CN115851939A - 环状RNA cZNF215及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了环状RNA cZNF215及其用途，基于发明人对环状RNA cZNF215(CircBase ID:hsa_circ_0008338)在肝胆管癌细胞生长和转移中的功能和机制研究，提供一种诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒、用于肝内胆管细胞癌患者预后评估的试剂盒、治疗肝内胆管细胞癌的药物组合物，以及环状RNA cZNF215作为治疗靶点在肝内胆管细胞癌的预后、诊断和治疗中的应用。

Description

环状RNA cZNF215及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及环状RNA CircZNF215，包含该环状RNA的试剂盒、药物组合物，以及该环状RNA在诊断、治疗肝内胆管细胞癌，以及肝内胆管细胞癌预后中的应用。

背景技术

肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是第二常见的原发性肝脏恶性肿瘤。由于非酒精性脂肪性肝病和丙型肝炎患病率的增加，肝内胆管细胞癌的发病率在全球范围内呈增长态势，过去10年平均每年增长4.4％。ICC在早期通常是无症状的，大多数患者诊断出ICC时已处于晚期，可选用的治疗手段有限，造成临床效果不佳。

当前，根治性切除仍是治愈ICC的主要手段，但60％的手术患者存在复发或转移性疾病。发明人团队致力于探寻ICC转移的分子机制，确定能够抑制转移的新治疗靶点以改善ICC患者的生存结果。在前期的研究成果中，公开了环状RNA cGGNBP2、CircNFIB在肝内胆管细胞癌诊断、治疗及预后中的用途，通过特有的机制抑制ICC的生长和转移。

环状RNA cZNF215(CircBase ID:hsa_circ_0008338)是一种已知的环状RNA，具有与其他环状RNA一样，其不易被降解，相较于线性RNA能够更稳定地存在于生物体中。cZNF215包含基因ZNF215的第2个至第4个外显子，其环化的核苷酸序列有405个碱基，目前尚未有任何关于环状RNA cZNF215在诊断、治疗肝内胆管细胞癌，以及肝内胆管细胞癌预后中应用的报道。

发明内容

PI3K/AKT是一个典型的致癌信号通路，在肝内胆管细胞癌中经常被异常激活。PTEN是第一个被发现具有磷酸酶功能的肿瘤抑癌基因并且在癌症中常发生失调，大量研究表明PTEN的失活可以激活PI3K/AKT通路。进一步地，有研究发现PTEN的活性是通过氧化作用进行负向调节的，在细胞有氧和无氧代谢过程中不断产生的包括超氧化物(O₂-)和过氧化氢(H₂O₂)在内的活性氧(ROS)可以通过氧化诱导PTEN失活，被氧化失活后的PTEN导致PI3K/AKT通路过度激活，从而促进癌症进展。同时，Prdx1是过氧化物蛋白中的一员，已有研究证实在氧化应激下Prdx1可以结合PTEN并防止PTEN被氧化从而发挥PTEN的抑瘤功能。

本发明中，发明人发现一种新的机制，即环状RNA cZNF215与Prdx1存在竞争性地相互作用。如图1所示，较高的cZNF215表达(cZNF215 high)将抑制Prdx1与PTEN的结合，cZNF215与Prdx1大量结合致使PTEN被活性氧氧化失活，从而激活PI3K/AKT通路，最终促进ICC的生长和转移；而较低的cZNF215表达(cZNF215 low)无法与PTEN竞争Prdx1结合位点，因此Prdx1可以大量与PTEN结合从而保护PTEN不被活性氧氧化，进而使得PTEN抑制PI3K/AKT通路并发挥抑制ICC生长和转移的作用。

