CN115835920A - 可编程核酸酶诊断装置 - Google Patents

可编程核酸酶诊断装置 Download PDF

Info

Publication number
CN115835920A
CN115835920A CN202180047814.9A CN202180047814A CN115835920A CN 115835920 A CN115835920 A CN 115835920A CN 202180047814 A CN202180047814 A CN 202180047814A CN 115835920 A CN115835920 A CN 115835920A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
nucleic acid
trans
target nucleic
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180047814.9A
Other languages
English (en)
Inventor
杰瑟斯·陈
詹姆斯·保罗·布劳顿
玛丽亚-内菲利·察洛格卢
李耀辉
蒂莫西·詹姆斯·帕特诺
贾尼斯·沙·陈
莎拉·简·夏皮罗
詹姆斯·雷蒙德·科尔多瓦
布莱恩·J·伊士曼
唐纳德·艾伦·洛米勒
克莱尔·路易丝·法兴
卡利·盖伦特·亨德里克斯
利奥尔·克赖恩德勒
丹尼尔·托马斯·德扎尔
德文·斯普拉特
雅各布·列辛斯基
约书亚·拜克
雷切尔·诺哈·德兰尼
索纳尔·简恩
索菲亚·哈贝尔
马修·韦罗斯洛夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mammoth Biosciences Inc
Original Assignee
Mammoth Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mammoth Biosciences Inc filed Critical Mammoth Biosciences Inc
Publication of CN115835920A publication Critical patent/CN115835920A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0825—Test strips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0633—Valves, specific forms thereof with moving parts
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0633—Valves, specific forms thereof with moving parts
    • B01L2400/0644—Valves, specific forms thereof with moving parts rotary valves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0633—Valves, specific forms thereof with moving parts
    • B01L2400/065—Valves, specific forms thereof with moving parts sliding valves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0633—Valves, specific forms thereof with moving parts
    • B01L2400/0655—Valves, specific forms thereof with moving parts pinch valves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502738—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by integrated valves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/301—Endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Endoscopes (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)

Abstract

本公开提供了各种诊断装置。装置可包括：样品接口，所述样品接口被配置为接收样品，所述样品可包含至少一个目标序列；与所述样品接口和检测腔室流体连通的通道，所述通道包括一个或多个可移动机构以将所述样品分为多个液滴，其中所述检测腔室被配置为接收所述多个液滴并且使所述多个液滴与设置在所述检测腔室的表面上的至少一个可编程核酸酶探针接触，并且其中所述至少一个可编程核酸酶探针可包含与可编程核酸酶复合的引导核酸；以及多个传感器，所述多个传感器通过检测在所述至少一个可编程核酸酶探针切割所述至少一个目标序列的靶核酸区域时产生的信号来确定所述至少一个目标序列的存在。

Description

可编程核酸酶诊断装置
交叉引用
本申请要求以下各项的权益：2020年5月29日提交的美国临时申请号63/032,455；2020年11月13日提交的美国临时申请号63/113,798；2021年2月19日提交的美国临时申请号63/151,592；2021年3月26日提交的美国临时申请号63/166,538；以及2021年4月28日提交的美国临时申请号63/181,130，所述申请中的每一者都以引用的方式整体并入本文。
关于联邦政府赞助研究的声明
本发明是在由美国国防部的国防高级研究计划局(DARPA)授予的合同号N66001-21-C-4048下通过政府支持完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
特别是在疾病或传染病的早期阶段对病痛的检测可为治疗或干预提供指导以减缓所述病痛的进展或传播。此类病痛可在能够进行诊断测定的即时需求装置处进行检测。这些装置可检测与生物体、疾病状态、表型或基因型相关联的各种生物物种。部署此类装置的挑战包括开发在不影响测定性能的情况下将诊断测定部件固定在表面上的方法，以及在没有大量额外仪器的情况下执行样品扩增的方法。
发明内容
在一方面，本公开提供了一种可编程核酸酶诊断装置，所述可编程核酸酶诊断装置可包括：样品接口，所述样品接口被配置为接收样品，所述样品可包含至少一个目标序列；与所述样品接口和检测腔室流体连通的通道，所述通道包括一个或多个可移动机构以将所述样品分为多个液滴，其中所述检测腔室被配置为接收所述多个液滴并且使所述多个液滴与设置在所述检测腔室的表面上的至少一个可编程核酸酶探针接触，其中所述至少一个可编程核酸酶探针可包含与可编程核酸酶复合的引导核酸；以及多个传感器，所述多个传感器通过检测在所述至少一个可编程核酸酶探针切割所述至少一个目标序列的靶核酸区域时产生的信号来确定所述至少一个目标序列的存在。在一些实施方案中，靶核酸区域的切割在所述靶核酸区域与所述至少一个可编程核酸酶探针的所述引导核酸发生互补结合之后发生。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针可包含CRISPR/Cas酶。在一些实施方案中，引导核酸可包括引导RNA。在一些实施方案中，一个或多个可移动机构包括被配置为限制通过所述通道的一个或多个部段的流量的一个或多个阀。在一些实施方案中，一个或多个可移动机构包括被配置为限制通过所述通道的一个或多个部段的流量的柱塞或刷毛。在一些实施方案中，一个或多个可移动机构操作性地联接到与所述装置集成或可插入所述装置中的电源。在一些实施方案中，电源可包括电池。在一些实施方案中，装置可包括物理过滤器以从样品中过滤不包含目标序列的一个或多个颗粒。在一些实施方案中，装置可包括样品制备腔室。在一些实施方案中，样品制备腔室可包括裂解剂。在一些实施方案中，样品制备腔室可包括被配置用于热灭活的加热单元。在一些实施方案中，样品制备腔室可包括用于核酸纯化的一种或多种试剂。在一些实施方案中，通道可包括多个加热元件和多个散热器以用于对所述至少一个目标序列或其一部分进行扩增。在一些实施方案中，多个加热元件和所述多个散热器被配置为对所述多个液滴执行一个或多个热循环操作。在一些实施方案中，装置可包括包含不同的引导RNA的多个可编程核酸酶探针。在一些实施方案中，信号与物理、化学或电化学变化或反应相关联。在一些实施方案中，信号可包括光学信号。在一些实施方案中，信号可包括荧光或比色信号。在一些实施方案中，信号可包括电位或电流信号。在一些实施方案中，信号可包括压电信号。在一些实施方案中，信号与设置有所述至少一个可编程核酸酶探针的固体或凝胶体积的折射率的变化相关联。
在另一方面，本公开提供了一种装置，所述装置可包括：样品接口，所述样品接口被配置为接收样品，所述样品可包含一个或多个目标靶序列；一个或多个通道，所述一个或多个通道包括一个或多个可移动机构以将所述样品分为分区的样品，其中所述一个或多个通道与所述样品接口和反应腔室流体连通，所述反应腔室被配置为接收所述分区的样品并且使所述分区的样品与酶、试剂或可编程检测剂接触，所述酶、试剂或可编程检测剂被配置为切割所述一个或多个目标靶序列的核酸；以及多个传感器，所述多个传感器用于通过检测在所述核酸的所述切割时释放的一个或多个报告基因来确定所述一个或多个目标靶序列的存在。在一些实施方案中，可编程检测剂可包含CRISPR/Cas酶。在一些实施方案中，一个或多个目标靶序列包含核酸序列，所述核酸序列包含所述核酸。在一些实施方案中，一个或多个可移动机构包括多个阀，所述多个阀被配置为限制在第一方向上通过所述一个或多个通道流向所述样品接口的流量。在一些实施方案中，多个阀被配置为选择性地准许在第二方向上通过所述一个或多个通道流向所述反应腔室的流量。在一些实施方案中，多个阀的第一阀和第二阀被配置为在所述第一阀和所述第二阀处于关闭状态时将所述样品的第一部分与所述样品的第二部分物理地、流体地分离或热分离。在一些实施方案中，一个或多个通道包括多个加热元件和多个散热器以对所述分区的样品执行热循环。在一些实施方案中，多个加热元件中的第一加热元件和所述多个散热器中的第一散热器定位在所述一个或多个可移动机构中的第一可移动机构与第二可移动机构之间。在一些实施方案中，报告基因可包含核酸和检测部分。在一些实施方案中，报告基因可包含至少一种核糖核苷酸或至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，报告基因可包含DNA核酸或RNA核酸。在一些实施方案中，装置可包括远程医疗单元，所述远程医疗单元被配置为将一个或多个检测结果提供到远离所述装置的计算单元，其中所述一个或多个检测结果表明所述样品中存在或不存在目标靶核酸。
在另一方面，本公开提供了一种用于靶标检测的方法，所述方法包括：使样品与本文所述的任何装置接触；以及检测所述样品中一个或多个目标基因的存在或不存在。在一些实施方案中，方法可包括产生指示样品中一个或多个目标基因的存在或不存在的一个或多个检测结果。在一些实施方案中，方法可包括将一个或多个检测结果传输到远程计算单元。在一些实施方案中，远程计算单元可包括移动装置。在另一方面，本公开提供了一种用于靶标检测的方法，所述方法包括：提供包含至少一个目标基因的样品；使用一个或多个可移动机构将所述样品分为多个子样品；在检测腔室中接收所述多个子样品并且使所述多个子样品与设置在所述检测腔室的表面上的至少一个可编程核酸酶探针接触，其中所述至少一个可编程核酸酶探针可包含与可编程核酸酶复合的引导核酸；以及使用多个传感器以通过检测在所述至少一个可编程核酸酶探针切割所述至少一个目标基因中的靶核酸区域时产生的信号来确定所述至少一个目标基因的存在或不存在。在一些实施方案中，方法可包括在将所述样品分为多个子样品之后对所述至少一个目标基因进行扩增。在一些实施方案中，方法可包括在所述检测腔室中接收所述多个子样品之前对所述至少一个目标基因进行扩增。在一些实施方案中，对所述至少一个目标基因进行扩增可包括使用多个加热元件和多个散热器来对所述多个子样品执行热循环。
在一些实施方案中，可编程核酸酶探针可包含CRISPR/Cas酶。在一些实施方案中，引导核酸可包括引导RNA。在一些实施方案中，一个或多个可移动机构包括被配置为限制通过所述通道的一个或多个部段的流量的一个或多个阀。在一些实施方案中，一个或多个可移动机构包括被配置为限制通过所述通道的一个或多个部段的流量的柱塞或刷毛。在一些实施方案中，方法可包括使用物理过滤器以从所述样品中过滤不包含所述至少一个目标基因的一个或多个颗粒。在一些实施方案中，方法可包括在检测所述至少一个目标基因之前裂解所述样品。在一些实施方案中，方法可包括对样品执行热灭活。在一些实施方案中，方法可包括对样品执行核酸纯化。在一些实施方案中，方法可包括使所述多个子样品与包含不同的引导RNA的多个可编程核酸酶探针接触。在一些实施方案中，信号与物理、化学或电化学变化或反应相关联。在一些实施方案中，信号选自由以下各项组成的组：光学信号、荧光信号、比色信号、电位信号、电流信号和压电信号。在一些实施方案中，信号与设置有所述至少一个可编程核酸酶探针的固体或凝胶体积的折射率的变化相关联。在一些实施方案中，方法可包括使用所述信号来检测病原性病毒、病原性细菌、病原性蠕虫、病原性真菌或癌细胞。在一些实施方案中，病原性病毒选自由以下各项组成的组：呼吸道病毒、腺病毒、副流感病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)、冠状病毒、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS、胃肠道病毒、诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、发疹病毒、肝病毒性疾病、皮肤病毒性疾病、疱疹、出血性病毒性疾病、埃博拉、拉沙热、登革热、黄热病、马尔堡出血热、克里米亚-刚果出血热、神经系统病毒、脊髓灰质炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、狂犬病、性传播病毒、HIV、HPV、免疫缺陷病毒、流感病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、疱疹病毒、黄热病病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和乳头瘤病毒。在一些实施方案中，方法可包括使用在切割时释放的报告基因与所述检测腔室中的另一种材料、实体或分子物质之间的物理或化学相互作用来放大或修改所述信号。在一些实施方案中，本公开的所述装置被配置为基于所述信号而检测病原性病毒、病原性细菌、病原性蠕虫、病原性真菌或癌细胞。在一些实施方案中，病原性病毒选自由以下各项组成的组：呼吸道病毒、腺病毒、副流感病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)、冠状病毒、SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS、胃肠道病毒、诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、发疹病毒、肝病毒性疾病、皮肤病毒性疾病、疱疹、出血性病毒性疾病、埃博拉、拉沙热、登革热、黄热病、马尔堡出血热、克里米亚-刚果出血热、神经系统病毒、脊髓灰质炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、狂犬病、性传播病毒、HIV、HPV、免疫缺陷病毒、流感病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒、疱疹病毒、黄热病病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒和乳头瘤病毒。在一些实施方案中，装置的所述检测腔室或所述反应腔室可包括另一种材料、实体或分子物质，其被配置为与在切割时释放的报告基因物理或化学地相互作用或发生反应以放大或修改所述信号。在一些实施方案中，目标序列可包括生物序列。所述生物序列可包括核酸序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，目标序列与目标生物体、目标疾病、目标疾病状态、目标表型、目标基因型或目标基因相关联。
在另一方面，反应腔室可包括表面，其中探针包含所述酶、所述试剂、所述可编程检测试剂、可编程核酸酶、引导核酸、报告基因或其组合中的至少一种，并且其中所述探针通过键联固定到所述表面。在一些实施方案中，键联可包括表面官能度和探针官能度。在一些实施方案中，表面官能度设置在所述表面上。在一些实施方案中，表面官能度是链霉亲和素。在一些实施方案中，可编程核酸酶的氨基酸残基通过所述键联连接到所述表面。在一些实施方案中，氨基酸残基用所述探针官能度进行修饰。在一些实施方案中，探针官能度是生物素。在一些实施方案中，引导核酸通过所述键联连接到所述表面。在一些实施方案中，引导核酸在3’端或5’端用所述探针官能度进行修饰。在一些实施方案中，报告基因通过所述键联连接到所述表面。在一些实施方案中，报告基因可包含所述核酸、所述探针官能度、检测部分、淬灭剂或其组合中的至少一种。在一些实施方案中，报告基因被配置为使所述检测部分保持固定到所述表面，并且使所述淬灭剂在切割所述报告基因时释放到溶液中。在一些实施方案中，报告基因被配置为使所述淬灭剂保持固定到所述表面，并且使所述检测部分在切割所述报告基因时释放到溶液中。
在本文所述的各个方面，报告基因通过键联连接到所述表面。在一些实施方案中，键联可包括表面官能度和探针官能度。在一些实施方案中，表面官能度设置在所述表面上并且所述报告基因可包含所述探针官能度。
在某些方面，本文描述了一种用于靶标检测的方法的实施方案，所述方法包括：提供包含至少一个目标序列的样品；使用一个或多个可移动机构将所述样品分为多个子样品；在检测腔室中接收所述多个子样品并且使所述多个子样品与至少一个探针接触，其中所述至少一个探针通过键联连接到所述检测腔室的表面，其中所述至少一个探针可包含可编程核酸酶、引导核酸、报告基因或其组合；以及使用多个传感器以通过检测在所述可编程核酸酶切割所述报告基因时产生的信号来确定所述至少一个目标序列的存在。
本文描述了一种装置的各种实施方案，所述装置包括：样品接口，所述样品接口被配置为接收可包含一个或多个目标靶序列的样品；一个或多个通道，所述一个或多个通道包括一个或多个可移动机构以将所述样品分为分区的样品，其中所述一个或多个通道与所述样品接口和包括表面的反应腔室流体连通，其中至少一个探针可包含可编程核酸酶、引导核酸、报告基因或其组合，其中所述至少一个探针通过键联连接到所述表面；以及多个传感器，所述多个传感器用于通过检测在所述可编程核酸酶切割所述报告基因时发出的信号来确定所述一个或多个目标靶序列的存在。
本文描述了用于检测靶核酸的各种装置，所述装置包括：样品接口，所述样品接口被配置为接收包含靶核酸的样品；反应腔室(例如，加热区域)，所述反应腔室与所述样品接口流体连通并且被配置为对经由所述样品接口接收的所述样品进行扩增；检测区域，所述检测区域与所述加热区域流体连通；以及可编程核酸酶探针，所述可编程核酸酶探针设置在所述样品接口、所述加热区域和/或所述检测区域内，其中经由所述加热区域、所述样品接口和/或所述检测区域内所述可编程核酸酶探针与所述靶核酸之间的选择性结合而产生信号，其中所述检测区域被配置为检测对应于所述靶核酸的存在的信号，并且其中在所述样品接口处接收到所述样品之后不到30分钟的时间内确定所述靶核酸的存在或不存在。在一些实施方案中，试剂混合物包含扩增试剂。在一些实施方案中，试剂混合物是冻干的。在一些实施方案中，试剂混合物位于所述装置的与所述样品接口和所述加热区域两者流体连通的区域中。在一些实施方案中，试剂混合物位于所述样品接口、所述加热区域、所述检测区域和/或所述样品接口与所述加热区域之间的区域内。在一些实施方案中，加热区域包括扩增试剂。在一些实施方案中，样品经由环介导等温扩增(LAMP)进行扩增。在一些实施方案中，加热区域被配置为维持等温或非循环温度曲线。在一些实施方案中，等温或非循环温度曲线是在约30℃至约60℃之间。在一些实施方案中，等温或非循环温度曲线为约55℃至约60℃。在一些实施方案中，样品接口包括被配置为接收含有所述样品的拭子的隔室。在一些实施方案中，隔室包括被配置为将所述样品从所述拭子转移到所述装置的刮刀。在一些实施方案中，隔室含有被配置为从所述拭子中提取所述样品的接口溶液。在一些实施方案中，接口溶液包括缓冲溶液或裂解缓冲溶液。在一些实施方案中，样品接口被配置为经由移液从拭子接收所述样品。在一些实施方案中，样品接口包括被配置为从含有所述样品的容器接收所述样品的隔室。在一些实施方案中，容器包括注射器。在一些实施方案中，注射器接口包括用于从中接收所述样品的开口。在一些实施方案中，注射器接口开口与以下各项流体连通：i)所述加热区域，和/或ii)与所述加热区域流体连通的另一个隔室。在一些实施方案中，样品接口被配置为接收作为流体的所述样品。在一些实施方案中，加热区域和检测区域设置在所述装置上的相同位置。在一些实施方案中，加热区域和所述检测区域设置在所述装置的同一隔室内。在一些实施方案中，加热区域包括用于供流体移动穿过其中的通道。在一些实施方案中，通道与所述样品接口和所述检测区域直接或间接地流体连通，从而使得所述样品能够从所述样品接口移动到所述检测区域。在一些实施方案中，通道包括螺旋构造或蛇形构造。在一些实施方案中，用于供流体移动穿过其中的两个或更多个通道，其中所述两个或更多个通道中的至少一个通道被配置为使所述样品从所述样品接口移动到所述检测区域。在一些实施方案中，加热区域的每个通道包括一个或多个可移动机构。在一些实施方案中，一个或多个可移动机构包括：i)第一可移动机构，所述第一可移动机构是在所述样品接口与加热区域之间以用于控制所述样品在它们之间的转移，和/或ii)第二可移动机构，所述第二可移动机构是在所述加热区域与所述检测区域之间以用于控制所述样品在它们之间的转移。在一些实施方案中，加热区域的至少一个通道包括被配置为将所述样品分为两个或更多个子样品的两个或更多个加热隔室，其中所述两个或更多个隔室经由所述一个或多个可移动机构中的可移动机构而彼此分开。在一些实施方案中，每个加热隔室被配置为由对应的加热元件加热。在一些实施方案中，装置的至少一个加热元件包括化学加热元件。在一些实施方案中，至少一个化学加热元件是乙酸钠。在一些实施方案中，加热区域包括与所述样品接口和所述检测区域流体连通的腔室。在一些实施方案中，加热区域包括固定在其中的报告基因，其中所述报告基因被配置为经由激活的可编程核酸酶与所述靶核酸之间的选择性结合而释放检测部分，从而使得能够产生所述信号。在一些实施方案中，报告基因经由固定在所述加热区域的表面上的支持物而固定在所述加热区域中。在一些实施方案中，支持物包括珠粒、涂层和散布的聚合物。在一些实施方案中，支持物包括固体支持物。在一些实施方案中，加热区域的所述表面包括为所述表面的凹陷部分的孔，其中所述支持物设置在所述孔内。在一些实施方案中，一个或多个通道将所述样品从所述样品接口移动到所述检测区域。在一些实施方案中，一个或多个通道位于所述样品接口内，位于所述样品接口与所述加热区域之间，位于所述加热区域内，位于所述加热区域与所述检测区域之间和/或位于所述检测区域内。在一些实施方案中，一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组连续布置的通道。在一些实施方案中，一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组平行布置的通道(平行通道)，从而使得所述样品能够在所述至少一组平行通道的每个通道内分为子样品。在一些实施方案中，一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组通道，所述至少一组通道被构造为将所述样品从所述装置内的第一位置移动到所述装置内的第二位置，从而使得所述样品能够在所述至少一组通道的每个通道内分为子样品。在一些实施方案中，至少一组通道包括具有不同长度和/或不同构造的两个或更多个通道，从而使得能够为两个或更多个对应的子样品指定特定条件。在一些实施方案中，特定条件包括指定的加热温度范围、指定的加热持续时间、在所述装置上的任何区域或位置内的指定的停留时间、特定温育时间、与特定试剂的接触或其任何组合。在一些实施方案中，至少一组通道包括具有相同长度和/或构造的两个或更多个通道，从而使得能够为两个或更多个对应的子样品指定特定条件。在一些实施方案中，一个或多个通道中的通道包括径向构造、螺旋构造、蛇形构造、线性构造或其任何组合。在一些实施方案中，至少一个致动器。在一些实施方案中，至少一个致动器包括柱塞、弹簧致动柱塞或弹簧机构。在一些实施方案中，至少一个致动器是手动致动的。在一些实施方案中，至少一个致动器中的第一致动器被配置为经由所述第一致动器的手动致动而将所述样品从所述样品接口移动到所述加热区域。在一些实施方案中，至少一个致动器中的第二致动器被配置为经由所述第二致动器的手动致动而将所述检测部分从所述加热区域移动到所述检测区域。在一些实施方案中，装置被配置为在没有电力的情况下手动地操作。在一些实施方案中，电源。在一些实施方案中，电源包括一个或多个电池。在一些实施方案中，加热区域被配置为经由加热元件加热所述样品。在一些实施方案中，加热元件包括化学加热元件。在一些实施方案中，化学加热元件是乙酸钠。在一些实施方案中，信号是视觉可检测的。在一些实施方案中，可编程核酸酶包含引导核酸。在一些实施方案中，引导核酸被修饰。在一些实施方案中，引导核酸用至少一个甲基进行修饰。在一些实施方案中，可编程核酸酶还包括Cas酶。在一些实施方案中，Cas酶选自由以下各项组成的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a、Cas14a1和CasPhi。在一些实施方案中，靶核酸指示呼吸道病症或呼吸道病原体。在一些实施方案中，呼吸道病症或呼吸道病原体选自由以下各项组成的组：SARS-CoV-2和对应的变体、29E、NL63、OC43、HKU1、MERS-CoV、MERS、SARS-CoV(SARS)、甲型流感、乙型流感、RSV、鼻病毒、A族链球菌和TB。在一些实施方案中，装置被配置为区分病毒感染与细菌感染。在一些实施方案中，靶核酸指示性传播感染(STI)或与女性健康相关的感染。在一些实施方案中，STI或与女性健康相关的感染选自由以下各项组成的组：CT、NG、MG、TV、HPV、念珠菌、细菌性阴道炎、梅毒和UTI。在一些实施方案中，靶核酸包含单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，SNP指示NASH病症或α-1病症。在一些实施方案中，靶核酸是选自由以下各项组成的组的血源性病原体：HIV、HBV、HCV和寨卡病毒。在一些实施方案中，靶核酸指示幽门螺杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、诺如病毒、HSV和脑膜炎。在一些实施方案中，物理过滤器被配置为从所述样品中过滤不包含所述靶核酸的一个或多个颗粒。在一些实施方案中，物理过滤器位于所述样品接口与加热区域之间并且与所述样品接口和加热区域流体连通。在一些实施方案中，可编程核酸酶、引导核酸或报告基因通过键联固定到装置表面。在一些实施方案中，键联包括共价键、非共价键、静电键、链霉亲和素与生物素之间的键、酰胺键或其任何组合。在一些实施方案中，键联包括非特异性吸收。在一些实施方案中，可编程核酸酶通过所述键联固定到所述装置表面，其中所述键联是在所述可编程核酸酶与所述表面之间。在一些实施方案中，报告基因通过所述键联固定到所述装置表面，其中所述键联是在所述报告基因与所述表面之间。在一些实施方案中，引导核酸通过所述键联固定到所述表面，其中所述键联是在所述引导核酸的所述5’端与所述表面之间。在一些实施方案中，引导核酸通过所述键联固定到所述表面，其中所述键联是在所述引导核酸的所述3’端与所述表面之间。在一些实施方案中，多种引导核酸，其中所述多种引导核酸中的每种引导核酸与所述靶核酸的不同片段互补或部分互补。在一些实施方案中，样品包括含有所述靶核酸的样品、含有所述扩增试剂的样品、扩增的样品和/或含有所述检测部分的样品。
本文描述了用于检测样品中的靶核酸的各种装置，所述装置包括：样品接口，所述样品接口用于接收所述样品；反应腔室(例如，加热区域)，所述反应腔室与所述样品接口流体连通，所述加热区域包括：包含引导核酸的可编程核酸酶和报告基因，其中所述可编程核酸酶通过所述引导核酸与靶核酸之间的选择性结合而激活，其中所述报告基因被配置为在被所述激活的可编程核酸酶切割时释放检测部分；化学加热元件，所述化学加热元件被配置为将热量提供到所述加热区域；检测区域，所述检测区域与所述加热区域流体连通，其中所述检测区域被配置为检测由所述释放的检测部分产生的信号；第一手动致动器，所述第一手动致动器被配置为将所述样品从所述加热区域转移到所述检测区域；以及试剂混合物，所述试剂混合物包含扩增试剂，其中所述试剂混合物设置在所述样品接口、所述加热区域、所述检测区域内，和/或设置在所述样品接口与所述加热区域之间，其中所述装置被配置为经由所述产生的信号而在不到30分钟的时间内确定所述靶核酸的存在或不存在。在一些实施方案中，试剂混合物是冻干的。在一些实施方案中，加热区域被配置为对所述靶核酸进行扩增。在一些实施方案中，加热区域包括所述扩增试剂。在一些实施方案中，靶核酸经由环介导等温扩增(LAMP)进行扩增。在一些实施方案中，加热区域被配置为维持等温或非循环温度曲线。在一些实施方案中，等温或非循环温度曲线是在约30℃至约60℃之间。在一些实施方案中，等温或非循环温度曲线为约55℃至约60℃。在一些实施方案中，样品接口包括被配置为接收含有所述样品的拭子的隔室。在一些实施方案中，隔室包括被配置为将所述样品从所述拭子转移到所述装置的刮刀。在一些实施方案中，隔室含有被配置为从所述拭子中提取所述样品的接口溶液。在一些实施方案中，接口溶液包括缓冲溶液或裂解缓冲溶液。在一些实施方案中，样品接口被配置为经由移液从拭子接收所述样品。在一些实施方案中，样品接口包括被配置为从含有所述样品的容器接收所述样品的隔室。在一些实施方案中，容器包括注射器。在一些实施方案中，注射器接口包括用于从中接收所述样品的开口。在一些实施方案中，注射器接口开口与以下各项流体连通：所述加热区域或与所述加热区域流体连通的另一个隔室。在一些实施方案中，样品接口被配置为接收作为流体的所述样品。在一些实施方案中，加热区域和检测区域设置在所述装置上的相同位置。在一些实施方案中，加热区域和所述检测区域设置在所述装置的同一隔室内。在一些实施方案中，加热区域包括用于供流体移动穿过其中的通道。在一些实施方案中，通道与所述样品接口和所述检测区域直接或间接地流体连通，从而使得所述样品能够从所述样品接口移动到所述检测区域。在一些实施方案中，通道包括螺旋构造或蛇形构造。在一些实施方案中，用于供流体移动穿过其中的两个或更多个通道，其中所述两个或更多个通道中的至少一个通道被配置为使所述样品从所述样品接口移动到所述检测区域。在一些实施方案中，加热区域的每个通道包括一个或多个可移动机构。在一些实施方案中，一个或多个可移动机构包括：i)第一可移动机构，所述第一可移动机构是在所述样品接口与加热区域之间以用于控制所述样品在它们之间的转移，和/或ii)第二可移动机构，所述第二可移动机构是在所述加热区域与所述检测区域之间以用于控制所述样品在它们之间的转移。在一些实施方案中，加热区域的至少一个通道包括被配置为将所述样品分为两个或更多个子样品的两个或更多个加热隔室，其中所述两个或更多个隔室经由所述一个或多个可移动机构中的可移动机构而彼此分开。在一些实施方案中，每个加热隔室被配置为由至少一个加热元件的对应的加热元件加热。在一些实施方案中，装置的所述至少一个加热元件包括化学加热元件。在一些实施方案中，至少一个化学加热元件是乙酸钠。在一些实施方案中，加热区域包括腔室。在一些实施方案中，加热区域包括固定在其中的所述报告基因。在一些实施方案中，报告基因经由固定在所述加热区域的表面上的支持物而固定在所述加热区域中。在一些实施方案中，支持物包括珠粒、涂层和散布的聚合物。在一些实施方案中，支持物包括固体支持物。在一些实施方案中，加热区域的所述表面包括为所述表面的凹陷部分的孔，其中所述支持物设置在所述孔内。在一些实施方案中，一个或多个通道将所述样品从所述样品接口移动到所述检测区域。在一些实施方案中，一个或多个通道位于所述样品接口内，位于所述样品接口与所述加热区域之间，位于所述加热区域内，位于所述加热区域与所述检测区域之间和/或位于所述检测区域内。在一些实施方案中，一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组连续布置的通道。在一些实施方案中，一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组平行布置的平行通道(平行通道)，从而使得所述样品能够在所述至少一组平行通道的每个通道内分为子样品。在一些实施方案中，一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组通道，所述至少一组通道被配置为使所述样品从所述装置内的第一位置移动到所述装置内的第二位置，从而使得所述样品能够在所述至少一组通道的每个通道内分为子样品。在一些实施方案中，至少一组通道包括具有不同长度和/或不同构造的两个或更多个通道，从而使得能够为两个或更多个对应的子样品指定特定条件。在一些实施方案中，特定条件包括指定的加热温度范围、指定的加热持续时间、在所述装置上的任何区域或位置内的指定的停留时间、特定温育时间、与特定试剂的接触或其任何组合。在一些实施方案中，至少一组通道包括具有相同长度和/或构造的两个或更多个通道，从而使得能够为两个或更多个对应的子样品指定特定条件。在一些实施方案中，一个或多个通道中的通道包括径向构造、螺旋构造、蛇形构造、线性构造或其任何组合。在一些实施方案中，至少一个致动器包括柱塞、弹簧致动柱塞或弹簧机构。在一些实施方案中，装置被配置为在没有电力的情况下手动地操作。在一些实施方案中，装置可包括电源。在一些实施方案中，电源包括一个或多个电池。在一些实施方案中，加热区域被配置为经由加热元件加热所述样品。在一些实施方案中，加热元件包括化学加热元件。在一些实施方案中，化学加热元件是乙酸钠。在一些实施方案中，信号是视觉可检测的。在一些实施方案中，引导核酸被修饰。在一些实施方案中，引导核酸用至少一个甲基进行修饰。在一些实施方案中，可编程核酸酶还包括Cas酶。在一些实施方案中，Cas酶选自由以下各项组成的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a、Cas14a1和CasPhi。在一些实施方案中，靶核酸指示呼吸道病症或呼吸道病原体。在一些实施方案中，呼吸道病症或呼吸道病原体选自由以下各项组成的组：SARS-CoV-2和对应的变体、29E、NL63、OC43、HKU1、MERS-CoV、MERS、SARS-CoV(SARS)、甲型流感、乙型流感、RSV、鼻病毒、A族链球菌和TB。在一些实施方案中，装置被配置为区分病毒感染与细菌感染。在一些实施方案中，靶核酸指示性传播感染(STI)或与女性健康相关的感染。在一些实施方案中，STI或与女性健康相关的感染选自由以下各项组成的组：CT、NG、MG、TV、HPV、念珠菌、细菌性阴道炎、梅毒和UTI。在一些实施方案中，靶核酸包含单核苷酸多态性(SNP)。在一些实施方案中，SNP指示NASH病症或α-1病症。在一些实施方案中，靶核酸是选自由以下各项组成的组的血源性病原体：HIV、HBV、HCV和寨卡病毒。在一些实施方案中，靶核酸指示幽门螺杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、诺如病毒、HSV和脑膜炎。在一些实施方案中，物理过滤器被配置为从所述样品中过滤不包含所述靶核酸的一个或多个颗粒。在一些实施方案中，物理过滤器位于所述样品接口与加热区域之间并且与所述样品接口和加热区域流体连通。在一些实施方案中，可编程核酸酶、引导核酸或报告基因通过键联固定到装置表面。在一些实施方案中，键联包括共价键、非共价键、静电键、链霉亲和素与生物素之间的键、酰胺键或其任何组合。在一些实施方案中，键联包括非特异性吸收。在一些实施方案中，可编程核酸酶通过所述键联固定到所述装置表面，其中所述键联是在所述可编程核酸酶与所述表面之间。在一些实施方案中，报告基因通过所述键联固定到所述装置表面，其中所述键联是在所述报告基因与所述表面之间。在一些实施方案中，引导核酸通过所述键联固定到所述表面，其中所述键联是在所述引导核酸的所述5’端与所述表面之间。在一些实施方案中，引导核酸通过所述键联固定到所述表面，其中所述键联是在所述引导核酸的所述3’端与所述表面之间。在一些实施方案中，多种引导核酸，其中所述多种引导核酸中的每种引导核酸与所述靶核酸的不同片段互补或部分互补。在一些实施方案中，样品包括含有所述靶核酸的样品、含有所述扩增试剂的样品、扩增的样品和/或含有所述检测部分的样品。
