CN115844951A - 迷迭香纯露在制备治疗失眠的药物和/改善睡眠功能的食品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了迷迭香纯露在制备治疗失眠的药物和/改善睡眠功能的食品中的用途。本发明对大鼠的海马体进行检测，利用Elisa试剂盒、Western‑Blot实验、Rt‑PCR技术与免疫组化对富集在五羟色胺能突触通路上的5‑HT1AR、PKA、cAMP、ADCY5和GABAA进行测定，确定迷迭香纯露通过作用Serotonergic synapse来达到治疗失眠的效果，其可开发为一种具有缓解失眠患者症状的功能性食品或药品，调节失眠患者的情绪，降低抑郁症的风险。

Description

迷迭香纯露在制备治疗失眠的药物和/改善睡眠功能的食品 中的用途

技术领域

本发明涉及迷迭香纯露在制备治疗失眠的药物和/改善睡眠功能的食品中的用途。

背景技术

睡眠是保证人体健康的必要环节，是人类生存所必须进行的身体机能。然而，大多数人的睡眠时间及睡眠质量是不理想的。睡眠不足是当今时代一个重要的公共卫生问题。睡眠时间不足，会提高患有心血管疾病、癌症患者的死亡率]。并且，失眠患者会产生抑郁、头晕、疲劳、身体不适、焦虑等多种身体疾病。

目前，失眠的治疗包括心理行为干预、药物治疗和针灸治疗。心理干预行为具有个体差异且有很大得不确定性；药物治疗包括苯二氮卓类、镇静抗抑郁药、抗组胺药、抗精神病药等。虽然效果良好，但有许多副作用，如嗜睡、恶心、头晕、消化不良、轻微躁狂症，且具有成瘾性，长期使用会导致身体产生依赖性，使得副作用加剧；针灸治疗可以改善中枢抑制功能，帮助人更好的进入睡眠，但针灸会使人有疼痛反应，且在针灸的过程中有的患者会出现局部血肿和头痛。因此，安全、有效、副作用小的失眠药物有待开发。引人注目的是，植物化学物质被证明具有极好的促进睡眠的作用，尤其是已经使用了2000多年的中草药资源。研究表明，用于治疗抑郁症和失眠的药用植物有缬草、洋甘菊、迷迭香和薰衣草。

迷迭香(Rosmarinus officinalisL.)是一种发源于地中海盆地的草本植物，是唇形科的一员。由于它的适应性很强，可以在世界各地种植。迷迭香提取物可以用作食品和制药行业的添加剂，在欧盟的多个食品类别中被授权为食品添加剂，且含量很高。迷迭香在美国被FDA归类为一般安全，在欧洲食品安全局(EFSA)被批准为一种天然存在的食品防腐剂。它的主要化学成分有α-蒎烯、桉树脑、迷迭香酸、樟脑等。有研究表明，迷迭香具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗抑郁、抗焦虑等生物活性，它的抗氧化活性在分子上至少相等或优于其他食品中合成的抗氧化剂。迷迭香胶囊具有治疗失眠的功效，迷迭香挥发油具有改善焦虑、抑郁和睡眠障碍的作用。迷迭香可以治疗失眠导致的情绪不安和抑郁症，较多的民间应用将迷迭香制作成茶叶发挥治疗失眠的功效。但也有研究表明迷迭香中的成分具有醒脑的作用，张煜等，试论精油香薰在失眠诊疗中的应用[J],中华中医药学会养生康复分会换届会暨第十三次学术研讨会,2015,207-210中公开了迷迭香精油具有醒脑作用。迷迭香存在的醒脑和促眠双向调节机制，使迷迭香中治疗失眠的有效部位并不明确，影响了其在治疗失眠方面的实际应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了迷迭香纯露在制备治疗失眠的药物和/改善睡眠功能的食品中的用途。

进一步地，所述迷迭香纯露是迷迭香药材加水蒸馏，蒸馏液去除精油后的液体。

进一步地，所述药物是以迷迭香纯露为活性成分，加上药品上可接受的辅料制备而成的制剂；

所述食品是以迷迭香纯露为活性成分，加上食品上可接受的辅料制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂是口服制剂。

更进一步地，所述口服制剂为溶液剂、丸剂、膏剂或胶囊剂

进一步地，所述药物是提升睡眠质量的药物；所述食品是提升睡眠质量的食品。

更进一步地，所述药物是升高血清中5-HT、GABA和/或DA水平的药物；所述食品是升高血清中5-HT、GABA和/或DA水平的食品。

进一步地，所述药物是升高海马体组织中5-HT1AR、ADCY5、GABAA、cAMP和/或PKA表达水平的药物；所述食品是升高海马体组织中5-HT1AR、ADCY5、GABAA、cAMP和/或PKA表达水平的食品。