通过分析cZNF215表达与ICC患者临床病理特征之间的关系发现，较高的cZNF215表达与更多的肿瘤数量和更大的肿瘤体积、淋巴结转移、微血管侵犯以及更晚的肿瘤分期相关，表明cZNF215参与了ICC进展，且cZNF215表达较高的患者的总生存期(OverallSurvival，OS)和无复发生存率(Recurrence-Free Survival，RFS)更短，通过单因素和多因素分析发现，cZNF215的表达升高被认为是OS和RFS的独立危险因素，表明高cZNF215表达水平可以作为ICC患者的重要的预后指标之一。功能性研究表明，cZNF215在体外和体内促进了ICC细胞的增殖和转移。其中，体外实验表明，敲低cZNF215能够显著地抑制细胞的生长、迁移和侵袭能力，体内实验表明，敲低cZNF215将抑制肿瘤的生长、肝内转移和肺转移。不仅如此，发明人还发现帕他色替(ipatasertib)，一种AKT特异性抑制剂，与敲低编码cZNF215的慢病毒载体共同治疗相比于仅采用帕他色替进行治疗，显示出了更强的肿瘤抑制作用，表明cZNF215的外源性敲低能够增强帕他色替的抗肿瘤作用。

以上，实验结果及机理研究均表明环状RNA cZNF215在ICC细胞的生长与转移中发挥至关重要的作用，可作为治疗肝内胆管细胞癌的潜在的药物作用靶点。

本发明的目的在于基于发明人对环状RNA cZNF215在肝胆管癌细胞生长和转移中的功能和机制研究，提供一种诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒、治疗肝内胆管细胞癌的药物组合物，以及环状RNA cZNF215作为治疗靶点在肝内胆管细胞癌的预后、诊断和治疗中的应用。

本发明通过下述技术方案实现：

用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包括定量检测环状RNA的试剂，所述环状RNA的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

用于肝内胆管细胞癌患者预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括定量检测环状RNA的试剂，所述环状RNA的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

环状RNA cZNF215包含基因ZNF215的第2个至第4个外显子，其环化的核苷酸序列有405个碱基。

cZNF215对应的DNA序列为：

ATATGCCCTGCAAGGACTCTGCCCTGCAGATGGGGAGCATCAAGGAGAAAATGAAAGCTGGCTCACGAACAGGCAAACCACAGGAACCAGTGACATTCAAAGATGTGGTTGTGGAATTCAGCAAGGAAGAGTGGGGGCAACTGGACTCTGCTGTAAAGAACCTGTACAGGAATGTGATGCTGGAAAACTTTAGGAACCTGAATTCATTGCGTAAAGCACATCTACTTTCCAAACCATTTGAGAGCCTTAAGTTGGAGAGTAAGAAAAAAAGATGGATAATGGAGAAAGAAATACCAAGGAAGACTATTTTTGACATGAAGAGTATTTCTGGAGAAGAATCATCCCATGGAGTGATTATGACAAGGCTTACCGAAAGTGGACACCCTTCTTCAGATGCCTGGAAAG

cZNF215的序列为以下所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构：

AUAUGCCCUGCAAGGACUCUGCCCUGCAGAUGGGGAGCAUCAAGGAGAAAAUGAAAGCUGGCUCACGAACAGGCAAACCACAGGAACCAGUGACAUUCAAAGAUGUGGUUGUGGAAUUCAGCAAGGAAGAGUGGGGGCAACUGGACUCUGCUGUAAAGAACCUGUACAGGAAUGUGAUGCUGGAAAACUUUAGGAACCUGAAUUCAUUGCGUAAAGCACAUCUACUUUCCAAACCAUUUGAGAGCCUUAAGUUGGAGAGUAAGAAAAAAAGAUGGAUAAUGGAGAAAGAAAUACCAAGGAAGACUAUUUUUGACAUGAAGAGUAUUUCUGGAGAAGAAUCAUCCCAUGGAGUGAUUAUGACAAGGCUUACCGAAAGUGGACACCCUUCUUCAGAUGCCUGGAAAG

进一步地，对于用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒、或用于肝内胆管细胞癌患者预后评估的试剂盒，其所采用的定量检测环状RNA的试剂包括用于扩增所述环状RNA的引物，所述引物包括：