本文描述了一种用于多重检测样品中的多种靶核酸的微阵列装置的各种实施方案，所述微阵列装置包括：样品接口，所述样品接口用于接收所述样品；试剂混合物，所述试剂混合物包含扩增试剂；反应腔室(例如，加热区域)，所述反应腔室与所述样品接口流体连通；以及检测区域，所述检测区域包括表面，所述表面包括微阵列形式的多个检测点，其中所述多个检测点中的每一个包括报告探针，其中每个报告探针被配置为经由激活的可编程核酸酶的切割而释放检测部分，其中所述多个检测点中的每一个包括不同的可编程核酸酶探针，并且其中所述装置被配置为经由所述多个检测点中的每一个处的每个报告基因的每个检测部分的释放而在不到30分钟的时间内确定所述多种靶核酸中的每一种的存在或不存在。在一些实施方案中，至少一种可编程核酸酶探针包含Cas酶。在一些实施方案中，至少一种可编程核酸酶的每种Cas酶选自包括以下各项的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a和Cas14a1。在一些实施方案中，微阵列装置可包括如本文所述的装置的所有不同实施方案。
本文描述了一种用于检测样品中的靶核酸的试剂盒的各种实施方案，所述试剂盒包括：拭子；洗脱试剂；裂解试剂；装置，所述装置包括：样品接口，所述样品接口用于接收所述样品；反应腔室(例如，加热区域)，所述反应腔室与所述样品接口流体连通并且被配置为接收所述样品，所述加热区域包括设置在所述加热区域内的包含引导核酸的可编程核酸酶和报告基因，其中所述可编程核酸酶通过所述引导核酸与所述靶核酸之间的选择性结合而激活，其中所述报告基因被配置为经由所述激活的可编程核酸酶而释放检测部分；化学加热元件，所述化学加热元件被配置为将热量提供到所述加热区域；检测区域，所述检测区域与所述加热区域和所述样品接口流体连通；其中所述检测区域被配置为检测由所述释放的检测部分产生的信号，从而检测所述靶核酸的存在；以及试剂混合物，所述试剂混合物包含扩增试剂，其中所述试剂混合物设置在所述样品接口、所述加热区域、所述检测区域内和/或设置在所述样品接口与所述加热区域之间，并且其中所述装置被配置为经由所述释放的检测部分而在不到30分钟的时间内确定所述靶核酸的存在或不存在。在一些实施方案中，样品接口被配置为从所述拭子接收所述样品。在一些实施方案中，收集管，其中所述收集管被配置为接纳所述拭子，其中所述拭子中所含的所述样品被转移到所述收集管，并且其中所述收集管与所述装置是分开的。在一些实施方案中，收集管被配置为插入所述样品接口中以将所述样品转移到所述装置。在一些实施方案中，收集管是注射器。在一些实施方案中，试剂盒包括含有所述洗脱试剂和/或所述裂解试剂的第一容器。在一些实施方案中，试剂盒包括稀释试剂。在一些实施方案中，试剂盒包括含有所述稀释试剂的第二容器。在一些实施方案中，可编程核酸酶包括Cas酶。在一些实施方案中，Cas酶选自包括以下各项的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a和Cas14a1。在一些实施方案中，试剂盒可包括如本文所述的装置的所有不同实施方案。
本文描述了一种用于检测样品中的靶核酸的方法的各种实施方案，所述方法包括：提供装置，所述装置被配置为在将样品引入所述装置中之后不到30分钟内确定靶核酸的存在或不存在，所述装置包括样品接口、与所述样品接口流体连通的加热区域以及与所述加热区域流体连通的检测区域；将所述样品引入所述装置的所述样品接口中；将所述样品与包含扩增试剂的试剂混合物混合以产生混合样品溶液；将所述混合样品溶液从所述样品接口转移到所述加热区域；通过在所述加热区域中加热所述混合样品溶液来对所述样品进行扩增；执行基于可编程核酸酶的测定，其中引导核酸与所述靶核酸之间的选择性结合激活可编程核酸酶探针，所述可编程核酸酶探针被配置为切割报告探针，从而在存在所述靶核酸时将检测部分释放到所述样品溶液中；将具有所述扩增样品的所述混合样品溶液从所述加热区域转移到所述检测区域；以及经由所述检测区域中对所述释放的检测部分的捕获而确定所述样品中所述靶核酸的存在或不存在。在一些实施方案中，对所述靶核酸进行扩增和所述执行所述可编程核酸酶测定在所述加热区域中作为一锅反应执行。在一些实施方案中，所述一锅反应是在约30℃至60℃之间执行。在一些实施方案中，一锅反应是在约55℃下执行。在一些实施方案中，一锅反应的所述可编程核酸酶包括Cas酶，所述Cas酶选自包括以下各项的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a和Cas14a1。在一些实施方案中，方法还包括在进入所述加热区域之前对具有所述试剂混合物的所述样品进行过滤。在一些实施方案中，方法还包括过滤所述样品，这包括从所述样品中过滤不包含所述靶核酸的一个或多个颗粒。在一些实施方案中，过滤器位于所述样品接口与加热区域之间并且与所述样品接口和加热区域流体连通。在一些实施方案中，方法还包括多种引导核酸，所述多种引导核酸中的每种引导核酸与所述靶核酸的不同片段互补或部分互补。在一些实施方案中，方法在步骤(a)之前还包括：提供包括样品溶液的收集管，所述样品溶液包含所述靶核酸；以及经由将所述收集管插入所述装置的样品接口中而将所述样品溶液转移到所述装置，其中所述样品溶液溶解并且与包含扩增试剂的冻干反应混合物混合。在一些实施方案中，方法可包括如本文所述的各种装置的所有各种实施方案。
以引用的方式并入
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其程度就如同每个独立的公布、专利或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入一样。
附图说明
本发明的新颖特征在随附权利要求中具体地阐述。通过参考以下阐述利用本发明原理的说明性实施方案的详细描述和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1示出了用于基于可编程核酸酶的检测装置的过程流程图，由此在检测一个或多个靶序列之前收集并制备包含一个或多个靶序列的样品。样品制备包括分隔开的热循环。
图2A至图2B示出了如本文所述的基于可编程核酸酶的检测装置的自上而下的视图和横截面图。
图3A至图3B示出了如本文所述的基于可编程核酸酶的检测装置的横截面图，所述检测装置包括具有可移动机构的多个热循环隔室。
图4A至图4B示出了如本文所述的在互补的结合事件之前和之后的可编程核酸酶探针，所述可编程核酸酶探针包含可编程核酸酶和与可编程核酸酶复合的引导核酸。
图5A至图5B示出了如本文所述的在互补的结合事件之前和之后的可编程核酸酶探针以及指示靶序列或靶核酸的存在的信号的产生。
图6示出了如本文所述的可进行反应以产生可由传感器检测的放大的信号的大分子量报告基因。
图7A至图7C示出了如本文所述的基于可编程核酸酶的检测装置的各种复用实施方案。
图8示出了针对即时需求(PON)型5重呼吸组的测定设计。
图9示出了如本文所述的根据实施方案的PON一次性装置。
图10A至图10C示出了如本文所述的消耗品和部件的实施方案。
图11A至图11D进一步示出了如本文所述的消耗品部件的各种实施方案。
图12示出了如本文所述的可消耗装置的阀定位。
图13呈现了如本文所述的用电化学报告基因进行的HERC2基因DETECTR反应的氧化曲线。
图14呈现了如本文所述的用电化学报告基因进行的HERC2DETECTR反应的还原曲线。
图15呈现了如本文所述的在HERC2 DETECTR反应前后取得的循环伏安图。
图16呈现了如本文所述的用电化学报告基因进行的SARS-CoV-2DETECTR反应的氧化曲线。
图17呈现了如本文所述的用电化学报告基因和对照进行的SARS-CoV-2DETECTR反应的方波伏安法测量的完整数据集。
图18呈现了如本文所述的具有R1763(N-基因)的复合主混合物。
图19呈现了如本文所述的方波伏安法测量的实验条件。
图20示出了如本文所述的用于CRISPR-Cas诊断测定组分的固定化策略。
图21示出了如本文所述的固定化策略被结合来实现CRISPR诊断读出的实施方案。
图22呈现了如本文所述的评估各种化学修饰与gRNA的相容性的结果。
图23呈现了如本文所述的将gRNA固定化到经链霉亲和素涂覆的表面的结果。
图24呈现了如本文所述的固定化Cas蛋白-RNA复合物的结果。
图25A至图25B呈现了如本文所述的固定化报告基因的结果。
图26呈现了如本文所述的对组合的固定的核糖核蛋白(RNP)和报告基因系统进行功能测试的结果。
图27A至图27E呈现了如本文所述的评估结合Cas复合物固定化一起固定化的不同报告基因的结果。
图28A至图28C呈现了如本文所述的Cy5报告基因对DETECTR起作用的结果。
图29A至图29F呈现了如本文所述的涉及复合物形成步骤的固定化优化的结果。
图30A至图30B呈现了涉及gRNA/报告基因结合时间和报告基因浓度的固定化优化的结果。
图31A至图31C呈现了显示修饰的gRNA的靶标区分的结果。
图32A至图32E呈现了显示经生物素修饰的Cas13a gRNA起作用的结果。
图33呈现了具有生物素化的报告基因的经链霉亲和素涂覆的显微镜载片的结果。
图34A至图34B呈现了载玻片上的DETECR反应的结果。
图35呈现了如本文所述的实验条件。
图36呈现了如本文所述的实验条件。
图37A至图37B呈现了如本文所述的实验条件。
图38A至图38B呈现了如本文所述的实验条件。
图39A至图39B呈现了如本文所述的实验条件。
图40A至图40B呈现了如本文所述的实验条件。
图41A至图41B呈现了如本文所述的实验条件。
图42呈现了如本文所述的实验条件。
图43示出了DETECTR测定装置的布局。
图44示出了滑动阀装置的示意图。
图45示出了样品移动通过如图44所示的滑动阀装置的图。
图46呈现了针对初始裂解和浓缩缓冲液筛选进行样品制备优化的结果。
图47呈现了涉及用Cas 14a.1实现Hotpot的样品制备优化的结果。
图48呈现了涉及LANCR(Cas12MO8 DETECTR)对照操作的样品制备优化的结果。
图49A至图49B呈现了使用左侧的RT-LAMP和右侧的DETECTR对组1:海藻糖实现的冻干优化结果。
图50A至图50B呈现了如图50A所示在3％至8％的候选赋形剂下使用RT-LAMP MM对组2：PVP 40、山梨醇、甘露糖醇、甘露糖实现的冻干优化结果，以及针对如图50B所示的DETECTR的结果。
图51A至图51B呈现了在3％至5％的候选赋形剂下使用DETECTR MM对组2：PVP 40、山梨醇、甘露糖醇、甘露糖实现的冻干优化结果。
图52呈现了在海藻糖功能筛选中对RT-LAMP主混合物实现的冻干优化结果。
图53A至图53B呈现了如本文所述的在海藻糖中对DETECTR主混合物实现的冻干优化结果。
图54A至图54B呈现了涉及在单个反应体积(一锅)中进行LAMP扩增与Cas14aDETECTR的HotPot的结果。
图55呈现了在单个反应体积(一锅)中实现RT-LAMP扩增与Cas14a DETECTR的结果。
图56A至图56B呈现了用于鉴定与Cas14a和低温RT-LAMP(LowLAMP)相容的缓冲液的结果。
图57呈现了在低温RT-LAMP条件下各个组分对Cas14的性能的影响的结果。
图58呈现了在单个反应体积(一锅)中实现LAMP扩增与Cas14aDETECTR的结果。
图59A至图59B呈现了伴有LowLAMP的一锅Cas14在50℃下的结果。
图60呈现了在55℃下用Bsm DNA聚合酶进行一锅Cas14的结果。
图61呈现了涉及一锅DETECTR(HotPot)的检测限研究的结果。
图62呈现了涉及一锅DETECTR(HotPot)的检测限研究的结果，其中在55℃下测试了两种不同的DNA聚合酶。
图63呈现了涉及在NEAR测定中替换Bst聚合酶的研究的结果，显示能够在较低温度下进行SARS-CoV-2检测。
图64呈现了在Cas14a最佳缓冲液中实现NEAR测定扩增功能的结果。
图65呈现了Cas14a在某一KOAc盐浓度范围内起作用的结果。
图66呈现了涉及增加KOAc的浓度以提高在Cas14a最佳缓冲液中的NEAR性能的研究的结果。
图67呈现了涉及增加KOAc的浓度以提高在Cas14a最佳缓冲液中的NEAR性能的研究的结果。
图68A至图68B分别呈现了序列以及Cas14a.1crRNA对SARS-CoV-2E-基因扩增子的性能的结果。
图69呈现了评估Klenow(exo-)NEAR测定在IB13缓冲液中在降低的盐浓度下的性能的结果。
图70呈现了对sRCA的概述。
图71呈现了针对sRCA筛选哑铃形DNA模板的结果。
图72呈现了来自涉及Cas14a在升高的温度下检测RCA反应产物的能力的研究的结果。
图73呈现了来自涉及触发寡核苷酸的作用的研究的结果。
图74呈现了来自涉及在Cas14一锅sRCA中滴定触发寡核苷酸的研究的结果。
图75呈现了在一锅sRCA中评估Cas12M08的结果。
图76呈现了对Cas13实现RCA正反馈的概述。
图77呈现了评估用于RCA的与Cas13相容的DNA模板的结果。
图78呈现了来自评估与Cas13相容的DNA模板是否在RCA中起作用的研究的结果。
图79呈现了来自涉及在升高的温度下在一锅sRCA反应中的Cas13功能的研究的结果。
图80呈现了对CasPin的概述。
图81呈现了CasPin的潜在发夹结构。
图82呈现了使用两个发夹的初始设计的结果。
图83在左侧呈现了组合的gRNA和报告基因固定化的示意图，而在右侧呈现了使用NHS-胺化学物质固定化DETECTR组分的结果。
图84呈现了优化缀合缓冲液以减少非特异性结合的结果。
图85呈现了来自涉及固定报告基因+引导物+Cas12M08的不同组合的研究的结果。
图86呈现了来自优化gRNA和靶标浓度以提高固定的DETECTR的信噪比的研究的结果。
图87A至图87B分别呈现了修饰和针对DETECTR固定化评估各种氨基修饰的结果。
图88呈现了FASTR测定的结果，所述测定涉及通过快速热循环+CRISPR Dx检测SARS-CoV-2。
图89呈现了来自为FASTR测定确定表现最佳的聚合酶和缓冲液的研究的结果。
图90呈现了用FASTR对SARS-CoV-2进行单拷贝检测的结果。
图91呈现了快速循环时间的变化对FASTR中的变性和退火/延伸造成的结果。
图92呈现了最小化FASTR的RT时间的结果。
图93呈现了提高FASTR性能的较高pH缓冲液的结果。
图94呈现了FASTR与粗裂解缓冲液的相容性的结果。
图95呈现了非优化的多重FASTR的结果。
图96呈现了多重FASTR的结果。
图97呈现了多重FASTR的检测限的结果。
图98呈现了关键引物和gRNA。
图99A至图99B呈现了被合并在一起的RT-LAMP和DETECTR测定试剂两者的一锅主混合物的结果。针对每次测定单独地流入含有Cas12M08蛋白的相同反应混合物的等分试样。图99A示出了RT-LAMP测定的结果，并且图99B示出了DETECTR测定的结果。
图100呈现了在冻干之后复溶的基于Cas12M08的DETECTR主混合物的结果。
图101呈现了基于Cas14a1的DETECTR测定的结果。
图102A至图102B呈现了RT-LAMP和基于Cas12M08的DETECTR测定的结果，其中在冻干之前将含有试剂主混合物的一个样品储存两周。
图103呈现了小体积、冻干反应主混合物的结果。
图104呈现了DETECTR和RT-LAMP试剂的合并的冻干主混合物的动态扫描量热法结果。
图105呈现了赋形剂列表。
图106呈现了在手持式微流体装置上进行的一锅DETECTR测定的结果。
图107示出了如本文所述的复用横向流试纸条的实施方案。
图108示出了如本文所述的利用复用“HotPot”的工作流的实施方案。
图109示出了如本文所述的基于HRP纸的检测的实施方案。
图110示出了如本文所述的基于HRP的多重横向流测定的实施方案。
图111示出了如本文所述的基于HRP的多重横向流测定的多重Cas13固定化方法的实施方案。
图112示出了相隔一周进行两次重复操作的DNA酶测定和基于DETECTR的测定两者的结果。
图113示出了如本文所述的增强对横向流测定的信号检测的多个Cas-复合物探针引导物合并的使用。
图114描绘了DETECTR测定的结果，与使用单独的gRNA形式的基于DETECTR Cas12a的测定相比，所述测定使用合并引导物(合并-gRNA)形式显示了对GF184靶标的增强的基于Cas12a的检测。
图115描绘了DETECTR测定的结果，与使用单独的引导物形式的基于Cas13a的测定相比，所述测定使用合并引导物形式显示了对SC2靶标的基于Cas13a的检测的增强的灵敏度。
图116示出了对应于每个腔室的用于计数阳性液滴的数量的图像，显示与含有单独形式的引导RNA的Cas13a-DETECTR测定样品相比，含有合并的引导RNA的Cas13a-DETECTR测定样品在每个靶RNA的起始拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体。
图117示出了在扩增之后对信号强度的测量，显示与含有单独形式的引导RNA的Cas13a-DETECTR测定样品相比，含有合并的引导RNA的Cas13a-DETECT测定样品在每个靶模板RNA的起始拷贝中产生更大的信号强度。
图118示出了在扩增之后对信号强度的测量，显示与含有单独形式的引导RNA的Cas13a-DETECTR测定样品相比，含有合并的引导RNA的Cas13a-DETECT测定样品在每个靶模板RNA的起始拷贝中产生更大的信号强度。图118还示出了通过计数阳性液滴的数量执行的相对定量，显示与含有单独形式的引导RNA的Cas13a-DETECTR测定样品相比，含有合并的引导RNA的Cas13a-DETECTR测定样品在每个靶模板RNA的起始拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体。
图119示出了与含有单独形式的单一引导物R4684、R4667或R4785(RNA酶P引导物)的Cas13a DETECTR样品相比，含有合并引导物(R4637、R4638、R4667、R4676、R4684、R4689、R4691)的Cas13a DETECTR测定样品在每个靶标的起始拷贝中并未展现出更高的靶标检测灵敏度。
图120示出了如本文所述的包括横向流测定的手持装置的实施方案。
图121A至图121B示出了如本文所述的包括横向流测定的即时需求装置的实施方案。
图122示出了如本文所述的包括横向流测定的即时需求装置的实施方案。
图123示出了如本文所述的包括横向流测定和螺旋反应腔室的即时需求装置的实施方案。
图124示出了如本文所述的包括用于触发装置致动器的开关触发器的即时需求装置的实施方案。
图125示出了如本文所述的联接到输入端口并且形状基本上为螺旋形的反应腔室的实施方案。
图126示出了如本文所述的用于横向流测定的壳体结构的实施方案，所述壳体结构包括针对每个测定具有基本上相同的轮廓长度的通道结构。
图127A至图127B示出了如本文所述的在装置致动器致动之前和部分致动之后的即时需求装置的实施方案。
图128A至图128B示出了如本文所述的化学加热元件及其时间依赖性温度曲线的实施方案。
图129A至图129B示出了如本文所述的横向流试纸条构造的实施方案。
图130示出了包括化学加热元件和电加热元件的即时需求装置的实施方案。
图131A至图131B示出了DETECTR测定的结果，所述结果显示利用本文所述的即时需求装置实施方案中的一个实施方案成功地实现了核酸扩增。
图132示出了DETECTR测定的结果，所述结果显示利用本文所述的流动试纸条测定实施方案中的一个实施方案成功地实现了核酸检测。
图133示出了用于评估、表征和优化诊断应用的蛋白质的过程的流程图。
图134展示了示出使用Labcyte Echo的过程的工作流的示意图。
图135示出了三种候选Cas酶的荧光反应的实验结果。
图136示出了三种候选Cas酶在不同温度和缓冲液下的性能。
图137示出了在存在三种另外的缓冲液的情况下在35℃下用CasM.1740进行的测试的结果。
图138示出了研究在35℃下关于单链寡核苷酸或合成dsDNA靶标的检测限的实验的结果。
图139示出了评估在35℃和证明蛋白质对CasM.1740起作用所处的最高温度下的检测限的实验的结果。
图140示出了研究添加剂和测定制剂对蛋白质性能的影响的实验的结果。
图141示出了用CasM.124070进行的单核苷酸突变敏感性实验的结果。
图142示出了用CasM.08进行的单核苷酸突变敏感性实验的结果。
图143示出了用CasM.124070和CasM.08在相同靶位点下进行的单核苷酸突变敏感性实验的结果。
图144A至图144B示出了针对在敏感性、特异性或热稳定性方面具有最佳性能的蛋白质研究反式切割的动力学的实验的结果。
图145总结了各种Cas酶的性能结果。
具体实施方式
本公开提供了用于核酸靶标检测的系统和方法。本公开的系统和方法可使用被配置用于基于可编程核酸酶的检测的装置来实现。在一些实施方案中，装置可被配置用于单反应检测。在一些实施方案中，装置可为一次性装置。本文公开的装置可特别适合于进行高效、快速而准确的反应以检测样品中是否存在靶标。靶标可包括靶序列或靶核酸。如本文所用，靶标可互换地称为靶核酸。此外，如果靶标经历扩增(例如，通过如本文其他位置所描述的热循环过程)，则此类靶标可称为靶标扩增子或靶核酸扩增子。靶核酸可为目标核酸，例如来自任何目标植物、动物、病毒或微生物的靶核酸的一部分。本文提供的装置可用于在单个集成系统中执行快速测试。
靶核酸可为来自病原体、病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫或导致活生物体(例如，人类、动物、植物、作物等)中的疾病或疾患和/或与所述疾病或疾患相关的其他病原(agent)或生物体的核酸或核酸的一部分。靶核酸可为核酸或其一部分。靶核酸可为来自样品中的癌症或遗传病中表达的基因的核酸的一部分。靶核酸可为来自样品中的任何生物体的RNA或DNA的一部分。在一些实施方案中，如本文所公开的一种或多种可编程核酸酶可被激活以引发报告基因(本文中也称为报告基因)的反式切割活性。在一些情况下，如本文所公开的可编程核酸酶可与靶序列或靶核酸结合以引发报告基因的反式切割。可编程核酸酶可称为RNA激活的可编程RNA核酸酶。在一些情况下，如本文所公开的可编程核酸酶可与靶DNA结合以引发RNA报告基因的反式切割。这种可编程核酸酶在本文中可称为DNA激活的可编程RNA核酸酶。在一些情况下，如本文所述的可编程核酸酶可被靶RNA或靶DNA激活。例如，可编程核酸酶(例如，Cas酶)可被靶RNA核酸或靶DNA核酸激活以切割RNA报告基因。在一些实施方案中，Cas酶可与引发RNA报告基因的反式切割的靶ssDNA结合。在一些情况下，如本文所公开的可编程核酸酶可与靶DNA结合以引发DNA报告基因的反式切割，并且这种可编程核酸酶可称为DNA激活的可编程DNA核酸酶。
本文描述和提及的核酸可包含多个碱基对。碱基对可为包含通过氢键彼此结合的两个核碱基的生物单元。核碱基可包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和/或尿嘧啶。在一些情况下，本文描述和提及的核酸可包含不同的碱基对。在一些情况下，本文描述和提及的核酸可包含一个或多个修饰的碱基对。当一个或多个碱基对经历导致新碱基的化学修饰时，可产生一个或多个修饰的碱基对。一个或多个修饰的碱基对可为例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤、黄嘌呤核苷、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟苷、5,6-二氢尿嘧啶、二氢尿苷、5-甲基胞嘧啶、5-甲基胞苷、5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)或5-羧基胞嘧啶(5caC)。
在与可编程核酸酶复合的引导核酸与靶核酸结合之后，可编程核酸酶可被激活，并且激活的可编程核酸酶可切割靶核酸，这可产生反式切割活性。反式切割活性可为激活的可编程核酸酶对附近单链核酸的非特异性切割，诸如具有检测部分的检测核酸的反式切割。一旦靶核酸被激活的可编程核酸酶切割，检测部分就可从报告基因中释放或分离，并且可直接或间接地产生可检测信号。报告基因和/或检测部分可固定在支持介质上。通常，检测部分是荧光团、染料、多肽或核酸中的至少一种。有时，检测部分与待固定的支持介质上的捕获分子结合。可检测信号可在支持介质上显现，以评定与诸如疾病、癌症或遗传病等病痛相关联的一种或多种靶核酸的存在或浓度。
本公开的系统和方法可使用与人类工程化或天然存在的任何类型的可编程核酸酶相容的装置来实现。可编程核酸酶可包括当与引导核酸和靶核酸片段或其一部分复合时能够被激活的核酸酶。当与引导核酸和目标靶基因的靶序列复合时，可编程核酸酶可被激活。可编程核酸酶可在引导核酸与靶核酸结合时被激活，并且一旦被激活就可展现出或实现反式切割活性。在描述或使用基于CRISPR的可编程核酸酶的任何实例或实施方案中，本文认识到，可使用任何其他类型的可编程核酸酶以作为对此类基于CRISPR的可编程核酸酶的补充或替代。
本公开的系统和方法可使用与多种可编程核酸酶相容的装置来实现。所述装置可包括多个可编程核酸酶探针，所述可编程核酸酶探针包含多种可编程核酸酶和一种或多种对应的引导核酸。多个可编程核酸酶探针可为相同的。可替代地，多个可编程核酸酶探针可为不同的。例如，多个可编程核酸酶探针可包含不同的可编程核酸酶和/或与可编程核酸酶相关联的不同的引导核酸。
如本文所用，可编程核酸酶通常是指可切割核酸的任何酶。可编程核酸酶可为能够或已经通过人类贡献设计、修改或工程化，使得酶以序列特异性方式靶向或切割核酸的任何酶。可编程核酸酶可包括例如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或RNA引导的核酸酶，诸如细菌的成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas(CRISPR相关)核酸酶或Cpfl。可编程核酸酶还可包括例如PfAgo和/或NgAgo。
ZFN可剪切序列特异性物质中的遗传物质，并且可被设计或编程为靶向特定的病毒靶标。ZFN由两个结构域组成：键联到Fokl核酸酶结构域的DNA结合锌指蛋白。DNA结合锌指蛋白与非特异性Fokl切割结构域融合以产生ZFN。蛋白质通常会二聚化以实现活性。两个ZFN单体形成活性核酸酶；每个单体与靶标上的相邻半位点结合。ZFN的序列特异性通过ZFP确定。每个锌指识别3-bp DNA序列，并且3到6个锌指用于产生与9-18bp的DNA序列结合的单个ZFN亚基。锌指的DNA结合特异性因诱变而改变。新的ZFP通过预先表征的锌指的模块化组装进行编程。
转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)可剪切序列特异性物质中的遗传物质，并且可被设计或编程为靶向特定的病毒靶标。TALEN含有在其羧基末端处的Fokl核酸酶结构域和一类称为转录激活因子样效应子(TALE)的DNA结合结构域。TALEN由33到35个氨基酸重复序列的串联阵列组成，每个氨基酸重复序列识别靶病毒DNA的大沟中的单个碱基对。结构域的核苷酸特异性来自位置12和13处的两个氨基酸，其中Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly分别识别鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。这种模式允许人们对TALEN进行编程以靶向各种核酸。
可编程核酸酶可包括任何类型的人类工程化酶。可替代地，可编程核酸酶可包括来源于天然存在的细菌或噬菌体的CRISPR酶。可编程核酸酶可为Cas蛋白(也可互换地称为Cas核酸酶)。crRNA和Cas蛋白可形成CRISPR酶。可编程核酸酶可为具有反式切割活性的CRISPR-Cas(成簇的规则间隔的短回文重复序列-CRISPR相关)核蛋白复合物，其可通过引导核酸与靶核酸的结合来激活。可编程核酸酶可包含一种或多种氨基酸修饰。可编程核酸酶可为来源于CRISPR-Cas系统的核酸酶。可编程核酸酶可为来源于重组工程的核酸酶。
可编程核酸酶
本文公开了可编程核酸酶及其用途，例如靶核酸的检测和编辑。在一些情况下，可编程核酸酶包含V型CRISPR/Cas蛋白。在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白包括核酸切割活性。在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白切割或切削单链核酸、双链核酸或其组合。在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白切割单链核酸。在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白切割双链核酸。在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白切削双链核酸。通常，V型CRISPR/Cas蛋白的引导RNA与ssDNA或dsDNA杂交。然而，V型CRISPR/Cas蛋白的反式切割活性通常是针对ssDNA。[41]在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白包含无催化活性的核酸酶结构域。在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白包含无催化活性的核酸酶结构域。V型CRISPR/Cas蛋白的无催化活性的结构域相对于V型CRISPR/Cas蛋白的野生型核酸酶结构域可包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个突变。所述突变可存在于核酸酶的切割或活性位点内。[42]V型CRISPR/Cas蛋白可为Cas14蛋白。Cas 14蛋白可为Cas14a.1蛋白。Cas14a.1蛋白可由表1中呈现的SEQ ID NO：1表示。Cas14蛋白可包含与SEQ IDNO：1至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列。Cas14蛋白可由与SEQ ID NO：1至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一的氨基酸序列组成。Cas14蛋白可包含SEQ ID NO：1的至少约50、至少约100、至少约150、至少约200、至少约250、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约500个连续氨基酸。