本发明经动物实验证明，相较现有技术中公开的迷迭香主要的活性成分以及西药地西泮，迷迭香纯露具有更明显的改善失眠的作用。本发明对大鼠的海马体进行检测，利用Elisa试剂盒、Western-Blot实验、Rt-PCR技术与免疫组化对富集在五羟色胺能突触通路上的5-HT1AR、PKA、cAMP、ADCY5和GABAA进行测定，确定迷迭香纯露通过作用Serotonergicsynapse来达到治疗失眠的效果，其可开发为一种具有缓解失眠患者症状的功能性食品或药品，调节失眠患者的情绪，降低抑郁症的风险。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围

附图说明

图1提取装置图

图2 19种化合物的结构

图3RNA-seq分析结果图(A:PCA图；B：火山图；C：热图；D:KEGG图；E：GO图；F：GSEA-KEGG图；G：GSEA-GO图)

图4 GC-MS和网络药理学结果图(A.GC-MS离子质谱图；B.交集基因靶点图；C.Cytoscape网络图；D.PPI网络图；E.KEGG富集分析；F.GO富集分析)

图5 KEGG和GO结果图(A、C、E、G是排序前KEGG、BP、CC、MF的结果；B、D、F、H是排序后KEGG、BP、CC、MF的结果)

图6分子对接结果图(A、B是GABRB2靶点的蛋白6X40对接的1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one成分和Propofol阳性药图；C、D是GABRB3靶点的蛋白7A5V对接的3-Methyl-4-isopropylphenol成分和Piperazine阳性药图；E、F是HTR1A靶点的蛋白7E2Y对接的Caryophyllene成分和Clozapine阳性药图。G、H是PTGS1靶点的蛋白1DIY对接的Citronellol成分和Mesalamine阳性药图；I是分子对接的热图)。

图7旷场实验和试剂盒结果图(A、B是旷场实验的结果；C、D、E是Elisa试剂盒5-HT、GABA、DA的结果)

图8免疫组化结果图

图9Rt-PCR和Western-blot结果图(A-E是Rt-PCR的结果；F是Western-Blot的分析结果)

图10机制图

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得，其中，由本发明涉及到的迷迭香纯露的制备工艺成熟，参照现有技术常规方法即可制成。

实施例1、迷迭香纯露的制备

称取迷迭香药材100g，加入1200mL的水，采用水蒸气蒸馏法进行提取，2小时后，接取迷迭香纯露，将迷迭香精油分离去除，共取得纯露500mL。

实施例2、迷迭香纯露的制备

称取迷迭香药材100g，加入1200mL的水，采用超声辅助水蒸气蒸馏法进行提取，2小时后，接取迷迭香纯露，将迷迭香精油分离去除，共取得纯露500mL。

实施例3、迷迭香纯露的制备

称取迷迭香药材100g，加入1200mL的水，采用微波辅助水蒸气蒸馏法进行提取，2小时后，接取迷迭香纯露，将迷迭香精油分离去除，共取得纯露500mL。

实施例4、迷迭香纯露的制备

称取迷迭香药材100g，加入1200mL的水，采用酶解辅助水蒸气蒸馏法进行提取，2小时后，接取迷迭香纯露，将迷迭香精油分离去除，共取得纯露500mL。

以下通过实验来说明本发明的有益效果。

实验例1迷迭香纯露对失眠大鼠的影响研究

(一)药物的制备

取迷迭香药材，加入12倍量水，蒸馏2小时后，接取迷迭香纯露，将迷迭香精油分离去除，共取得纯露500mL。

(二)动物给药及分组

选80只SPF级成年雄性SD大鼠，适应性饲养三天后，随机分为8组，每组10只。分别为空白组、模型组、阳性药组(地西泮0.92mg/kg)、迷迭香纯露超低剂量组(5mg/mL)、迷迭香纯露低剂量组(10mg/mL)、迷迭香纯露中剂量组(12.5mg/mL)、迷迭香纯露高剂量组(15mg/mL)和迷迭香纯露超高剂量组(30mg/mL)。除空白组外，其余7组均采用300mg/kg的对氯苯丙氨酸(4-Chloro-DL-phenylalanine，PCPA)进行腹腔注射，每天一次，连续三天，建立大鼠失眠模型。从第四日起，空白组和模型组每日灌胃1％吐温80水溶液，阳性药组灌胃含有地西泮(0.92mg/Kg)的1％吐温80水溶液，给药组灌胃含迷迭香纯露(5mg/mL、10mg/mL、12.5mg/mL、15mg/mL、30mg/mL)的1％吐温80水溶液。共灌胃治疗6日。

(三)大鼠的生理生化指标的检测

试验结束后，麻醉大鼠，进行腹主动脉采血，于4℃，3000r/min离心10min后分离血清，收集储存。大鼠安乐死后，剥取大鼠的全脑至于冰上，分离海马体。取大鼠血清进行ELISA试剂盒检测大鼠血清中5-HT、GABA、DA的表达水平。

