CN115851782A - 一种水稻稻瘟病抗性基因bdr1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种水稻稻瘟病抗性基因BDR1及其应用，所述水稻稻瘟病抗性基因BDR1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。上述水稻稻瘟病抗性基因BDR1所编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ I DNO.2。本发明的有益效果：BDR1在M.oryzae感染下表达量迅速增加；而沉默或敲除BDR1显著提高了水稻品种的稻瘟病抗性。通过蛋白相互作用和激酶活性测定，我们发现BDR1直接与MPK3相互作用并使之磷酸化。敲除BDR1会降低稻瘟病菌诱导的MPK3磷酸化水平。转录组分析结果显示，稻瘟菌诱导的茉莉酸(JA)信号通路受BDR1和MPK3的负调控。BDR1‑MPK3分子模块，通过影响JA相关的防御反应负向介导水稻稻瘟病抗性。

Description

一种水稻稻瘟病抗性基因BDR1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种水稻稻瘟病抗性基因BDR1及其应用。

背景技术

由病原真菌Magnaporthe oryzae(M.oryzae)引起的水稻稻瘟病一直对全球粮食安全构成威胁(Pennisi 2010,Liu et al.2013)。最有效、最环保的防治方法是培育和种植作物的抗病品种(Hayashi et al.2010,Fisher et al.2012,Inoue et al.2013a)。最近的研究已经鉴定了几十个水稻稻瘟病抗性基因，为控制水稻病害提供了潜在的解决方案和措施(Liu et al.2013,Yin et al.2018)。然而，由于稻瘟病菌生理小种特异性的改变和致病性的快速变化，大多数抗性基因在几年内就会丧失抗病性。因此培育水稻稻瘟病持久抗性品种非常困难，迫切需要通过对水稻中潜在的靶基因进行操纵以便提高水稻对稻瘟病菌的免疫力，从而是水稻品种对稻瘟病均具有持久抗病能力(Nasir et al.2018)。)

水稻在长期演化过程中已经进化出复杂的先天免疫系统来识别和应对不同层次的病原体感染。先天性免疫反应系统的第一层被激活以检测保守的病原菌相关分子模式(PAMP)，触发由病原菌相关分子模式介导的先天免疫反应(即PTI)。然而，病原体已经进化出了通过在感染部位分泌效应蛋白来克服PTI的策略。同时，植物形成第二层先天免疫反应，通过宿主抗病基因(即R基因)编码蛋白识别病原菌分泌的效应蛋白，诱导小种特异性的效应物介导的免疫反应(即ETI)(Liu et al.2013)。)研究发现许多受体激酶可以识别病原体分泌的病原相关分子模式和效应分子(Kaku et al.2006,Liu et al.2012,Liao etal.2016)。例如，水稻几丁质诱导受体激酶1(CERK1)可以识别真菌几丁质并诱导下游防御反应(Kaku et al.2006,Zipfel 2008,Shimizu et al.2010)。水稻的基因组编码约1131个受体激酶基因(Liu et al.2014)。对于这些受体激酶的生物学功能(如对稻瘟病菌的反应)的我们的了解仍然有限。识别更多直接连接细胞外和细胞内间隔的受体激酶将有助于深入了解植物的抗病防御机制。

植物细胞表面包括质膜对于侵入的病原菌进行识别，随后激活各种细胞内部的防御反应机制，包括诱导氧化物迸发、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的级联反应、植物激素生物合成、抗菌化合物或酶类物质的积累和胼胝质积累，从而抑制或阻滞病原菌增殖(Nasir etal.2018)。植物丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的级联反应属于高度保守的信号系统，被病原菌相关的受体激酶(包括CERK1,FLS2和EFR等)激活(Lourdes et al.2000,Zipfel etal.2006)。生物化学和遗传学实验表明，在水稻对稻瘟病菌的抗性反应中有几个完整的水稻MAPK级联反应(Xiong et al.2003,Mitsuko et al.2010)。丝裂原蛋白激酶MPK3在水稻对稻瘟菌的抗性中起负调控作用(Xiong et al.2003)，而丝裂原蛋白激酶MPK6参与了几丁质诱导的二萜植物抗菌化合物的生物合成，作为抵御侵染水稻的稻瘟病菌所分泌的毒素(Mitsuko et al.2010)。最近的一项研究表明，MAPK激酶的激酶(MAPKKK)发生基因沉默的水稻株系表现出抑制基于几丁质的激酶MPK3和MPK6的激活，并表现对稻瘟病菌抗性的降低(Wang et al.2017)。越来越多的研究表明，植物激素茉莉酸酯(JA)通过介导抗菌化合物的生物合成，积极参与水稻对稻瘟菌的防卫反应(John.2009,Riemann et al.2013,Taniguchi et al.2014b)。JA生物合成基因的突变或过表达导致水稻对稻瘟菌的抗性发生改变(Mei et al.2006,Riemann et al.2013,Shimizu et al.2013)。此外，在水稻中过表达响应茉莉酸的MYB转录因子可以显著增加水稻对稻瘟菌的抗性(Cao et al.2015)。MAPKs在烟草和拟南芥中参与调控JA生物合成和信号通路(Meng et al.2013)。例如，最近有报道MPK6为拟南芥中JA信号通路的重要调控因子(Vishmita S.et al.2007)。据报道，在烟草中，损伤诱导的蛋白激酶(WIPK)和抑制蛋白激酶(SIPK)在昆虫对植物组织损伤产生茉莉酸的过程中是必需的(Kumar et al.2000,Seo et al.2010)。然而，MAPK与JA信号在水稻稻瘟病防御中的相互作用尚不明确。