F：5'-TCAGATGCCTGGAAAGATATGC-3'(SEQ ID NO：3)

R：5'-CCCCACTCTTCCTTGCTGAA-3'(SEQ ID NO：4)。

进一步地，所述试剂盒还包括RNA提取试剂和逆转录反应体系。所述RNA提取试剂为Trizol试剂，所述逆转录反应体系包括逆转录酶、缓冲液、RNase抑制剂、Oligo、dNTPs等。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括环状RNA抑制剂和/或减少所述环状RNA表达量的试剂，以及药物学上可接受的载体，所述环状RNA的CircBase ID为hsa_circ_0008338。本技术方案中，药物组合物可以包含该环状RNA，环状RNA的敲低载体，其他能够抑制所述环状RNA表达量的试剂，或者任意组合。

进一步地，所述药物组合物还包括帕他色替。

本发明进一步提供前述的任一种药物组合物在制备用于抑制肝胆管癌细胞增殖、迁移的药物或治疗肝内胆管细胞癌的药物中的应用。

本发明还提供定量检测环状RNA cZNF215的试剂在制备用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒中的用途，所述环状RNA cZNF215的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

本发明还提供环状RNA cZNF215在制备或筛选治疗肝内胆管细胞癌的药物中的用途，所述环状RNA cZNF215的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

本发明还提供减少环状RNA cZNF215的表达量的试剂在制备治疗肝内胆管细胞癌的药物中的用途，所述环状RNA cZNF215的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明通过研究cZNF215的表达水平与临床病理特征、以及患者预后之间的关系，证明了cZNF215参与了ICC进展，并且cZNF215表达较高的患者的总生存期和无复发生存率更短，cZNF215的表达升高被认为是OS和RFS的独立危险因素，故cZNF215的表达水平可以作为ICC患者的一个重要预后指标；

2、本发明通过CCK-8增殖实验发现敲低cZNF215能够显著地抑制ICC细胞的增殖能力，通过Transwell迁移与侵袭实验证实cZNF215敲低之后，ICC细胞迁移与侵袭能力受到明显抑制，表明cZNF215能够作为治疗靶点应用于ICC的治疗；

3、本发明通过构建裸鼠皮下肿瘤模型、裸鼠肝癌原位模型和裸鼠肺转移模型，检验了敲低cZNF215对裸鼠体内ICC细胞增殖、侵袭和转移的影响，证明了敲低cZNF215在动物体内起到抑制ICC细胞增殖、侵袭和转移的作用；

4、本发明发现，在cZNF215敲低的ICC细胞中，帕他色替的IC50显著下降，表明cZNF215低表达可以增强帕他色替的抗肿瘤活性，同时，皮下异种移植瘤模型显示，敲低cZNF215与帕他色替的组合相较于单独敲低cZNF215或单独使用帕他色替，能够进一步抑制肿瘤的生长。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明中较高表达的cZNF215(cZNF215 high)和较低表达cZNF215(cZNF215low)对ICC进程影响的机理图；

图2为本发明具体实施例中cZNF215的特征结构图、以及cZNF215扩增产物拼接位点的一代测序图；

图3为本发明具体实施例中引物Random hexamer和oligo(dT)18primers对cZNF215和mZNF215的qRT-PCR结果对比图；

图4为本发明具体实施例中在指定时间点利用放线菌素D处理HuCCT1细胞后，通过qRT-PCR检测的cZNF215和mZNF215的相对RNA表达水平；

图5为本发明具体实施例中qRT-PCR检测肿瘤组织和匹配的非肿瘤组织中cZNF215的表达结果对比图；

图6示出了本发明具体实施例中Kaplan-Meier生存分析显示ICC患者的cZNF215表达水平与总生存期(Overall Survival)、无复发生存率(Recurrence-free Survival)之间的相关性