(四)实验结果

试剂盒结果见表1，与正常组相比，失眠模型组的血清中5-HT、GABA降低(p＜0.05)，DA显著降低(p＜0.001)。与模型组相比较，地西泮组和迷迭香纯露低、中、高组血清中5-HT、GABA均有不同程度的升高(p＜0.05和p＜0.01)；与模型组相比较，地西泮组和迷迭香纯露低、中、高血清中的DA，除低剂量组外，其余都有不同程度的升高(p＜0.05和p＜0.01)；与模型组相比，迷迭香纯露超低剂量组血清中的5-HT、GABA、DA均有不同程度的降低(p＞0.05)；迷迭香超高剂量组血清中的5-HT、GABA、DA均有不同程度的升高(p＞0.05)。表明迷迭香纯露低、中、高组可显著提高失眠大鼠的5-HT、GABA、DA的含量，初步判断迷迭香纯露对失眠大鼠有较好的治疗作用。

表1迷迭香纯露对大鼠血清中5-HT、GABA、DA的测验

注：*p<0.05**p<0.01***p<0.001

实验例2探究迷迭香纯露治疗失眠大鼠的成分

(一)迷迭香纯露化合物的鉴定

对迷迭香纯露进行GC-MS分析，共得到23种活性成分，包括内标物(十六烷)鉴定出20种合格的成分，结果见表2。

表2迷迭香纯露GC-MS分析表

(二)成分挖掘

对单体成分进行质控研究，挖掘得到迷迭香纯露治疗失眠的关键性成分可能有四种，分别为1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one、Citronellol、3-Methyl-4-isopropylphenol和Caryophyllene。

(三)关键成分的含量测定

对四种成分利用内标物进行绝对含量的计算，确定迷迭香纯露低、中、高剂量组治疗失眠大鼠中，四种成分的含量，结果见表3。

表3迷迭香纯露成分的含量

综上，结果表明，迷迭香纯露治疗失眠的关键成分有四种。其中1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one的含量为0.0699-0.104851μg；Citronellol的含量为0.008971-0.013456μg；3-Methyl-4-isopropylphenol的含量为0.011497-0.017245μg；Caryophyllene的含量为0.004183-0.006274μg。

实验例2探究四个成分及其配伍分别对失眠大鼠的治疗效果

(一)药物的制备

取迷迭香药材，加入12倍量水，蒸馏2小时后，接取迷迭香纯露，将迷迭香精油分离去除，共取得纯露500mL。

(二)动物给药及分组

选80只SPF级成年雄性SD大鼠，适应性饲养三天后，随机分为8组，每组10只。分别为空白组、模型组、阳性药组(地西泮0.92mg/Kg)、1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one组(0.104851mg/Kg)、Citronellol组(0.013456mg/Kg)、3-Methyl-4-isopropylphenol组(0.017245mg/Kg)、Caryophyllene组(0.006274mg/Kg)和配伍组(1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one(0.104851mg/Kg)、Citronellol(0.013456mg/Kg)、3-Methyl-4-isopropylphenol(0.017245mg/Kg)和Caryophyllene(0.006274mg/Kg)四种成分)。除空白组外，其余7组均采用300mg/kg的对氯苯丙氨酸(4-Chloro-DL-phenylalanine，PCPA)进行腹腔注射，每天一次，连续三天，建立大鼠失眠模型。从第四日起，空白组和模型组每日灌胃1％吐温80水溶液，阳性药组灌胃含有地西泮(0.92mg/Kg)的1％吐温80水溶液,给药组分别灌胃含1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one(0.104851mg/Kg)、Citronellol(0.013456mg/Kg)、3-Methyl-4-isopropylphenol(0.017245mg/Kg)、Caryophyllene(0.006274mg/Kg)的1％吐温80水溶液，配伍组灌胃含1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one(0.104851mg/Kg)、Citronellol(0.013456mg/Kg)、3-Methyl-4-isopropylphenol(0.017245mg/Kg)和Caryophyllene(0.006274mg/Kg)的1％吐温80水溶液。共灌胃治疗6日。

(三)大鼠的生理生化指标的检测

试验结束后，麻醉大鼠，进行腹主动脉采血，于4℃，3000r/min离心10min后分离血清，收集储存。大鼠安乐死后，剥取大鼠的全脑至于冰上，分离海马体。取大鼠血清进行ELISA试剂盒检测大鼠血清中5-HT、GABA、DA的表达水平。

(四)实验结果

试剂盒结果见表4，与正常组相比，失眠模型组的血清中5-HT、GABA降低(p＜0.01)，DA显著降低(p＜0.001)。与模型组相比较，地西泮组血清中5-HT、GABA、DA均有不同程度的升高(p＜0.01)；与模型组相比较，除1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one组的血清中的GABA含量略有提高(p＜0.05)；其余的1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one组、Citronellol组、3-Methyl-4-isopropylphenol组、Caryophyllene组和配伍组血清中的5-HT、GABA、DA均有提高，但无差异性(p＞0.05)。表明四种单体成分对失眠大鼠无明显的改善作用，且四种成分的配伍也对失眠大鼠无作用。