发明内容

本发明的目的解决上述技术不足，而提供一种水稻稻瘟病抗性基因BDR1及其应用。

本发明解决问题采用的技术方案，一种水稻稻瘟病抗性基因BDR1，所述水稻稻瘟病抗性基因BDR1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

本发明另一目的是提供上述水稻稻瘟病抗性基因BDR1所编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ I DNO.2。

本发明的另一目的是提供含有所述水稻稻瘟病抗性基因BDR1的载体。

本发明的另一目的是提供一种水稻稻瘟病抗性基因BDR1在调控水稻稻瘟病抗性中的应用。

本发明的有益效果：受体样激酶(Receptor-like kinases,RLKs)是通过感知环境信号并将其传递到细胞机制中来启动信号通路的理想分子元件，在植物发育过程和对环境胁迫的反应中发挥多种作用。水稻基因组编码超过1000个RLKs；到目前为止，只有一小部分被鉴定为植物激素受体，多肽，激发子和效应子。本发明筛选了在水稻抗稻瘟病菌Magnaporthe oryzae(M.oryzae)中发挥作用的11个RLKs，并鉴定了其中一个名为BDR1(blast Disease resistance 1)的负调控因子。BDR1在M.oryzae感染下表达量迅速增加；而沉默或敲除BDR1显著提高了水稻品种的稻瘟病抗性。通过蛋白相互作用和激酶活性测定，我们发现BDR1直接与MPK3相互作用并使之磷酸化。敲除BDR1会降低稻瘟病菌诱导的MPK3磷酸化水平。转录组分析结果显示，稻瘟菌诱导的茉莉酸(JA)信号通路受BDR1和MPK3的负调控。茉莉酸生物合成基因AOC和信号基因MYC2突变降低了水稻对稻瘟病菌的抗性。本发明研究结果表明，BDR1-MPK3分子模块，通过影响JA相关的防御反应负向介导水稻稻瘟病抗性。

附图说明

图1水稻对稻瘟病抗性相关RLKs的筛选。(A)用TMC-1处理的RLK-RNAi株系(反向重复，ir-RLKs)和TJ394株(野生型，WT)的平均疾病指数(±SE,n＝10)。(B)4个独立的BDR1RNAi株系(ir-BDR1)经TMC-1处理后WT植株的平均病变面积(±SE,n＝10)和(C)发病指数。疾病指标数据用箱形图表示(±SE,n＝30)。星号表示RNAi株系与WT株系有显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)。(D)ir-BDR1株系和WT植株经TMC-1处理后的表型。处理7天后拍照。Bar,1cm。(E)在TMC-1处理和对照植株中BDR1基因的平均转录水平(±SE,n＝6)。用TMC-1处理水稻幼苗12、24、48和72h，以每个时间点的模拟处理作为对照。星号表示tmc-1处理植株与对照植株差异显著(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)。BDR1启动子的GUS活性:GUS报告系。以0.02％的补间(mock)或TMC-1处理叶片72h.Bar,1cm。

图2野生型、BDR1突变株系和-过表达系的稻瘟病接种表型。(A)CRISPR/Cas9对BDR1基因的突变。列出了单导RNA(single-guide RNA,sgRNA)的靶序列。选择BDR1编码区的靶点进行基因组编辑。“-”被标记为缺失的核苷酸。(B)M.oryzae菌株TMC-1在WT(TP309)和bdr1突变体中引起的水稻病害症状。接种后7d拍照。(C)TMC-1处理7天后，bdr1突变体和WT植株的平均病变面积(±SE,n＝10)和(D)疾病指数(±SE,n＝60)。疾病指数数据以箱形图表示。星号表示突变体与WT植株有显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)。(E)BDR1-oe株系和TJ394中BDR1的平均转录水平(±SE,n＝6)。通过t测验，星号表示与WT的差异有统计学意义(*，<0.05；**,<0.01)。(F)TMC-1在WT(TJ394)和BDR1过表达(OE)系中引起的水稻病害症状。接种后7d拍照。(G)TMC-1治疗7d后WT和2个OE品系的平均病变面积(±SE,n＝10)和(H)疾病指数(±SE,n＝60)。疾病指数数据以箱形图表示。星号表示OE株系与WT株系之间存在显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)。