表1–Cas14a.1蛋白序列
Figure BDA0004036779040000351
在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白已经被修饰(也称为工程化蛋白)。例如，本文公开的V型CRISPR/Cas蛋白或其变体可包含核定位信号(NLS)。在一些情况下，NLS可包含KRPAATKKAGQAKKKKEF序列(SEQ ID NO：2)。V型CRISPR/Cas蛋白可被密码子优化以在特定细胞(例如，细菌细胞、植物细胞、真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或人类细胞)中表达。在一些实施方案中，V型CRISPR/Cas蛋白针对人类细胞进行密码子优化。
在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白已经被修饰(也称为工程化蛋白)。例如，本文公开的V型CRISPR/Cas蛋白或其变体可包含核定位信号(NLS)。在一些情况下，NLS可包含KRPAATKKAGQAKKKKEF序列。V型CRISPR/Cas蛋白可被密码子优化以在特定细胞(例如，细菌细胞、植物细胞、真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或人类细胞)中表达。在一些实施方案中，V型CRISPR/Cas蛋白针对人类细胞进行密码子优化。
Cas14蛋白
在一些情况下，V型CRISPR/Cas蛋白包括Cas14蛋白。Cas14蛋白可能包含具有不同的氨基末端和羧基末端结构域的双叶结构。氨基末端和羧基末端结构域可通过柔性接头来连接。柔性接头可能会影响氨基和羧基末端结构域的相对构象。柔性接头可能是短的，例如长度少于10个氨基酸、少于8个氨基酸、少于6个氨基酸、少于5个氨基酸或少于4个氨基酸。柔性接头可能足够长，以在Cas14二聚体复合物的两种Cas14蛋白之间实现氨基和羧基末端结构域的不同构象(例如，氨基和羧基末端结构域的相对取向在Cas14同二聚体复合物的两种Cas14蛋白之间有所不同)。接头结构域可能包含会影响氨基和羧基末端结构域的相对构象的突变。接头可能包含会影响Cas14二聚化的突变。例如，接头突变可增强Cas14二聚体的稳定性。
在一些情况下，Cas14蛋白的氨基末端结构域包括楔形结构域、识别结构域、锌指结构域或其任何组合。楔形结构域可包含多链β桶结构。多链β桶结构可包含在结构上与一些Cas12蛋白相当的寡核苷酸/寡糖结合折叠。识别结构域和锌指结构域各自可(单独地或共同地)插入楔形结构域的β桶链之间。识别结构域可包含4-α-螺旋结构，其在结构上与一些Cas12蛋白中发现的螺旋结构相当，但是更短。识别结构域可包含对引导核酸或引导核酸-靶核酸异源双链体的结合亲和力。在一些情况下，REC叶可包含对靶核酸中的PAM序列的结合亲和力。氨基末端可包含楔形结构域、识别结构域和锌指结构域。羧基末端可包含RuvC结构域、锌指结构域或其任何组合。羧基末端可包含一个RuvC和一个锌指结构域。
Cas14蛋白可包含RuvC结构域或部分RuvC结构域。RuvC结构域可由单个连续序列，或相对于Cas14蛋白的一级氨基酸序列不连续的一组部分RuvC结构域来定义。在一些情况下，部分RuvC结构域本身不具有任何底物结合活性或催化活性。本公开的Cas14蛋白可包括多个部分RuvC结构域，所述结构域可组合来产生具有底物结合或催化活性的RuvC结构域。例如，Cas14可包括3个部分RuvC结构域(RuvC-I、RuvC-II和RuvC-III，本文也称为亚结构域)，所述结构域相对于Cas14蛋白的一级氨基酸序列是不连续的，但是一旦产生蛋白质并发生折叠，就会形成RuvC结构域。Cas14蛋白可包含将Cas14蛋白的羧基末端结构域与Cas14蛋白的氨基末端结构域连接的接头环，并且其中羧基末端结构域包含一个或多个RuvC结构域并且氨基末端结构域包含识别结构域。
Cas14蛋白可包含锌指结构域。在一些情况下，Cas14蛋白的羧基末端结构域包含锌指结构域。在一些情况下，Cas14蛋白的氨基末端结构域包含锌指结构域。在一些情况下，氨基末端结构域包含楔形结构域(例如，多β桶楔形结构)、锌指结构域或其任何组合。在一些情况下，羧基末端结构域包含RuvC结构域和锌指结构域，并且氨基末端结构域包含识别结构域、楔形结构域和锌指结构域。
与许多其他Cas蛋白相比较，Cas14蛋白可能相对较小，从而使得其适合于核酸检测或基因编辑。例如，Cas14蛋白可能由于其尺寸小而不太可能吸附到表面或另一生物物种上。与其他较大的Cas蛋白相比较，这些蛋白质的较小性质也允许它们更容易作为试剂封装在系统或测定中，并且以更高的效率递送。在一些情况下，Cas14蛋白是400至800个氨基酸残基的长度、400至600个氨基酸残基的长度、440至580个氨基酸残基的长度、460至560个氨基酸残基的长度、460至540个氨基酸残基的长度、460至500个氨基酸残基的长度、400至500个氨基酸残基的长度或500至600个氨基酸残基的长度。在一些情况下，Cas14蛋白的长度小于约550个氨基酸残基。在一些情况下，Cas14蛋白的长度小于约500个氨基酸残基。
在一些情况下，Cas14蛋白可作为催化靶核酸内特定位置处的切割的内切核酸酶发挥作用。在一些情况下，Cas14蛋白能够催化单链核酸的非序列特异性切割。在一些情况下，Cas14蛋白在引导核酸与靶核酸结合之后被激活以表现出反式切割活性。这种反式切割活性也称为“附带”或“反式附带”切割。反式切割活性可为激活的可编程核酸酶对附近单链核酸的非特异性切割，诸如具有检测部分的检测核酸的反式切割。
工程化的可编程核酸酶探针
本文公开了非天然存在的组合物和系统，其包含工程化Cas蛋白和工程化引导核酸中的至少一种，它们在本文中可分别简称为Cas蛋白和引导核酸。一般而言，工程化Cas蛋白和工程化引导核酸分别是指自然界中不存在的Cas蛋白和引导核酸。在一些情况下，系统和组合物包含至少一种非天然存在的组分。例如，组合物和系统可包含引导核酸，其中引导核酸的序列与天然存在的引导核酸的序列不同或有所修饰。在一些情况下，组合物和系统包含不会同时天然存在的至少两种组分。例如，组合物和系统可包含引导核酸，所述引导核酸包含不会同时天然存在的重复区和间隔区。此外，举例来说，组合物和系统可包含不会同时天然存在的引导核酸和Cas蛋白。相反，为了清楚起见，“天然的”、“天然存在的”或“自然界中存在的”Cas蛋白或引导核酸包括来自细胞或生物体的未被人类或机器基因修饰的Cas蛋白和引导核酸。
在一些情况下，引导核酸可包含非天然核碱基序列。在一些情况下，非天然序列是自然界中不存在的核碱基序列。非天然序列可包含天然存在的序列的一部分，其中天然存在的序列的所述部分在缺少天然存在的序列的其余部分的情况下在自然界中是不存在的。在一些情况下，引导核酸可包含以自然界中观察不到的顺序或接近度排列的两个天然存在的序列。在一些情况下，组合物和系统包含核糖核苷酸复合物，所述核糖核苷酸复合物包含在自然界中不会同时存在的CRISPR/Cas效应蛋白和引导核酸。工程化引导核酸可包含不会同时天然存在的第一序列和第二序列。例如，工程化引导核酸可包含天然存在的重复区和与天然存在的真核序列互补的间隔区的序列。工程化引导核酸可包含天然存在于生物体中的重复区和不天然存在于该生物体中的间隔区的序列。工程化引导核酸可包含存在于第一生物体中的第一序列和存在于第二生物体中的第二序列，其中第一生物体和第二生物体是不同的。引导核酸可包含设置于引导核酸的3’或5’端或者引导核酸的第一序列与第二序列之间的第三序列。例如，工程化引导核酸可包含通过接头序列偶联的天然存在的crRNA和tracrRNA。
在一些情况下，本文所述的组合物和系统包含与天然存在的Cas蛋白类似的工程化Cas蛋白。工程化Cas蛋白可能缺少天然存在的Cas蛋白的一部分。Cas蛋白可包含相对于天然存在的Cas蛋白的突变，其中所述突变在自然界中是不存在的。相对于天然存在的Cas蛋白，Cas蛋白还可包含至少一种附加氨基酸。例如，Cas蛋白可包含相对于天然存在的Cas蛋白添加的核定位信号。在某些实施方案中，编码Cas蛋白的核苷酸序列相对于天然存在的序列进行密码子优化(例如，以在真核细胞中表达)。
在一些情况下，本文提供的组合物和系统包含编码本文所述的Cas蛋白和引导核酸的多载体体系，其中引导核酸和Cas蛋白由相同或不同的载体编码。在一些实施方案中，工程化引导核酸和工程化Cas蛋白由体系的不同载体编码。
热稳定的可编程核酸酶
本文描述了热稳定的可编程核酸酶的各种实施方案。在一些实施方案中，可编程核酸酶称为效应蛋白。效应蛋白可为热稳定的。在一些情况下，已知的效应蛋白(例如，Cas12核酸酶)是相对热敏感的并且展现出的活性(例如，顺式和/或反式切割)仅足够在低于40℃的温度下，以及最佳地在约37℃下在诊断测定中产生可检测信号。热稳定蛋白可具有与37℃下的那些效应蛋白相当的酶活性、稳定性或折叠。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性(例如，如通过荧光信号产生所测量的最大反式切割率)可为37℃下的反式切割活性的至少50％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少55％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少60％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少65％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少70％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少75％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少80％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少85％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少90％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少95％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少100％。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少1倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少2倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少3倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少4倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少5倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少6倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少7倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少8倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少9倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。
在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少50％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少55％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少60％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少65％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少70％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少75％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少80％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少85％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少90％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少95％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少100％。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少1倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少2倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少3倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少4倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少5倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少6倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少7倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少8倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少9倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。
在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少50％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少55％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少60％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少65％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少70％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少75％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少80％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少85％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少90％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少95％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少100％。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少1倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少2倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少3倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少4倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少5倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少6倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少7倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少8倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少9倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。
在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少50％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少55％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少60％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少65％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少70％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少75％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少80％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少85％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少90％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少95％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少100％。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少1倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少2倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少3倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少4倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少5倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少6倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少7倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少8倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少9倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。
在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少50％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少55％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少60％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少65％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少70％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少75％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少80％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少85％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少90％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少95％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少100％。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少1倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少2倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少3倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少4倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少5倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少6倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少7倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少8倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少9倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。
在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少50％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少55％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少60％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少65％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少70％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少75％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少80％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少85％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少90％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少95％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少100％。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少1倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少2倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少3倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少4倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少5倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少6倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少7倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少8倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少9倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。在一些情况下，效应蛋白在70℃、75℃、80℃或更高温度下在反式切割测定中的反式切割活性可为37℃下的反式切割活性的至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。
在一些情况下，可在反式切割测定中对比阴性对照测量反式切割活性。在一些情况下，效应蛋白在37℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在37℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在40℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在45℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在50℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在55℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在60℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在65℃下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。在一些情况下，效应蛋白在70℃、75℃、80℃或更高温度下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些情况下，效应蛋白在70℃、75℃、80℃或更高温度下在反式切割测定中对比核酸的反式切割活性可为对比阴性对照核酸的反式切割活性的至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多倍。
本文所述的报告基因可为RNA报告基因。RNA报告基因可包含至少一种核糖核酸和可检测部分。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针或包含Cas酶的CRISPR探针可识别和检测ssDNA，并且还可特异性地反式切割RNA报告基因。对样品中靶核酸的检测可指示样品中存在疾病(或致病原)，并且可为采取行动以减少疾病在受疾病影响的环境中或携带疾病的个体附近的个体中的传播提供信息。
报告基因(例如，蛋白质-核酸)的切割可产生信号。信号可指示样品中存在靶核酸，而信号的缺失可指示样品中不存在靶核酸。在一些情况下，蛋白质-核酸的切割可产生量热信号、电位信号、电流信号、光学信号或压电信号。各种装置和/或传感器可用于检测这些不同类型的信号，所述信号指示样品中是否存在靶核酸。可用于检测此类信号的传感器可包括例如光学传感器(例如，用于检测具有各种波长和频率的荧光或光学信号的成像装置)、电位传感器、表面等离子体共振(SPR)传感器、干涉型传感器或适合于检测量热信号、电位信号、电流信号、光学信号或压电信号的任何其他类型的传感器。
在一方面，本公开提供了一种用于靶标检测的方法。所述方法可包括样品收集。所述方法还可包括样品制备。所述方法还可包括在所收集和制备的样品中检测一种或多种靶分子。
在另一方面，本公开提供了一种用于靶标检测的检测装置。检测装置可被配置用于多重靶标检测。检测装置可用于收集一个或多个样品，制备或处理一个或多个样品以供检测，并且任选地将一个或多个样品分成多个液滴、等分试样或子样品以对一个或多个靶序列或靶核酸进行扩增。靶序列可包括例如生物序列。生物序列可包括核酸序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，靶序列与目标生物体、目标疾病、目标疾病状态、目标表型、目标基因型或目标基因相关联。
检测装置可被配置为对多个液滴、等分试样或子样品中所含的靶核酸进行扩增。检测装置可被配置为通过单独处理多个液滴中的每一个(例如，通过使用热循环过程或如下文更详细地描述的任何其他合适的扩增过程)来对多个液滴中所含的靶序列或靶核酸进行扩增。在一些情况下，多个液滴可经历单独的热循环过程。在一些情况下，热循环过程可同时发生。在其他情况下，对于每个液滴，热循环过程可在不同时间发生。
检测装置还可被配置为在液滴中的每一个中的靶核酸经历扩增之后重新混合液滴、等分试样或子样品。检测装置可被配置为将包含液滴、等分试样或子样品的重新混合的样品提供到所述装置的检测腔室。检测腔室可被配置为将重新混合的液滴、等分试样或子样品导引到多个可编程核酸酶探针。检测腔室可被配置为沿着一个或多个流体流动路径导引重新混合的液滴、等分试样或子样品，使得重新混合的液滴、等分试样或子样品定位在与一个或多个可编程核酸酶探针相邻之处和/或接触之处。在一些情况下，检测腔室可被配置为使重新混合的液滴、等分试样或子样品再循环或再回流，使得重新混合的液滴、等分试样或子样品在预定时间段内被重复地放置成与一个或多个可编程核酸酶探针接触。
检测装置可包括一个或多个传感器。检测装置的一个或多个传感器可被配置为检测在一个或多个可编程核酸酶探针的一种或多种可编程核酸酶由于可编程核酸酶探针的引导核酸与样品中存在的靶核酸的结合而被激活之后产生的一个或多个信号。如本文其他位置所描述，激活的可编程核酸酶可切割靶核酸，这可产生反式切割活性。反式切割活性可为激活的可编程核酸酶对附近单链核酸的非特异性切割，诸如具有检测部分的靶核酸的反式切割。一旦靶核酸被激活的可编程核酸酶切割，检测部分就可从报告基因中释放或分离，从而产生一个或多个可检测信号。检测装置的一个或多个传感器可被配置为寄存和/或处理一个或多个可检测信号以确认特定靶标(例如，靶核酸)的存在和/或不存在。
检测装置的一个或多个可编程核酸酶探针可被配置用于多重检测。在一些情况下，每个可编程核酸酶探针可被配置为检测特定目标。在其他情况下，每个可编程核酸酶探针可被配置为检测多个靶标。在一些情况下，第一可编程核酸酶探针可被配置为检测第一靶标或第一组靶标，并且第二可编程核酸酶探针可被配置为检测第二靶标或第二组靶标。在其他情况下，第一可编程核酸酶探针可被配置为检测第一组靶标，并且第二可编程核酸酶探针可被配置为检测第二组靶标。本公开的可编程核酸酶探针可用于检测多个不同的靶序列或靶核酸。在本文所述的任何实施方案中，提供到检测装置的样品可包含多个靶序列或靶核酸。在本文所述的任何实施方案中，提供到检测装置的样品可包含多种类别的靶序列或靶核酸。每一类靶序列或每一类靶核酸可包含与样品内存在的特定生物体、疾病状态、表型或基因型相关联的多个靶序列或靶核酸。在一些情况下，每个可编程核酸酶探针可用于检测与样品内存在的特定生物体、疾病状态、表型或基因型相关联的特定类别的靶序列或特定类别的靶核酸。在一些情况下，可使用两个或更多个可编程核酸酶探针来检测不同类别的靶序列或不同类别的靶核酸。在此类情况下，两个或更多个可编程核酸酶探针可包含与探针的可编程核酸酶复合的不同组或类别的引导核酸。
在本文所述的任何实施方案中，检测装置可包括单个集成系统，所述单个集成系统被配置为执行样品收集、样品处理、液滴产生、液滴处理(例如，对液滴中靶核酸的扩增)、液滴重新混合和/或使重新混合的液滴在检测腔室内循环，使得重新混合的液滴中的至少一部分被放置成与偶联到检测腔室的一个或多个可编程核酸酶探针接触。本公开的检测装置可为被配置为执行一个或多个快速单反应或多反应测试以检测一个或多个靶序列或靶核酸的存在和/或不存在的一次性装置。