图7为本发明具体实施例中敲低cZNF215的HuCCT1细胞和RBE细胞中的细胞增殖结果，其中(a)为HuCCT1细胞和RBE细胞增殖的荧光视野，(b)为敲低cZNF215的HuCCT1细胞和RBE细胞的增殖能力量化分析图；

图8示出了本发明具体实施例中敲低cZNF215的HuCCT1细胞和RBE细胞的细胞侵袭(invasion)和迁移能力(migration)；

图9示出了本发明具体实施例中敲低cZNF215对裸鼠体内肝癌肿瘤生长的影响，其中(a)为裸鼠皮下注射敲低cZNF215的RBE细胞后裸鼠皮下成瘤情况；(b)为裸鼠皮下肿瘤体积增长曲线；

图10示出了本发明具体实施例中敲低cZNF215对裸鼠体内肿瘤肝内转移的影响，其中(a)为荧光视野，展示了裸鼠肝包膜下注射敲低cZNF215的RBE细胞的肝内转移瘤结果；(b)为裸鼠肝脏转移瘤HE染色照片；(c)为肝内成瘤实验量化分析图，其中纵坐标为荧光视野下的肿瘤个数；

图11示出了本发明具体实施例中敲低cZNF215对裸鼠体内肿瘤的肺转移的影响，其中(a)为荧光视野，展示了裸鼠尾静脉注射敲低cZNF215的RBE细胞的肺转移瘤结果；(b)为裸鼠肺转移肿瘤HE染色照片；(c)为肺转移实验量化分析图，其中纵坐标为荧光视野下的肿瘤个数。

图12示出了本发明具体实施例中敲低cZNF215的ICC细胞帕他色替的IC50，表明cZNF215低表达可以增强帕他色替的抗肿瘤活性；

图13为本发明具体实施中稳定敲除cZNF215表达载体RBE细胞的皮下异种移植瘤模型，当皮下肿瘤体积达到100～130mm³时，连续14天，每天一次以75mg/kg的剂量给小鼠口服帕他色替，图中示出了实验结束时切除肿瘤的具有代表性的图像；其中，si-NC+vehicle为没有喂帕他色替的对照载体，si-cZNF215+vehicle为没有喂帕他色替的cZNF215敲低载体，si-NC+ipatasertib为喂帕他色替的对照载体，si-cZNF215+ipatasertib喂帕他色替的cZNF215敲低载体。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明所涉及的技术为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。

除非另有说明，实施例中各实验方法采用现有的实验方法步骤，并严格按照试剂盒制造商说明执行。

本发明的各实施例中，经华西医院伦理审查委员会批准，根据委员会的政策向每位患者提供书面知情同意书，在患者完全知情并签署知情同意书后，纳入2010年10月至2017年12月在四川大学华西医院接受根治性手术的120例ICC患者。选择含有30例组织进行环状RNA测序，其中包含15例术后出现肝外转移的原发性ICC组织和15例无术后转移或复发的原发性ICC组织。随访期定义为手术至死亡或复发的时间间隔。总生存期(OS)定义为从手术到死亡的时间间隔。无复发生存率(RFS)定义为从手术到检测到任何类型的复发的时间间隔。

本发明的各实施例中，所有人类ICC细胞系(HuCCT1、HCCC9810、RBE)均购自上海生命科学研究院，细胞系在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃和5％CO2的加湿培养箱中培养。

本发明的各实施例中，统计分析采用SPSS 26.0和Prism version 9.0完成。数据显示为平均值±标准偏差(SD)。根据中位表达水平确定ICC组织中相对cZNF215表达量的截断值。生存数据采用Kaplan-Meier法测量，采用时序检验分析。P值小于0.05表示具有统计学意义。

【实施例1】

本实施例中，发明人设计能够扩增环状RNA cZNF215的特异性引物对，并利用该引物对扩增cZNF215，通过一代测序的方法证实了该环状RNA的拼接位点(back-splicesite)，之后通过Random hexamer和oligo(dT)18primers引物实验，确定了cZNF215为具有闭合环状结构的环状RNA分子而非线性RNA分子，通过放线菌素D实验证明了cZNF215的稳定性。