表4四种成分对大鼠血清中5-HT、GABA、DA的测验

注：*p<0.05**p<0.01***p<0.001

综上表明，四种单体成分及其配伍对失眠大鼠无改善作用。含有1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one(0.0699-0.104851μg)、Citronellol(0.008971-0.013456μg)、3-Methyl-4-isopropylphenol(0.011497-0.017245μg)和Caryophyllene(0.004183-0.006274μg)四种成分的迷迭香纯露对失眠大鼠有明显的改善作用。

实施例3迷迭香(Rosmarinus officinalis L.)纯露基于Serotonergic synapse治疗失眠的研究

1、材料和方法

1.1迷迭香纯露的提取

反应釜的底部加入1200ml的水，称取100g迷迭香药材于三颈反应釜的隔板上，采用水蒸气蒸馏法进行提取，蒸馏两小时后，接取迷迭香纯露，将迷迭香精油分离去除，共取得纯露500mL。提取装置如下图所示(图1)。

1.2迷迭香纯露化合物的鉴定

按照1.1下方法进行提取，参照中国药典(2020版)挥发油测定法(通则2204)乙法，取二甲苯层，加入十六烷内标物质进行气相色谱-质谱(GC-MS)测定。气相色谱条件如下：Agilent HP-5ms(30m×250μm×0.25μm)毛细管柱，载气He，不分流，进样量1.5μL，流速1mL/min。起始温度为40℃(保留时间1min)、5℃/min至90℃、10℃/min至140℃和20℃/min升至250℃的程序升温。质谱条件如下：电离源EI，电离能70eV，传输线温度280℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，溶剂延迟时间11min，扫描质量范围30–550amu。所用数据经过数据分析软件处理，阈值调整为24，筛选迷迭香纯露的成分含量。使用NIST标准库检索，根据匹配度、保留指数及相关文献对组分进行筛选。保留指数定义为正构烷烃(C₈-C₄₀)在相同条件下的保留时间。根据正构烷烃的保留指数，迷迭香纯露的保留指数如下：

其中，t_R为保留时间，X为待分析化合物，K和K+1为分析物前后两个正构烷烃的碳原子数，即t_R(K)＜t_R(X)＜t_R(K+1)。

1.3动物实验

购自西安交通大学医学部实验动物中心9只SPF级雄性大鼠，体重(200±20)g，动物许可证号SCXK(陕)2018-001。在实验条件下(温度25±2℃，相对湿度50±5％)，动物适用性喂养1周。本研究经陕西中医药大学动物伦理委员会批准。将SD大鼠随机分为3组，每组3只，包括空白对照组、模型组和迷迭香给药组。除空白组，其余两组均用300mg/KgPCPA(DL-4-氯苯丙氨酸)进行腹腔注射，连续三天，复制失眠大鼠模型。从第四天开始，空白对照组和模型组灌胃1％吐温80水溶液；迷迭香纯露给药组灌胃12.5mg/mL的迷迭香纯露；分别给药6天，观察各组大鼠的睡眠恢复情况。实验结束后，对所有大鼠采用10％水合氯醛进行麻醉，实施安乐死。剥取大鼠的全脑至于冰上，分离海马体，在液氮中冷冻并迅速转移到-80℃的冰箱中。

1.4NA-seq分析

RNA-seq是对生物体内的基因进行测序，对1.3下的海马体组织进行总RNA提取，对mRNA进行富集，后反转录成双链cDNA，修复cDNA双末端后，加上接头，通过PCR扩增构建上机文库。使用实时交互式在线数据分析平台Omicsmart(http://www.omicsmart.com)进行生物信息学分析，满足FDR<0.05且log2|FC|≥2的条件为差异基因，根据差异基因的结果，进行GO和KEGG Pathway的富集分析。

1.5基于“成分-靶点”的网络药理学分析

1.5.1迷迭香纯露成分靶点和失眠疾病靶点的获取

使用PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库、SwissTargetPrediction数据库和Metatarget数据库对迷迭香纯露靶点进行预测，筛选出有关迷迭香活性成分的靶点。分别在Genecards(https://www.genecards.org/)，DisGeNET(https://www.disgenet.org/)、OMIM(https://omim.org/)数据库输入关键字“insomnia”，得到有关失眠疾病的相关靶点基因，将其整合删重。

1.5.2失眠疾病-迷迭香纯露成分的网络构建

将迷迭香活性靶点、失眠疾病靶点和RNA-seq差异基因靶点，输入在线Vennydiagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webools/Venn/)平台，取其交集，这些共同靶点是解释迷迭香纯露有效成分治疗失眠的关键作用靶点。将迷迭香纯露成分-靶点导入到Cytoscape3.7.2软件(http://www.cytoscape.org/)中，构建迷迭香成分-靶点网络，从而使迷迭香纯露中有效成分与共同靶点之间的关系更加清晰。在网络图中，在自由度条件下对网络进行筛选，确定迷迭香活性成分与疾病交叉目标之间的相互作用关系和重要性。将整理好的交集靶基因导入在线String(http://string-db.org/)数据库中，选择研究物种为“Homo sapiens”，将置信度选为0.7，获取PPI网络图。用交集基因的EnsemblID和log2fc进行KEGG和GO的富集分析。