本公开的系统和方法可用于检测一个或多个样品中的一个或多个靶序列或靶核酸。一个或多个样品可包含用于检测诸如疾病、癌症或遗传病等病痛，或者获得遗传信息，诸如用于表型分析、基因分型分析或确定世系，并且与如本文所述的试剂和支持介质相容的一个或多个靶序列或靶核酸。通常，样品可取自能够存在核酸的任何地方。样品可取自个体/人类、非人类动物或作物，或者可获得环境样品来测试疾病、病毒、病原体、癌症、遗传病或目标任何突变或病原体的存在。生物样品可为血液、血清、血浆、肺液、呼出气冷凝液、唾液、口水、尿液、粪便、排泄物、粘液、淋巴液、腹水、脑脊液、羊水、母乳、胃分泌物、身体排出物、来自溃疡的分泌物、脓液、鼻分泌物、痰、咽渗出物、尿道分泌物/粘液、阴道分泌物/粘液、肛门分泌物/粘液、精液、泪液、渗出物、流出物、组织液、间质液(例如，肿瘤间质液)、囊肿液、组织，或在一些情况下为其任何组合。样品可为来自动物(例如，人类、动物、家畜、宠物等)或植物的体液的抽出物。组织样品可来自可被病原体感染或影响的任何组织(例如，疣、肺组织、皮肤组织等)。在施加到本公开的检测系统之前，可将组织样品(例如，来自动物、植物或人类)解离或液化。样品可来自植物(例如，作物、水培种植的作物或植物和/或室内植物)。植物样品可包括来自组织(例如，根、叶、茎、主干等)的细胞外液。样品可取自紧密包围植物的环境，诸如水培液/水或土壤。来自环境的样品可来自土壤、空气或水。在一些情况下，环境样品作为拭子取自目标表面或者直接取自目标表面。在一些情况下，将原始样品施加到检测系统。在一些情况下，样品在施加到检测系统之前用缓冲液或流体进行稀释或进行浓缩。在一些情况下，样品的含量不超过约200纳升(nL)。在一些情况下，样品的含量为约200nL。在一些情况下，样品的含量是大于约200nL且小于约20微升(μL)的体积。在一些情况下，样品的含量不超过20μl。在一些情况下，样品的含量不超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200、300、400、500μl，或1μl至500μl的任何值。在一些情况下，样品的含量是1μL至500μL、10μL至500μL、50μL至500μL、100μL至500μL、200μL至500μL、300μL至500μL、400μL至500μL、1μL至200μL、10μL至200μL、50μL至200μL、100μL至200μL、1μL至100μL、10μL至100μL、50μL至100μL、1μL至50μL、10μL至50μL、1μL至20μL、10μL至20μL或1μL至10μL。有时，样品的含量超过500μl。
在一些情况下，样品取自单细胞真核生物体；植物或植物细胞；藻细胞；真菌细胞；动物或动物细胞、组织或器官；来自无脊椎动物的细胞、组织或器官；来自诸如鱼类、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳动物等脊椎动物的细胞、组织、体液或器官；来自诸如人类、非人类灵长类动物、有蹄类动物、猫科动物、牛、绵羊和山羊等哺乳动物的细胞、组织、体液或器官。在一些情况下，样品取自线虫、原生动物、蠕虫或疟原虫。在一些情况下，样品可包含来自真核细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、原核细胞或植物细胞的细胞裂解物的核酸。在一些情况下，样品可包含由细胞表达的核酸。
用于疾病测试的样品可包含可与本文所述的试剂的引导核酸结合的至少一个靶序列。在一些情况下，靶序列是核酸的一部分。核酸可来自基因组基因座、转录mRNA或逆转录cDNA。核酸的长度可为5至100、5至90、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、5至30、5至25、5至20、5至15或5至10个核苷酸。核酸的长度可为10至90、20至80、30至70或40至60个核苷酸。核酸序列的长度可为10至95、20至95、30至95、40至95、50至95、60至95、10至75、20至75、30至75、40至75、50至75、5至50、15至50、25至50、35至50或45至50个核苷酸。核酸的长度可为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60、70、80、90或100个核苷酸。靶核酸可与引导核酸反向互补。在一些情况下，引导核酸的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60、70、80、90或100个核苷酸可与靶核酸反向互补。
在一些情况下，靶序列是来自病毒或细菌或导致样品中疾病的其他因子的核酸的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自性传播感染或传染病的核酸的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自上呼吸道感染、下呼吸道感染或传染病的核酸的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自医院获得性感染或传染病的核酸的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自脓毒症的核酸的一部分。这些疾病可包括但不限于呼吸道病毒(例如，SARS-CoV-2(即，引起COVID-19的病毒)、SARS、MERS、流感、腺病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、人类偏肺病毒(hMPV)、人类鼻病毒/肠道病毒、A型流感、A/H1型流感、A/H3型流感、A/H1-2009型流感、B型流感、C型流感、副流感病毒1、副流感病毒2、副流感病毒3、副流感病毒4、呼吸道合胞病毒)和呼吸道细菌(例如，副百日咳杆菌、百日咳杆菌、肺炎衣原体、肺炎支原体)。其他病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、衣原体、淋病、梅毒、滴虫病、性传播感染、疟疾、登革热、埃博拉、基孔肯雅热和利什曼病。病原体包括病毒、真菌、蠕虫、原生动物、疟原虫、疟原虫属寄生虫、弓形体属寄生虫和血吸虫属寄生虫。蠕虫包括蛔虫、心丝虫以及植食性线虫、吸虫、棘头虫和绦虫。原生动物感染包括来自贾第鞭毛虫属、毛滴虫属、非洲锥虫病、阿米巴痢疾、巴贝西虫病、小袋虫痢疾、查加斯病(Chaga's disease)、球虫病、疟疾和弓形虫病的感染。诸如寄生/原生动物病原体等病原体的实例包括但不限于：恶性疟原虫、间日疟原虫、克氏锥虫和刚地弓形虫。真菌病原体包括但不限于新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和白色念珠菌。病原性病毒包括但不限于：呼吸道病毒(例如，腺病毒、副流感病毒、严重急性呼吸综合征(SARS)、冠状病毒、MERS)、胃肠道病毒(例如，诺如病毒、轮状病毒、一些腺病毒、星状病毒)、发疹病毒(例如，引起麻疹的病毒、引起风疹的病毒、引起水痘/带状疱疹的病毒、引起玫瑰疹的病毒、引起天花的病毒、引起第五疾病的病毒、基孔肯雅病毒感染)；肝病毒性疾病(例如，甲型、乙型、丙型、丁型、戊型肝炎)；皮肤病毒性疾病(例如，疣(包括生殖器、肛门)、疱疹(包括口腔、生殖器、肛门)、传染性软疣)；出血性病毒性疾病(例如，埃博拉、拉沙热、登革热、黄热病、马尔堡出血热、克里米亚-刚果出血热)；神经系统病毒(例如，脊髓灰质炎、病毒性脑膜炎、病毒性脑炎、狂犬病)、性传播病毒(例如，HIV、HPV等)、免疫缺陷病毒(例如，HIV)；流感病毒；登革热病毒；西尼罗河病毒；疱疹病毒；黄热病病毒；丙型肝炎病毒；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；乳头瘤病毒；等。病原体包括例如HIV病毒、结核分枝杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、炭疽杆菌、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、洋葱伯克霍尔德菌、白喉杆菌、伯内特考克斯体(Coxiella burnetii)、无乳链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、长滩军团菌、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、卡他莫拉菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、长奈瑟菌、淋病奈瑟菌、副肠孤病毒、肺炎球菌、耶氏肺孢子菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、B型流感嗜血杆菌、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、绿脓杆菌、麻风杆菌、牛布鲁氏杆菌、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人血清微小样病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、生殖支原体(M.genitalium)、阴道毛滴虫(T.Vaginalis)、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒、恶性疟原虫、间日疟原虫、刚地弓形虫、朗杰尔氏锥虫(Trypanosoma rangeli)、克氏锥虫、罗得西亚锥虫、布氏锥虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、牛巴贝虫、柔嫩艾美耳球虫、旋盘尾丝虫、热带利什曼原虫、结核分枝杆菌、旋毛虫、小泰勒虫、泡状带绦虫、羊带绦虫、牛带绦虫、细粒棘球绦虫、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoides corti)、关节炎支原体、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、拉耶拉維无胆支原体(Achoplasma laylawii)、唾液支原体(M.salivarium)、肺炎支原体、阴沟肠杆菌、产气克雷伯氏菌(Kiebsiellaaerogenes)、普通变形杆菌、粘质沙雷氏菌(Serratia macesens)、粪肠球菌、屎肠球菌、中间链球菌(Streptococcus intermdius)、肺炎链球菌和酿脓链球菌。通常，靶核酸可包含来自病毒或细菌或导致可在样品中发现的疾病的其他因子的序列。在一些情况下，靶核酸是在以下各项中的至少一者中的基因组基因座的核酸、转录mRNA或基因座的逆转录cDNA的一部分：人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、衣原体、淋病、梅毒、滴虫病、性传播感染、疟疾、登革热、埃博拉、基孔肯雅热和利什曼病。病原体包括病毒、真菌、蠕虫、原生动物、疟原虫、疟原虫属寄生虫、弓形体属寄生虫和血吸虫属寄生虫。蠕虫包括蛔虫、心丝虫以及植食性线虫、吸虫、棘头虫和绦虫。原生动物感染包括来自贾第鞭毛虫属、毛滴虫属、非洲锥虫病、阿米巴痢疾、巴贝西虫病、小袋虫痢疾、查加斯病、球虫病、疟疾和弓形虫病的感染。诸如寄生/原生动物病原体等病原体的实例包括但不限于：恶性疟原虫、间日疟原虫、克氏锥虫和刚地弓形虫。真菌病原体包括但不限于新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、沙眼衣原体和白色念珠菌。致病病毒包括但不限于免疫缺陷病毒(例如，HIV)；流感病毒；登革热；西尼罗河病毒；疱疹病毒；黄热病病毒；丙型肝炎病毒；甲型肝炎病毒；乙型肝炎病毒；乳头瘤病毒；等。病原体包括例如HIV病毒、结核分枝杆菌、无乳链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、唾液链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎球菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、B型流感嗜血杆菌、梅毒螺旋体、莱姆病螺旋体、绿脓杆菌、麻风杆菌、牛布鲁氏杆菌、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人血清微小样病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、生殖支原体、阴道毛滴虫、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒、恶性疟原虫、间日疟原虫、刚地弓形虫、朗杰尔氏锥虫、克氏锥虫、罗得西亚锥虫、布氏锥虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、牛巴贝虫、柔嫩艾美耳球虫、旋盘尾丝虫、热带利什曼原虫、结核分枝杆菌、旋毛虫、小泰勒虫、泡状带绦虫、羊带绦虫、牛带绦虫、细粒棘球绦虫、科氏中殖孔绦虫、关节炎支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、拉耶拉維无胆支原体、唾液支原体和肺炎支原体。在一些情况下，靶序列是细菌或导致样品中疾病的其他因子中的基因组基因座的核酸、转录mRNA或基因座的逆转录cDNA的一部分，所述部分包含赋予对治疗的抗性的突变，诸如赋予对抗生素治疗的抗性的单核苷酸突变。
用于癌症测试或癌症风险测试的样品可包含可与本文所述的试剂的引导核酸结合的至少一个靶序列或靶核酸片段。在一些情况下，靶核酸片段是来自以下各项的核酸的一部分：具有与癌症相关联的突变的基因、其过表达与癌症相关联的基因、肿瘤抑制基因、致癌基因、检查点抑制基因、与细胞生长相关联的基因、与细胞代谢相关联的基因或与细胞周期相关联的基因。有时，靶核酸编码癌症生物标志物，诸如前列腺癌生物标志物或非小细胞肺癌。在一些情况下，测定可用于检测靶核酸中的可预测诸如肺癌、宫颈癌等癌症的“热点”，在一些情况下，癌症可为病毒所引起的癌症。引起人类癌症的病毒的一些非限制性实例包括爱泼斯坦-巴尔病毒(例如，伯基特淋巴瘤、霍奇金病和鼻咽癌)；乳头瘤病毒(例如，宫颈癌、肛门癌、口咽癌、阴茎癌)；乙型和丙型肝炎病毒(例如，肝细胞癌)；成人T细胞白血病1型病毒(HTLV-1)(例如，T细胞白血病)；以及梅克尔细胞多瘤病毒(例如，梅克尔细胞癌)。本领域技术人员将认识到病毒可引起或造成其他类型的癌症。在一些情况下，靶核酸是与血热相关联的核酸的一部分。在一些情况下，靶核酸片段是以下各项中的至少一者中的基因组基因座的核酸、转录mRNA或基因座的逆转录cDNA的一部分：ALK、APC、ATM、AXIN2、BAP1、BARD1、BLM、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CASR、CDC73、CDH1、CDK4、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CEBPA、CHEK2、CTNNA1、DICER1、DIS3L2、EGFR、EPCAM、FH、FLCN、GATA2、GPC3、GREM1、HOXB13、HRAS、KIT、MAX、MEN1、MET、MITF、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、NF2、NTHL1、PALB2、PDGFRA、PHOX2B、PMS2、POLD1、POLE、POT1、PRKAR1A、PTCH1、PTEN、RAD50、RAD51C、RAD51D、RB1、RECQL4、RET、RUNX1、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMARCE1、STK11、SUFU、TERC、TERT、TMEM127、TP53、TSC1、TSC2、VHL、WRN和WT1。
用于遗传病测试的样品可包含可与本文所述的试剂的引导核酸结合的至少一个靶序列或靶核酸片段。在一些实施方案中，遗传病是血友病、镰状细胞性贫血、β-地中海贫血、杜兴氏肌肉萎缩症、重症综合性免疫缺陷或囊性纤维化。在一些情况下，靶核酸片段是来自以下各项的核酸的一部分：具有与遗传病相关联的突变的基因、其过表达与遗传病相关联的基因、与导致遗传病的异常细胞生长相关联的基因，或与导致遗传病的异常细胞代谢相关联的基因。在一些情况下，靶核酸片段是以下各项中的至少一者的基因组基因座的核酸、转录mRNA或基因座的逆转录cDNA的一部分：CFTR、FMR1、SMN1、ABCB11、ABCC8、ABCD1、ACAD9、ACADM、ACADVL、ACAT1、ACOX1、ACSF3、ADA、ADAMTS2、ADGRG1、AGA、AGL、AGPS、AGXT、AIRE、ALDH3A2、ALDOB、ALG6、ALMS1、ALPL、AMT、AQP2、ARG1、ARSA、ARSB、ASL、ASNS、ASPA、ASS1、ATM、ATP6V1B1、ATP7A、ATP7B、ATRX、BBS1、BBS10、BBS12、BBS2、BCKDHA、BCKDHB、BCS1L、BLM、BSND、CAPN3、CBS、CDH23、CEP290、CERKL、CHM、CHRNE、CIITA、CLN3、CLN5、CLN6、CLN8、CLRN1、CNGB3、COL27A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL7A1、CPS1、CPT1A、CPT2、CRB1、CTNS、CTSK、CYBA、CYBB、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、CYP19A1、CYP27A1、DBT、DCLRE1C、DHCR7、DHDDS、DLD、DMD、DNAH5、DNAI1、DNAI2、DYSF、EDA、EIF2B5、EMD、ERCC6、ERCC8、ESCO2、ETFA、ETFDH、ETHE1、EVC、EVC2、EYS、F9、FAH、FAM161A、FANCA、FANCC、FANCG、FH、FKRP、FKTN、G6PC、GAA、GALC、GALK1、GALT、GAMT、GBA、GBE1、GCDH、GFM1、GJB1、GJB2、GLA、GLB1、GLDC、GLE1、GNE、GNPTAB、GNPTG、GNS、GRHPR、HADHA、HAX1、HBA1,、HBA2、HBB、HEXA、HEXB、HGSNAT、HLCS、HMGCL、HOGA1、HPS1、HPS3、HSD17B4、HSD3B2、HYAL1、HYLS1、IDS、IDUA、IKBKAP、IL2RG、IVD、KCNJ11、LAMA2、LAMA3、LAMB3、LAMC2、LCA5、LDLR、LDLRAP1、LHX3、LIFR、LIPA、LOXHD1、LPL、LRPPRC、MAN2B1、MCOLN1、MED17、MESP2、MFSD8、MKS1、MLC1、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MPI、MPL、MPV17、MTHFR、MTM1、MTRR、MTTP、MUT、MYO7A、NAGLU、NAGS、NBN、NDRG1、NDUFAF5、NDUFS6、NEB、NPC1、NPC2、NPHS1、NPHS2、NR2E3、NTRK1、OAT、OPA3、OTC、PAH、PC、PCCA、PCCB、PCDH15、PDHA1、PDHB、PEX1、PEX10、PEX12、PEX2、PEX6、PEX7、PFKM、PHGDH、PKHD1、PMM2、POMGNT1、PPT1、PROP1、PRPS1、PSAP、PTS、PUS1、PYGM、RAB23、RAG2、RAPSN、RARS2、RDH12、RMRP、RPE65、RPGRIP1L、RS1、RTEL1、SACS、SAMHD1、SEPSECS、SGCA、SGCB、SGCG、SGSH、SLC12A3、SLC12A6、SLC17A5、SLC22A5、SLC25A13、SLC25A15、SLC26A2、SLC26A4、SLC35A3、SLC37A4、SLC39A4、SLC4A11、SLC6A8、SLC7A7、SMARCAL1、SMPD1、STAR、SUMF1、TAT、TCIRG1、TECPR2、TFR2、TGM1、TH、TMEM216、TPP1、TRMU、TSFM、TTPA、TYMP、USH1C、USH2A、VPS13A、VPS13B、VPS45、VRK1、VSX2、WNT10A、XPA、XPC和ZFYVE26。
用于表型测试的样品可包含可与本文所述的试剂的引导核酸结合的至少一个靶核酸片段。在一些情况下，靶核酸片段是来自与表型性状相关联的基因的核酸的一部分。
用于基因分型测试的样品可包含可与本文所述的试剂的引导核酸结合的至少一个靶核酸片段。在一些情况下，靶核酸片段是来自与基因型相关联的基因的核酸的一部分。
用于祖先测试的样品可包含可与本文所述的试剂的引导核酸结合的至少一个靶核酸片段。在一些情况下，靶核酸片段是来自与起源地理区域或种族相关联的基因的核酸的一部分。
样品可用于鉴定疾病状态。例如，样品是本文所述的任何样品，并且从受试者获得以用于鉴定受试者的疾病状态。疾病可为癌症或遗传病。有时，方法可包括从受试者获得血清样品；以及鉴定受试者的疾病状态。通常，疾病状态是前列腺疾病状态。在本文所述的任何实施方案中，无论免疫力如何，所述装置都可被配置用于无症状、症状前和/或有症状的诊断应用。在本文所述的任何实施方案中，装置可被配置为对样品(例如，包含血液的样品)执行一种或多种血清学测定。
在一些实施方案中，样品可用于鉴定植物或者与植物或土壤相关联的细菌、病毒或微生物的靶核酸中的突变。本公开的装置和方法可用于鉴定影响基因表达的靶核酸的突变。影响基因表达的突变可为基因内靶核酸的突变、包含与基因表达相关联的RNA的靶核酸的突变，或包含与基因表达的调节相关联的核酸突变的靶核酸，诸如RNA或基因的启动子、增强子或阻抑物。通常，突变是单核苷酸突变。
在一些情况下，靶核酸是单链核酸。可替代地或组合地，靶核酸是双链核酸并且在接触试剂之前或在接触试剂时制备成单链核酸。靶核酸可为RNA、DNA、合成核酸或者在生物或环境样品中发现的核酸。靶核酸包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA、非编码RNA、长链非编码RNA和微小RNA(miRNA)。在一些情况下，靶核酸是mRNA。在一些情况下，靶核酸来自本文所述的病毒、寄生虫或细菌。在一些情况下，靶核酸转录自如本文所述的基因。
多种靶核酸与本文公开的系统和方法一致。本文所述的一些方法可将以各种浓度或量存在于样品中的靶核酸检测作为靶核酸群体。在一些情况下，样品具有至少2种靶核酸。在一些情况下，样品具有至少3、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000种靶核酸。在一些情况下，样品具有1至10,000、100至8000、400至6000、500至5000、1000至4000或2000至3000种靶核酸。在一些情况下，样品具有100至9500、100至9000、100至8500、100至8000、100至7500、100至7000、100至6500、100至6000、100至5500、100至5000、250至9500、250至9000、250至8500、250至8000、250至7500、250至7000、250至6500、250至6000、250至5500、250至5000、2500至9500、2500至9000、2500至8500、2500至8000、2500至7500、2500至7000、2500至6500、2500至6000、2500至5500或2500至5000种靶核酸。在一些情况下，所述方法检测至少在每101种非靶核酸、102种非靶核酸、103种非靶核酸、104种非靶核酸、105种非靶核酸、106种非靶核酸、107种非靶核酸、108种非靶核酸、109种非靶核酸或1010种非靶核酸一个拷贝处存在的靶核酸。
多种靶核酸群体与本文公开的系统和方法一致。可实现本文所述的一些方法来检测以各种浓度或量存在于样品中的两个或更多个靶核酸群体。在一些情况下，样品具有至少2个靶核酸群体。在一些情况下，样品具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个靶核酸群体。在一些情况下，样品具有3至50、5至40或10至25个靶核酸群体。在一些情况下，样品具有2至50、5至50、10至50、2至25、3至25、4至25、5至25、10至25、2至20、3至20、4至20、5至20、10至20、2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10或9至10个靶核酸群体。在一些情况下，可实现本公开的方法来检测至少在每101种非靶核酸、102种非靶核酸、103种非靶核酸、104种非靶核酸、105种非靶核酸、106种非靶核酸、107种非靶核酸、108种非靶核酸、109种非靶核酸或1010种非靶核酸一个拷贝处存在的靶核酸群体。靶核酸群体可以不同的浓度或量存在于样品中。
图1示出了用于基于可编程核酸酶的检测的示例性方法。所述方法可包括收集样品。样品可包括如本文所述的任何类型的样品。所述方法可包括制备样品。样品制备可包括一个或多个样品制备步骤。一个或多个样品制备步骤可以任何合适的次序执行。一个或多个样品制备步骤可包括使用大型过滤器对非靶物质进行物理过滤。一个或多个样品制备步骤可包括核酸纯化。一个或多个样品制备步骤可包括裂解。一个或多个样品制备步骤可包括热灭活。一个或多个样品制备步骤可包括添加一种或多种酶或试剂以制备用于靶标检测的样品。
所述方法可包括从样品产生一个或多个液滴、等分试样或子样品。一个或多个液滴、等分试样或子样品可对应于样品的体积部分。可将样品分成1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个液滴、等分试样或子样品。在一些实施方案中，不将样品分成子样品。
所述方法可包括对每个液滴、等分试样或子样品内的一个或多个靶标进行扩增。每个液滴内的一个或多个靶标的扩增可针对每个液滴并行和/或同时执行。将样品分成多个液滴可提高扩增过程(例如，热循环过程)的速度和/或效率，因为液滴包含比所引入的大件样品更小体积的物质。对每个单独液滴内的一个或多个靶标进行扩增还可准许对各种靶核酸进行有效扩增，所述各种靶核酸在含有各种靶核酸的大件样品中不能如此有效地扩增，如果大件样品是经历单一扩增过程的话。在一些实施方案中，对大件样品执行扩增，而不首先将样品分成子样品。
所述方法还可包括使用基于CRISPR或基于可编程核酸酶的检测模块来检测样品中的一个或多个靶标(例如，靶序列或靶核酸)。在一些情况下，可将样品分成多个液滴、等分试样或子样品以有助于样品制备并且提高本公开的装置的检测能力。在一些情况下，不将样品分成子样品。
在一些实施方案中，可将样品手动地提供到本公开的检测装置。例如，可将拭子样品浸入溶液中，并且可将样品/溶液移液到所述装置中。在其他实施方案中，可经由自动注射器提供样品。自动注射器可被配置为控制将样品提供到检测装置的流速。自动注射器可被配置为控制在预定时段内提供到检测装置的样品的体积。
在一些实施方案中，可将样品直接提供到本公开的检测装置。例如，可将拭子样品插入检测装置上的样品腔室中。
可在样品内检测一个或多个靶标之前制备样品。本文所述的样品制备步骤可处理粗样品以产生纯的或较纯的样品。样品制备可为一个或多个物理或化学过程，包括例如核酸纯化、裂解、结合、洗涤和/或洗脱。在某些情况下，样品制备可包括呈任何次序的以下步骤，包括样品收集、核酸纯化、热灭活和/或碱/酸裂解。
在一些实施方案中，可对样品执行核酸纯化。纯化可包括破坏细胞的生物基质以释放核酸、使与核酸相关联的结构蛋白(核蛋白)变性、对可使分离产物降解的核酸酶(RNA酶和/或DNA酶)进行灭活和/或去除污染物(例如，蛋白质、碳水化合物、脂质、生物或环境元素、不想要的核酸和/或其他细胞碎片)。
在一些实施方案中，可对所收集的样品执行裂解。可使用蛋白酶(例如，蛋白酶K或PK酶)来执行裂解。在一些情况下，可使用试剂溶液来裂解样品中的细胞并且释放核酸，使得所述核酸可触及可编程核酸酶。溶液的活性成分可为离液剂、洗涤剂、盐，并且可具有高渗透压、离子强度和pH。离液剂或促溶剂是破坏诸如蛋白质、DNA或RNA等大分子中三维结构的物质。一个示例方案可包括4M异硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠.2H20、0.5％(w/v)月桂基肌氨酸钠和0.1Mβ-巯基乙醇)，但是也可使用许多用于不同细胞靶标的商业缓冲液。碱性缓冲液也可用于具有硬壳的细胞，特别是用于环境样品。诸如十二烷基硫酸钠(SDS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等洗涤剂也可用于化学裂解缓冲液。除了前文提及的化学诱导的细胞裂解以外，还可通过物理、机械、热或酶促手段执行细胞裂解。在一些情况下，根据样品的类型，可使用纳米级倒钩、纳米线、发声器、集成激光器、集成加热器和/或微毛细管探针来执行裂解。
在某些情况下，可对样品执行热灭活。在一些实施方案中，经处理/裂解的样品可经历热灭活以使裂解的样品中在裂解期间使用的蛋白质(例如，PK酶或裂解试剂)灭活。在一些情况下，集成到检测装置中的加热元件可用于热灭活。加热元件可由电池或者与检测装置集成的另一个热能或电能源供电。
在一些情况下，样品内的靶核酸可在与引导核酸(例如，CRISPR酶的crRNA)结合之前经历扩增。可对纯化样品内的靶核酸进行扩增。在一些情况下，扩增可使用环介导扩增(LAMP)、等温重组酶聚合酶扩增(RPA)和/或聚合酶链反应(PCR)来完成。在一些情况下，可使用数字液滴扩增。样品的这种核酸扩增可改进靶RNA检测的灵敏度、特异性或准确度中的至少一者。用于核酸扩增的试剂可包括重组酶、寡核苷酸引物、单链DNA结合(SSB)蛋白和聚合酶。核酸扩增可为转录介导的扩增(TMA)。核酸扩增可为解旋酶依赖性扩增(HDA)或环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)。在其他情况下，核酸扩增是链置换扩增(SDA)。核酸扩增可为重组酶聚合酶扩增(RPA)。核酸扩增可为环介导扩增(LAMP)或指数扩增反应(EXPAR)中的至少一者。在一些情况下，核酸扩增是通过滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、简单方法扩增RNA靶标(SMART)、单引物等温扩增(SPIA)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、铰链引发的引物依赖性核酸扩增(HIP)、切口酶扩增反应(NEAR)或改进的多重置换扩增(IMDA)来进行。核酸扩增可执行不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或60分钟。有时，核酸扩增执行1至60、5至55、10至50、15至45、20至40或25至35分钟。有时，核酸扩增执行5至60、10至60、15至60、30至60、45至60、1至45、5至45、10至45、30至45、1至30、5至30、10至30、15至30、1至15、5至15或10至15分钟。
在一些实施方案中，扩增可包括样品的热循环。可并行地和/或单独地在分开的位置中对样品的一个或多个液滴进行热循环。这可通过诸如以下方法来完成：(1)将液滴保持固定在多个位置上，在这些位置处，加热元件在液滴的一侧上非常接近于液滴并且散热器元件非常接近于液滴的另一侧，或(2)使液滴流过流体通道中的多个区，在这些区中，热量从加热源穿过所述液滴流动到散热器。在一些情况下，可使用一个或多个电阻加热元件来执行热循环。有时，核酸扩增反应在约20℃至45℃的温度下执行。核酸扩增反应可在不大于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的温度下执行。核酸扩增反应可在至少20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的温度下执行。在一些情况下，核酸扩增反应在20℃至45℃、25℃至40℃、30℃至40℃或35℃至40℃的温度下执行。在一些情况下，核酸扩增反应在45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃或60℃至65℃的温度下执行。在一些情况下，核酸扩增反应可在范围为约20℃至45℃、25℃至45℃、30℃至45℃、35℃至45℃、40℃至45℃、20℃至37℃、25℃至37℃、30℃至37℃、35℃至37℃、20℃至30℃、25℃至30℃、20℃至25℃或约22℃至25℃的温度下执行。在一些情况下，核酸扩增反应可在范围为约40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、60℃至65℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃、55℃至60℃、40℃至55℃、45℃至55℃、50℃至55℃、40℃至50℃或约45℃至50℃的温度下执行。
另外，靶核酸可任选地在与可编程核酸酶(例如，CRISPR酶)的引导核酸(例如，crRNA)结合之前进行扩增。这种扩增可为PCR扩增或等温扩增。样品的这种核酸扩增可改进靶RNA检测的灵敏度、特异性或准确度中的至少一者。用于核酸扩增的试剂可包括重组酶、寡核苷酸引物、单链DNA结合(SSB)蛋白和聚合酶。核酸扩增可为转录介导的扩增(TMA)。核酸扩增可为解旋酶依赖性扩增(HDA)或环状解旋酶依赖性扩增(cHDA)。在其他情况下，核酸扩增是链置换扩增(SDA)。核酸扩增可为重组酶聚合酶扩增(RPA)。核酸扩增可为环介导扩增(LAMP)或指数扩增反应(EXPAR)中的至少一者。在一些情况下，核酸扩增是通过滚环扩增(RCA)、连接酶链反应(LCR)、简单方法扩增RNA靶标(SMART)、单引物等温扩增(SPIA)、多重置换扩增(MDA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、铰链引发的引物依赖性核酸扩增(HIP)、切口酶扩增反应(NEAR)或改进的多重置换扩增(IMDA)来进行。核酸扩增可执行不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或60分钟。有时，核酸扩增反应在约20℃至45℃的温度下执行。有时，核酸扩增反应在约45℃至65℃的温度下执行。核酸扩增反应可在不大于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的温度下执行。核酸扩增反应可在至少20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的温度下执行。