本实施例的实验方案如下：

使用Trizol试剂从RBE细胞中提取总RNA，采用超微量核酸测定仪检测细胞总RNA纯度和浓度。在冰上进行逆转录反应体系配制，配制完成后加入已准备好的细胞总RNA进行逆转录，所述逆转录反应体系为：

逆转录反应条件如下：

在37℃下反应15分钟，之后在85℃下反应5秒。降温至4℃后，将反应得到的cDNA稀释5倍，之后置于-20℃冰箱保存。

采用下述设计的引物对扩增逆转录得到的cDNA：

正向引物：5'-TCAGATGCCTGGAAAGATATGC-3'(SEQ ID NO：3)

反向引物：5'-CCCCACTCTTCCTTGCTGAA-3'(SEQ ID NO：4)。

利用上述引物对扩增逆转录得到的cDNA后，对扩增产物进行一代测序。如图2所示，cZNF215源自基因ZNF215的第2个至第4个外显子，一代测序的结果证明cZNF215存在反向剪切连接，且准确地显示了扩增产物的拼接位点，表明cZNF215的形成不是由于基因组的重组错配。

1.Random hexamer和oligo(dT)18primers实验：

使用Trizol试剂从HuCCT1中提取总RNA并测好浓度，采用Thermo scientific-revert aid first strand cDNA synthesis试剂盒，将4μg的总RNA分成两组，分别加入Random hexamer和oligo(dT)18primer孵育处理(42℃，60min)，之后于70℃终止孵育5分钟，随后通过实时PCR分析比较cZNF215和mZNF215的相对RNA表达水平。实验结果如图3所示，oligo(dT)18引物并不能逆转录出cZNF215，表明cZNF215不含poly A尾，证实cZNF215为环状结构。

2.放线菌素D实验：

HuCCT1细胞经放线菌素D(2μg/ml)处理0、4、8、12、24小时，通过实时PCR检测cZNF215和mZNF215的表达水平，并通过0小时组的值进行归一化。实验结果如图4所示，表明cZNF215的半衰期比mZNF215的半衰期更长，证明了环状RNA cZNF215的稳定性。

【实施例2】

本实施例中，通过荧光定量PCR检测cZNF215在肿瘤组织和对应的非肿瘤组织中的表达差异，发现cZNF215在肿瘤组织中的表达明显高于对应的非肿瘤组织，表明可以利用检测cZNF215的表达量来诊断肝内胆管细胞癌。

本实施例的实验方案如下：

使用总RNA分离试剂盒根据制造商的说明提取细胞和肿瘤组织的总RNA，采用ChamQ^TM SYBR@qPCR Master Mix进行实时PCR分析。RNA的相对表达通过β-肌动蛋白或U6标准化，并通过2-ΔΔCt法定量。

具体地，采用实施例1中的cDNA逆转录反应进行组织RNA逆转录。

在冰上进行PCR反应体系配制(以20μL体系为例)，配制完成后再加入已逆转录得到的cDNA模板。其中，PCR反应体系为：

用于扩增环状RNA的引物对采用实施例1中优选的引物对：

正向引物：5'-TCAGATGCCTGGAAAGATATGC-3'(SEQ ID NO：3)

反向引物：5'-CCCCACTCTTCCTTGCTGAA-3'(SEQ ID NO：4)

反应条件包括：

第一步：预变性——95℃，5分钟；

第二步：PCR反应(40个循环)——95℃，20秒；60℃，20秒；72℃，20秒。

第三步：融解曲线分析——65℃，5秒；95℃，5秒。

PCR扩增后进行定量分析。目标基因的相对表达量计算公式为：2-△△Ct＝2-【(△Ct)Test-(△Ct)Control】。其中，△Ct＝Ct目的-Ct管家，Ct目的为目标基因Ct值，Ct管家为管家基因Ct值，△Ct表示各样本目的基因相对管家基因的相Ct值，△△Ct＝(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示处理组相对对照组进行归一化，2-△△Ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。