1.6权重系数的建立

迷迭香纯露包含多种有效治疗失眠疾病的成分，但不同产地、厂家的药材成分的相对含量存在着差异。OB是权衡药物在体内代谢过程的重要参数，因此，将OB值纳入考察范围，与成分含量建立相应的联系：

A_x＝B_x*C_x

式中A_x表示成分x参与药物体内代谢的量，B_x表示成分x在迷迭香纯露成分中所占的相对含量，C_x表示成分x的口服生物利用度值。

上式中M_x表示成分x的中包含各靶点的分数总和。

N＝(M₁+M₂+…+M_n)

上式表示各成分参与通路N的分数总和。

权重系数的建立成功的引入了成分含量的关键因素，根据权重系数的数据结果对通路进行重新排序，使得实验结果更加可靠。

1.7基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析

为了进一步的阐明迷迭香纯露治疗失眠的作用靶点和通路，首先，将测序的差异基因进行KEGG富集分析，再使用R软件进行GO和KEGG的富集分析，分析结果根据权重系数重新排序，每条通路的权重系数为特定通路中所有目标的权重系数之和。

1.8分子对接

选用富集到通路上的靶点为研究对象，通过PCSB-PDB数据库筛选出关键靶点的3D结构，从PubChem下载活性成分的2D结构，通过Discovery Studio Client4.5软件进行分子对接。

1.9药效学实验

1.9.1动物模型制备与分组

60只SPF级雄性SD大鼠，体重(200±20)g，购自西安交通大学医学部实验动物中心，动物许可证号SCXK(陕)2018-001。在实验条件下(温度25±2℃，相对湿度50±5％)，动物适应性喂养1周。本研究经陕西中医药大学动物伦理委员会批准。将SD大鼠随机分为6组，每组10只，包括空白对照组、模型组、阳性组、迷迭香纯露低剂量组、中剂量组、高剂量组。造模期间，除空白组，其余各组均用300mg/KgPCPA(DL-4-氯苯丙氨酸)(MACKLIN D831376.)进行腹腔注射，持续三天。与空白组相比，其余各组均出现昼夜节律消失，攻击性更强，毛发蓬乱，表明失眠模型建立成功。从第四天起，空白对照组和模型组灌胃1％吐温80水溶液；地西泮组灌胃0.092mg/mL的地西泮溶液；迷迭香纯露低剂量组灌胃10mg/mL的迷迭香纯露；迷迭香纯露中剂量组灌胃12.5mg/mL的迷迭香纯露；迷迭香纯露高剂量组灌胃15mg/mL的迷迭香纯露；分别给药6天，观察各组大鼠的睡眠恢复情况。

1.9.2旷场实验

动物治疗实验结束后，进行旷场实验。测定条件：保持行为学实验室安静通风，室内暗光，手术灯通过照射到天花板上反射到实验操作区；实验人员应远离旷场实验分析箱(以操作角度看不到箱中实验的动物为准)。实验前，动物需要在测定房间内适应10min以上。动物行为学分析系统中将旷场分析箱从左上开始，按照从左到右的顺序以不同颜色编号为9个相同的小格，其中5号为中央区域，其余均为外周格，每次实验时捏住大鼠尾巴距根部2/3处轻放入5号格中，在显示器中观察其5min内活动情况，每只大鼠试验结束后，清除粪便，用75％酒精擦拭试验箱底部及内壁，并进行清洗，风扇吹干后放入下一只，每只仅测定一次。试验结束录像分析，软件统计，记录每只大鼠站立和通过中央格次数。

1.9.3样本采集

旷场实验结束后，对1.9.1下所有大鼠实施安乐死，采用10％水合氯醛进行麻醉，进行腹主动脉取血5mL。血液在4℃、3000r/min下离心10min。然后吸取上层血清储存。大鼠安乐死后，剥取大鼠的全脑至于冰上，分离海马体，一半用多聚甲醛固定，另一半在液氮中冷冻并迅速转移到-80℃的冰箱中。

1.9.4酶联免疫吸附测定

ELISA法检测各组大鼠中五羟色胺(5-HT)、γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺(DA)的含量，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验，按照试剂盒说明书操作，最终用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD)值，绘制标准曲线，计算样品中5-HT、GABA、DA的含量。

1.9.5免疫组化

将海马体组织切片后在二甲苯中浸泡两次，然后使用乙醇梯度(1000％、95％、85％、75％)和双蒸馏水各水化3min，在0.01M柠檬酸钠缓冲溶液中进行高压抗原修复20min-30min，加3％H₂O₂，阻断内源性过氧化物酶，湿盒孵育10min。加非免疫、正常羊血清封闭非特异性抗原，37℃湿盒孵育30min，然后滴加一抗，4℃孵育过夜，然后取出在室温下洗涤3次，每次3min，再加HRP标记二抗(兔抗)在37℃下温育60min。然后将切片进行DAB染色，自来水冲洗，苏木精复染，再用0.1％盐酸酒精分化，显微镜下观察染色程度，最后进行脱水、透明以及封片。