图3 BDR1与MPK3的相互作用。(A)体外下拉试验。用His-MBP-GUS或His-MBP-BDR1融合蛋白分别下拉2μg GST或GST融合蛋白。用抗GST抗体免疫印迹法检测相关蛋白。用CBB染色凝胶监测输入蛋白量。(B)BDR1与MPK3/MPK6相互作用的体内BiFC分析。BDR1-nYFP和MPK3/6-cYFP融合蛋白在烟草叶片中共表达。以BDR1-nYFP和cYFP,MPK3/6-cYFP和nYFP融合蛋白为对照。Bar，20μm。BF,明场。(C)BDR1与MPK3或MPK6在体内共免疫共沉淀。用GFP-Trap_A珠免疫沉淀表达YFP-BDR1-myc或MPK3/6-YFP-BDR1-myc的本氏烟草的蛋白提取物。输入对照或共免疫沉淀样本采用抗myc检测。(D)BDR1在体外磷酸化MPK3和MPK6。分别用抗Phospho-MAPK、抗MBP和抗GST抗体检测Phospho-MPK3或-MPK6、MPK3-GST和MPK6-GST、BDR1-MBP-His和CIP处理的BDR1-MBP-His。(E)体内BDR1影响MPK3的磷酸化水平，但不影响OsMPK6。使用抗Phospho-MAPK抗体免疫印迹法检测MAPK磷酸化。用稻瘟病菌TMC-1菌株处理水稻bdr1突变体和WT(TP309)。分别在0、12和24h从bdr1突变体和WT叶片中提取蛋白质。CBB染色显示为蛋白质载量控制。(F)WT(XS11)和mpk3突变系中由TMC-1引起的水稻病害症状。接种TMC-1后7d拍照。bar,1cm。(G)TMC-1处理7d后，WT和两个mpk3突变系的平均病变面积(±SE,n＝8)和(H)发病指数(±SE,n＝60)。疾病指数数据以箱形图表示。星号表示mpk3突变体与WT植株有显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)。

图4稻瘟菌侵染后bdr1突变体和WT植株的转录组分析。(A)M.oryzae处理12、24、48和72h后，与野生型植株相比，bdr1系上调的差异表达基因(DEGs)数量的Venn图。DEGs的临界值为FC(fold-change)>2，调整后p值<0.05。(B)ClueGO对上调的DEGs进行GO富集分析。节点的颜色代表不同的GO组。节点的大小表示术语充实意义。列出P>0.05的GO项。与野生型植物相比，bdr1突变体中JA途径基因(C)转录丰度的热点图。颜色梯度代表相对序列丰度。颜色键中的数字表示log2FC。

图5 bdr1和mpk3突变体中引发的JA信号传导。在bdr1突变体和野生型植物中AOC(A)、AOS2(B)、MYC2(C)和JAZ8(D)基因的平均转录水平(±SE,n＝6)。bdr1突变体和野生型植株中JA(E)和JA-Ile(F)含量的平均值(±SE,n＝6)。稻瘟菌TMC-1菌株处理水稻幼苗12、24、48和72h，星号表示bdr1突变体与野生型植株之间存在显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)。(G)aoc和myc2突变体对TMC-1敏感。接种后7d拍照。(H)WT(XS11)、aoc和myc2突变株系接种TMC-1后7d的平均病变面积(±SE,n＝10)和(I)发病指数(±SE,n＝60)。发病指数数据以箱形图表示。星号表示突变体与WT植株有显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)。mpk3突变体和野生型植株中AOC(J)、AOS1(K)、AOS2(L)、JAR1(M)、MYC2(N)和JAZ8(O)基因的平均相对转录水平。星号表示mpk3突变体与WT植株有显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)。

图6为RLKs在RNAi株系和野生型植物中的表达。(A)用于敲除RLK基因表达的RNAi结构示意图。(B)RLKs RNAi(ir-RLK)株系和WT植株(TJ394)中RLK基因的平均转录水平(±SE,n＝6)。(C)4株BDR1-rnai(ir-BDR1)和TJ394中BDR1的平均转录水平(±SE,n＝6)。星号表示RNAi株系与WT株系有显著差异(**，P<0.01；t测验)。

图7为BDR1的表征。(A)BDR1在不同组织中的平均转录水平(±SE,n＝6)。(B)用于生成GUS报告的结构示意图。(C)BDR1启动子GUS系组织中GUS活性的组织化学分析。bar,1cm。(D)烟草表皮细胞BDR1-GFP融合蛋白亚细胞定位。bar,10000nm。

图8为用于构建OE转基因植物的结构示意图

图9为WT株系、bdr1突变体和BDR1-OE株系的单株粒数和千粒重。WT和bdr1突变体的平均单株粒数(±SE,n＝10)(A)和1000粒重(±SE,n＝10)(B)。WT和OE转基因植株的平均单株粒数(±SE,n＝10)(C)和1000粒重(±SE,n＝10)(D)。通过t检验，星号表示bdr1突变体/OE转基因植株与WT的差异有统计学意义(*<0.05；**<0.01)