图3A示出了样品的连续流可行进到其中以经历热循环程序的通道的实例。所述装置可包括集成到装置中的一个或多个可移动机构。一个或多个可移动机构可使用与所述装置集成的电池来供电。一个或多个可移动机构可被配置为以一个或多个预定时间间隔停止和开始通过通道的样品的连续流。一个或多个可移动机构可被配置为将样品的连续流斩断或分成多个较小的体积，这些体积在本文中可称为“液滴”。一个或多个可移动机构可具有打开构造和关闭构造。打开构造可准许样品连续流动通过通道的一个或多个部段，如可见于图3A中。关闭构造可限制或完全抑制样品流过通道的一个或多个部段，如可见于图3B中。关闭构造可准许对流过通道的样品的一个或多个体积或部分实现物理分离和/或热分离。当可移动机构处于关闭位置时，可移动机构可在流过通道的样品的不同体积或部分之间提供物理屏障。液滴体积的范围可为0.01至1微升、1至5微升和5至50微升。不同的体积或分区可对应于本文其他位置描述的液滴。可移动机构可从打开位置切换到关闭位置，或从关闭位置切换到打开位置，这取决于提供样品的注射器或控制通过通道的样品流量的另一个流量调节器的操作。可移动机构可使用与所述装置集成的电池来供电。
在一些情况下，可移动机构可包括多个阀。多个阀可包括例如止回阀。在一些情况下，可移动机构可包括柱塞或刷毛。柱塞或刷毛可具有打开构造和关闭构造。如上所述，打开构造可准许样品连续流动通过通道的一个或多个部段，而关闭构造可限制或完全抑制样品流过通道的一个或多个部段。关闭构造可准许对流过通道的样品的一个或多个体积或部分实现物理分离和/或热分离。当处于打开构造时，柱塞或刷毛可被定位成与通道的底部齐平，使得样品可流过通道。当处于关闭构造时，柱塞或刷毛可被构造为从通道的底部部分伸展到通道的顶部部分，使得样品流动被限制并且样品被分成彼此物理分离和/或热分离的多个不同的液滴或分区。在一些情况下，可移动机构可包括可被配置为限制在通道的一个或多个部段处通过通道的流量的任何物理对象(例如，板)。在一些情况下，可移动机构可包括铰链或弹簧机构以使可移动机构在打开构造与关闭构造之间移动。
可移动机构可用于产生一个或多个液滴、等分试样或子样品。使用可移动机构产生的一个或多个液滴、等分试样或子样品中的每一者可在通道内的多个不同部分内物理分离和/或热分离。液滴、等分试样或子样品可被物理地约束于通道内的不同部分内。液滴、等分试样或子样品可被约束于处于关闭位置的第一可移动机构与处于关闭位置的第二可移动机构之间。第一可移动机构可位于与通道的入口相距第一距离处，并且第二可移动机构可位于与通道的入口相距第二距离处。通道可为样品可从中流过的封闭系统的一部分。在一些情况下，当通过通道的入口的样品流被停止(例如，含有样品的注射器的柱塞被拉回)时，可使一个或多个可移动机构置于关闭构造中，从而将已经在通道内的样品分为多个热分离和物理分离的液滴。产生液滴、等分试样或子样品可简化解决方案，降低解决方案的复杂性，并且增强对靶标的可触及性以进行扩增。
使用可移动机构产生的一个或多个液滴、等分试样或子样品可经历如本文其他位置所描述的扩增步骤或热循环步骤。在一些情况下，使用可移动机构产生的一个或多个液滴可与单独的加热单元和散热器接触，同时被约束于两个可移动机构之间。通道的不同部段可包括被配置为对不同的液滴执行热循环的多个加热单元和散热器。液滴、等分试样或子样品的独立热循环可准许对较小体积的流体进行更有效的热循环，并且可需要更少的能量使用(例如，来自电池)。一个或多个阀可控制样品通过通道的流动或移动。一个或多个阀可包括止回阀，所述止回阀被配置为限制样品或一个或多个液滴的移动，使得样品或一个或多个液滴不会往回朝向通道的入口部分行进。一个或多个阀可控制样品或液滴何时与加热单元和/或散热器热接触。这种热接触的时机可对应于一个或多个热循环步骤的时机。在一些情况下，样品的第一液滴可与第一加热单元和第一散热器热接触，样品的第二液滴可与第二加热单元和第二散热器热接触，以此类推。
如上所述，本公开的装置可被配置为执行液滴数字化或液滴产生。液滴数字化或产生可包括将一定体积的样品拆分成多个液滴、等分试样或子样品。样品可具有范围为约10微升至约500微升的体积。多个液滴、等分试样或子样品可具有范围为约0.01微升至约100微升的体积。多个液滴、等分试样或子样品可具有相同或基本上相似的体积。在一些情况下，多个液滴、等分试样或子样品可具有不同的体积。在一些情况下，可使用物理过滤器或上文描述的一个或多个可移动机构来产生液滴、等分试样或子样品。在一些情况下，样品的每个液滴可单独地和/或并行地经历一个或多个样品制备步骤(例如，核酸纯化、裂解、热灭活、扩增等)，同时液滴被物理地约束于两个可移动机构之间或在所述两个可移动机构之间热分离。
在扩增之后，可重新混合样品。可使用主体循环机构使样品循环通过检测腔室，所述主体循环机构被配置为来回搅拌重新混合的样品，使得重新混合的样品与一个或多个可编程核酸酶探针接触，如图7A所示。在一些情况下，可将样品提供在检测腔室的表面的在一个或多个可编程核酸酶探针近侧的一部分上，如图7C所示。在一些情况下，检测腔室可被配置为沿着一个或多个流体流动路径导引样品，所述一个或多个流体流动路径将重新混合的样品定位成与一个或多个可编程核酸酶探针相邻和/或定位在所述一个或多个可编程核酸酶探针的近侧。一个或多个流体流动路径可用于将重新混合的液滴的至少一部分有针对性地递送到与一个或多个可编程核酸酶探针相关联的一个或多个检测区域。重新混合的液滴可借助于压电装置沿着一个或多个期望的流体流动路径循环通过检测腔室。
在一些实施方案中，装置可使用电润湿来进行样品输送。在一些情况下，所述装置可被配置用于电介质上电润湿(EWOD)应用。本公开的装置可包括集成到装置中的单独可触及的电极阵列。
本文描述了用于基于可编程核酸酶(例如，基于CRISPR)的测定的装置的各种实施方案。图2A示出了用于基于CRISPR的检测的示例性装置的自上而下的视图。所述装置可包括被配置为接收样品的样品接口(200)。样品可经历如本文其他位置所描述的一个或多个处理步骤。本文所述的任何装置可包括物理过滤器(201)以从样品中过滤不包含一个或多个靶标(例如，目标基因)的一个或多个颗粒。在一些实施方案中，装置可包括热循环部件(202)。在一些情况下，样品可被分成多个数字化液滴。多个数字化液滴可提供在装置的多个不同的腔室中。多个数字化液滴可经历单独的处理步骤(例如，热循环)。在一些实施方案中，独立的数字反应可并行地在它们之间没有串扰的情况下进行。在其他实施方案中，独立的数字反应可在最低的串扰水平或串扰量下并行地进行。多个液滴可在完成处理步骤时在单独的处理步骤之后混合在一起。包含一种或多种可编程核酸酶(例如，Cas酶)的多个可编程核酸酶探针可操作性地联接到检测腔室(203)以检测样品或在检测腔室中混合在一起的多个数字化液滴中的一个或多个靶标。一个或多个检测器(204)可被配置为检测如本文所述的来自检测腔室的信号。图2B中示出了示例性基于可编程核酸酶的装置的实施方案的侧面轮廓。在一些实施方案中，装置可包括如可见于侧视图中的一个或多个热循环隔室(205)。在一些实施方案中，装置可包括检测腔室(206)。在一些实施方案中，装置可包括一个或多个检测器(207)。在一些实施方案中，装置可包括电池(208)。在一些实施方案中，装置可包括远程医疗部件。
图4A、图4B、图5A和图5B示出了可以与本公开的装置相容的方式使用的示例性可编程核酸酶探针。可编程核酸酶探针可包含与可编程核酸酶复合的引导核酸。可编程核酸酶可包括如本文所述的任何类型的可编程核酸酶。在一些情况下，可编程核酸酶探针可包含与CRISPR酶复合的引导核酸。例如，图4A示出了在与引导RNA结合之前循环腔室中的未结合的靶扩增子，所述引导RNA进而与可编程核酸酶(例如，CRISPR酶)接触。引导RNA-CRISPR酶复合物还包括报告基因。可编程核酸酶探针(例如，CRISPR探针)被固定化到固定化基质，其中固定化基质的内侧暴露于循环腔室的内壁。引导核酸或引导RNA暴露于循环腔室内部的靶扩增子。报告基因接近于固定化基质的“外”侧，其中固定化基质的外侧接近于检测区域。图4B示出了与互补靶扩增子结合之后的可编程核酸酶探针(例如，CRISPR探针)。结合事件触发将报告基因释放到可检测区域或改变报告基因的反式剪切。检测机制可涉及干涉测量法、表面等离子体共振、诸如电位测定法的电化学检测或其他检测机制。
在某些情况下，如可见于图5A和图5B中，在由互补结合诱导的反式剪切之后，可编程核酸酶探针的报告基因可与另一种分子物质引发信号放大反应。此类物质可为反应性固体或凝胶基质，或在检测期间产生放大的信号的其他反应性实体。信号放大反应本质上可为物理或化学的。在某些情况下，如可见于图5A和图5B中，在由互补结合诱导的反式剪切之后，释放的报告基因X可引发与另一个实体Y的相互作用和/或反应，以产生放大或修改的信号。此类实体可包括分子物质、固体、凝胶或其他实体。信号放大相互作用可为物理或化学反应。在一些实施方案中，相互作用涉及自由基、阴离子、阳离子或配位聚合反应。在其他实施方案中，剪切报告基因可触发分子、细胞或纳米颗粒的聚集或凝集。在一些情况下，剪切报告基因可与半导体材料相互作用。在一些实施方案中，由相互作用引起的化学或物理变化通过诸如干涉测量法、表面等离子体共振、反射率或其他方式等光学检测手段来检测。在其他实施方案中，由相互作用引起的化学或物理变化通过电位、电流、场效应晶体管或其他电子手段来检测。
可编程核酸酶探针可包含可编程核酸酶和/或引导核酸。如下文更详细地描述的，引导核酸可与靶核酸结合。在一些情况下，为了最小化脱靶结合(这会减慢检测或抑制准确的检测)，所述装置可被配置为产生电位梯度或向可编程核酸酶探针近侧的一个或多个区域提供热能,以增强靶向性。
在一些实施方案中，一种或多种引导核酸可用于进行高效、快速而准确的反应以检测样品中是否存在靶核酸。引导核酸与单链靶核酸结合，所述单链靶核酸包含来自病毒或细菌或导致如本文所述的疾病的其他因子的核酸的一部分。引导核酸可与单链靶核酸结合，所述单链靶核酸包含来自细菌或导致如本文所述的疾病的其他因子的核酸的一部分，并且还包含可赋予对诸如抗生素治疗的治疗的抗性的突变，诸如单核苷酸多态性(SNP)。引导核酸与单链靶核酸结合，所述单链靶核酸包含来自癌症基因或与如本文所述的遗传病相关联的基因的核酸的一部分。引导核酸与靶核酸互补。通常，引导核酸与靶核酸特异性结合。靶核酸可为RNA、DNA或合成核酸。引导核酸可包含与靶核酸的序列反向互补的序列。引导核酸可为crRNA。有时，引导核酸可包含crRNA和tracrRNA。引导核酸可与靶核酸特异性结合。在一些情况下，引导核酸不是天然存在的，而是通过人工组合另外分开的序列片段来制得。通常，人工组合通过化学合成，通过基因工程技术，或通过人工操纵核酸的分离的片段来执行。可设计和制取靶核酸以提供期望的功能。在一些情况下，引导核酸的靶向区域的长度为20个核苷酸。引导核酸的靶向区域的长度可为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，引导核酸的靶向区域的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，引导核酸的靶向区域具有以下长度：确切地或约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt。在一些情况下，引导核酸的靶向区域具有约10nt至约60nt、约20nt至约50nt或约30nt至约40nt的长度。在一些情况下，引导核酸的靶向区域具有15nt至55nt、25nt至55nt、35nt至55nt、45nt至55nt、15nt至45nt、25nt至45nt、35nt至45nt、15nt至35nt、25nt至35nt或15nt至25nt的长度。应当理解，多核苷酸的序列不需要与其可特异性杂交或特异性结合的靶核酸的序列100％互补。引导核酸可具有在核酸残基5至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的修饰可变区反向互补。在一些情况下，引导核酸具有在核酸残基5至9、10至14或15至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的修饰可变区反向互补。引导核酸可具有在核酸残基5至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的甲基化可变区反向互补。在一些情况下，引导核酸具有在核酸残基5至9、10至14或15至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的甲基化可变区反向互补。
引导核酸可选自已针对感染株或目标基因组基因座的核酸平铺的一组引导核酸。引导核酸可选自已针对HPV 16或HPV 18株的核酸平铺的一组引导核酸。通常，针对感染株或目标基因组基因座的核酸平铺的引导核酸可被合并用于本文所述的方法中。通常，这些引导核酸被合并用于在单一测定中检测靶核酸。针对单一靶核酸平铺的引导核酸的合并可增强使用本文所述的方法对靶核酸的检测。针对单一靶核酸平铺的引导核酸的合并可确保使用本文所述的方法在单个反应中对靶核酸的广泛覆盖。例如，平铺沿着靶核酸是有序的。有时，平铺沿着靶核酸是重叠的。在一些情况下，平铺可包括沿着靶核酸的平铺的引导核酸之间的间隙。在一些情况下，引导核酸的平铺是无序的。通常，用于检测靶核酸的方法可包括：使靶核酸与引导核酸池和可编程核酸酶接触，其中引导核酸池中的引导核酸具有选自一组平铺的引导核酸的与靶核酸的序列反向互补的序列；以及测定由检测核酸群体中的至少一些检测核酸的切割产生的信号。引导核酸的合并可确保在单个反应中对靶物质的广谱鉴定或广泛覆盖。这对于可能由多种生物体引起的疾病或适应症(如脓毒症)可能特别有用。
在一些实施方案中，可编程核酸酶可用于进行高效、快速而准确的反应以检测样品中是否存在靶核酸。可编程核酸酶可包括当与引导核酸和靶核酸复合时能够被激活的可编程核酸酶。在引导核酸与靶核酸结合之后，可编程核酸酶可被激活，其中激活的可编程核酸酶可切割靶核酸并且可具有反式切割活性。反式切割活性可为激活的可编程核酸酶对附近单链核酸的非特异性切割，诸如具有检测部分的检测核酸的反式切割。一旦检测核酸被激活的可编程核酸酶切割，检测部分就会从检测核酸中释放并且可产生信号。信号可为量热、电位、电流、光学(例如，荧光、比色等)或压电信号。通常，信号在检测核酸切割之前就已存在并且在检测核酸切割时改变。有时，信号在检测核酸切割之前不存在，而在检测核酸切割时存在。可检测信号可固定在支持介质上以供检测。可编程核酸酶可为具有反式切割活性的CRISPR-Cas(成簇的规则间隔的短回文重复序列-CRISPR相关)核蛋白复合物，其可通过引导核酸与靶核酸的结合来激活。CRISPR-Cas核蛋白复合物可包含与引导核酸复合的Cas蛋白(也称为Cas核酸酶)，所述Cas蛋白还可称为CRISPR酶。引导核酸可为CRISPR RNA(crRNA)。有时，引导核酸可包含crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)。
用于检测修饰的靶核酸的可编程核酸酶系统可包含CRISPR RNA(crRNA)、反式激活crRNA(tracrRNA)、Cas蛋白和检测核酸。
本文描述了包含当与引导核酸和靶核酸片段或部分复合时能够被激活的可编程核酸酶的试剂。当与引导核酸和靶序列复合时，可编程核酸酶可能够被激活。可编程核酸酶可在引导核酸与其靶核酸结合时被激活并且在其环境中非特异性地降解核酸。可编程核酸酶一旦被激活就具有反式切割活性。可编程核酸酶可为Cas蛋白(也可互换地称为Cas核酸酶)。crRNA和Cas蛋白可形成CRISPR酶。
若干可编程核酸酶与本公开的方法和装置一致。例如，CRISPR/Cas酶是用于本文公开的方法和系统中的可编程核酸酶。CRISPR/Cas酶可包括任何已知类别和类型的CRISPR/Cas酶。本文公开的可编程核酸酶包括1类CRISPR/Cas酶，诸如I型、IV型或III型CRISPR/Cas酶。本文公开的可编程核酸酶还包括2类CRISPR/Cas酶，诸如II型、V型和VI型CRISPR/Cas酶。包括在本文公开的若干装置(例如，微流体装置，诸如气动阀装置或滑动阀装置或横向流测定)中的优选的可编程核酸酶及其使用方法包括V型或VI型CRISPR/Cas酶。
在一些实施方案中，V型CRISPR/Cas酶是可编程Cas12核酸酶。V型CRISPR/Cas酶(例如，Cas12或Cas14)缺乏HNH结构域。本公开的Cas12核酸酶经由单个催化RuvC结构域来切割核酸。RuvC结构域是在核酸酶，或蛋白质的“NUC”叶内，并且Cas12核酸酶还包含识别或“REC”叶。REC和NUC叶通过桥螺旋连接，并且Cas12蛋白另外包含用于PAM识别的两个结构域，称为PAM相互作用(PI)结构域和楔形(WED)结构域。在一些情况下，可编程Cas12核酸酶可为Cas12a(也称为Cpf1)蛋白、Cas12b蛋白、Cas12c蛋白、Cas12d蛋白或Cas12e蛋白。
在一些实施方案中，可编程核酸酶可为Cas13。有时，Cas13可为Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d或Cas13e。在一些情况下，可编程核酸酶可为Mad7或Mad2。在一些情况下，可编程核酸酶可为Cas12。有时，Cas12可为Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d或Cas12e。在一些情况下，Cas12可为Cas12M08，它是Cas12蛋白家族/类别内的特定蛋白变体)。在一些情况下，可编程核酸酶可为Csm1、Cas9、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9或CasZ。有时，Csm1也可称为smCms1、miCms1、obCms1或suCms1。有时，Cas13a也可称为C2c2。有时，CasZ也可称为Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g或Cas14h。有时，可编程核酸酶可为V型CRISPR-Cas系统。在一些情况下，可编程核酸酶可为VI型CRISPR-Cas系统。有时，可编程核酸酶可为III型CRISPR-Cas系统。有时，可编程核酸酶可为不来自天然存在的CRISPR-Cas系统的工程化核酸酶。在一些情况下，可编程核酸酶可来自以下各项中的至少一者：沙氏纤毛菌(Lsh)、斯氏李斯特氏菌(Lse)、口腔纤毛菌(Lbu)、韦德纤毛菌(Lwa)、荚膜红细菌(Rca)、解半纤植雪菌(Hhe)、产丙酸栖沼泽杆菌(Ppr)、毛螺菌科细菌(Lba)、直肠[真杆菌](Ere)、纽约李斯特氏菌(Listeria newyorkensis)(Lny)、嗜氨基酸梭菌(Clostridiumaminophilum)(Cam)、普雷沃氏菌属(Psm)、犬咬嗜二氧化碳噬细胞菌(Capnocytophagacanimorsus，Cca)、毛螺菌科细菌(Lba)、动物溃疡伯杰氏菌(Bzo)、中间普雷沃氏菌(Pin)、颊普雷沃氏菌(Pbu)、另枝菌属(Alistipes sp.，(Asp)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer)(Ran)、桔红色普雷沃氏菌(Prevotella aurantiaca)(Pau)、解糖普雷沃氏菌(Prevotella saccharolytica)(Psa)、中间普雷沃氏菌(Pin2)、犬咬嗜二氧化碳噬细胞菌(Cca)、齿周卟啉单胞菌(Porphyromonas gulae)(Pgu)、普雷沃氏菌属(Psp)、牙龈卟啉单胞菌(Pig)、中间普雷沃氏菌(Pin3)、意大利肠球菌(Ei)、唾液乳杆菌(Ls)或嗜热栖热菌(Tt)。有时，Cas13是LbuCas13a、LwaCas13a、LbaCas13a、HheCas13a、PprCas13a、EreCas13a、CamCas13a或LshCas13a中的至少一者。当crRNA与靶核酸复合时，可激活CRISPR酶的反式切割活性。当包含tracrRNA和crRNA的引导核酸与靶核酸复合时，可激活CRISPR酶的反式切割活性。靶核酸可为RNA或DNA。
在一些实施方案中，如本文所公开的可编程核酸酶是RNA激活的可编程RNA核酸酶。在一些实施方案中，如本文所公开的可编程核酸酶是DNA激活的可编程RNA核酸酶。在一些实施方案中，可编程核酸酶能够被靶RNA激活以引发RNA报告基因的反式切割并且能够被靶DNA激活以引发RNA报告基因的反式切割，诸如VI型CRISPR/Cas酶(例如，Cas13核酸酶)。例如，本公开的Cas13a可被靶RNA激活以引发Cas13a的反式切割活性以用于切割RNA报告基因，并且可被靶DNA激活以引发Cas13a的反式切割活性以用于反式切割RNA报告基因。RNA报告基因可为基于RNA的报告基因。在一些实施方案中，Cas13a识别并检测ssDNA以引发RNA报告基因的反式切割。在引导核酸与靶DNA杂交时，多种Cas13a分离物可识别包括ssDNA的靶DNA、被所述靶DNA激活并且检测所述靶DNA。例如，Lbu-Cas13a和Lwa-Cas13a都可被靶DNA激活以反式附带切割RNA报告基因。因此，VI型CRISPR/Cas酶(例如，Cas13核酸酶，诸如Cas13a)可为DNA激活的可编程RNA核酸酶，并且因此可用于使用如本文所述的方法来检测靶DNA。ssDNA的DNA激活的可编程RNA核酸酶检测在多个pH值下可为稳健的。例如，Cas13对靶ssDNA的检测可在广泛范围的pH条件(诸如pH 6.8至pH 8.2)下展现出一致的切割。相比之下，Cas13对靶RNA的检测可在7.9至8.2的pH值下展现出高切割活性。在一些实施方案中，也能够是RNA激活的可编程RNA核酸酶的DNA激活的可编程RNA核酸酶可具有与其RNA靶向偏好不同的DNA靶向偏好。例如，Cas13a的最佳ssDNA靶标具有与Cas13a的最佳RNA靶标不同的性质。作为一个实例，ssDNA上的gRNA性能可能不一定与RNA上相同gRNA的性能相关。作为另一个实例，gRNA可以高水平发挥作用，而不管靶RNA序列的3’位置处的靶核苷酸同一性如何。在一些实施方案中，gRNA可在靶ssDNA序列的3’位置处不存在G的情况下以高水平发挥作用。另外，通过本文公开的Cas13检测的靶DNA可直接取自生物体，或者可通过核酸扩增方法(诸如PCR和LAMP或本文所述的任何扩增方法)间接产生。通过DNA激活的可编程RNA核酸酶(诸如Cas13a)灵敏检测靶DNA(诸如靶ssDNA)的关键步骤可包括：(1)产生或分离DNA至每个反应的浓度高于约0.1nM，以用于体外诊断，(2)选择具有适当序列特征的靶序列以使得能够进行DNA检测，因为这些特征不同于RNA检测所需的那些特征，以及(3)增强DNA检测的缓冲液组合物。
通过DNA激活的可编程RNA核酸酶对靶DNA的检测可连接到各种读出装置，包括荧光、横向流、电化学或本文所述的任何其他读出装置。可编程DNA核酸酶(诸如V型CRISPR-Cas蛋白)与DNA激活的可编程RNA核酸酶(诸如VI型蛋白)与DNA报告基因和RNA报告基因的复用可相应地实现靶ssDNA或靶dsDNA和靶ssDNA的组合的多重检测。具有不同RNA报告基因切割偏好的不同的RNA激活的可编程RNA核酸酶的复用可实现另外的复用。用于基于DNA激活的可编程RNA核酸酶的诊断的产生ssDNA的方法可包括：(1)不对称PCR，(2)不对称等温扩增，诸如RPA、LAMP、SDA等，(3)用于产生短ssDNA分子的NEAR，以及(4)通过逆转录酶将RNA靶标转化为ssDNA，之后进行RNA酶H消化。因此，靶DNA的DNA激活的可编程RNA核酸酶检测与本文公开的各种系统、试剂盒、组合物、试剂和方法相容。例如，通过Cas13a对靶ssDNA的检测可被用于如本文所公开的检测装置中。
在本文所述的任何实施方案中，可编程核酸酶可包括当与引导核酸和靶核酸复合时能够被激活的可编程核酸酶。在引导核酸与靶核酸结合之后，可编程核酸酶可被激活，其中激活的可编程核酸酶可切割靶核酸，这可引发反式切割活性。在一些情况下，反式剪切或反式切割可剪切和/或释放报告基因。在其他情况下，反式剪切或反式切割可产生可直接检测的靶标类似物。反式切割活性可为激活的可编程核酸酶对附近核酸的非特异性切割，诸如具有检测部分的检测核酸的反式切割。一旦检测核酸被激活的可编程核酸酶切割，检测部分就可从检测核酸中释放并且可产生信号。例如，检测部分可对应于图4A、图4B、图5A、图5B和图6所示的元素或部分(X)。信号可固定在支持介质上以供检测。信号可被显现以评定是否存在靶核酸。
能够可互换地称为报告基因或检测核酸的报告基因可与本文公开的组合物(例如，可编程核酸酶、引导核酸等)结合使用，以进行高效、快速而准确的反应以检测样品中是否存在靶核酸。报告基因可悬浮在溶液中或固定在表面上。例如，报告基因可固定在如本文所公开的装置中的腔室的表面上。在一些情况下，报告基因可固定在如本文所公开的装置的腔室中的诸如磁珠的珠粒上，其中所述珠粒通过放置在腔室下方的磁体保持在适当位置。报告基因可能够被激活的可编程核酸酶切割，从而产生可检测信号。可检测信号可对应于如图5A和图5B所示的一种或多种元素(X)的释放。当在存在元素(X)的情况下存在元素(Y)时，一种或多种元素(X)的释放可引发与另一种元素(Y)的反应。元素(Y)与元素(X)之间的反应可在固相材料中引发化学链反应。这种化学链反应可产生一种或多种物理或化学变化。在一些情况下，可光学地检测物理或化学变化。在一些实施方案中，可进行一种或多种级联扩增反应以在感测或检测之前进一步放大信号。报告基因与元素(X)之间可存在单个附着点。剪切单个附着点可释放大分子(X)，所述大分子可基于大分子(X)本身而经历一系列反应。在本文所述的任何实施方案中，报告基因可包含单链检测核酸，所述单链检测核酸包含检测部分。
如本文所用，检测核酸可与报告基因或报告基因互换地使用。在一些情况下，检测核酸是包含脱氧核糖核苷酸的单链核酸。在其他情况下，检测核酸是包含核糖核苷酸的单链核酸。检测核酸可为包含至少一种脱氧核糖核苷酸和至少一种核糖核苷酸的单链核酸。在一些情况下，检测核酸是在用作切割位点的内部位置处包含至少一个核糖核苷酸残基的单链核酸。在一些情况下，检测核酸可在内部位置处包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸可在内部位置处包含2至10、3至9、4至8或5至7个核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸可在内部位置处包含3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、9至10、2至8、3至8、5至8、6至8、7至8、2至5、3至5或4至5个核糖核苷酸残基。有时，核糖核苷酸残基是连续的。可替代地，核糖核苷酸残基散布在非核糖核苷酸残基之间。在一些情况下，检测核酸仅具有核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸仅具有脱氧核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸可包含对本文所述的可编程核酸酶的切割具有抗性的核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含合成核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个核糖核苷酸残基和至少一个非核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸的长度为5-20、5-15、5-10、7-20、7-15或7-10个核苷酸。在一些情况下，检测核酸的长度为3至20、4至20、5至20、6至20、7至20、8至20、9至20、10至20、15至20、3至15、4至15、5至15、6至15、7至15、8至15、9至15、10至15、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、9至10、3至8、4至8、5至8、6至8或7至8个核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个尿嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少两个尿嘧啶核糖核苷酸。有时，检测核酸仅具有尿嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少两个腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸仅具有腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个胞嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少两个胞嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个鸟嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少两个鸟嘌呤核糖核苷酸。检测核酸可仅包含未经修饰的核糖核苷酸，仅包含未经修饰的脱氧核糖核苷酸或其组合。在一些情况下，检测核酸的长度为5至12个核苷酸。在一些情况下，检测核酸的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，检测核酸的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。对于由包含Cas13的可编程核酸酶进行的切割，检测核酸的长度可为5、8或10个核苷酸。对于由包含Cas12的可编程核酸酶进行的切割，检测核酸的长度可为10个核苷酸。
单链检测核酸可包含能够产生第一可检测信号的检测部分。有时，检测核酸可包含能够产生信号的蛋白质。信号可为量热、电位、电流、光学(例如，荧光、比色等)或压电信号。在一些情况下，检测部分是在切割位点的一侧上。任选地，淬灭部分是在切割位点的另一侧上。有时，淬灭部分是荧光淬灭部分。在一些情况下，淬灭部分位于切割位点的5’，并且检测部分位于切割位点的3’。在一些情况下，检测部分位于切割位点的5’，并且淬灭部分位于切割位点的3’。有时，淬灭部分是在检测核酸的5’末端处。有时，检测部分是在检测核酸的3’末端处。在一些情况下，检测部分是在检测核酸的5’末端处。在一些情况下，淬灭部分是在检测核酸的3’末端处。在一些情况下，单链检测核酸是能够产生第一可检测信号的单链核酸的至少一个群体。在一些情况下，单链检测核酸是能够产生第一可检测信号的单链核酸群体。任选地，存在多于一个的单链检测核酸群体。在一些情况下，存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50或大于50，或由此列表的范围跨越的任何数量的能够产生可检测信号的不同的单链检测核酸群体。在一些情况下，存在2至50、3至40、4至30、5至20或6至10个能够产生可检测信号的不同的单链检测核酸群体。在一些情况下，存在2至50、5至50、10至50、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、2至40、5至40、10至40、15至40、20至40、25至40、30至40、35至40、2至30、5至30、10至30、15至30、20至30、25至30、2至20、5至20、10至20、15至20、2至10或5至10个能够产生可检测信号的不同的单链检测核酸群体。
在一些实施方案中，通过例如像CRISPR CAS引导RNA探针(称为CRISPR探针)的固定的可编程核酸酶探针来检测靶核酸扩增子。在靶核酸扩增子与可编程核酸酶探针之间发生互补结合事件(例如，固定的CRISPR CAS/引导RNA复合物)时，将发生释放报告基因的剪切事件，所述报告基因之后被传感器检测到。存在用于检测靶标与可编程核酸酶探针之间的结合事件的两个主要方案，即如图7A所示的移动相方案和如图7C所示的固定相方案。在本文所述的任何实施方案中，每个可编程核酸酶探针可具有一种或多种可编程核酸酶(例如，CRISPR酶)与一种或多种特异性引导RNA以用于检测不同的靶核酸或不同类别的靶核酸。
在某些情况下，使用移动相检测方案(图7A)。在这些情况下，使重新混合的样品流过通道。通道的壁可包括上面设置有一个或多个可编程核酸酶探针或CRISPR探针的一个或多个区域。可编程核酸酶探针或CRISPR探针可包含与如本文其他位置描述的可编程核酸酶复合的引导核酸(例如，引导RNA)。引导核酸和/或可编程核酸酶可相对于通道的壁固定。引导核酸和/或可编程核酸酶可暴露于流过通道的重新混合的样品。可在靶核酸扩增子与特异性引导核酸发生互补结合事件时剪切和释放报告化合物。如图6所示，报告化合物可自由地参与产生放大的信号的一种或多种级联扩增反应。可使用如本文所述的一个或多个传感器来检测放大的信号。
在一些实施方案中，使用固定相检测方案。在这些实施方案中，重新混合的样品可含有一种或多种靶核酸扩增子序列类型及其拷贝。图7B示出了多种靶扩增子的自上而下的视图，所述靶扩增子可与定位在反应腔室的内壁上已知位置处的可编程核酸酶探针相互作用。图7C示出了检测腔室的横截面侧视图，其中靶扩增子与可编程核酸酶探针相互作用。可编程核酸酶或CRISPR探针的引导RNA可固定在与腔室的底表面相邻之处。当探针与靶标之间发生互补的相互作用时，CRISPR酶将剪切并释放报告基因，之后将感测到所述报告基因。由于固定的可编程核酸酶或CRISPR探针的特定的引导RNA可在空间上配准，因此可实现多重检测。在一些情况下，在一个传感器对应于一个固定探针的情况下，可使用电检测。也可使用其他检测方法，诸如光学成像、表面等离子体共振(SPR)和/或干涉型感测。