1.9.6Western-Blot实验

收集各组大鼠的海马体组织，加入RIPA裂解液至完全裂解。将样品进行4℃、12000g离心15min,取上清液作为蛋白质提取物。按照SDS-PAGE凝胶配置合适浓度的分离胶，取15μg蛋白上样，进行电泳，再转到PVDF膜上，用5％脱脂奶粉密封，加入一抗，4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次，每次5min。加入按照1：1000稀释的HRP标记的二抗，与膜37℃孵育1h，再用TBST进行洗涤，ECL试剂显影。用凝胶图像处理系统分析目标条带，分析计算目的蛋白相对表达量。

1.9.7实时荧光定量聚合酶链式反应(Rt-PCR)

TRlzol法提取总DNA，反转录反应程序：42℃，60分钟；70℃，5分钟；Real-time PCR反应总程序：95℃，10分钟(95℃，15秒；55℃，45秒)×40；95℃,15秒；60℃,1分钟；95℃,15秒；60℃,15秒。数据采用仪器自带软件(ABI Prism 7300SDS Software)进行分析，采用2^-ΔctΔct方法计算各mRNA的相对表达水平。引物见表5。

表5 Rt-PCR引物表

1.10统计分析

本研究所有实验数据均采用SPSS19.0软件及进行统计分析。结果表示为平均值±标准偏差

应用单因素方差分析来确定各组之间的差异性，p＜0.05，p＜0.01表示具有差异性。

2.结果

2.1迷迭香纯露GC-MS分析

本研究采用GC-MS分析迷迭香纯露的活性成分，得到纯露的离子质谱图(图4A)，结合NIST数据库和保留指数筛选共得到23种活性成分，鉴定出19种合格的迷迭香纯露成分，具体化合物结构见图2。

2.2RNA-seq分析结果

经基迪奥生物在线分析平台，设置FDR≤0.05，差异倍数为1，PCA如图3A，共获得1579个差异基因靶点。其中，空白与模型相比，上调基因有945个，下调基因有613个，差异基因火山图如图3B所示。差异基因热图如图3C所示。针对空白与模型两组差异基因进行KEGG和GO富集，将与神经系统疾病有关的通路进行分析，KEGG富集到的通路有GABAergicsynapse、Nicotine addiction、cAMP signaling pathway、Serotonergic synapse等通路(如图3D)；GO富集分析包括BP、CC、MF，参与的通路有cellular process、biologicalregulation、binding、cell part等(如图3E)。针对测序结果，对单个比较组中的所有基因使用KEGG和GO数据库进行GSEA分析，对与神经系统有关的疾病进行富集说明。针对空白和模型两组，GSEA-KEGG结果表明，富集到的通路有Amyotrophic lateral sclerosis、Serotonergic synapse、Neurotrophin signaling pathway等通路(如图3F)；GSEA-GO结果表明，参与的通路有protein activation cascade、complement activation等(如图3G)。

2.3失眠靶点的选择及网络分析

通过使用PubChem数据库结合Swiss Target Prediction和Meta Tar Fisher数据库共获得迷迭香纯露533个靶点。并且从GeneCards、DisGeNet和OMIM数据库中获得了失眠疾病2705个靶点。取迷迭香纯露成分靶点、失眠疾病靶点与测序差异基因三者的交集，获得迷迭香纯露治疗失眠的靶点29个结果如图(图4B)。将交集基因靶点数据导入Cytoscape3.7.2软件，构建迷迭香纯露治疗失眠疾病的“成分-靶点”网络图。结果如图4C所示，黄色椭圆代表迷迭香纯露的活性成分，绿色菱形代表关键基因，连线表示成分与基因之间存在关系，连接数目越多，表明成分或者基因的作用越重要。将29个交集基因导入string构建PPI网络图，结果如图4D所示。PPI网络图由29个节点构成，平均自由度1.45。节点大小代表度值，值越大，表明越重要。PPI显示ALB、GABAR2、GBARB3等度值较大，在治疗失眠的过程中起作用。将29个交集基因的Ensembl ID和log2fc值进行KEGG和GO的富集分析。KEGG结果(图4E)表明，参与的通路包括Nicotine addiction、Neuroactive ligand-receptorinteraction、GABAergic synapse、Serotonergic synapse等。GO富集分析如图4F所示。

2.4GO和KEGG富集分析

对29个基因利用R软件进行GO和KEGG富集分析。GO分析包括87条生物过程、45条细胞组成和61条分子功能通路。KEGG富集了18条通路。这些通路包括神经活性配体受体相互作用、五羟色胺能突触、GABA能突触和cAMP信号通路等途径，经过权重系数的计算，将结果综合考虑确定五羟色胺能突触通路是最重要的通路。结果如图5。