图10为WT与稻瘟菌生理小种GUY11处理的bdr1突变株表型比较(A)稻瘟菌菌株GUY11在WT(TP309)和bdr1突变体中引起的水稻病害症状。接种后7d拍照。GUY11处理后7d,bdr1突变体和WT植株的平均病变面积(B)(±SE,n＝10)和疾病指数(C)(±SE,n＝60)。星号表示突变体与WT植株有显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)

图11为野生型植物和bdr1突变体中BDR1蛋白结构域预测及MPK3/6磷酸化水平(A)BDR1的蛋白结构域通过NCBI(conservative domain Database)进行预测。WT植株和bdr1突变体中MPK3(B)和MPK6(C)蛋白的相对磷酸化水平(±SE,n＝3)。印迹的相对强度用ImageJ定量。星号表示突变体与WT植株有显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)

图12为MPK3在WT植株和BDR1-OE株系中的磷酸化水平。用稻瘟病菌分离株TMC-1处理OE和WT(TJ394)水稻。在0、12和24h分别从OE和WT叶片中提取蛋白质。CBB染色显示为蛋白质装载控制。使用抗phospho-MAPK抗体免疫印迹法检测MAPK磷酸化。

图13为WT植株和MPK3突变体中MPK3的磷酸化水平。MPK3突变系和XS11稻瘟病菌菌株TMC-1处理后的植株。从MPK3和XS11叶片中分别提取0h、12h和24h的蛋白。使用抗phospho-MAPK抗体免疫印迹法检测MAPK磷酸化。以肌动蛋白作为内参。

图14为通过RNA测序对WT和bdr1突变样本中所有基因进行主成分分析(PCA)图

图15为在bdr1突变系和WT植株中AOS1(A)和JAR1(B)基因的平均转录水平(±SE,n＝6)。星号表示bdr1突变株系与WT株之间存在显著差异(*，P<0.05；**，p<0.01；t测验)

具体实施方式

下面将结合附图对本发明做详细的介绍：

本发明筛选了11个稻瘟病菌诱导的水稻受体激酶基因(RLKs)，发现在基因沉默的水稻植株中，只有一个RLK对稻瘟菌TMC-1菌株的抗性增强。该RLK被命名为Blast DiseaseResistance 1(BDR1)。接下来，我们通过基因组编辑和过表达验证了BDR1与稻瘟病抗性相关的功能。通过蛋白相互作用和磷酸化分析，BDR1与MAPK信号通路直接相关。通过转录组分析探讨BDR1的调控机制。我们的研究结果表明，BDR1与MPK3相互作用并磷酸化，进而通过调控JA化合物的生物合成负调控水稻稻瘟病抗性。

材料和方法

稻瘟病菌培养和接种

在完全培养基(CM)上培养稻瘟菌菌株TMC-1和GUY11，并按照前面所述进行喷雾接种。用浓度为5X 10⁵孢子/mL的分生孢子接种三叶一心的水稻幼苗。接种的水稻首先在相对湿度为85％和24℃的暗室中保持24小时。然后，在相对湿度85％的14小时光照/12小时黑暗循环中，在26℃/24℃下将植物移入生长室。通过测量第三叶的病斑面积和发病指数，在感染后7天对稻瘟病病斑症状进行统计分析。每个接种实验重复三次以上。

水稻材料

本发明使用四种水稻材料，分别是泰粳394(Taijing394，TJ394)、台北309(Taibei309，TP309),日本晴(Nipponbare，NPB)和秀水11(Xiushui11，XS11).野生型(WT)品种TJ394用于产生BDR1的RNA干扰(RNAi)水稻株系和过表达水稻株系，TP309用于产生BDR1敲除的水稻突变株系，日本晴用于OsTPS3和OsTPS29敲除突变体。水稻aoc-2和myc2-5突变体如前所述产生。mpk3突变体及其野生型水稻品种秀水11(XS11)由娄永根教授的实验室(浙江大学昆虫科学研究所)提供。使用遗传稳定的T2代水稻株系的幼苗来研究对稻瘟病菌株TMC-1或GUY11的抗性。水稻种子在37℃条件下催芽后，移栽于培养盆中，并在温室或生长室中以85％湿度进行14小时光照/12小时黑暗中培养生长。

RNAi株系、突变株系和过表达材料的构建

扩增不同水稻类受体激酶(RLK)的200-300bp基因特异性片段，并将其导入pANDA载体中以生成RLK-RNAi构建体。扩增BDR1的开放阅读框(ORF)序列并将其插入pCXUN载体以生成BDR1过表达构建体。为构建BDR1、OsTPS3和OsTPS29的突变株系，将每个基因的靶序列引入pLYsgRNA-OsU6b载体以产生水稻U6b启动子驱动的单引导RNA(sgRNA)。然后将sgRNA表达盒引入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体。使用农杆菌介导的转化将每个构建体的T-DNA导入水稻基因组。获得的水稻材料通过潮霉素抗性筛选阳性株系。