上述qRT-PCR实验结果如图5所示。从图5可以看出，cZNF215在肿瘤组织(Tumor)中的表达水平明显高于非肿瘤组织(Normal)，表明cZNF215在ICC发生发展中有重要意义，能够在ICC诊断中产生积极作用。

【实施例3】

本实施例中，利用ICC组织中相对cZNF215表达量的中位值，将120名ICC患者分为cZNF215低表达组(n＝60)和cZNF215高表达组(n＝60)，β-肌动蛋白或者U6用作内源性对照。

如图6所示，通过Kaplan-Meier生存分析表明，cZNF215表达水平较高的ICC患者在治愈性切除后，总生存期和无复发生存率更短。

表1示出了单变量COX比例风险回归模型的总生存期和无复发生存率的预后因素。在单变量分析中，血清CA19-9的水平、肿瘤数量、肿瘤体积、肿瘤分化、微血管侵犯、淋巴结转移、TNM分期和cZNF215表达水平与总生存期、无复发生存率相关。

表1：

在多变量分析中，cZNF215的高表达与较差的肿瘤分化、更多的肿瘤数量和更大的肿瘤体积被确认为总生存期的独立危险因素。而cZNF215的高表达与较差的肿瘤分化、更晚的TNM分期、存在微血管侵犯一同被确认为无复发生存率的独立危险因素(表2)。

表2：

综上，cZNF215的表达水平升高为总生存期和无复发生存率的独立危险因素，表明cZNF215的表达水平可以作为ICC患者的理想的预后标志物，且cZNF215在ICC转移中具有肿瘤促进作用。

【实施例4】

本实施例中，为了评估cZNF215在ICC进展中的生物学功能，检查了细胞系HuCCT1和RBE的内源性cZNF215表达水平，且cZNF215通过siRNA对HuCCT1和RBE进行敲低。cZNF215敲低(si-cZNF215)及其对照(si-NC)根据标准程序进行稳定转染。

通过EdU细胞增殖实验发现，cZNF215敲低的HuCCT1、RBE的ICC细胞增殖能力受到明显抑制。通过Transwell迁移与侵袭实验可证实，cZNF215敲低将显著抑制细胞的迁移和侵袭能力。上述实验表明，cZNF215能够作为治疗靶点应用于ICC的治疗。

1.EdU细胞增殖实验

通过EdU测定检查细胞增殖活性。简言之，将悬浮于500μL培养基中的1×10⁴个细胞接种于12孔板中，然后加入EdU试剂做标记，在37℃孵育2小时，然后用4％多聚甲醛室温固定30min,接着Apollo染色，然后DNA染色，最后在荧光显微镜下观察并计数。

EdU细胞增殖实验结果见图7，cZNF215敲低后，HuCCT1和RBE细胞的EdU阳性率显著降低，表明ICC增殖能力受到明显抑制，其增殖速度明显减慢。

2.细胞迁移与侵袭实验

使用涂有(侵袭实验)或未涂有(迁移实验)基质胶的Transwell小室(8.0μm孔径，Corning Costar，Kennebunk，USA)。对于细胞迁移实验，将悬浮于500μL无血清1640培养基中的2×10⁴个细胞接种到24孔板的上室。对于基质胶侵袭实验，将悬浮在500μL无血清1640培养基中的4×10⁴个细胞接种到24孔板的上室，将含有10％FBS的1640培养基加入下室，24或48小时后，将迁移或侵入下室下表面的细胞用多聚甲醛固定并染色，之后于显微镜下观察。

实验结果见图8，证明敲低cZNF215的HuCCT1细胞和RBE细胞中，ICC细胞的迁移(Migration)与侵袭(Invasion)能力受到明显抑制。

【实施例5】

本实施例中，为研究cZNF215在体内的影响，通过构建裸鼠皮下肿瘤模型、裸鼠肝癌原位移植模型和裸鼠肺转移模型，通过慢病毒转染建立了HuCCT1细胞中的cZNF215(sh-cZNF215)，检验了敲低cZNF215的HuCCT1细胞中的cZNF215对裸鼠体内ICC细胞增殖、侵袭和转移的影响。