图2、图7A和图7C所示和本文所述的多个可编程核酸酶探针可以各种构造进行布置。例如，多个可编程核酸酶探针可以横向构造进行布置。可替代地，多个可编程核酸酶探针可以圆形构造进行布置，使得每个可编程核酸酶探针与共同中心点等距。在一些情况下，多个可编程核酸酶探针可分布成在可编程核酸酶探针之间具有相同的分隔距离或间距。在其他情况下，第一可编程核酸酶探针和第二可编程核酸酶探针可分开第一分隔距离或间距，并且第三可编程核酸酶探针和第四可编程核酸酶探针可分开第二分隔距离或间距，所述第二分隔距离或间距不同于第一分隔距离或间距。
如上所述，单链检测核酸可包含能够产生第一可检测信号的检测部分。有时，检测核酸可包含能够产生信号的蛋白质。信号可为比色、电位、电流、光学(例如，荧光、比色等)或压电信号。从检测部分的释放中产生可检测信号表明已经发生可编程核酸酶的切割并且样品含有靶核酸。检测部分可为能够产生比色、电位、电流、光学(例如，荧光、比色等)或压电信号的任何部分。有时，检测核酸是在切割核酸时能够产生量热、电位、电流、光学(例如，荧光、比色等)或压电信号的蛋白质-核酸。量热信号通常是在切割检测核酸之后产生的热量。有时，量热信号是在切割检测核酸之后被吸收的热量。例如，电位信号是在切割检测核酸之后产生的电位。电流信号可为在切割检测核酸之后产生的电子运动。通常，信号是光学信号，诸如比色信号或荧光信号。光学信号是例如在切割检测核酸之后产生的光输出。有时，光学信号是检测核酸切割前后之间光吸收的变化。通常，压电信号是检测核酸切割前后之间的质量的变化。
检测目标靶核酸的存在或不存在可涉及测量在被激活的可编程核酸酶切割报告基因之后从报告基因中存在的检测部分发出的信号。可使用与所述装置集成或操作性地联接到所述装置的一个或多个传感器来测量信号。因此，本文公开的检测步骤可涉及测量靶核酸的存在、定量靶核酸的存在量，或测量指示样品中不存在靶核酸的信号。在一些实施方案中，在可编程核酸酶切割检测核酸时产生信号。在其他实施方案中，信号在可编程核酸酶切割检测核酸时发生变化。在其他实施方案中，信号可在不存在检测核酸切割的情况下存在并且在可编程核酸酶切割靶核酸时消失。例如，可在使样品与包含可编程核酸酶的组合物接触之后在微流体装置或横向流装置中产生信号。
在一些情况下，信号可包括比色信号或肉眼可见的信号。在一些情况下，信号是荧光的、电的、化学的、电化学的或磁的。信号可为量热、电位、电流、光学(例如，荧光、比色等)或压电信号。在一些情况下，可检测信号是比色信号或肉眼可见的信号。在一些情况下，可检测信号是荧光的、电的、化学的、电化学的或磁的。在一些情况下，通过检测部分与检测区域中的捕获分子的结合产生第一检测信号，其中第一检测信号指示样品含有靶核酸。有时，所述系统可检测多于一种类型的靶核酸，其中所述系统可包括多于一种类型的引导核酸和多于一种类型的检测核酸。在一些情况下，可检测信号直接由切割事件产生。可替代地或组合地，可检测信号间接由信号事件产生。有时，可检测信号不是荧光信号。在一些情况下，可检测信号是比色信号或基于颜色的信号。在一些情况下，检测到的靶核酸是基于其在支持介质的检测区域上的空间位置而鉴定。
在一些情况下，在切割之后产生的一种或多种可检测信号可产生折射率变化或一种或多种电化学变化。在一些情况下，可使用荧光、电化学检测和/或电化学发光来实现Cas反应的实时检测。
在一些情况下，可以各种方式检测和分析可检测信号。例如，可使用成像装置来检测可检测信号。成像装置可为数字相机，诸如移动装置上的数字相机。移动装置可具有能够捕获荧光、紫外(UV)、红外(IR)或可见波长信号的软件程序或移动应用程序。可使用任何合适的检测或测量装置来检测和/或分析本文所述的比色、荧光、电流、电位或电化学信号。在一些实施方案中，可使用连接到所述装置的检测腔室的测量装置(例如，荧光测量装置、分光光度计和/或示波器)来检测比色、荧光、电流、电位或另一种电化学信号。
在本公开的某些方面，复用是指通过多个探针并行感测一个样品中的多个靶核酸序列。
图7A、图7B和图7C示出了如本文所述的CRISPR检测装置的两个复用实施方案。图7A、图7B和图7C示出了CRISPR检测装置的两个复用实施方案。图7A示出了毛细管流动或移动样品相实施方案并且图7B和图7C示出了固定样品相实施方案。图7A示出了在某些实施方案中的呈毛细管回路形式的反应腔室。功能化的可编程核酸酶探针(例如，CRISPR探针)可设置在毛细管壁上，并且与可编程核酸酶探针(例如，CRISPR探针)缔合的一种或多种引导核酸可暴露于样品以进行结合。在与互补的靶核酸扩增子(或靶核酸序列)结合之后，可编程核酸酶探针或CRISPR探针之后剪切并释放报告基因的至少一部分，所述至少一部分产生指示存在特定靶核酸扩增子的信号。该识别过程在多个可编程核酸酶探针或CRISPR探针上并行地重复，其中每个可编程核酸酶或CRISPR探针被配置为检测特定的靶序列、核酸扩增子、靶序列组或靶核酸扩增子组。在某些方面，如可见于图7B和图7C，也可以固定相或微阵列格式实现多重检测。在一些实施方案中，各自被设计成检测特定靶核酸序列的可编程核酸酶探针或CRISPR探针被固定在已知位置上。当含有多种类型的靶标扩增子的重新混合的样品暴露于可编程核酸酶或CRISPR探针的阵列时，特定的探针-靶标对将结合并且触发信号事件。这些信号事件可在使用成像时通过其位置或者在传感器单独地连接到每个探针时通过特定传感器接收到的信号而与特定的靶核酸扩增子或靶核酸扩增子组相关联。在一些情况下，一种或多种靶核酸扩增子可由可编程核酸酶探针检测。在一些情况下，可编程核酸酶探针可与一类序列或一类靶核酸扩增子相互作用和/或检测一类序列或一类靶核酸扩增子，这可指示样品内存在的特定生物体、疾病状态或表型的存在或存在性。
本公开的装置可用于实现对样品内的一种或多种靶核酸的检测。本公开的装置可包括一个或多个泵、阀、储存器和腔室，以用于样品制备，样品内靶核酸的任选扩增，与可编程核酸酶混合并且检测因可编程核酸酶切割检测核酸而产生的可检测信号。
与本公开一致的方法包括一种测定样品中的多种靶核酸的复用方法。复用方法可包括：使样品与复合物接触，所述复合物包含：引导核酸，所述引导核酸包含与靶核酸的片段反向互补的片段；以及可编程核酸酶，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的片段结合的引导核酸的片段的复合物时展现出与序列无关的切割；以及测定指示对报告基因分子(例如，蛋白质-核酸)群体中的至少一些报告基因(例如，蛋白质-核酸)的切割的信号，其中信号指示样品中存在靶核酸，并且其中信号的缺失指示样品中不存在靶核酸。
复用可包括空间复用，其中同时检测多种不同的靶核酸，但反应在空间上是分开的。在一些情况下，多种靶核酸使用相同的可编程核酸酶，但使用不同的引导核酸来检测。多种靶核酸有时使用不同的可编程核酸酶来检测。在使用不同的可编程核酸酶检测多种靶核酸的情况下，所述方法涉及：使用第一可编程核酸酶，所述第一可编程核酸酶在激活时(例如，在第一引导核酸与第一靶标结合之后)切割第一报告基因的核酸；以及使用第二可编程核酸酶，所述第二可编程核酸酶在激活时(例如，在第二引导核酸与第二靶标结合之后)切割第二报告基因的核酸。
有时，复用可为单反应复用，其中在单个反应体积中检测多种不同的靶核酸。通常，在单反应复用中使用至少两种不同的可编程核酸酶。例如，可通过将多种类别的检测核酸固定化在流体系统内来实现复用，从而能够在单个流体系统内检测多种靶核酸。复用允许在一个试剂盒或系统中检测多种靶核酸。在一些情况下，多种靶核酸包括针对导致一种疾病的病毒、细菌或病原体的不同靶核酸。在一些情况下，多种靶核酸包括与癌症或遗传病相关联的不同靶核酸。针对一种疾病、癌症或遗传病的复用提高了检测样品中疾病的存在的测定的灵敏度、特异性或准确度中的至少一者。在一些情况下，多种靶核酸包括针对导致多于一种疾病的不同病毒、细菌或病原体的靶核酸。在一些情况下，复用允许区分多种靶核酸，诸如包含导致疾病的相同细菌或病原体的不同基因型的靶核酸，例如细菌或病原体的野生型基因型和细菌或病原体的包含突变的基因型，诸如可赋予对诸如抗生素治疗的治疗的抗性的单核苷酸多态性(SNP)。因此，复用允许对多个基因组等位基因进行多重检测。例如，复用可包括测定方法，所述测定方法包括使用第一可编程核酸酶对微生物物种以及使用第二可编程核酸酶对微生物中的抗生素抗性模式进行单一测定。有时，复用允许区分不同HPV株(例如，HPV16和HPV18)的多种靶核酸。在一些情况下，多种靶核酸包括针对不同癌症或遗传病的靶核酸。通常，复用允许区分多种靶核酸，诸如包含不同基因型，例如野生型基因型和SNP基因型的靶核酸。针对多种疾病、癌症或遗传病的复用提供了从单个样品测试一组疾病的能力。例如，针对多种疾病的复用在对新患者进行广泛的小组测试或流行病学调查中可能很有价值。通常，复用用于鉴定脓毒症或与多种病原体相关联的其他疾病中的细菌性病原体。
另外，可定量来自复用的信号。例如，用于疾病组的定量方法可包括：测定来自样品的多个等分试样中的多种独特靶核酸；测定样品的第二等分试样中的对照核酸对照；以及通过与第二等分试样中产生的信号相比测量由检测核酸的切割产生的信号来定量多种独特靶核酸的多个信号。在此上下文中，独特靶核酸是指与多种靶核酸中的其他核酸的序列相比具有至少一个核苷酸差异的核酸序列。可存在每种靶核酸的多个拷贝。例如，独特靶核酸群体可包括独特靶核酸的多个拷贝。通常，多种独特靶核酸来自样品中的多种细菌性病原体。
在一些情况下，复用装置、系统、流体装置、试剂盒和方法在单个反应中检测至少2种不同的靶核酸。在一些情况下，复用装置、系统、流体装置、试剂盒和方法在单个反应中检测至少3种不同的靶核酸。在一些情况下，复用装置、系统、流体装置、试剂盒和方法在单个反应中检测至少4种不同的靶核酸。在一些情况下，复用装置、系统、流体装置、试剂盒和方法在单个反应中检测至少5种不同的靶核酸。在一些情况下，复用装置、系统、流体装置、试剂盒和方法在单个反应中检测至少6、7、8、9或10种不同的靶核酸。在一些情况下，复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少2种不同的靶核酸。在一些情况下，复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少3种不同的靶核酸。在一些情况下，复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少4种不同的靶核酸。在一些情况下，复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少5种不同的靶核酸。在一些情况下，复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少6、7、8、9或10种不同的靶核酸。在一些情况下，复用试剂盒在单个试剂盒中检测2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、9至10、2至9、3至9、4至9、5至9、6至9、7至9、8至9、2至8、3至8、4至8、5至8、6至8、7至8、2至7、3至7、4至7、5至7、6至7、2至6、3至6、4至6、5至6、2至5、3至5、4至5、2至4、3至4或2至3种不同的靶核酸。复用可在单锅或“一锅”反应中进行，其中逆转录、扩增、体外转录或其任何组合以及检测在单个体积中进行。复用可在“两锅反应”中进行，其中逆转录、扩增、体外转录或其任何组合在第一体积中进行，而检测在第二体积中进行。
在一些情况下，复用可包括用单个探针检测多个靶标。可替代地，复用可包括用多个探针检测多个靶标。多个探针可被配置为检测特定序列、靶核酸或多种不同靶序列或核酸的存在。
本公开的装置可由各种不同的材料制造。可使用的示例性材料包括塑料聚合物，诸如聚甲基丙烯酸酯(PMMA)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)；玻璃；以及硅。装置的特征(例如，腔室、通道等)可通过各种工艺制造。例如，特征可为(1)使用注塑成型进行压花，(2)使用计算机数字控制(CNC)微机械加工或非接触式激光钻孔(借助于CO2激光源)进行微铣削或微雕刻；(3)使用增材制造产生和/或(4)使用一种或多种光刻或立体光刻方法产生。
在一些实施方案中，本公开的任何装置可包括样品接口，所述样品接口被配置为接收可包含至少一个目标基因的样品。所述装置还可包括与样品接口和检测腔室流体连通的通道。在一些情况下，通道可包括一个或多个可移动机构以将样品分为多个液滴。如本文所用，液滴可指样品的体积部分、样品的分区子样品和/或样品的等分试样。在一些情况下，检测腔室被配置为接收多个液滴并且使所述多个液滴与设置在所述检测腔室的表面上的至少一个可编程核酸酶探针接触。至少一个可编程核酸酶探针可包含与可编程核酸酶复合的引导核酸。在一些情况下，可编程核酸酶探针可包含CRISPR/Cas酶。在一些情况下，引导核酸可包括引导RNA。在一些实施方案中，装置可包括包含不同的引导RNA的多个可编程核酸酶探针。
所述装置还可包括多个传感器，所述多个传感器通过检测在所述至少一个可编程核酸酶探针切割含有所述至少一个目标基因的靶核酸区域时产生的信号来确定所述至少一个目标基因的存在。靶核酸区域的切割可在所述靶核酸区域与所述至少一个可编程核酸酶探针的所述引导核酸发生互补结合之后发生。
如本文其他位置所描述，一个或多个可移动机构可包括被配置为限制通过通道的一个或多个部段的流量的一个或多个阀。一个或多个可移动机构可包括被配置为限制通过通道的一个或多个部段的流量的柱塞或刷毛。一个或多个可移动机构可操作性地联接到与所述装置集成或可插入所述装置中的电源。电源可包括电池。
在一些情况下，本文所述的任何装置可包括物理过滤器以从样品中过滤不包含一个或多个靶标(例如，目标基因)的一个或多个颗粒。在一些情况下，所述装置可包括样品制备腔室。样品制备腔室可包括裂解剂。样品制备腔室可包括被配置用于热灭活的加热单元。样品制备腔室可包括用于核酸纯化的一种或多种试剂。
在一些情况下，样品接口与检测腔室之间的通道可包括多个加热元件和多个散热器以用于对至少一个目标基因或其一部分进行扩增。多个加热元件和多个散热器可被配置为对样品或样品的至少一部分(例如，多个液滴)执行一个或多个热循环操作。
如本文其他位置所描述，在切割靶核酸时产生的信号可与物理、化学或电化学变化或反应相关联。信号可包括光学信号、荧光或比色信号、电位或电流信号和/或压电信号。在一些情况下，信号与设置有至少一个可编程核酸酶探针的固体或凝胶体积的折射率的变化相关联。
在一些实施方案中，装置可包括样品接口，所述样品接口被配置为接收可包含一个或多个目标基因组靶标的样品。在一些情况下，一个或多个目标基因组靶标包含核酸序列，所述核酸序列包含核酸。
所述装置还可包括一个或多个通道，所述一个或多个通道包括一个或多个可移动机构以将样品分为分区的样品。一个或多个通道可与样品接口和反应腔室流体连通，所述反应腔室被配置为接收分区的样品并且使所述分区的样品与酶、试剂或可编程检测剂接触，所述酶、试剂或可编程检测剂被配置为切割所述一个或多个目标基因组靶标的核酸。
所述装置还可包括多个传感器，以用于通过检测由所述核酸的所述切割释放的一个或多个报告基因来确定一个或多个目标基因组靶标的存在。可编程检测剂可为CRISPR/Cas酶。在一些情况下，报告基因可包含核酸和检测部分。在一些情况下，报告基因可包含至少一种核糖核苷酸或至少一种脱氧核糖核苷酸。在一些情况下，报告基因可包含DNA核酸或RNA核酸。报告分子可固定在检测腔室的表面上(即，报告基因的移动可被物理或化学地约束)。
在一些情况下，一个或多个可移动机构包括多个阀，所述多个阀被配置为限制在第一方向上通过一个或多个通道流向样品接口的流量。多个阀可被配置为选择性地准许在第二方向上通过一个或多个通道流向反应腔室的流量。多个阀的第一阀和第二阀可被配置为在第一阀和第二阀处于关闭状态时将样品的第一部分与样品的第二部分物理地、流体地分离或热分离。
一个或多个通道可包括多个加热元件和多个散热器以对分区的样品执行热循环。多个加热元件中的第一加热元件和多个散热器中的第一散热器可定位在一个或多个可移动机构中的第一可移动机构与第二可移动机构之间。
在本文所述的任何实施方案中，装置还可包括远程医疗单元，所述远程医疗单元被配置为将一个或多个检测结果提供到远离所述装置的计算单元。在一些实施方案中，远程医疗单元通过基于云的连接将一个或多个检测结果提供到远离所述装置的计算单元。在一些实施方案中，远程医疗单元符合HIPAA。在一些实施方案中，远程医疗单元传输加密数据。计算单元可包括移动装置或计算机。一个或多个检测结果可指示样品中目标靶核酸的存在或不存在。
在另一方面，本公开提供了一种用于靶标检测的方法。所述方法可包括使样品与前述权利要求中任一项所述的装置接触并且检测所述样品中一个或多个目标基因的存在或不存在。在一些情况下，所述方法可包括产生指示样品中一个或多个目标基因的存在或不存在的一个或多个检测结果。在一些情况下，所述方法可包括将一个或多个检测结果传输到远程计算单元。远程计算单元可包括例如移动装置。
在另一方面，本公开提供了一种用于靶标检测的方法。所述方法可包括提供包含至少一个目标基因的样品。所述方法可包括使用本文所述的一个或多个可移动机构将样品分为多个子样品。所述方法可包括在检测腔室中接收多个子样品并且使多个子样品与设置在所述检测腔室的表面上的至少一个可编程核酸酶探针接触。至少一个可编程核酸酶探针可包含与可编程核酸酶复合的引导核酸。在一些情况下，所述方法可包括使多个子样品与包含不同的引导RNA的多个可编程核酸酶探针接触。所述方法可包括使用多个传感器以通过检测在所述至少一个可编程核酸酶探针切割含有所述至少一个目标基因的靶核酸区域时产生的信号来确定所述至少一个目标基因的存在或不存在。
在一些情况下，所述方法还可包括在将样品分为多个子样品之后对至少一个目标基因进行扩增。在一些情况下，所述方法还可包括在检测腔室中混合多个子样品之前对至少一个目标基因进行扩增。对至少一个目标基因进行扩增可包括使用多个加热元件和多个散热器来对多个子样品执行热循环。
在一些情况下，所述方法可包括使用物理过滤器以从样品中过滤不包含一个或多个目标靶基因的一个或多个颗粒。在一些情况下，所述方法可包括在检测一个或多个目标靶基因之前裂解样品。在一些情况下，所述方法可包括对样品执行热灭活。在一些情况下，所述方法可包括对样品执行核酸纯化。
在一些情况下，本文所述的检测装置可被配置为实现过程控制程序以确保样品制备、靶标扩增和靶标检测过程准确且如预期地执行。
一次性流体工作流
本文描述了关于即时需求(PON)型基于可编程核酸酶的装置的各种实施方案。在一些实施方案中，PON装置被配置用于如图8所示的5重呼吸组。图8示出了用于病毒检测的PON-5重组的示例性测定设计，所述组包括在离散区域中的合并的CRISPR-Cas复合物。离散区域用于检测：(1)SARS-CoV-2，(2)甲型流感，(3)乙型流感，(4)Pan-CoV，以及(5)内源性人对照。(1)SARS-CoV-2区域可包括用于检测N-基因靶标和E-基因靶标的gRNA，(2)甲型流感区域可包括用于检测H1N1靶标、H3N2靶标和H1N1 pdm2009靶标的gRNA，(3)乙型流感区域可包括用于检测Yamagata靶标和Victoria靶标的gRNA，(4)Pan-CoV区域可包括用于检测HCoV-OC43靶标、HCoV-NL63靶标、HCoV-229E靶标和HCoV-HKU1靶标的gRNA，并且(5)内源性人对照区域可包括人rpp30靶标的gRNA。每个区域可包括合并的gRNA。例如，甲型流感区域的gRNA与在H1N1、H3N2和H1N1pdm2009中98％保守的靶位点，诸如基质蛋白1(MP)、非结构蛋白1(NS)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、血凝素(HA)、PB1、聚合酶酸性蛋白(PA)和聚合酶碱性蛋白2(PB2)结合。来自每个区域的检测信号可指示对该区域内靶标的检测。在一些实施方案中，PON型基于可编程核酸酶的装置是一次性的，如图9所示。
本文描述了可在患者需要时快速鉴定位置上病痛的病因的各种即时需求(PON)诊断。在一些实施方案中，一次性PON装置可在无菌条件下制造并且交付给用户以帮助满足这种需求。然而，在一些实施方案中，将测定从实验室转移到即时需求装置可能是一项挑战。在一些实施方案中，集成能够提供快速、可靠且易于解释的结果，同时仍然是一次性的流体系统尤其具有挑战性。
本文公开了用于一次性流体工作流的方法、装置和组合物的各种实施方案。在一些实施方案中，工作流方法可包括：(1)从患者收集样品并且将所述样品递送到所述装置，(2)裂解，(3)扩增，以及(4)检测/读出。在一些实施方案中，本文所述的任何一次性流体装置可包括外部壳体和上面安装有子部件的内部控制印刷电路板(PCB)。在一些实施方案中，此类子部件可包括用于从患者收集样品的拭子、用于从拭子中提取样品的机构(例如，刮刀)、被配置为使样品在装置内移动的流体、一个或多个样品腔室、一个或多个试剂储存袋或腔室、扩增机构、检测器、阀和加热元件。在本文所述的一些实施方案中，阀可为能够使样品转向到一个腔室或通道并使所述样品从一个腔室或通道转向到多个其他腔室或通道的旋转阀。
图10A示出了可消耗外部壳体的实例。图10B示出了安装在印刷电路板(PCB)1007上并容纳在图10A的可消耗装置壳体内的部件的实例。在一些实施方案中，拭子帽1001可被配置(例如，旋转、压下等)以允许用户激活所述装置。在一些实施方案中，试剂储存袋(或腔室等)1002可垂直地安装在PCB 1007上。在一些实施方案中，用于驱动阀(见于图11D中)的马达1003可集成到PCB 1007上。在一些实施方案中，伴热件(heat trace)1004可集成到PCB1007上以有助于样品或其一部分的加热。在一些实施方案中，用于激发报告基因(例如，一个或多个荧光标记)的发光二极管(LED)1005可集成到PCB上。在一些实施方案中，可通过推压拭子帽1006来激活开始按钮。图10C示出了示例拭子壳体，所述拭子壳体含有被配置为有助于从拭子1008移除样品的刮刀。在一些实施方案中，样品接口可包括刮刀。图9示出了包括刮刀的装置的实施方案，当拭子被插入一次性用品内部时，刮刀搅动携带样品的拭子。图10C示出了包括刮刀(1008)的装置的另一个实施方案。本领域技术人员将认识到刮刀可包括各种形式、形状和尺寸，同时保留其搅动输入样品的功能。在一些实施方案中，刮刀有助于将样品从拭子转移到所述装置。
图11A、图11B、图11C、图11D进一步示出了如本文所述的消耗品的各种示例部件。图11A示出了用于发射检测的光电二极管1101、膨胀室袋1102、编码器PCB 1103和注射泵的实例，它们可设置在PCB顶部的层中。在一些实施方案中，注射泵可由马达1004驱动。在其他实施方案中，注射泵由形状记忆合金(SMA)(例如，压缩弹簧)驱动以便进行大规模生产。图11B示出了示例性膨胀袋1102。图11C示出了膨胀袋1102的示例性注塑成型袋芯，其中过滤器(未示出)可热密封在所述膨胀袋的近侧端部1105上。在一些实施方案中，O形环密封件可用注塑成型袋芯1106在其远侧端部上制得，以有助于在制造期间将膨胀袋(1102)联接到所述装置。在其他实施方案中，包覆成型部件1106或诸如TPE的软聚合物可与注塑成型袋芯集成以便进行大规模生产。图11D示出了旋转阀包覆成型件的实施方案，所述旋转阀包覆成型件被配置为调节如本文所述的装置内的流体流动。
图12示出了在如下工作流方法期间使用的可消耗装置的各种阀位置实例：提取裂解物(1201)；转移裂解拭子以提取样品(1202)；将裂解物移动到加热区(Z1)(1203)；将裂解物移动到珠粒以进行结合(1204)；将裂解物移动到废弃物(1205)；提取洗脱液(1206)；将洗脱液移动到珠粒(1207)；将洗脱液移动到MM(1208)；移动到PCR循环(1209)；移动到稀释液(1210)；移动到DETECTR(1211)。图12另外示出了具有加热区(Z)的消耗品的实施方案，所述加热区用于在95℃下进行裂解加热(Z1)；在95℃下进行PCR循环(Z2)；在65℃下进行PCR循环(Z3)并且在37℃下进行DETECTR加热(Z4)。在一些实施方案中，样品可在一个腔室或通道内暴露于多个加热区，从而实现恒定的样品流体流动。
电化学DETECTR反应
本公开提供了用于快速测试的各种装置、系统、流体装置和试剂盒，它们可通过使用可与流体系统的功能化表面相互作用以产生可检测信号的可编程核酸酶来快速评定样品中是否存在靶核酸。例如，本文公开了特别适合于进行高效、快速而准确的反应以检测靶核酸的存在(例如，DETECTR反应)的特定的微流体装置、横向流装置、样品制备装置和用于所述装置中的组合物(例如，可编程核酸酶，引导RNA，用于体外转录、扩增、逆转录的试剂和报告基因，或其任何组合)。本文公开的系统和可编程核酸酶可用作对本文公开的任何疾病(例如，RSV、脓毒症、流感、COVID-19)的伴随诊断，或者可用于试剂盒、即时诊断或非处方诊断中。所述系统可用作即时诊断或实验室测试以用于检测靶核酸，并且由此检测例如从中取得样品的受试者的疾患。所述系统可用于各种场所或地点，诸如实验室、医院、医生办公室/实验室(POL)、诊所、远程场所或家中。有时，本公开提供用于消费者基因使用或非处方使用的各种装置、系统、流体装置和试剂盒。
引导核酸
引导核酸与本文所述的装置(例如，气动阀装置、滑动阀装置、旋转阀装置和横向流装置)的使用是相容的，并且可与本文公开的组合物(例如，可编程核酸酶、用于体外转录的试剂、用于扩增的试剂、用于逆转录的试剂和报告基因或其任何组合)结合使用来进行高效、快速而准确的反应，以检测样品中是否存在靶核酸(例如，DETECTR反应)。引导核酸与单链靶核酸结合，所述单链靶核酸包含来自病毒或细菌或导致如本文所述的疾病的其他因子的核酸的一部分。引导核酸可与单链靶核酸结合，所述单链靶核酸包含来自细菌或导致如本文所述的疾病的其他因子的核酸的一部分，并且还包含可赋予对诸如抗生素治疗的治疗的抗性的突变，诸如单核苷酸多态性(SNP)。引导核酸与单链靶核酸结合，所述单链靶核酸包含来自癌症基因或与如本文所述的遗传病相关联的基因的核酸的一部分。引导核酸与靶核酸互补。通常，引导核酸与靶核酸特异性结合。靶核酸可为RNA、DNA或合成核酸。引导核酸可包含与靶核酸的序列反向互补的序列。引导核酸可为crRNA。有时，引导核酸可包含crRNA和tracrRNA。引导核酸可与靶核酸特异性结合。在一些情况下，引导核酸不是天然存在的，而是通过人工组合另外分开的序列片段来制得。通常，人工组合通过化学合成，通过基因工程技术，或通过人工操纵核酸的分离的片段来执行。可设计和制取靶核酸以提供期望的功能。在一些情况下，引导核酸的靶向区域的长度为20个核苷酸。引导核酸的靶向区域的长度可为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，引导核酸的靶向区域的长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，引导核酸的靶向区域具有以下长度：确切地或约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt。在一些情况下，引导核酸的靶向区域具有约10nt至约60nt、约20nt至约50nt或约30nt至约40nt的长度。在一些情况下，引导核酸的靶向区域具有15nt至55nt、25nt至55nt、35nt至55nt、45nt至55nt、15nt至45nt、25nt至45nt、35nt至45nt、15nt至35nt、25nt至35nt或15nt至25nt的长度。应当理解，多核苷酸的序列不需要与其可特异性杂交或杂交或特异性结合的靶核酸的序列100％互补。引导核酸可具有在核酸残基5至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的修饰可变区反向互补。在一些情况下，引导核酸具有在核酸残基5至9、10至14或15至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的修饰可变区反向互补。引导核酸可具有在核酸残基5至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的甲基化可变区反向互补。在一些情况下，引导核酸具有在核酸残基5至9、10至14或15至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，所述区域与靶核酸中的甲基化可变区反向互补。
引导核酸可选自已针对感染株或目标基因组基因座的核酸平铺的一组引导核酸。引导核酸可选自已针对HPV 16或HPV 18株的核酸平铺的一组引导核酸。通常，针对感染株或目标基因组基因座的核酸平铺的引导核酸可被合并用于本文所述的方法中。通常，这些引导核酸被合并用于在单一测定中检测靶核酸。针对单一靶核酸平铺的引导核酸的合并可增强使用本文所述的方法对靶核酸的检测。针对单一靶核酸平铺的引导核酸的合并可确保使用本文所述的方法在单个反应中对靶核酸的广泛覆盖。例如，平铺沿着靶核酸是有序的。有时，平铺沿着靶核酸是重叠的。在一些情况下，平铺可包括沿着靶核酸的平铺的引导核酸之间的间隙。在一些情况下，引导核酸的平铺是无序的。通常，用于检测靶核酸的方法可包括：使靶核酸与引导核酸池和可编程核酸酶接触，其中引导核酸池中的引导核酸具有选自一组平铺的引导核酸的与靶核酸的序列反向互补的序列；以及测定由检测核酸群体中的至少一些检测核酸的切割产生的信号。引导核酸的合并可确保在单个反应中对靶物质的广谱鉴定或广泛覆盖。这对于可能由多种生物体引起的疾病或适应症(如脓毒症)可能特别有用。
报告基因
本文所述的可互换地称为报告基因或检测核酸的报告基因与本文所述的装置(例如，气动阀装置、滑动阀装置、旋转阀装置和横向流装置)的使用是相容的，并且可与本文公开的组合物(例如，可编程核酸酶、引导核酸、用于体外转录的试剂、用于扩增的试剂、用于逆转录的试剂、报告基因或其任何组合)结合使用来进行高效、快速而准确的反应，以检测样品中是否存在靶核酸(例如，DETECTR反应)。本文描述了包含单链检测核酸的报告基因，所述单链检测核酸包含检测部分，其中报告基因能够被激活的可编程核酸酶切割，从而产生第一可检测信号。如本文所用，检测核酸可与报告基因或报告基因互换地使用。在一些情况下，检测核酸是包含脱氧核糖核苷酸的单链核酸。在其他情况下，检测核酸是包含核糖核苷酸的单链核酸。检测核酸可为包含至少一种脱氧核糖核苷酸和至少一种核糖核苷酸的单链核酸。在一些情况下，检测核酸是在用作切割位点的内部位置处包含至少一个核糖核苷酸残基的单链核酸。在一些情况下，检测核酸可在内部位置处包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸可在内部位置处包含2至10、3至9、4至8或5至7个核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸可在内部位置处包含3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、9至10、2至8、3至8、5至8、6至8、7至8、2至5、3至5或4至5个核糖核苷酸残基。有时，核糖核苷酸残基是连续的。可替代地，核糖核苷酸残基散布在非核糖核苷酸残基之间。在一些情况下，检测核酸仅具有核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸仅具有脱氧核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸可包含对本文所述的可编程核酸酶的切割具有抗性的核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含合成核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个核糖核苷酸残基和至少一个非核糖核苷酸残基。在一些情况下，检测核酸的长度为5-20、5-15、5-10、7-20、7-15或7-10个核苷酸。在一些情况下，检测核酸的长度为3至20、4至20、5至20、6至20、7至20、8至20、9至20、10至20、15至20、3至15、4至15、5至15、6至15、7至15、8至15、9至15、10至15、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、9至10、3至8、4至8、5至8、6至8或7至8个核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个尿嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少两个尿嘧啶核糖核苷酸。有时，检测核酸仅具有尿嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少两个腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸仅具有腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个胞嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少两个胞嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少一个鸟嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，检测核酸可包含至少两个鸟嘌呤核糖核苷酸。检测核酸可仅包含未经修饰的核糖核苷酸，仅包含未经修饰的脱氧核糖核苷酸或其组合。在一些情况下，检测核酸的长度为5至12个核苷酸。在一些情况下，检测核酸的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，检测核酸的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。对于由包含Casl3的可编程核酸酶进行的切割，检测核酸的长度可为5、8或10个核苷酸。对于由包含Casl2的可编程核酸酶进行的切割，检测核酸的长度可为10个核苷酸。