GUS活性的组织化学分析

扩增BDR1基因的2kb启动子序列并将其插入pQHY06载体中以产生BDR1启动子驱动的GUS活性报告株系。处理的转基因水稻株系和对照水稻品种的叶片组织在37℃的GUS染色溶液(0.5M磷酸盐缓冲液pH 7.5，0.5MEDTApH 7.4，20mM X-Gluc和10％Triton)中孵育。用乙醇去除染色组织的叶绿素并拍照保存。

重组蛋白的纯化

将BDR1和MPK3和MPK6的ORF片段插入pDEST112-MBP和pDEST15中，以分别产生HisMBP标记和GST标记的蛋白质。使用His-MBP标记的GUS蛋白作为对照。将构建好的载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将含有His-MBP-BDR1、His-MBP-GUS、GST-MPK3或GST-MPK6的菌株在37℃下培养至OD600为0.5，然后添加0.4mM的D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷，并在37℃下再孵育4小时。根据说明书，使用Ni NTA琼脂糖(Qiagen)纯化His标记的蛋白质。根据制造商的说明，使用Sepharose 4B(GE Healthcare)纯化GST标记的蛋白质。

Pull-down试验

将2μg GST标记蛋白(GST-MPK3和GST-MPK6)和GST与4μg His-MBP-BDR1或His-MBP-GUS在500μL结合缓冲液[50mM Tris-HCl，(pH 7.5)、100mM NaCl、0.25％Triton X-100和35mMβ-巯基乙醇]中混合。然后，加入25μL Ni NTA琼脂糖。在4℃温育1小时后，用洗涤缓冲液[50mM Tris-HCl(pH 7.5)、800mM NaCl、0.25％Triton X-100和35mMβ-巯基乙醇]洗涤Ni NTA琼脂糖五次,再悬浮于0.05ml的2×蛋白质加载缓冲液中。使用抗GST抗体通过免疫印迹分析下拉测定的产物。凝胶用考马斯亮蓝(CBB)染色以检测输入蛋白量。

免疫共沉淀(CO-IP)检测

用含有编码BDR1-MYC/MPK3-YFP、BDR1-MYC/MPK6-YFP或BDR1/MYC/YFP的基因的农杆菌共渗透烟草叶片。本实验使用绿色荧光蛋白(GFP)-Trap_A珠(华安生物科技)。通过SDS-PAGE分离免疫沉淀剂产物，并使用抗MYC抗体进行免疫印迹检测。

亚细胞定位和生物分子荧光互补(BiFC)试验

将含有35S:BDR1 YFP或35S:YFP构建体的农杆菌渗透到本氏烟草叶片中。孵育48小时后，用共焦显微镜(Zeiss)观察荧光。

激酶测定

体外激酶测定，纯化2μg GST-MPK3和GST-MPK6融合蛋白，并在激酶反应缓冲液(50mM HEPES、10mM MgCl2、5mM MnCl2和1mM ATP)中与2μg的HIS-MBP-BDR1在30℃孵育2小时。将添加小牛肠碱性磷酸酶(CIP；新英格兰生物实验室，NEB)并在37℃下再孵育1小时的反应用作阴性对照。通过SDS-PAGE分离混合物，用抗磷酸化-p44/42MAPK抗体(细胞信号技术)检测印迹，以检测磷酸化MAPK，用抗MBP或抗GST抗体分别检测His-MBP-BDR1和GST-MPK3/6。

对于体内激酶测定，在所指示的时间点用TMC-1菌株处理BDR1突变体和WT植物的水稻幼苗。收集样品，并使用裂解缓冲液提取总蛋白[100mM HEPES(pH 7.5)、5mM EDTA、5mMEGTA、2mM二硫苏糖醇、10mM Na3VO4、10mM NaF、50mMβ-甘油磷酸钠、1mM苯甲磺酰氟、10％甘油、1mM蛋白抑制剂和1mM磷酸酶抑制剂]。使用抗磷酸-p44/42MAPK抗体检测MPK3和MPK6的磷酸化水平。

植物激素分析

在特定的时间点用TMC-1处理bdr1突变体和WT植物。对照是每个时间点的缓冲液处理的样品。约100mg样品用于植物激素分析。如前所述分析所有样品。

转录组检测与分析

使用MiniNEST植物RNA提取试剂盒(Takara)提取水稻样品的总RNA。RNA测序委托Novogene公司完成。如前所述分析转录本。每个基因的读取数量以每百万次读取的转录物(TPM)进行量化。所有编码基因的TPM值用于主成分分析(PCA)。使用R包GGORD进行PCA。在每个时间点比较稻瘟菌处理样品和对照样品中每个基因的转录水平。折叠变化(FC)>2且调整后P<0.05的基因被定义为差异表达基因(DEG)。ClueGO对上调的DEG进行了基因本体(GO)分析。代表基因表达的热图由R脚本进行。