2.5分子对接结果

通过分子对接将迷迭香纯露治疗失眠的有效成分和关键靶点连接起来，结果表明，有关键靶点蛋白对接结果优于阳性药物，表明迷迭香纯露在治疗失眠方面存在活性成分，结果如图6所示。

2.6迷迭香纯露对失眠大鼠的治疗作用研究

PCPA腹腔注射后，除空白组，其余各组均出现了昼夜节律消失，攻击性更强，毛发蓬乱，表明模型成功；空白组活动灵活，昼夜活动有规律。阳性药组和不同剂量的迷迭香纯露组治疗后，攻击性降低，昼夜节律浮现。

2.7旷场实验结果

对所有大鼠进行旷场实验，结果表明，通过观察大鼠站立次数与通过中央的次数两个指标，与正常组相比，模型组的站立次数和通过中央的次数显著减少(p＜0.001)。与模型组相比较，地西泮组和迷迭香纯露各组大鼠的站立次数和通过中央的次数，均有升高(p＜0.05和p＜0.01)，结果如图7A、B。

2.8 5-HT、GABA、DA的血清水平

通过ELISA试剂盒测定血清中5-HT、GABA、DA的水平，结果显示(图7C、D、E)，与正常组相比，失眠模型组的血清中5-HT、GABA降低(p＜0.05，n＝6)，DA显著降低(p＜0.001，n＝6)。与模型组相比较，地西泮组和迷迭香纯露各组血清中5-HT、GABA均有不同程度的升高(p＜0.05和p＜0.01，n＝6)，与模型组相比较，地西泮组和迷迭香纯露各组血清中DA除低剂量组(p＞0.05)外，其余都有不同程度的升高(p＜0.05和p＜0.01)。

2.9 5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA在海马体组织中的表达(免疫组化结果)

通过免疫组化实验测定大鼠海马体中的5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA的表达水平。与正常组相比，模型组中的5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA的表达水平均显著降低(p＜0.001)。与模型组相比较，地西泮组和迷迭香纯露各组的5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA均有不同程度的升高(p＜0.05和p＜0.01)。结果表明，迷迭香纯露可以促使失眠大鼠海马体组织中5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA表达升高，从而提升其睡眠质量，如图8。

2.10 Western-Blot分析

通过Western-Blot实验测定大鼠海马体中5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA的蛋白的表达水平。与正常组相比，模型组中的5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA的表达水平均显著降低(p＜0.01，n＝3)。与模型组相比较，地西泮组和迷迭香低、中、高剂量组中的5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA均有不同程度的升高。其中，迷迭香中剂量组与模型组比较均有差异性(p＜0.05，n＝3)。结果表明迷迭香纯露可以促进5-HT通路，治疗失眠。结果如图9F。

2.11实时荧光定量聚合酶链式反应(Rt-PCR)

通过Rt-PCR实验测定大鼠海马体中5-HT1AR、ADCY5、GABAA和PKA的mRNA的表达水平。结果表明，与正常组相比，模型组的5-HT1AR、ADCY5、GABAA、PKA的表达水平均显著降低(p＜0.001，n＝3)，cAMP的表达水平降低(p＜0.01，n＝3)。与模型组相比较，地西泮组和迷迭香纯露各组的5-HT1AR、cAMP、PKA的表达量均有不同程度的升高，且有差异性(p＜0.05和p＜0.01)；ADCY5的表达量除迷迭香低剂量组外，其余均有差异性升高(p＜0.05)；GABAA的表达量除迷迭香纯露高剂量组外，其余均有差异性升高(p＜0.05)。结果如图9A-E。

通过以上结果表明迷迭香纯露的活性成分1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one、3-Methyl-4-isopropylphenol、Caryophyllene和Citronellol协同改善失眠的症状。其中，Caryophyllene可能是通过上调5-HT1AR表达，使得5-HT含量增加，上调参与五羟色胺能突触通路中的ADCY5、cAMP、PKA和GABA，达到治疗失眠的目的。其作用机制图如图10。

3.讨论

众所周知，失眠与抑郁高度相关，且常规治疗精神疾病类的药物会对患者造成依赖性，所以人们对草药抗失眠的研究越来越感兴趣，草药的提取物及其成分，例如石竹、连翘、迷迭香等在动物模型中具有抗失眠、抗抑郁的作用。本研究经迷迭香纯露口服给药，探究治疗失眠疾病的作用机制。以网络药理学为基础，以构建“权重系数”为载体，运用RNA-seq，引入口服生物利用度和成分含量的关键性指标，进行通路富集排序，综合考察文献信息确定五羟色胺能突触是迷迭香纯露治疗失眠疾病的关键通路。

