6）按比对到的基因组所在位置，检索下机数据的比对结果，找出与参考序列特定位置存在的差异碱基的读，统计上述存在差异的位点上合计比对上多少条读，记作该区域的总深度DP，之后分别统计支持ACGT四种碱基各自对应的对应的读有多少条读，将ACGT中支持的碱基深度最多的是称为Allele depth，Variant allele frequency（VAF，变异碱基频率）的定义为AD/DP；将存在碱基差异位点所在的染色体编号，染色体位置，ACGT分别对应的读的条数及VAF记录于文件中，该文件被称为变异结果文件；

（7）将变异中的Indel（插入删除）类变异删除；

（8）计算该样本的snp位点平均深度avg和snp位点测序深度的标准差sd；

（9）测序深度过滤，只保留5x到（avg+4sd）的snp位点；

（10）对变异检测文件进行滑动切割，按200k为1个bin，将检出的变异分段；

（11）在每一个bin中，根据VAF（变异等位基因频率）的大小，分为4类，分别为AB（25%-75%）、 B（100%），AAB（0-25%）及ABB（75%-100%）。AB代表杂合位点，B代表纯合位点，AAB和ABB为检测样本为三倍体，或包含嵌合体时会出现的基因型，在不存在三倍体或嵌合体时，ABB和AAB代表了由于测序时双链的不均一性带来的噪音，统计每个bin中四类位点的个数；

（12）根据下列公式分别计算每个bin，四种类型的Z_score：

B_Z_score= (B_count- B_base_bin_avg) / B_base_bin_sd；

AB_Z_score= (AB_count - AB_base_bin_avg) / AB_base_bin_sd；

ABB_Z_score= (ABB_count - ABB_base_bin_avg) / ABB_base_bin_sd；

AAB_Z_score= (AAB_count - AAB_base_bin_avg) / AAB_base_bin_sd ；

其中，B_base_bin_avg，AB_base_bin_avg，AAB_base_bin_avg，ABB_base_bin_avg为健康中国人群在同一区域对应的bin中，去除极端值（即保留深度排名为10%-90%样本）的四类位点个数均值，B_base_bin_sd，AB_base_bin_sd，AAB_base_bin_sd，ABB_base_bin_sd为健康中国人群在该bin中，去除极端值（即保留深度排名为10%-90%样本）的四类位点个数的标准差；

（13）针对每个窗口，会向后滑动5个窗口，计算该bin与之后10个bin中，四类位点个数与对应zscore的均值；

（14）根据步骤（13）得出的数据，分染色体绘制四类位点个数和对应zscore的折线图，其中横轴为变异在特定染色体上的位置，单位为Mbp。通过对比AOH阴性及阳性样本的可视化结果，与AOH阴性样本指出两者存在显著差异，说明该方法可判别AOH；

（15）对每个bin中，待检测样本的杂合与纯合的个数与阴性样本进行T检验，计算区域的p值，如p值小于0.05，判定为即统计显著的AOH区域。

图1中，可以看出：代表杂合变异（AB）的线的绝对数目多于代表纯合变异（B）的线的数目。

图2中，可以看出：杂合（AB）的线与代表纯合（B）的线在-1到1之间震荡。

图3中，可以看出：代表纯合变异（B）的线的绝对数目多于代表杂合变异（AB）的线的数目。

图4中，可以看出：代表杂合（AB）的线显著小于0，而代表纯合的线（B）则显著大于0，均值大于2

图5中，可以看出：发生AOH的区域（130Mb-150Mb）中，代表纯合变异（B）的线的绝对数目多于代表杂合变异（AB）的线的数目。

图6中，可以看出：发生AOH的区域（130Mb-150Mb）中代表杂合（AB）的线显著小于0，而代表纯合的线（B）则显著大于0，均值大于2。

如图7，基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的装置，包括比对模块、变异识别模块、多个bin获取模块、Z_score的折线图转换模块；其中：

比对模块，用于对样本进行DNA提取与建库，并将过滤后的下机数据与人类参考基因组进行比对，将比对结果文件进行排序；

同时，如图8，一种服务器，所述服务器包括处理器和存储器，所述存储器中存储有至少一段程序，所述程序由所述处理器加载并执行以实现上述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，其特征在于，包含以下步骤：

S2、对比对结果文件进行变异识别，得到变异结果文件；

2.根据权利要求1所述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，其特征在于，步骤S1中，所述将比对结果文件进行排序是通过Samtools实现。

3.根据权利要求1所述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，其特征在于，所述步骤S2，具体为：按比对到的基因组所在位置，找出下机数据和参考序列特定位置碱基存在的差异的碱基，统计上述存在差异的位点上合计比对上多少条读，支持ACGT四种碱基各自对应的读有多少条读，将存在碱基差异位点所在的染色体编号，染色体位置，ACGT分别对应的读的条数记录于文件中，之后找出ACGT中对应最多的碱基，将每种碱基对应的读的条数除以ACGT四种碱基总和，得到变异结果文件。

4.根据权利要求1所述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，其特征在于，步骤S3中，所述对变异结果文件进行测序深度过滤之前，还需要对变异结果文件进行过滤：将变异中的Indel类变异删除。

5.根据权利要求1所述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，其特征在于，步骤S3中，所述对变异结果文件进行测序深度过滤：只保留测序深度在5x到（avg+4sd）之间的snp位点，其中，5x即5层，avg为该样本的snp位点平均深度，sd为该样本的snp位点测序深度的标准差。

6.根据权利要求1所述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法，其特征在于，每个所述bin分为4类，分别为：AB、B、AAB、ABB，统计每个bin中四类位点的个数；

通过下式分别计算每个bin每个类型的Z_score：

B_Z_score= (B_count- B_base_bin_avg) / B_base_bin_sd；

AB_Z_score= (AB_count - AB_base_bin_avg) / AB_base_bin_sd；

ABB_Z_score= (ABB_count - ABB_base_bin_avg) / ABB_base_bin_sd；

AAB_Z_score= (AAB_count - AAB_base_bin_avg) / AAB_base_bin_sd；

其中，B_base_bin_avg，AB_base_bin_avg，AAB_base_bin_avg，ABB_base_bin_avg为健康中国人群在同一区域对应的bin中，去除极端值的四类位点个数均值，B_base_bin_sd，AB_base_bin_sd，AAB_base_bin_sd，ABB_base_bin_sd为健康中国人群在该bin中，去除极端值的四类位点个数的标准差。

7.基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的装置，其特征在于，包括比对模块、变异识别模块、多个bin获取模块、Z_score的折线图转换模块；其中：

8.一种服务器，其特征在于，所述服务器包括处理器和存储器，所述存储器中存储有至少一段程序，所述程序由所述处理器加载并执行以实现如权利要求1-6任一项所述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法。

9.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述存储介质中存储有至少一段程序，所述程序由处理器加载并执行以实现如权利要求1-6任一项所述基于中深度全基因组二代测序检测杂合性缺失的方法。