实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

使用逆转录试剂盒(Takara)合成cDNA。使用SYBR Green在20μL反应体系中进行RT-qPCR。用水稻内参基因表达水平来规范其他基因的表达。

结果与分析

BDR1在稻瘟菌侵染下快速上调表达并参与水稻抗稻瘟病

我们之前的转录组分析发现，在稻瘟菌处理的水稻样品中，有许多上调的RLK基因，这表明这些RLKs可能在水稻和稻瘟菌的相互作用中发挥作用。为了验证这一结果，通过RNAi构建了11个RLKs的基因沉默株系(图6A)。与野生型植株相比，经TMC-1处理后，RNAi株系(ir-RLKs)中这些RLKs的转录水平显著降低(图6B)。然后，对rlk沉默水稻进行稻瘟病接种。只有沉默候选基因Os07g38810的水稻株系对稻瘟病菌的抗性增强(图1A)。这个RLK被命名为BDR1。为了进一步证实这一表型，研究人员使用了另外3个独立沉默系。与野生型植株相比，ir-BDR1株系的BDR1 mRNA水平降低了65％-80％(图6C)。经TMC-1处理7d后，所有ir-BDR1品系对稻瘟病菌的抗性均增强。ir-BDR1株系的病变面积和疾病指数明显低于WT植株(图1B-D)。以上结果提示BDR1是水稻抗稻瘟病免疫的负调控因子。

RT-qPCR验证了稻瘟病菌诱导的BDR1表达。BDR1表达量从TMC-1处理12小时开始增加，并在处理期间稳步增加(图1E)。同时，BDR1基因在水稻所有组织中均有普遍表达(图7A)。在BDR1启动子:GUS报告系中检测到BDR1基因的表达。水稻各组织中均能观察到GUS活性(图7C)，而稻瘟病菌处理后水稻叶片中GUS活性增加(图1F)。为了确定BDR1蛋白的亚细胞定位，GFP标记的BDR1在本氏烟草中瞬时表达。结果显示BDR1定位于质膜(图7D)。

BDR1负向调控水稻稻瘟病抗性

为了进一步解析BDR1在水稻稻瘟病抗性中的作用，本发明构建了2个独立的BDR1敲除突变体和2个过表达系。这两个bdr1突变体在靶位点均有1-bp或5-bp的缺失(图2A)。通过BDR1转录水平的鉴定，证实了这两个过表达系(图2E和图8)。BDR1基因的突变不影响水稻的生长发育(粒长和粒宽、单株粒数、单株分蘖数和千粒重，图9A和B)，而BDR1过表达(OE_植株在单株粒数和千粒重较低时生长迟缓(图9C和D)。以病变面积和发病指数为指标。与野生型植株相比，bdr1突变株对稻瘟菌菌株TMC-1的抗性增强(图2B)，病变面积小(图2C)，疾病指数低(图2D)，而BDR1-OE突变株对TMC-1的抗性减弱(图2F)，病变面积大(图2G)，疾病指数高(图2H)。同时，利用另一株稻瘟菌兼容菌株GUY11进行生物测定。bdr1突变体对GUY11的抗性增强，BDR1-oe对GUY11更敏感(图10)，表明BDR1突变体对稻瘟病具有广谱抗性。综上所述，BDR1是水稻抗稻瘟病的负调控因子。

BDR1与MPK3相互作用并磷酸化MPK3

蛋白结构域预测显示BDR1具有n端凝集素结构域和c端蛋白激酶结构域(图11A)，提示BDR1可能参与磷酸化下游激酶级联反应。鉴于MPK3和MPK6被证明广泛参与植物对生物胁迫的响应，我们对BDR1和OsMPK3/6之间的相互作用进行了测试。首先，进行体外下拉试验。GST-MPK3或GST-MPK6被His-MBP-BDR1拉低，而GST-MPK3/GST-MPK6被GST取代或His-MBP-GUS取代时未检测到信号，表明BDR1在体外与MPK3或MPK6相互作用(图3A)。体内BiFC实验研究了其复合物的亚细胞定位。当BDR1-nYFP(YFP的n端半部分[黄色荧光蛋白])和MPK3/6-cYFP(YFP的c端半部分)在benthamiana表皮细胞中共同表达时，沿着细胞膜观察到互补的YFP信号。BDR1-nYFP和cYFP未观察到荧光信号，或nYFP和MPK3/6-cYFP共浸润叶片(图3B)。通过共免疫沉淀法检测BDR1与MPK3/6的体内相互作用。的确，MPK3-YFP或MPK6-YFP与BDR1-myc蛋白共免疫共沉淀(图3C)。综上所述，这些结果表明BDR1与MPK3和MPK6互作。