信号
本文所述的用于检测样品中靶核酸的存在的装置、系统、流体装置、试剂盒和方法可包括产生指示样品中靶核酸的存在或不存在的信号。如本文所述产生指示样品中靶核酸的存在或不存在的信号与本文所述的方法和装置(例如，气动阀装置、滑动阀装置、旋转阀装置和横向流装置)是相容的，并且可能起因于使用本文公开的组合物(例如，可编程核酸酶、引导核酸、用于体外转录的试剂、用于扩增的试剂、用于逆转录的试剂、报告基因或其任何组合)来进行高效、快速而准确的反应，以检测样品中是否存在靶核酸(例如，DETECTR反应)。如本文所公开，在一些实施方案中，检测目标靶核酸的存在或不存在涉及测量在被激活的可编程核酸酶切割报告基因之后从报告基因中存在的检测部分发出的信号。可替代地或组合地，在一些实施方案中，检测目标靶核酸的存在或不存在涉及测量在被激活的可编程核酸酶切割报告基因之后从与报告基因中存在的检测部分结合的缀合物发出的信号。缀合物可包括纳米颗粒、金纳米颗粒、乳胶纳米颗粒、量子点、化学发光纳米颗粒、碳纳米颗粒、硒纳米颗粒、荧光纳米颗粒、脂质体或树状物。缀合物的表面可用缀合物结合分子涂覆，所述缀合物结合分子与检测部分或如本文所述的切割的检测分子的另一种亲和分子结合。因此，本文公开的检测步骤涉及间接(例如，经由报告基因)测量靶核酸的存在、定量靶核酸的存在量，或测量指示样品中不存在靶核酸的信号。在一些实施方案中，在可编程核酸酶切割检测核酸时产生信号。在其他实施方案中，信号在可编程核酸酶切割检测核酸时发生变化。在其他实施方案中，信号可在不存在检测核酸切割的情况下存在并且在可编程核酸酶切割靶核酸时消失。例如，可在使样品与包含可编程核酸酶的组合物接触之后在微流体装置或横向流装置中产生信号。
缓冲液
本文所述的试剂还可包括与本文公开的装置、系统、流体装置、试剂盒和方法相容的缓冲液。本文所述的缓冲液与本文所述的装置(例如，气动阀装置、滑动阀装置、旋转阀装置和横向流装置)的使用是相容的，并且可与本文公开的组合物(例如，可编程核酸酶、引导核酸、用于体外转录的试剂、用于扩增的试剂、用于逆转录的试剂、报告基因或其任何组合)结合使用来进行高效、快速而准确的反应，以检测样品中是否有靶核酸(例如，DETECTR反应)。这些缓冲液与如本文所述的用于检测诸如疾病、癌症或遗传病等病痛，或者获得遗传信息，诸如用于表型分析、基因分型或确定世系的其他试剂、样品和支持介质是相容的。本文所述的方法还可包括使用与本文公开的方法相容的缓冲液。例如，缓冲液可包括HEPES、MES、TCEP、EGTA、吐温20、KC1,MgCl2、甘油或其任何组合。在一些情况下，缓冲液可包括Tris-HCl pH 8.8、VLB、EGTA、CH3COOH、TCEP、IsoAmp、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、吐温20、KOAc、MgOAc、BSA、TCEP或其任何组合。在一些情况下，缓冲液可包含0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、至30、5至40、5至50、5至75、5至100、10至20、10至30、10至40、10至50、15至20、15至25、15至30、15至4、15至50、20至25、20至30、20至40或20至50mM的HEPES pH6.8。缓冲液可包含0至500、0至400、0至300、0至250、0至200、0至150、0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150、5至200、5至250、5至300、5至400、5至500、25至50、25至75、25至100、50至100、50至150、50至200、50至250、50至300、100至200、100至250、100至300或150至250mM的KC1。在其他情况下，缓冲液可包含0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、5至40、5至50、5至75、5至100、10至20、10至30、10至40、10至50、15至20、15至25、15至30、15至40、15至50、20至25、20至30、20至40或20至50mM的MgCl2。缓冲液可包含0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30％的甘油。缓冲液可包含0％至30％、5％至30％、10％至30％、15％至30％、20％至30％、25％至30％、0％至25％、2％至25％、5％至25％、10％至25％、15％至25％、20％至25％、0％至20％、5％至20％、10％至20％、15％至20％、0％至15％、5％至15％、10％至15％、0％至10％、5％至10％或0％至5％的甘油。缓冲液可包含0至500、0至400、0至300、0至250、0至200、0至150、0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150、5至200、5至250、5至300、5至400、5至500、25至50、25至75、25至100、50至100、50至150、50至200、50至250、50至300、100至200、100至250、100至300或150至250mM的Tris-HCl pH 8.8。缓冲液可包含0至500、0至400、0至300、0至250、0至200、0至150、0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150、5至200、5至250、5至300、5至400、5至500、25至50、25至75、25至100、50至100、50至150、50至200、50至250、50至300、100至200、100至250、100至300或150至250mM的KOAc。缓冲液可包含0至500、0至400、0至300、0至250、0至200、0至150、0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、5至40、5至50、5至75、5至100、5至150、5至200、5至250、5至300、5至400、5至500、25至50、25至75、25至100、50至100、50至150、50至200、50至250、50至300、100至200、100至250、100至300或150至250mM的MgOAc。在一些情况下，缓冲液可包含0至100、0至75、0至50、0至25、0至20、0至10、0至5、5至10、5至15、5至20、5至25、5至30、5至40、5至50、5至75、5至100、10至20、10至30、10至40、10至50、15至20、15至25、15至30、15至40、15至50、20至25、20至30、20至40或20至50mM的EGTA。缓冲液可包含0％至30％、5％至30％、10％至30％、15％至30％、20％至30％、25％至30％、0％至25％、2％至25％、5％至25％、10％至25％、15％至25％、20％至25％、0％至20％、5％至20％、10％至20％、15％至20％、0％至15％、5％至15％、10％至15％、0％至10％、5％至10％或0％至5％的吐温20。
DETECTR装置布局
图43示出了被配置为进行如本文所述的可编程核酸酶测定(例如，DETECTR测定)的装置盒的布局。在顶部示出了被配置为与盒对接的气动泵。在中间示出了盒的顶视图，其示出了具有储存器的顶层。在底部示出了含有样品的滑动阀(4301)，并且箭头指向左侧的裂解腔室(4302)，之后是右侧的扩增腔室(4303)和更右侧的检测腔室(4304)。图44示出了滑动阀装置的示意图。通道的偏移间距允许分别吸入和分配到每个孔中，并且有助于减轻扩增腔室(4402)与对应的检测腔室(4303)之间的串扰。图45示出了样品移动通过图44所示的滑动阀(4500)装置的图。在初始关闭位置(i.)，将样品加载到样品孔中并且进行裂解。然后通过仪器致动滑动阀(4500)，并且使用移液器泵将样品加载到每个通道中，从而将适当的体积分配到通道中(ii.)。通过致动滑动阀(4500)将样品递送到扩增腔室并且用移液器泵进行混合(iii.)。将来自扩增腔室的样品吸入每个通道中(iv.)，然后通过致动滑动阀(4500)和移液器泵将所述样品分配并混合到每个DETECTR腔室中(v.)。在一些实施方案中，滑动阀装置具有以下表面积：5cm乘以8cm、5乘以6cm、6乘以7cm、7乘以8cm、8乘以9cm、9乘以10cm、10乘以11cm、11乘以12cm、6乘以9cm、7乘以10cm、8乘以11cm、9乘以12cm、10乘以13cm、11乘以14cm、12乘以11cm、约30平方厘米、约35平方厘米、约40平方厘米、约45平方厘米、约50平方厘米、约55平方厘米、约60平方厘米、约65平方厘米、约70平方厘米、约75平方厘米、约25平方厘米、约20平方厘米、约15平方厘米、约10平方厘米、约5平方厘米、1至100平方厘米、5至10平方厘米、10至15平方厘米、15至20平方厘米、20至25平方厘米、25至30平方厘米、30至35平方厘米、35至40平方厘米、40至45平方厘米、45至50平方厘米、5至90平方厘米、10至0平方厘米、15至5平方厘米、20至10平方厘米或25至15平方厘米。
在一些实施方案中，滑动阀装置可包括用于样品裂解的第一腔室、用于检测的第二腔室和用于扩增的第三腔室。指代这些腔室的另一种方式是样品腔室(例如，第一腔室)、检测腔室(例如，第二腔室)和扩增腔室(例如，第三腔室)。在此布局中，本公开提供了一种用于测量信号的装置，所述装置可包括：滑动层，所述滑动层包括通道，所述通道在通道的第一端处具有开口并且在通道的第二端处具有开口；以及固定层，所述固定层包括：i)具有开口的第一腔室；ii)具有开口的第二腔室，其中第二腔室可包括可编程核酸酶以及包含核酸和检测部分的报告基因；iii)第一侧通道，所述第一侧通道具有与第一腔室的开口对准的开口；以及iv)第二侧通道，所述第二侧通道具有与第二腔室的开口对准的开口，其中滑动层和固定层相对于彼此移动以经由通道的第一端处的开口、通道的第二端处的开口、第一腔室的开口和第一侧通道的开口而流体地连接第一腔室和第一侧通道，并且其中滑动层和固定层相对于彼此移动以经由通道的第一端处的开口、通道的第二端处的开口、第二腔室的开口和第二侧通道的开口而流体地连接第二腔室和第二侧通道。固定层还可包括i)具有开口的第三腔室；以及ii)第三侧通道，所述第三侧通道具有与第三腔室的开口对准的开口，其中滑动层和固定层相对于彼此移动以经由通道的第一端处的开口、通道的第二端处的开口、第三腔室的开口和第三侧通道的开口而流体地连接第三腔室和第三侧通道。第二腔室联接到测量装置以测量来自检测部分的由报告基因的核酸的切割产生的信号。另外，通道的第一端的开口与第一腔室的开口重叠，并且通道的第二端的开口与第一侧通道的开口重叠。通道的第一端的开口与第二腔室的开口重叠，并且通道的第二端的开口与第二侧通道的开口重叠。通道的第一端的开口与第三腔室的开口重叠，并且通道的第二端的开口与第三通道的开口重叠。另外，第一侧通道、第二侧通道和第三侧通道流体地连接到混合腔室。在此实施方案中，第二腔室另外包括引导核酸。
在另一个实施方案中，滑动阀装置可包括用于样品裂解的第一腔室和用于检测的第二腔室。指代这些腔室的另一种方式是样品腔室(例如，第一腔室)和检测腔室。在此布局中，本公开提供了一种用于测量信号的装置，所述装置可包括：滑动层，所述滑动层包括通道，所述通道在通道的第一端处具有开口并且在通道的第二端处具有开口；以及固定层，所述固定层包括：i)具有开口的第一腔室；ii)具有开口的第二腔室，其中第二腔室可包括可编程核酸酶以及包含核酸和检测部分的报告基因；iii)第一侧通道，所述第一侧通道具有与第一腔室的开口对准的开口；以及iv)第二侧通道，所述第二侧通道具有与第二腔室的开口对准的开口，其中滑动层和固定层相对于彼此移动以经由通道的第一端处的开口、通道的第二端处的开口、第一腔室的开口和第一侧通道的开口而流体地连接第一腔室和第一侧通道，并且其中滑动层和固定层相对于彼此移动以经由通道的第一端处的开口、通道的第二端处的开口、第二腔室的开口和第二侧通道的开口而流体地连接第二腔室和第二侧通道。第二腔室联接到测量装置以测量来自检测部分的由报告基因的核酸的切割产生的信号。另外，通道的第一端的开口与第一腔室的开口重叠，并且通道的第二端的开口与第一侧通道的开口重叠。通道的第一端的开口与第二腔室的开口重叠，并且通道的第二端的开口与第二侧通道的开口重叠。另外，第一侧通道和第二侧通道流体地连接到混合腔室。在此实施方案中，第二腔室另外包括引导核酸。
在一些实施方案中，DETECTR测定依赖于基于荧光的检测。在某些实施方案中，DETECTR测定依赖于基于电化学的检测。已发现基于电化学的测定的检测限比基于荧光的测定低大约两个数量级(Lou等人，2015年)。
在一些实施方案中，电化学探针被并入DETECTR测定中以实现较低的检测限。例如，以下电化学探针可包含：5’-2XXTTATTXX–3’，其中2＝5’6-FAM；X＝二茂铁dT；并且3’＝3’生物素TEG，其中TEG是15原子三甘醇间隔基。在一些实施方案中，电化学探针用循环伏安法进行测试。在一些实施方案中，电化学探针用方波伏安法进行测试。在一些实施方案中，DropSensμSTAT ECL仪器用于电化学测量。在一些实施方案中，DropSens丝网印刷碳电极用于电化学测量。
图13示出了曲线图，其描绘了随电位变化的电流。电位(V)在x轴上示出为0V至0.25V，增量为0.05V。电流(μA)在y轴上示出为0μA至0.20μA，增量为0.02μA。所述曲线图描绘了两条线。虚线描绘了50nM HERC2 DETECTR在反应的时间＝0处的氧化曲线。实线描绘了50nM HERC2 DETECTR在反应开始之后33分钟处的氧化曲线。在此实例中，误差条表示同一解决方案的两次测量的标准偏差，每次测量使用三条迹线。40nA的信号差异指示50nMHERC2DETECTR检测。
图14示出了曲线图，其描绘了随电位变化的电流。电位(V)在x轴上示出为0V至0.25V，增量为0.05V。电流(μA)在y轴上示出为0μA至0.14μA，增量为0.02μA。所述曲线图描绘了两条线。虚线描绘了处于50fM的HERC2 DETECTR在反应的时间＝0处的还原曲线。实线描绘了处于50fM的HERC2 DETECTR在反应开始之后33分钟处的还原曲线。在此实例中，误差条表示同一解决方案的两次测量的标准偏差，每次测量使用三条迹线。
图15示出了曲线图，其描绘了随电位变化的电流。电位(V)在x轴上示出为-0.4V至0.6V，增量为0.2V。电流(μA)在y轴上示出为-1μA至1μA，增量为0.2μA。深绿色线(1501)和浅绿色线(1502)分别描绘了使用24μM电化学报告基因在HERC2 DETECTR反应前后取得的循环伏安图。在此实例中，每条迹线是同一解决方案的三次扫描的平均值，并且误差条表示标准偏差。伏安图之间的电流差异指示在24μM处的HERC2 DETECTR检测。
SARS-CoV-2电化学DETECTR反应
在某些实施方案中，本文所述的DETECTR已被证明是用于检测诸如SARS-CoV-2的病原体的强大技术(Broughton等人，2020)。在一些实施方案中，电化学探针用于检测病原体的DETECTR测定。在一些实施方案中，基于电化学探针的DETECTR测定被配置用于检测病原体SARS-CoV-2。在一些实施方案中，电化学探针是5’-2XXTTATTXX–3’，其中2＝5’6-FAM；X＝二茂铁dT；并且3＝3’生物素TEG。
图16示出了示例曲线图，其描绘了随电位变化的电流。电位(V)在x轴上示出为-0.3V至0.5V，增量为0.1V。电流(μA)在y轴上示出为-.04μA至0.05μA，增量为0.01μA。绿色线(1601)描绘了SARS-CoV2在反应的0秒处的氧化曲线，并且黄色线(1602)描绘了SARS-CoV2在反应开始之后20分钟处的氧化曲线。在一些实施方案中，误差条表示来自每次测量的三条迹线的标准偏差。观察到20分钟处的氧化曲线比时间0处的氧化曲线高20nA。20nA的差异表明存在SARS-CoV2。
图17示出了示例曲线图，其描绘了随电位变化的电流。电位(V)在x轴上示出为-0.3V至0.5V，增量为0.1V。电流(μA)在y轴上示出为-.6μA至0.6μA，增量为0.2μA。这些线描绘了用电化学报告基因和对照进行的SARS-COV-2DETECTR反应的方波伏安法测量。
图18示出了具有R1763(N-基因)的复合的主混合物的实例。
图19呈现了本文所述的用于方波伏安法的实验条件的实例。
DETECTR测定固定化
通常在Cas蛋白-RNA复合物可自由地结合靶分子和报告基因的溶液中执行CRISPR诊断反应。然而，所有组分都在溶液中的反应限制了CRISPR诊断测定尤其是在微流体装置中的设计。将CRISPR诊断反应的各种组分固定在表面上的系统能够实现在单个反应腔室内完成多个读出的设计。
本文描述了将CRISPR诊断反应组分固定到反应腔室的表面或其他表面(例如，珠粒的表面)的各种方法。本文所述的任何装置可包括一种或多种固定的检测试剂组分(例如，可编程核酸酶、引导核酸和/或报告基因)。在某些情况下，方法包括固定化可编程核酸酶(例如，Cas蛋白或Cas酶)、报告基因和引导核酸(例如，gRNA)。在一些实施方案中，各种CRISPR诊断反应组分用生物素进行修饰。在一些实施方案中，对这些生物素化的CRISPR诊断反应组分在用链霉亲和素涂覆的表面上的固定化进行测试。在一些实施方案中，生物素-链霉亲和素相互作用用作其他固定化化学反应的模型系统。
表1呈现了gRNA和报告基因固定化序列
Figure BDA0004036779040001091
Figure BDA0004036779040001101
Figure BDA0004036779040001111
Figure BDA0004036779040001121
Figure BDA0004036779040001131
图20A至图20C示出了用于CRISPR-Cas诊断测定组分的三种示例性固定化策略。在一些实施方案中，如可见于图20A中，Cas蛋白中氨基酸残基的化学修饰使得能够附着到表面。在一些实施方案中，如可见于图20B中，通过在gRNA的5’或3’端处添加与所选择的表面化学性质相容的各种化学修饰来固定gRNA。在一些实施方案中，如可见于图20C中，荧光淬灭(FQ)或其他报告化学物质使用与gRNA类似的化学修饰附着于表面。在一些实施方案中，这些附着的报告基因被Cas蛋白激活，这导致被激活的分子保持附着于表面，或者导致被激活的分子被释放到溶液中。
对于本文所述的一些实施方案，图21提供了与本文所述的方法和组合物一起使用的固定化策略的说明性实例，其中RNP复合物被gRNA固定化并且切割也固定化到表面的周围的FQ报告基因。在此处，淬灭剂被释放到溶液中，从而留下局部荧光信号。
在一些实施方案中，可编程核酸酶、引导核酸或报告基因通过键联或接头固定到装置表面。在一些实施方案中，键联包括共价键、非共价键、静电键、链霉亲和素与生物素之间的键、酰胺键或其任何组合。在一些实施方案中，键联包括非特异性吸收。在一些实施方案中，可编程核酸酶通过键联固定到装置表面，其中键联是在可编程核酸酶与表面之间。在一些实施方案中，报告基因通过键联固定到装置表面，其中键联是在报告基因与表面之间。在一些实施方案中，引导核酸通过键联固定到表面，其中键联是在引导核酸的5’端与表面之间。在一些实施方案中，引导核酸通过键联固定到表面，其中键联是在引导核酸的3’端与表面之间。
在一些实施方案中，如图22所示对gRNA的各种化学修饰进行了描述。y轴示出了随时间变化的用荧光强度表示的反应速率，并且x轴呈现了crRNA的各种修饰。在一些实施方案中，沿着Cas12M08gRNA将未经修饰的生物素和生物素修饰的变体放置在各个位置处。然后使修饰的gRNA与蛋白质复合并且添加dsDNA靶标。在一些实施方案中，在相同时间段内更高的平均荧光表明修饰在gRNA的5’和3’端上是耐受的，而在gRNA内部是不耐受的。经5’修饰的gRNA似乎比3’修饰更加稳健。
在一些实施方案中，如图23所示描述了gRNA到链霉亲和素表面的固定化。示出了两个图，其中左侧图描绘了与经链霉亲和素涂覆的表面结合的RNA，而右侧图描绘了未结合的对照RNA，其在溶液中与靶标、报告基因和蛋白质溶液混合。在每个表格中，在一些实施方案中，y轴描绘了crRNA的各种修饰，并且x轴描绘了crRNA经受的各种缓冲条件。左侧实验图显示gRNA在5’或3’侧上的修饰都是起作用的方法，但与经3’修饰的gRNA相比，经5’生物素修饰的gRNA显示增加的信号。在一些实施方案中，未经修饰的gRNA在与板结合时不显示信号。相反，右侧对照图描绘了未结合的对照，在一些实施方案中，游离gRNA与靶标、报告基因和蛋白质溶液混合。在此实施方案中，观察到足够的信号，从而表明了未经修饰的gRNA的功能。
在一些实施方案中，如本文所述且如图5所示，Cas蛋白与RNA复合物复合。图24示出了由经5’生物素修饰的gRNA结合的RNP复合物展现出较强的信号，从而表明功能性附着于经链霉亲和素涂覆的板的表面。暴露于未结合的高盐“B&W”缓冲条件的样品显示较少的荧光信号，从而表明功能性RNP复合物与板的表面的结合的蛋白质活性受到抑制或者所述结合出现中断。未经修饰的gRNA也展现出较低的荧光，从而表明RNP无法与板表面结合。右侧图中示出的对照测定表明未结合的gRNA仍能起作用。
在一些实施方案中，如图25A至图25B所示，报告基因固定到表面。图25A示出了具有经链霉亲和素涂覆的表面的四个孔的荧光图像，其中孔的左侧一列含有固定到经链霉亲和素涂覆的表面的FAM-生物素报告基因。孔的右侧一列含有未进行生物素功能化的FAM报告基因。左侧一列展现出较强的信号。图25B示出了FAM-生物素预结合溶液与在链霉亲和素板上温育之后的溶液的荧光强度的比较。观察到含有FAM-生物素的两个孔的信号减少。
在一些实施方案中，如图26所示，组合的RNP和报告基因系统被固定用于功能测试。针对以下三个条件绘制原始荧光(AU)：(1)溶液中未经修饰的crRNA，(2)与表面结合的未经修饰的crRNA，以及(3)与表面结合的经5’生物素-TEG修饰的crRNA。报告基因和RNP与板的组合式结合显示出与具有结合报告基因的溶液中的RNP类似的信号。
在一些实施方案中，将不同的报告基因结合Cas复合物一起固定在链霉亲和素表面上以评估DETECTR测定。图27A至图27E呈现了评估结合Cas复合物固定化一起固定化在链霉亲和素表面上的不同报告基因的结果。在每个图中，针对以分钟计的时间绘制了原始荧光，从而表示每种类型的报告基因在与阳性对照(+)和阴性对照(-)靶标结合时的动力学结合曲线。图27A呈现了FAM-生物素报告基因的结合结果，“rep”由荧光团FAM和生物素构成并且被列为rep72。图27B绘制了由荧光团AlexaFluor488(“AF488”)和TA10-内部生物素Q构成的报告基因的原始荧光。正如预测的那样，阳性对照显示出正斜率，从而表明在反应过程中结合增加。这是由于FAM染料在结合和反式切割时释放到溶液中。在rep104中，切割点是在FAM与生物素之间，而所有报告基因中的生物素都是链霉亲和素表面的附着点。图27C绘制了rep105的对照靶标结合动力学图。Rep105由生物素-FAM-T16-FQ构成。在这种情况下，经链霉亲和素涂覆的表面会发出荧光，因为FAM染料与淬灭剂之间的区域在结合之后被切割并且释放淬灭剂。图27D绘制了rep117的对照。Rep117由生物素-FAM-T20-FQ构成。在此实施方案中，在FAM染料与淬灭剂之间切割报告基因，从而允许淬灭剂在结合和反式切割时释放到溶液中。这进而使表面发出荧光。图27E绘制了rep118的对照。Rep118由FAM-T20-生物素-FQ构成。在此实施方案中，溶液发出荧光，因为在结合之后，在生物素与FAM之间的核酸区域被反式切割，从而将FAM释放到溶液中。
在一些实施方案中，Cy5染料可用作报告基因或报告基因的组分。图28A至图28C呈现了Cy5报告基因(rep108)的结果，显示所述报告基因对DETECTR起作用，但产生较弱的信号(可能与增益相关)。图28A和图28B绘制了被配置为分别读取Cy5染料和Alexa Fluor594(“AF594”)染料的通道的原始荧光与报告基因类型的关系图。在这些图中，针对每个报告基因示出了平均原始荧光。在“AF594”通道中读出的报告基因rep033具有最显著的荧光信号。图28C绘制了Cy5染料在板读取器上的针对激发和发射波长的各种组合的原始荧光。在类似的测定条件下，AF594展现出比Cy5更强的信号，但Cy5是起作用的。Cy5的最佳激发和发射波长分别示出为643nm和672nm。
图29A至图29F呈现了如本文所述的优化固定某些组分的复合物形成步骤的结果。在每个图中，针对以分钟计的时间绘制了原始荧光。图29A至图29C示出了重复1的结果。图29D至图29F示出了重复2的结果。在图29A和图29D中，报告基因和gRNA被固定。在图29B和图29E中，所有组分都在溶液中。在图29C和图29F中，报告基因和gRNA被固定并且Cas12和靶标同时进行添加。
图30A至图30B呈现了涉及gRNA/报告基因结合时间和报告基因浓度的固定化优化的结果。图30A是随时间变化对表面反应的上清液的测量，显示荧光减弱并且由此表明生物素化的染料报告基因被链霉亲和素表面吸收。在此实施方案中，发现15分钟的结合时间就已足够。
在一些实施方案中，gRNA被修饰。在一些实施方案中，修饰的gRNA用接头分子进行修饰以固定化到表面上。图31A至图31C呈现了显示修饰的gRNA的靶标区分的结果。
在一些实施方案中，对引导RNA进行修饰以用于表面修饰。在一些实施方案中，对报告基因进行修饰以用于表面固定化。在这些实施方案中，固定的gRNA或固定的报告基因或其组合参与包括可编程核酸酶的诊断测定。图32A至图32E呈现了证明经生物素修饰的Cas13a gRNA的功能的结果。在每个图中，针对以分钟计的时间绘制了原始荧光，其中虚线系列表示存在靶标时的数据，并且边界具有少量斑点的细实线系列表示不存在靶标(无靶标对照或NTC)时的数据。图32A和图32B分别示出了在溶液中的mod023(经生物素修饰的报告基因)和R003(未经生物素修饰的报告基因)的结果。在一些实施方案中，经生物素修饰的gRNA在溶液中具有与未经生物素修饰的gRNA类似的性能。图32C示出了用生物素修饰并固定到表面的gRNA的结果。图32D示出了未用生物素修饰但以与图32C相同的方式沉积在表面上的gRNA的结果图32E类似于图32A和图32B示出了未经修饰且在溶液中的gRNA的结果。这些结果一起显示，通过生物素修饰和表面固定化，维持了功能，并且DETECTR测定性能没有受到不利影响。
在一些实施方案中，生物分子被固定到表面。在一些实施方案中，表面是玻璃。图33示出了测试报告基因Rep072和阴性对照Rep106的结果。Rep072在5μM下的重复显示出最强的信号，并且Rep072在1μM浓度下的三次重复显示出接下来的最强的信号。对于5μM和1μM浓度两者，阴性对照报告基因rep106都显示出相同的低信号(或根本无信号)。这个结果显示了FAM-生物素化的报告基因在5μM和1μM两个浓度下经过30分钟温育时间的特异性结合。图34A至图34B示出了类似的结果，其中报告基因在图34中处于5mM浓度，并且在图34B中处于2.5mM浓度。图34A和图34B的顶排示出了展现出明亮荧光的点，并且图34A和图34B的底排示出了展现出类似低荧光的点。
用于制备复合混合物的实施方案的实验参数参见图35。
在一些实施方案中，基于荧光淬灭剂的报告基因用于固定的DETECTR测定。图36示出了在一些实施方案中使用的报告基因的序列和其他细节。在一些实施方案中，报告基因rep072、rep104、rep105、rep117和rep118用于与读取器板结合。对于一些实施方案，报告基因结合细节和复合混合物参数分别参见图37A和图37B。
本文描述了各种实施方案，其中gRNA和报告基因两者都与板结合，而不是gRNA、报告基因和CAS蛋白。这消除了用gRNA和CAS蛋白的预复合物对表面进行功能化的需求，从而允许实现更简单的制造过程。另外，通过允许更严格的洗涤可实现更高的特异性。这个实施方案的实验设计和在此实施方案中用于使报告基因与板结合的条件分别参见图38A和图38B。mod018(5'生物素-TEG R1763SARS-CoV-2N-基因)和R1763 CDC-N2-武汉的复合反应在特定实施方案中根据图39A中所呈现的条件来制备。实施方案中的两组完整的复合混合物参见图39B。
本文描述了各种实施方案，其证明了用于DETECTR反应的固定报告基因的靶标区分。这种实施方案的实验设计在图40A中示出并且报告基因结合条件在图40B中示出。在图41A和图41B中示出了反应条件。在图42中示出了PCR条件。
在一些实施方案中，气动泵与盒对接。在一些实施方案中，如自上而下的视图所示，在图43的中间，所述装置可包括具有顶层的盒，所述顶层可包括储存器。如在图43的底部处所示，所述装置可包括含有样品的滑动阀。在一些实施方案中，装置可包括在左侧示出的裂解腔室，之后是右侧的扩增腔室，以及更右侧的检测腔室。
在一些实施方案中，DETECTR测定装置可包括如可见于图44中的滑动阀。在一些实施方案中，通道的偏移间距允许分别吸入和分配到每个孔中，并且有助于减轻扩增腔室与对应的腔室之间的串扰。在一些实施方案中，样品移动通过滑动阀装置，如可见于图45中。
在一些实施方案中，NHS-胺化学物质用于固定化DETECTR组分。图83呈现了组合的gRNA和报告基因固定化的示意图以及此类实施方案的结果。在此实施方案中，功能性DETECTR反应使用经伯胺修饰的报告基因和gRNA固定到固体基质(NHS板)。在所示的实例中，修饰的报告基因(rep111)结合未经修饰的crRNA(R1763)或修饰的crRNA(mod027)一起与表面结合。在表面上温育这些核酸之后，将表面洗涤3次，然后添加Cas12M08与靶dsDNA。然后将固定的DETECTR反应在板读取器中在37℃下温育60分钟，同时连续监测荧光。
图84呈现了涉及优化缀合缓冲液以减少非特异性结合的各种实施方案的结果。对于一些实施方案，选择1x缀合缓冲液3(CB3)作为缓冲液以执行结合研究。已发现，CB3改善了经胺修饰的报告基因(rep111)的结合，并且减少了不应与NHS共价结合的生物素化的报告基因(rep117)的结合。在一些实施方案中，使用的洗涤缓冲液是1xMB3。在一些实施方案中，使用1x MB3：20mM HEPES(pH 7.2)、2mM KOAc、5mM MgAc、1％甘油、0.0016％ TriitonX-100。在一些实施方案中，使用1x CB2：20mM HEPES(pH 8.0)、2mM KOAc、5mM MgAc、1％甘油、0.0016％ Triiton X-100。在一些实施方案中，使用1x CB3：100mM HEPES(pH 8.0)、10mM KOAc、25mM MgAc。
在一些实施方案中，报告基因+引导物+Cas12M08的不同组合被固定。图85呈现了涉及测定优化的此类实施方案的结果。对于此类实施方案，已发现，首先固定引导物和报告基因，然后同时添加Cas12M08和靶标给出了足够的信号。
在图86中示出了用于优化gRNA和靶标浓度以提高固定的DETECTR测定的信噪比的结果。在一些实施方案中，增加引导物浓度，同时保持报告基因浓度一直处于0.5μM，如可见于图86的左侧。在此类实施方案中，信号变化不大。在一些实施方案中，如可见于图86的右侧，将靶标浓度增加2倍有助于改善rep135的整体信号。另外，对于此类实施方案，与rep111相比，rep135给出了更好的信号强度。两个报告基因的序列是：rep111：5AmMC6T//i6-FAMK/TTTTTTTTTTTT/3IABkFQ/以及rep135：5AmMC12//i6-FAMK/TTTTTTTTTTTTTTTTTTT/3IABkFQ/。
在一些实施方案中，氨基修饰用于DETECTR固定化。图87呈现了此类实施方案的结果。对于每个子图，针对以分钟计的时间绘制原始荧光。四个子图中的每一个都代表不同的修饰。实线迹线表示无靶标对照(NTC)，并且虚线迹线表示稀释度为1:10的靶标-GF676。
在一些实施方案中，使用快速热循环和CRISPR诊断来检测SARS-CoV-2。结果在图88中示出。对于一些实施方案，鉴定聚合酶和缓冲液组合，它们能够使用来自CDC测定的N2引物对SARS-CoV-2进行快速扩增。此类实施方案的测定在以下两个靶标浓度下执行：2个拷贝/rxn和10个拷贝/rxn。在一些实施方案中，反应条件如下：在98℃下初始变性30秒，然后是由98℃下1秒和65℃下3秒组成的45个循环。在热循环之后，将扩增子转移到Cas12M08检测反应，在37℃下持续30分钟。图88所示的表现最佳的酶/缓冲液对是在两种测试浓度下给出强信号的那些酶/缓冲液对。
在FASTR测定中测试了先前以各种浓度和多次重复鉴定的靠前的酶和缓冲液。在一些实施方案中，使用如先前公开的筛选研究中所鉴定的表现最佳的酶和缓冲液。此类实施方案的结果在图89中示出。此类实施方案的反应条件如下：在98℃下初始变性30秒，然后是由98℃下1秒和65℃下3秒组成的45个循环。所使用的引物来自针对SARS-CoV-2的CDC N2测定。在热循环之后，将扩增子转移到Cas12M08检测反应，在37℃下持续30分钟。存在的数据是来自CRISPR反应的信号。表现最佳的酶/缓冲液对是在最低测试浓度下并在重复检测中给出强信号的那些酶/缓冲液对。