体内动物实验得到了四川大学华西医院动物伦理委员会的批准。采用5至6周龄BALB/c裸鼠。对于裸鼠皮下肿瘤模型，将悬浮于100μL PBS中的5×10⁶个稳定转染的ICC细胞皮下注射到裸鼠右侧腋窝，接种后，每周记录肿瘤的长度和宽度，并计算肿瘤体积(V＝1/2×a×b²，a为长轴，b为短轴)。五周后处死裸鼠，测量皮下肿瘤的重量。对于裸鼠肝癌原位移植模型，麻醉后将2×10⁶个细胞植入到肝左叶，六周后，腹腔注射D-荧光素后，通过IVIS@Lumina II系统观察肿瘤形成和转移。对于裸鼠肺转移模型，通过尾静脉注射2×10⁶个细胞，八周后在注射D-荧光素后通过IVIS系统扫描肺中的肿瘤转移，IVIS测量后处死小鼠，切除肿瘤组织用于进一步检测。

实验结果如图9至图11所示，cZNF215敲低后，肿瘤的生长受到了明显的抑制，在肝脏中观察到的肝内转移灶明显减少，且cZNF215的敲低抑制了肺转移的形成。

【实施例6】

帕他色替是一种新型靶向药，可特异性地抑制AKT，并广泛用于各种研究，在国外已被批准用于前列腺癌、乳腺癌的临床治疗。本实施例中，应用帕他色替抑制AKT并研究了cZNF215对帕他色替IC50(半抑制浓度)的影响。如图12所示，在cZNF215敲低的ICC细胞中，帕他色替的IC50显著降低，表明抑制cZNF215可以增强帕他色替的抗肿瘤活性。

在体内实验中，使用稳定转染的RBE细胞建立了裸鼠皮下肿瘤模型，当皮下肿瘤体积达到100-130mm³时，小鼠随机接受对照组(vehicle)或帕他色替(ipatasertib)治疗。小鼠每日一次口服帕他色替，剂量为75mg/kg，连续治疗14天，每7天测量一次肿瘤体积。如图13所示，帕他色替与cZNF215敲低载体共同治疗相比于仅采用帕他色替或cZNF215敲低载体进行治疗，显示出了更强的肿瘤抑制作用，表明cZNF215的外源性敲低能够增强帕他色替的抗肿瘤作用。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括定量检测环状RNA的试剂，所述环状RNA的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

2.用于肝内胆管细胞癌患者预后评估的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括定量检测环状RNA的试剂，所述环状RNA的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述定量检测环状RNA的试剂包括用于扩增所述环状RNA的引物，所述引物包括：

F：5'-TCAGATGCCTGGAAAGATATGC-3'(SEQ ID NO：3)

R：5'-CCCCACTCTTCCTTGCTGAA-3'(SEQ ID NO：4)。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RNA提取试剂和逆转录反应体系。

5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括环状RNA抑制剂和/或减少所述环状RNA表达量的试剂，以及药物学上可接受的载体，所述环状RNA的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

6.根据权利要求5所述的一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括帕他色替。

7.根据权利要求5或6所述的一种药物组合物在制备用于抑制肝胆管癌细胞增殖、迁移的药物或治疗肝内胆管细胞癌的药物中的应用。

8.定量检测环状RNA cZNF215的试剂在制备用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒中的用途，所述环状RNA cZNF215的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

9.环状RNA cZNF215在制备或筛选治疗肝内胆管细胞癌的药物中的用途，所述环状RNAcZNF215的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

10.减少环状RNA cZNF215的表达量的试剂在制备治疗肝内胆管细胞癌的药物中的用途，所述环状RNA cZNF215的CircBase ID为hsa_circ_0008338。

Images