为了进一步阐明MPK3或MPK6是BDR1的基质，我们使用抗磷酸化MAPK抗体进行了体外磷酸化实验。结果显示His-MBP-BDR1可以磷酸化水稻GST-MPK3/6，而CIP处理可以破坏其磷酸化作用(图3D)。为了确定BDR1是否在体内磷酸化水稻MPK3/MPK6，我们在bdr1突变体和野生型植株中检测了MPK3/6的磷酸化水平。稻瘟菌侵染增强了处理24小时后WT植株中磷酸化的MPK3/6蛋白水平(图3E)。然而，与野生型相比，突变体bdr1的MPK3磷酸化水平显著降低，而MPK6的水平没有差异(图11B和C)。一致的是，在稻瘟病菌处理12小时和24小时时，BDR1-OE株系的MPK3磷酸化水平远高于野生型株系(图12)。这些数据表明BDR1调控稻瘟菌诱导的MPK3活性。为了确定MPK3是否也像BDR1一样在稻瘟病抗性中起负调控作用，我们对MPK3突变的抗性表型进行了评估。MPK3突变体中未检测到稻瘟病诱导的MPK3磷酸化(图13)。与bdr1一致，与野生型相比，mpk3突变体对稻瘟病菌的抗性都增强了(图3F)。真菌感染后mpk3突变体叶片的病变面积(图3G)和疾病指数(图3H)明显低于WT植株。

BDR1突变增强了稻瘟菌诱导的JA途径基因的表达

为了研究BDR1-MPK3级联的下游信号，我们对稻瘟病处理后的bdr1和野生型植株进行转录组分析。不同基因型在4个时间点用TMC-1处理，每个时间点3个重复。对24份样本进行了RNA测序。所有基因的PCA分析显示，每个处理的3个重复聚在一起，表明生物复制性良好(图14)。而且，不同的基因型在每个时间点都明显分离，提示BDR1突变带来了显著的转录变化。显示fold change(FC)>2和调整后P<0.05的水稻基因被定义为差异表达基因(DEGs)。在bdr1突变体中，共有2366个DEGs表达上调，且在处理24h的样品中表达量最高(图4A)。只有52个基因在所有处理中表达上调，说明BDR1在不同真菌感染阶段对下游基因均有调控作用。然后通过GO分析来预测这些上调的DEGs的功能。根据生物过程，6个氧化石墨烯基团被富集(图4B)。其中一组包括“细胞表面受体信号转导”和“信号转导”，与BDR1的潜在功能高度相关。有趣的是，与“ja介导的防御反应”相关的术语最为丰富。从上调的基因中筛选出JA通路核心基因。JA模块包括许多生物合成基因(如AOS2)、信号基因(如JAZ)和JA响应转录因子(如JAMYB)(图4C)，其中一些被报道与水稻稻瘟病抗性有关(22,24)。转录组数据表明，JA途径参与了BDR1介导的水稻稻瘟病防御反应。

BDR1-MPK3级联抑制稻瘟菌诱导的JA信号通路

为了验证稻瘟菌诱导的JA信号是否受BDR1调控，我们对JA通路基因的表达和JA含量进行了定量分析。与野生型植株相比，稻瘟病菌处理后的bdr1突变体中JA生物合成基因AOC、AOS1、AOS2和JAR1的转录水平显著增加(图5A和B；此外，与JA信号相关的基因MYC2和JAZ8在bdr1突变体中也表达上调(图5C和D)，与基因表达一致的是，经过24h、48h和72h稻瘟菌处理后，bdr1突变体中JA和JA-Ile水平也显著升高(图5E和F)。为了证实JA在稻瘟病抗性中的作用，我们采用了两个JA缺陷系。水稻基因组只编码一个AOC和MYC2基因拷贝。因此，我们使用了aoc-2和myc2-5突变体及其背景品种XS11(41,42)。这两个突变体对稻瘟菌菌株TMC-1比XS11植株更敏感(图5G)。表型与观察结果一致，与XS11植株相比，两个突变体的病变面积(图5H)和疾病指数(图5I)增加。由于BDR1可以直接调控MPK3磷酸化水平，因此我们研究MPK3是否也调控稻瘟菌诱导的JA通路。与稻瘟菌处理的野生植物相比，mpk3突变体中JA生物合成基因(AOC,AOS1,AOS2和JAR1)和信号基因(JAZ8和MYC2)的转录水平都有所提高(图5J-O)。综上所述，这些结果表明BDR1-MPK3级联负向调控JA介导的水稻稻瘟病防御。