五羟色胺能系统在治疗失眠、抑郁中扮演者不可替代的角色。五羟色胺(5-HT)是一种重要的脑神经递质，对情绪、认知、睡眠、生殖和运动功能都有着至关重要的作用，也与各种精神疾病的发病机制有关。5-HT是睡眠神经科学中第一个已知的促进睡眠的物质。五羟色胺能药物已经被证明可有效治疗焦虑症，并且不会出现苯二氮卓类药物的副作用。研究显示，大脑内的5-HT主要分布于脑干中缝核中的中缝背核(DRN)和中缝大核，有很多个受体，其中5-HT1A、5-HT1B受体亚型与抑制腺苷酸环化酶(ADCY5)有关。Flesinoxan(5-HT1A激动剂)显微注射到DRN可增强REM睡眠。研究表明，DA(多巴胺)的功能障碍可诱发失眠，在对患有严重抑郁症患者的脑脊液中，DA代谢物的含量降低，这与本研究ELISA试剂盒对DA的血清含量检测结果一致，通过口服迷迭香纯露，可以增加失眠大鼠的DA的含量，改善失眠症状。在抑郁患者的海马体中5-HT1A结合潜力降低，抑郁会引起失眠，表明5-HT1AR是引起抑郁、失眠的重要因素。5-HT作为信号分子，可与细胞膜表面的G蛋白偶联受体结合，进而触发腺苷酸环化酶(ADCY5),导致细胞内产生第二信使环磷酸腺苷(cAMP)，cAMP通过激活蛋白激酶A(PKA)使得蛋白质发生磷酸化，进而作用于GABA，使得GABA含量增加，促进睡眠。相反，当5-HT含量降低使得cAMP减少，会下调细胞外信号传递到细胞内，使得PKA-(环磷酸腺苷反应元件结合蛋白)CREB-(脑源性神经营养因子)BDNF通路表达下调，使产生不良心理的变化，会导致失眠、抑郁。因此，当cAMP激活PKA，使得CREB磷酸化来调节转录，BDNF基因表达增加，介导细胞对外界刺激的反应，从而影响人的心理行为特征。Garcia研究表明，在高度焦虑的环境下，激活DRN-(终纹床核)BNST通路中的5-HT能神经元，可以减少焦虑行为，促进睡眠。

本研究采用PCPA混悬液对SD大鼠进行腹腔注射，复制失眠模型，实验结束后，采取大鼠的海马体进行检测。利用Elisa试剂盒、Western-Blot实验、Rt-PCR技术与免疫组化对富集在五羟色胺能突触通路上的5-HT1AR、PKA、cAMP、ADCY5和GABAA进行测定，结果表明失眠大鼠的各个指标含量降低，经迷迭香纯露治疗的大鼠的指标相比于模型组大鼠都有不同程度的提高，表明迷迭香纯露对于治疗失眠疾病有相应的作用。通过动物实验的验证，更好的证明了“权重系数”与网络药理学结合分析的可靠性。在失眠的研究中，5-HT和GABA参与睡眠-觉醒周期，海马体内抑制5-HT1AR介导的cAMP/PKA信号通路可引起认知功能障碍。GABA是许多临床药物治疗失眠的重点靶点，例如地西泮是通过与GABAA受体结合来调节GABA，从而治疗失眠。PKA激活剂8-Br-cAMP具有抗抑郁的活性。为了进一步确定迷迭香纯露中影响五羟色胺能突触的有效成分，选择GABRB2、GABRB3、HTR1A和PTGS1四个靶点对应的迷迭香纯露活性成分与相应的阳性药作为配体，进行分子对接，验证迷迭香纯露的活性成分与失眠疾病靶点的相互关系。经过分析，表明1,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptan-2-one、3-Methyl-4-isopropylphenol、Caryophyllene和Citronellol作为迷迭香纯露的组成成分能发挥疗失眠的作用。迷迭香纯露是通过成分之间的协同作用，发挥治疗失眠的功效。

综上所述，研究表明迷迭香纯露通过作用Serotonergic synapse来达到治疗失眠的效果，其可开发为一种具有缓解失眠患者症状的功能性饮品，调节失眠患者的情绪，降低抑郁症的风险。

Claims (9)

1.迷迭香纯露在制备治疗失眠的药物和/改善睡眠功能的食品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述迷迭香纯露是迷迭香药材加水蒸馏，蒸馏液去除精油后的液体。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是以迷迭香纯露为活性成分，加上药品上可接受的辅料制备而成的制剂。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品是以迷迭香纯露为活性成分，加上食品上可接受的辅料制备而成的制剂。

5.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述制剂是口服制剂。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述口服制剂为溶液剂、丸剂、膏剂或胶囊剂。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是提升睡眠质量的药物；所述食品是提升睡眠质量的食品。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物是升高血清中5-HT、GABA和/或DA水平的药物；所述食品是升高血清中5-HT、GABA和/或DA水平的食品。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物是升高海马体组织中5-HT1AR、ADCY5、GABAA、cAMP和/或PKA表达水平的药物；所述食品是升高海马体组织中5-HT1AR、ADCY5、GABAA、cAMP和/或PKA表达水平的食品。

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