水稻中的RLK基因家族比拟南芥中的大两倍，这可能是因为它们中的许多都参与了先天免疫并且显然经历了复制事件)。迄今为止，已经鉴定了一些具有水稻抗病性的RLKs，而许多RLKs的功能尚不清楚。在这里，我们筛选并鉴定了一个膜定位的RLK基因BDR1，它负调节水稻对稻瘟病菌的抗性。在bdr1突变株系中发现了增强的广谱稻瘟病抗性，而BDR1过表达植株则对该真菌敏感。通过一系列分子、遗传和化学手段，本发明揭示了BDR1调控水稻稻瘟病抗性的机制。首先，BDR1直接与MPK3相互作用并使其磷酸化。改变BDR1的表达影响了真菌诱导的MPK3磷酸化水平。与bdr1突变体一致，mpk3敲除系表现出增强的稻瘟菌抗性。其次，BDR1-MPK3级联可以通过JA途径发挥作用。在bdr1和mpk3突变体中，稻瘟菌诱导的JA信号被激活。第三，芳樟醇和石竹烯被鉴定为抗稻瘟病菌的防御化学物质，其生物合成受JA信号通路调控，并受稻瘟病菌诱导的BDR1-MPK3级联抑制。根据我们的研究结果，BDR1似乎是稻瘟菌衍生效应物或PAMP的分子靶标。增加BDR1的表达会激活MPK3，这可能会抑制JA介导的抗真菌化合物在水稻中的积累。

在经典的MAPK级联中，MPK3/4/6及其同源基因在与活性氧稳态、气孔发育、激素信号传导、抗病性和非生物胁迫耐受性相关的应激信号转导中发挥关键作用。除了上游MKKs的磷酸化，MPKs也通过与其他激酶的串扰来调节。我们发现BDR1主要通过与MPK3相互作用和磷酸化MPK3来介导稻瘟病抗性。这与一篇研究显示MPK3是由上游激酶CPK18激活的，而CPK18负调控水稻稻瘟病抗性是一致和相似的。尽管在体外和体内试验中也观察到BDR1和MPK6之间的相互作用，但由稻瘟病真菌引起的MPK6磷酸化水平不受BDR1的影响。我们推断BDR1-MPK6级联可能参与其他生物和非生物胁迫。其他研究也观察到MPK3/6调控的特异性。例如，受体激酶SIT1或MKK9靶向MPK3和MPK6，但主要通过MPK6在耐盐性中发挥作用。

稻瘟病真菌侵染后，水稻中的JA的生物合成和相关信号通路被激活。JA通过促进抗菌化合物的合成和积累来调节稻瘟病菌抗性。有报道称，缺乏JA-生物合成基因AOC的cpm2和hebiba突变体降低了内源性JA和稻瘟菌诱导的植物抗毒素水平，并表现出对稻瘟菌的易感性，这与我们对基因组编辑的aoc突变体抗稻瘟病的结果一致(图5G)。类似的，过表达JA生物合成基因OsAOS2(allene oxide synthase)的转基因水稻植株对稻瘟菌的抗性增强。其他JA缺陷系也被报道对稻瘟病菌的敏感。在bdr1突变系中，许多JA生物合成基因在稻瘟病菌感染下上调，导致茉莉酸和JA-Ile的产量增加(图5E和F)。鉴于JA生物合成和信号基因在M.oryzae感染下的mpk3突变体中也被上调，MPK3可能在M.oryzae引发的JA途径的上游起作用。先前的研究在某种程度上支持了这一观点:MPK3的沉默增加了稻瘟菌诱导的PR10和几丁质酶基因的表达，这两个基因在水稻中都被JA通路调节。一些研究已经描述了MPK3/6激活和胁迫相关JA信号之间的联系。野生烟草和水稻中的两个MPK3/6同源蛋白在草食过程中被激活，进而介导JA的生物合成。JA响应转录因子是MPK3/6的潜在底物。例如，在拟南芥中，MPK6可以与MYC2转录因子相互作用并使其磷酸化，从而参与蓝光介导的幼苗发育。在水稻中，MPK3/6靶向WRKY70转录因子调节植物对植食性动物的防御。因此，MPK3可能通过靶向转录因子负调控M.oryzae诱导的JA。

综上所述，M.oryzae侵染增强了细胞内JA的生物合成，导致了JA响应性转录因子(TF)的激活，如MYC2。同时，M.oryzae感染可迅速激活质膜中BDR1基因的表达。BDR1蛋白能与MPK3发生物理相互作用并使其磷酸化。MPK3磷酸化水平的增加抑制JA信号生物合成，从而促进M.oryzae的感染(图6)。因此，激活BDR1可能是稻瘟菌对抗植物免疫反应的一种策略。鉴于BDR1定位于细胞膜，我们假设BDR1可能是M.oryzae分泌的效应子或PAMP的靶标。进一步的研究将通过描述BDR1的相互作用伙伴来关注这个有趣的问题。我们的研究结果丰富了水稻与稻瘟病菌相互作用的认识，为稻瘟病的防治提供了基因和化学资源。一方面，由于突变体bdr1对M.oryzae具有抗性，农艺表型无明显异常，BDR1可能是水稻抗性基因编辑育种的潜在靶点。

可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种水稻稻瘟病抗性基因BDR1，其特征在于：所述水稻稻瘟病抗性基因BDR1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因BDR1所编码的蛋白，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种含有如权利要求1所述水稻稻瘟病抗性基因BDR1的载体。

4.一种水稻稻瘟病抗性基因BDR1在调控水稻稻瘟病抗性中的应用。

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