对于一些实施方案，如图90所示，已经证明能用FASTR测定对SARS-CoV-2进行单拷贝检测。在一些实施方案中，FASTR测定的检测限使用由每个反应1000个SARS-CoV-2拷贝到每个反应1个拷贝构成的溶液来评估。对于一些实施方案，反应条件如下：在55℃下逆转录60秒，在98℃下初始变性30秒，然后是由98℃下1秒和65℃下3秒组成的45个循环。所使用的引物来自针对SARS-CoV-2的CDC N2测定。在热循环之后，将扩增子转移到Cas12M08检测反应，在37℃下持续30分钟。图90中存在的数据是来自CRISPR反应的信号。已发现，CRISPR测定的检测限是每个反应1个SARS-CoV-2拷贝。
关于一些实施方案之间的变化，改变快速循环时间以评估FASTR测定的变性和退火/延伸。此类实施方案的结果在图91中示出。在一些实施方案中，在55℃下进行60秒逆转录并且在98℃下进行30秒初始变性。在一些实施方案中，测试的循环条件是：98℃持续1秒，65℃持续3秒；98℃持续2秒，65℃持续2秒；或98℃持续1.5秒，65℃持续1.5秒。在一些实施方案中，所使用的引物来自针对SARS-CoV-2的CDC N2测定。在热循环之后，将扩增子转移到Cas12M08检测反应，在37℃下持续30分钟。图91所示的结果表明在65℃下超过2秒的退火/延伸时间对于稳健的灵敏度是必要的。
图92呈现了最小化FASTR的RT时间的结果。对于各种实施方案，评估了FASTR测定的性能，其中逆转录温育时间是变化的，从而将温度保持在55℃。图92所示的结果表明所述测定在逆转录超过30秒时最为稳健。
图93在一些实施方案中，FASTR测定利用具有pH 9.2或pH 7.8的缓冲液。使用这些缓冲液pH值来评估FASTR测定。如图93所示的结果表明更高pH的缓冲液在扩增子产率和灵敏度方面产生了优异结果。
对于一些实施方案，研究了FASTR测定与粗裂解缓冲液的相容性。结果在图94中示出，其中存在三个排组，每个排组由两个子排组成，从上到下分别表示缓冲液和对照。从上到下分别针对对照绘制了缓冲液(VTES、A3和洗脱缓冲液)。在图94中，还有7个子组显示出拷贝数从左到右递减。对于某些实施方案，评估了FASTR测定在与各种粗裂解缓冲液组合时的性能，其中对粗裂解缓冲液VTE5、A3和来自ChargeSwitch试剂盒(Thermo)的洗脱缓冲液进行了测试。对于某些实施方案，FASTR测定在VTE5中表现最好，但在A3缓冲液中表现得稍微不那么稳健，而来自ChargeSwitch试剂盒的洗脱缓冲液的表现与对照反应(水)类似。
对于一些实施方案，如图95所示证明了非优化的多重FASTR。在图95中，对于每个子图，在y轴上绘制了原始荧光并且在x轴上绘制了时间。每一列示出了一个特定序列：分别为R1965和R1763。每一排从上到下分别表示双链体、RNA酶P、N2和无靶标对照。对于一些实施方案，针对SARS-CoV-2和RNA酶P POP7(内源性对照)的多重FASTR的初始测试显示虽然单重测定在DETECTR中产生了稳健信号，但双重测定倾向于对SARS-CoV-2(R1763)产生微弱信号，而对RNA酶P(R1965)几乎不产生信号。在一些实施方案中，反应条件如下：在55℃下逆转录60秒，在98℃下初始变性30秒，然后是由98℃下1秒和65℃下3秒组成的45个循环。在一些实施方案中，使用来自针对SARS-CoV-2的CDC N2测定的引物和M3637/M3638。
在本文所述的各个方面，如图96所示，FASTR可用于多重检测。FASTR反应的组分(诸如引物浓度、dNTP浓度、DMSO的存在/不存在和其他因素)会影响多重FASTR反应的性能。图98示出了针对靶向人RNA酶P POP7和SARS-CoV-2的多重FASTR反应的18种不同的实验条件。在图96中，y轴的每一排表示实验操作1-18并且每一列表示在反应进行30分钟的时间点处来自特定crRNA的检测信号。颜色表示原始荧光的值。在一些实施方案中，针对SARS-CoV-2和RNA酶P的多重FASTR测定包括一组SARS-CoV-2引物(M3257/M3258)。在含有缓冲液、引物浓度、dNTP和DMSO的不同组合的不同的反应条件下执行此类实施方案的一系列实验。结果鉴定了对于多重反应稳健执行的两种反应条件。在这些实施方案中的一个实施方案中，反应4条件由以下各项组成：1X FastBuffer 2；1uM RNA酶P引物；0.5uM CoV引物；0.2mMdNTP；以及2％ DMSO。在另一个实施方案中，反应9条件由以下各项组成：1X Klentaq1缓冲液；1uM RNA酶P引物；0.5uM CoV引物；0.4mM dNTP；以及0％DMSO。在一些实施方案中，正常反应条件由以下各项组成：在55℃下逆转录60秒，在98℃下初始变性30秒，然后是由98℃下1秒和65℃下3秒组成的45个循环。在各个方面，容许的反应条件由以下各项组成：在55℃下逆转录60秒，在98℃下初始变性30秒，然后是由98℃下3秒和65℃下5秒组成的45个循环。
在一些实施方案中，FASTR测定能够实现多重检测。此类实施方案的检测限(LOD)研究的结果在图97中示出。在图97中，x轴示出了病毒RNA的每个反应的拷贝数，并且每个子图的y轴标识了特定crRNA。每个子图示出了每个反应的人RNA的纳克数，浓度从左到右递减。第4子图不含有人RNA，标记为无靶标对照(NTC)。对于一些实施方案，优化的多重FASTR测定在不同的人RNA和病毒RNA浓度下进行。在一些实施方案中，结果表明所述测定在一定范围的人RNA浓度下执行，同时维持每个反应约5个拷贝的灵敏度。在某些方面，示出的结果来自使用检测人RNA酶P的R1965或检测SARS-CoV-2的R3185(标记为M3309)进行的DETECTR反应。在各个方面，反应条件如下：在55℃下逆转录60秒，在98℃下初始变性30秒，然后是由98℃下1秒和65℃下3秒组成的45个循环。在一些实施方案中，所使用的引物是M3257/M3258(SARS-CoV-2)和M3637/M3638(RNA酶P)。
在一些实施方案中，关键引物和gRNA具有如图98所列的序列。
样品制备和冻干
本文描述了样品制备和试剂储存的各种方法。本文所述的任何装置可包括一种或多种样品制备试剂。本文所述的任何装置可包括作为干燥试剂的样品制备试剂。干燥试剂可包含固体和/或半固体。在某些情况下，干燥试剂可包括冻干试剂。本文所述的任何装置可包括一种或多种冻干试剂(例如，扩增试剂、可编程核酸酶、缓冲液、赋形剂等)。在某些情况下，方法包括样品裂解、浓缩和/或过滤。在某些情况下，方法包括使一种或多种冻干试剂复溶。在一些实施方案中，冻干试剂可为冻干珠粒、球体和/或微粒的形式。在一些实施方案中，冻干珠粒、球体和/或微粒可包含单一化合物或多种化合物。在一些实施方案中，冻干珠粒、球体和/或微粒可被调节到各种含湿量或湿度。在一些实施方案中，冻干珠粒、球体和/或微粒可包含测定内标。在一些实施方案中，冻干珠粒、球体和/或微粒可具有在约0.5毫米至约5毫米之间的直径。
本文描述了涉及优化样品制备和冻干的DETECTR反应的各种实施方案。此类实施方案允许调整用于结合底物的缓冲液以执行浓缩步骤。在一些实施方案中，可执行实验来评估具有不同组分的缓冲液的裂解(直接在测定中评估样品)和结合(从磁珠洗脱样品)特性。在此类实施方案中，输入样品与洗脱样品具有相同的浓度。结果显示出强裂解活性，但在图46中示出了极小的结合/浓缩潜力。此类实施方案的缓冲液a1、a3和可能的a11显示出可接受的结合活性。此类实施方案的缓冲液a5对裂解和结合两者都显示出适度的活性，而缓冲液a2对于任一种活性而言都是不合适的。
在一些实施方案中，将粗裂解缓冲液用于具有Cas14a.1的一锅测定中。结果可见于图47中。
在一些实施方案中，酶Cas12MO8与DTECR测定一起使用。在一些实施方案中，Cas12MO8的序列是：MKKIDNFVGCYPVSKTLRFKAIPIGKTQENIEKKRLVEEDEVRAKDYKAVKKLIDRYHREFIEGVLDNVKLDGLEEYYMLFNKSDREESDNKKIEIMEERFRRVISKSFKNNEEYKKIFSKKIIEEILPNYIKDEEEKELVKGFKGFYTAFVGYAQNRENMYSDEKKSTAISYRIVNENMPRFITNIKVFEKAKSILDVDKINEINEYILNNDYYVDDFFNIDFFNYVLNQKGIDIYNAIIGGIVTGDGRKIQGLNECINLYNQENKKIRLPQFKPLYKQILSESESMSFYIDEIESDDMLIDMLKESLQIDSTINNAIDDLKVLFNNIFDYDLSGIFINNGLPITTISNDVYGQWSTISDGWNERYDVLSNAKDKESEKYFEKRRKEYKKVKSFSISDLQELGGKDLSICKKINEIISEMIDDYKSKIEEIQYLFDIKELEKPLVTDLNKIELIKNSLDGLKRIERYVIPFLGTGKEQNRDEVFYGYFIKCIDAIKEIDGVYNKTRNYLTKKPYSKDKFKLYFENPQLMGGWDRNKESDYRSTLLRKNGKYYVAIIDKSSSNCMMNIEEDENDNYEKINYKLLPGPNKMLPKVFFSKKNREYFAPSKEIERIYSTGTFKKDTNFVKKDCENLITFYKDSLDRHEDWSKSFDFSFKESSAYRDISEFYRDVEKQGYRVSFDLLSSNAVNTLVEEGKLYLFQLYNKDFSEKSHGIPNLHTMYFRSLFDDNNKGNIRLNGGAEMFMRRASLNKQDVTVHKANQPIKNKNLLNPKKTTTLPYDVYKDKRFTEDQYEVHIPITMNKVPNNPYKINHMVREQLVKDDNPYVIGIDRGERNLIYVVVVDGQGHIVEQLSLNEIINENNGISIRTDYHTLLDAKERERDESRKQWKQIENIKELKEGYISQVVHKICELVEKYDAVIALEDLNSGFKNSRVKVEKQVYQKFEKMLITKLNYMVDKKKDYNKPGGVLNGYQLTTQFESFSKMGTQNGIMFYIPAWLTSKMDPTTGFVDLLKPKYKNKADAQKFFSQFDSIRYDNQEDAFVFKVNYTKFPRTDADYNKEWEIYTNGERIRVFRNPKKNNEYDYETVNVSERMKELFDSYDLLYDKGELKETICEMEESKFFEELIKLFRLTLQMRNSISGRTDVDYLISPVKNSNGYFYNSNDYKKEGAKYPKDADANGAYNIARKVLWAIEQFKMADEDKLDKTKISIKNQEWLEYAQTHCE*。*指示终止密码子。
图48呈现了涉及LANCR(Cas12MO8 DETECTR)测定的样品制备优化的对照研究的结果。在此类实施方案中，粗裂解涉及：25uL样品+25uL裂解缓冲液和在25℃下持续1分钟的温育。在一些实施方案中，LANCR反应如下进行：含5uL样品的25uL反应体积(标准条件)。在一些实施方案中，DETECTR反应如下进行：含2uL LANCR产物的20uL反应体积(标准条件)。样品：250个拷贝/rxn SeraCare。
对于一些实施方案，评估两组条件的冻干性能。对于一个实施方案，使用组I海藻糖。图49A至图49B呈现了使用如图49A中所呈现的RT-LAMP测定和如可见于图49B中的DETECTR测定对组1实现的冻干优化结果。
在另一个实施方案中，组II包括：使用PVP 40；山梨醇；甘露糖醇；以及甘露糖。图50A至图50B呈现了如图50A所示在3％至8％的候选赋形剂下使用RT-LAMP对组2评估的冻干优化结果，以及使用如可见于图50B中的DETECTR测定条件对组2评估的冻干优化结果。
图51A至图51B呈现了使用具有3％至5％的候选赋形剂的DETECTR MM对组2：PVP40、山梨醇、甘露糖醇、甘露糖实现的实施方案的冻干优化结果。
在一些实施方案中，海藻糖用于控制反应速率。图52呈现了来自涉及此类实施方案的研究的结果，其中使用了RT-LAMP反应组分和各种百分比的海藻糖。
图53A至图53B呈现了涉及使用DETECTR反应组分和海藻糖的实施方案的研究的结果。子图的顶排示出了在液体本体溶液中增加海藻糖百分比的结果。底排示出了以冻干粉末形式增加海藻糖的结果。在此类实施方案中，初次干燥持续90小时，填充体积为2mL小瓶中的250uL；用250uL水复溶；二次干燥为6小时；并且温度斜坡率为0.5℃/分钟。
本文描述了用于进行DETECTR测定的各种方法和装置。在一些实施方案中，DETECTR测定利用Cas12M08蛋白。在一些实施方案中，在相同的组合的主混合物中冻干RT-LAMP和DETECTR试剂的主混合物。在一些实施方案中，在相同的组合的主混合物中冻干RT-LAMP和DETECTR试剂和靶标的主混合物。图99A呈现了一锅RT-LAMP测定的结果。在一些实施方案中，一锅法是指RT-LAMP和DETECTR两者的反应试剂组合在一个样品中。图99B呈现了基于Cas12M08的DETECTR测定的结果。左侧y轴绘制了原始荧光。x轴绘制了以分钟计的时间。子图1呈现了主混合物未被冻干且不含赋形剂的结果。子图2呈现了主混合物未被冻干但确实含有赋形剂的结果。在一些实施方案中，使用赋形剂来确认整个冻干过程中的试剂稳定性，所述冻干过程包括冷冻和干燥步骤。在一些实施方案中，赋形剂是糖。在一些实施方案中，赋形剂包括图105所列的一种或多种化合物。图99A的子图7和11呈现了含有赋形剂海藻糖和棉子糖的主混合物的实施方案的结果，其中海藻糖和棉子糖以如右侧y轴上所描述的不同百分比包括在内。子图7呈现了具有10％海藻糖和3％棉子糖的混合物的结果。子图11展现了具有10％海藻糖和5％棉子糖的混合物的数据。子图8展现了具有10％棉子糖和3％海藻糖的混合物的数据。子图12展现了具有10％棉子糖和5％海藻糖的混合物的数据。
在一些实施方案中，来自RT-LAMP和DETECTR测定两者的试剂和靶标在一个样品中冻干。图99B示出了通过基于Cas12M08的DETECTR测定进行的这种实施方案的结果，并且可像图99A已经描述的那样进行解释。
在一些实施方案中，样品混合物包含多种靶分子。在一些实施方案中，样品混合物含有核酸靶标的多个拷贝。在一些实施方案中，一个样品中存在核酸靶标的1000个拷贝(cps)。在图99A至图99B的右侧上的图例中，“1000cps”是指靶标的1000个拷贝并且表示为实线。NTC是指无靶标对照并且表示为长虚线。形成图99A至图99B、图100、图101、图102A至图102B和图103的所有数据系列的边界的细实线表示数据集的边界。另外，在一些实施方案中，“混合物.重复”是指主混合物的形式，其中“液体”是指未被冻干的主混合物，表示为实线，并且“Lyo”是指被冻干的主混合物并且表示为短虚线。
在一些实施方案中，测定试剂的主混合物在冻干之后复溶。在一些实施方案中，DETECTR测定试剂的主混合物在冻干之后复溶。在一些实施方案中，包括Cas12M08蛋白的DETECTR测定试剂的主混合物在冻干之后复溶。在一些实施方案中，包括Cas12M08蛋白的扩增和DETECTR测定试剂的主混合物在冻干之后复溶。在一些实施方案中，包括Cas12M08蛋白的RT-LAMP和DETECTR测定试剂的主混合物在冻干之后复溶。复溶的冻干的Cas12M08DETECTR主混合物的结果在图100中示出。左侧y轴绘制了原始荧光。x轴绘制了以分钟计的时间。子图A含有甘油对照(10001)、IB1缓冲液(10003)和水(10002)的结果，而不存在赋形剂。子图B含有一锅对照的结果。子图G示出了含有10％海藻糖和3％棉子糖的样品的结果。子图K示出了含有10％海藻糖和5％棉子糖的样品的结果。子图H示出了棉子糖和海藻糖分别为10％和3％，并且子图L示出了棉子糖和海藻糖分别为10％和5％。粗体实心迹线示出了使用IB1反应缓冲液的实验系列。位于表示IB1缓冲液的粗实线的任一侧上的细实线(参见图99A至图99B(9901))示出了数据的边界。
图101呈现了基于Cas14a1的DETECTR测定的结果。左侧y轴绘制了原始荧光。x轴绘制了以分钟计的时间。子图A呈现了包含RT-LAMP池作为靶标的未冻干的对照主混合物的结果，被视为数据边界具有斑点背景的实线。具有斑点背景系列的细实线构成不存在靶标的未冻干的对照。子图E、F、H和I呈现了以RT-LAMP池为靶标的主混合物的结果。以RT-LAMP池为靶标的冻干的主混合物由实线表示，而未冻干的主混合物由具有斑点背景系列的细实线表示。不具有靶标的冻干的主混合物由粗线系列表示，并且不具有靶标的未冻干的样品由具有斑点背景系列的细实线表示。另外，子图E含有赋形剂，10％海藻糖和3％棉子糖。子图H含有10％海藻糖和5％棉子糖。子图F含有10％棉子糖和3％海藻糖并且子图I含有10％棉子糖和5％海藻糖。
在一些实施方案中，将用于一种测定的试剂和靶标的主混合物冻干。在一些实施方案中，将来自多于一种测定的主混合物合并冻干。在一些实施方案中，在混合与冻干之间存在一定持续时间。图102A和图102B呈现了分别制得用于RT-LAMP和基于Cas12M08的DETECTR测定两者的主混合物，将所述主混合物混合在一起并在冻干之前储存两周的实施方案的结果。图102A的子图1呈现了不具有赋形剂，未被冻干但就在进行RT-LAMP测定之前制备的样品的结果。子图2呈现了不含赋形剂且在初始制备之后两周被冻干的样品的结果。图102A的子图7、8、11、12、15和16示出了含有如轴上所述的不同类型和不同量的赋形剂的样品的结果。每条彩色线表示三次重复中的一次重复。实线表示每个样品存在靶标的1000个拷贝的浓度，而虚线不含靶标。图102B示出了对相同样品的等分试样进行的DETECTR测定的类似结果。
在一些实施方案中，来自多于一种测定的试剂的冻干的主混合物以小于1mL的体积进行制备。在一些实施方案中，来自多于一种测定的试剂的冻干的主混合物以小于250uL的体积进行制备。在一些实施方案中，来自多于一种测定的试剂的冻干的主混合物以小于25uL的体积进行制备。在一些实施方案中，来自多于一种测定的试剂的冻干的主混合物以小于10uL的体积进行制备。图103呈现了处于25uL的体积的冻干反应的结果。子图A、B、C示出了RT-LAMP测定的结果。子图A示出了具有赋形剂的冻干样品的RT-LAMP结果，其中实线表示每个样品存在靶标的500个拷贝的样品，而虚线表示无靶标对照。子图B呈现了具有赋形剂的未冻干样品的结果，其中实线表示每个样品存在靶标的500个拷贝的样品，而虚线表示无靶标对照。子图C呈现了不具有赋形剂的样品的结果。子图D、E和F示出了基于Cas12M08的DETECTR测定的结果。子图G、H和I示出了基于Cas14的DETECTR测定的结果。对于这两种测定，实线示出了具有用于RT-LAMP测定中的相同靶标的样品的结果，存在三次重复。虚线表示无靶标对照。
在一些实施方案中，通过动态扫描量热法(DSC)分析测定试剂的冻干的主混合物。图104绘制了这种实施方案的热流与以摄氏度计的温度的关系图。在一些实施方案中，此类测量提供了对主混合物在整个冻干过程，尤其是冷冻干燥步骤中的品质的度量。在一些实施方案中，DSC测量产生可指示样品的长期稳定性的玻璃化转变温度。
在一些实施方案中，赋形剂用于在可包括冷冻和干燥步骤的整个冻干过程中稳定样品。图105呈现了赋形剂以及每种赋形剂的主要/次要地位、功能、如由DSC所确定的冷冻温度(Tf)、如由DSC所确定的临界温度(T临界)和事件的列表。在一些实施方案中，T临界是确保样品完全冷冻所需的温度。
在一些实施方案中，优化酶和试剂的吸湿性以提高冻干性能。
在单个反应体积(一锅)中的LAMP扩增与Cas14a DETECTR
本文描述了在单个反应体积中进行样品扩增和检测的各种方法。本文所述的任何装置可被配置为在装置中的同一个孔、腔室、通道或体积中执行扩增和检测。在某些情况下，方法包括在同一体积中同时进行扩增和检测。在某些情况下，方法包括在同一体积中进行有序扩增和检测。在一些实施方案中，样品扩增可包括LAMP扩增。
图54A至图54B呈现了涉及在单个反应体积(一锅)中进行LAMP扩增与Cas14aDETECTR的HotPot的实施方案的结果。在这种实施方案中，Cas14在标准LAMP条件下无法作为一锅起作用。在一些实施方案中，对Cas14a进行测试以查明它在使用Klenow(exo-)作为DNA聚合酶在50℃下使用LowLAMP的一锅反应中是否能够起作用。(a)来自SYTO9(DNA结合染料)的信号表明LAMP产生了DNA。已证实，LowLAMP能够在存在Cas14的情况下在三种不同的缓冲液中产生DNA扩增子。(b)在(a)所示的一锅反应条件下，信号来自Cas14FQ报告基因。在一锅反应中没有检测到信号，即使产生了DNA也是如此。对于这个实施方案，结果表明Cas14在LAMP反应中受到抑制。
对于一些实施方案，RT-LAMP可通过使用Klenow(exo-)或Bsu聚合酶在较低温度下执行：LowLAMP。RT-LAMP通常在55℃至70℃之间的温度下执行。结果可见于图55中。这个温度范围受到所使用的聚合酶的影响。在标准RT-LAMP中，使用Bst或Bsm聚合酶，它们在高于55℃时显示出峰值活性。在此实施方案中，RT-LAMP在37℃至50℃的温度下执行。通过使用Klenow(exo-)和Bsu聚合酶，已评估并证明RT-LAMP在低至40℃的温度下对SARS-CoV-2的RNA靶标起作用。对于这个实施方案，测试了这些酶在4种不同的缓冲液中的性能，并且在50℃下观察到了Klenow(exo-)的峰值活性，而Bsu的峰值活性是在45℃。对于一些实施方案，这种方法被称为LowLAMP，因为它在比标准RT-LAMP更低的温度下起作用。
Cas14a1序列是：MAKNTITKTLKLRIVRPYNSAEVEKIVADEKNNREKIALEKNKDKVKEACSKHLKVAAYCTTQVERNACLFCKARKLDDKFYQKLRGQFPDAVFWQEISEIFRQLQKQAAEIYNQSLIELYYEIFIKGKGIANASSVEHYLSDVCYTRAAELFKNAAIASGLRSKIKSNFRLKELKNMKSGLPTTKSDNFPIPLVKQKGGQYTGFEISNHNSDFIIKIPFGRWQVKKEIDKYRPWEKFDFEQVQKSPKPISLLLSTQRRKRNKGWSKDEGTEAEIKKVMNGDYQTSYIEVKRGSKIGEKSAWMLNLSIDVPKIDKGVDPSIIGGIDVGVKSPLVCAINNAFSRYSISDNDLFHFNKKMFARRRILLKKNRHKRAGHGAKNKLKPITILTEKSERFRKKLIERWACEIADFFIKNKVGTVQMENLESMKRKEDSYFNIRLRGFWPYAEMQNKIEFKLKQYGIEIRKVAPNNTSKTCSKCGHLNNYFNFEYRKKNKFPHFKCEKCNFKENADYNAALNISNPKLKSTKEEP。
在一些实施方案中，使用称为R1518的tracrRNA并且对于系统而言是天然的并且具有以下序列：CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU。
在一些实施方案中，Cas14a.1使用两种RNA成分，即tracrRNA和crRNA。在一些实施方案中，使用这个系统产生的天然crRNA重复。
在一些实施方案中，所使用的crRNA是：
R3297-SARS-CoV-2N-基因，其具有以下序列：GUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGAAUGCAACCCCCCAGCGCUUCAGCGUUC；
R3298-猛犸象-具有以下序列：GUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGAAUGCAACGCCGAUAAUGAUGUAGGGAU；
R4336-SARS-CoV-2-具有以下序列：GUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGAAUGCAACUGGCACUGAGAAUUUGACUA；以及
R4783-OC43-具有以下序列：GUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGAAUGCAACUACAAGUGCCUGUAGGUAUA。
对于一些实施方案，鉴定了与Cas14a和低温RT-LAMP(LowLAMP)相容的缓冲液。结果在图56A至图56B中示出。对于这个实施方案，已发现LowLAMP和Cas14a能在不同缓冲液中起到最佳的作用。对于这个实施方案，评估了LowLAMP在50℃下在对于LowLAMP最佳的缓冲液(IB1、IB13、IB14)和对于Cas14a最佳的缓冲液(A3、H2、TM)中的性能，而且评估了Cas14a在相同的缓冲液中在50℃下的性能。图56A至图56B中的结果显示LowLAMP和Cas14a两者在LowLAMP最佳缓冲液中都能起作用，但Cas14a与缓冲液IB14最相容。这项工作使得能够鉴定与等温扩增和Cas14aDETECTR两者相容的缓冲条件，这是迈向一锅反应的关键步骤。
在一些实施方案中，引物和dNTP对Cas14性能具有最大的抑制作用，如可见于图57中所呈现的结果。在此处，测试了LowLAMP的各个组分对Cas14性能的影响，以确定哪些组分可能会导致在尝试一锅反应时出现的抑制。将每种组分与1nM靶dsDNA一起添加到Cas14a反应，并且在50℃下将反应进行60分钟。结果表明引物和dNTP造成了LAMP的抑制。
在一些实施方案中，如图58所示，LAMP在存在较低浓度的dNTP和引物的情况下起作用。在一些实施方案中，LAMP中的dNTP和引物两者都对Cas14具有抑制作用。在此实施方案中，测试了较低浓度的dNTP和引物的性能，以查明对使用Klenow(exo-)在50℃下进行的LowLAMP的性能的影响。对于这个实施方案，结果示出了结果读取时间(time-to-result)，其中较低的值指示较快的扩增。(a)dNTP的滴定显示LowLAMP在降至0.8mM dNTP时起作用。对于这个实施方案，测定的性能在1.2mM下出现提高，并且与标准1.4mM相比是更低的。(b)LowLAMP中引物的滴定。这个测定的结果显示，低于0.5X的引物可具有抑制作用。这些结果共同表明，可降低dNTP和引物浓度，而不会不利地影响LowLAMP性能，这可帮助缓解观察到的对Cas14的抑制。
在一些实施方案中，在50℃下测试伴有LowLAMP的一锅Cas14。对于此类实施方案，显示使用Klenow(exo-)DNA聚合酶在50℃下使用Cas14和LowLAMP的一锅DETECTR是起作用的，如可见于图59A至图59B中。对于这个实施方案，测试了较低的引物和dNTP浓度。其他实施方案表明，Cas14在标准1.4mM和1X引物浓度下受到抑制。(a)来自Cas14a一锅的信号。对于这个实施方案，使用Cas14的一锅DETECTR反应与靶向由LowLAMP产生的扩增子的SARS-CoV-2N-基因crRNA复合，或者与靶向猛犸象mtDNA中的基因的非靶crRNA复合。来自这个实施方案的结果显示仅在用靶RNA和靶向扩增子的crRNA进行的反应中出现信号。当不存在靶标或Cas14 crRNA靶向猛犸象基因时，看不到信号。(b)为了确认LAMP产生了目标靶标，使一锅反应中产生的扩增子流入使用SARS-CoV-2N-基因crRNA的Cas12 DETECTR反应中。这些结果证明当存在靶RNA时产生了扩增子。另外，结果表明一锅反应在0.8和0.6mM dNTP下起作用，而在1.4mM dNTP下不起作用，这归因于在此浓度的dNTP下的Cas14抑制。
在一些实施方案中，Cas14与聚合酶(例如，Bsm DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Klenow(exo-)DNA聚合酶或Bsu DNA聚合酶)(55C)一起用于一锅测定。如果反应温度从50℃升高到55℃，则一锅反应可能会更快。然而，LowLAMP中使用的DNA聚合酶在55℃下不起作用，因此，在此处使用了Bsm DNA聚合酶，它在55℃下能比诸如Bst的其他LAMP聚合酶更稳健地工作。测试了几种不同浓度的dNTP和引物，并且评定了测定的性能。图60所示的结果表明当Cas14具有与靶扩增子(N-基因)匹配的crRNA时以及当反应中存在靶RNA时，Cas14产生信号。在1mM dNTP下，反应速度最快，但当使用0.8和0.6mM dNTP时，总体信号较弱。
对于一些实施方案，评估了称为HotPot的一锅DETECTR反应的初始性能。结果在图61中示出。在本实验中，在55℃下针对两种不同的DNA聚合酶执行检测限实验。靶向SARS-CoV-2N-基因或脱靶基因的Cas14 crRNA被包括在实验中。对SARS-CoV-2RNA基因组的在1000、500、250或125个拷贝/rxn下的测定进行测试。在图61中示出了测定在3/3重复中在125个拷贝/rxn的最低测试浓度下具有稳健性能。
对于一些实施方案，在55℃下针对两种不同的DNA聚合酶执行检测限实验。结果在图62中示出。对于这些实施方案，靶向SARS-CoV-2N-基因或脱靶基因的Cas14 crRNA被包括在实验中，并且对SARS-CoV-2RNA基因组的在100、75、50、10或1个拷贝/rxn下的测定进行测试。对于这些实施方案，在3/3重复中在100个拷贝/rxn下观察到了测定的稳健性能。在75个拷贝及以下拷贝处，没有出现几次重复，但在2/3重复中在降至10个拷贝/rxn时观察到了检测物。
对于本文所述的各种实施方案，测定周转时间为5分钟。在一些实施方案中，测定周转时间为10分钟。在一些实施方案中，周转时间为15分钟。在一些实施方案中，周转时间为20分钟。在一些实施方案中，周转时间为30分钟。在一些实施方案中，周转时间为40分钟或更少。
一锅NECTR：在单个反应体积中进行NEAR扩增+Cas14aDETECTR
本文描述了在单个反应体积中进行样品扩增和检测的各种方法。本文所述的任何装置可被配置为在装置中的同一个孔、腔室、通道或体积中执行扩增和检测。在某些情况下，方法包括在同一体积中同时进行扩增和检测。在某些情况下，方法包括在同一体积中进行有序扩增和检测。在一些实施方案中，样品扩增可包括NEAR扩增。
对于一些实施方案，在NEAR中替换Bst聚合酶可使得能够在如图63所示的较低温度下进行SARS-CoV-2检测。在这些实施方案中，NEAR方案使用Bst 2.0以在60℃下从SARS-CoV-2产生扩增子。这种聚合酶在55℃下也起作用，但作用能力降低。对于这些实施方案，评估了Bsu和Klenow(-exo)聚合酶在较低温度下的性能。对于这些实施方案，已发现Klenow(-exo)聚合酶能够在55℃和50℃下进行稳健扩增。图63所示的数据是在NEAR扩增反应之后的Cas12M08DETECTR。对于一些实施方案，扩增反应在由1X IsoAmp缓冲液+0.5X CutSmart缓冲液的混合物构成的缓冲液中在指定温度下执行10分钟。在此实施方案中观察到，Cas14a在55℃和50℃下显示峰值活性，而在60℃下不显示峰值活性。
对于一些实施方案，NEAR扩增在如图64所示的Cas14a最佳缓冲液中起作用。与NEAR扩增的最佳缓冲液相比，Cas14a的最佳缓冲液具有更少的盐和更高的Mg2+。在此实施方案中，在Cas14a的以下两种缓冲液中执行NEAR扩增：1X TM缓冲液和1X H2缓冲液。在此实施方案中，用指定的聚合酶、缓冲液和反应温度经由Nt.BstNBI、Omniscript RT、M2805FWD、M2811 REV执行扩增反应。图64所示的数据是Cas12M08 DETECTR反应的结果，以评估产生的扩增子的量。对于这个实施方案，结果表明TM缓冲液和H2缓冲液可用于NEAR扩增。然而，结果表明反应产生比最佳NEAR反应少约10倍的扩增子。这表明有进一步优化缓冲液的空间。在一些实施方案中：1X TM缓冲液：20mM甲基甘氨酸，pH 8.5；2mM KOAc；100μg/mLBSA；15mM MgOAc。在一些实施方案中：1X H2缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 8.8；2mM KOAc；0.1％吐温-20；17.5mM MgOAc。
在一些实施方案中，Cas14a在如图65所示的KOAc盐浓度范围内起作用。在一些实施方案中，Cas14a反应缓冲液(H2缓冲液)含有2mM KOAc。在一些实施方案中，扩增反应需要更高浓度以实现最佳效率。在一些实施方案中，在增加的KOAc浓度下执行Cas14aDETECTR反应。用tracrRNA R1518、crRNA R2424，在1nM的靶标浓度下并在50℃的反应温度下评估Cas14a DETECTR反应。图65所示的结果表明Cas14a在2-10mM KOAc下具有最大活性，而在高达60mM时仍保持强劲活性。在70mM KOAc下，Cas14a的性能开始下降。在一些实施方案中，1XH2缓冲液由以下各项构成：20mM Tris-HCl；pH 8.8；2mM KOAc；0.1％吐温-20；以及17.5mMMgOAc。
在一些实施方案中，增加KOAc的浓度提高了在Cas14a最佳缓冲液中的NEAR性能，如可见于图66中。最初认为在Cas14a最佳反应缓冲液中的NEAR扩增的效率不如在最佳NEAR缓冲液(1XIsoAmp+0.5X CutSmart)中执行扩增时的效率。在一些实施方案中，增加的KOAc量对在Cas14a最佳扩增缓冲液(H2缓冲液)背景中NEAR扩增的性能具有影响。如可见于图66中，结果显示了在NEAR扩增之后如何执行Cas12M08 DETECTR测定来测量扩增效率。结果表明，将KOAc增加到高达60mM提高了产生的NEAR扩增子的量。2mM至60mM KOAc是Cas14a的作用范围。在一些实施方案中：1X H2缓冲液：20mM Tris-HCl，pH 8.8；2mM KOAc；0.1％吐温-20；17.5mM MgOAc。在一些实施方案中，增加KOAc的浓度提高了在Cas14a最佳缓冲液中的NEAR性能，如可见于图67中。
对于一些实施方案，在图70中示出了Cas14a.1crRNA对SARS-CoV-2E-基因扩增子的性能。在一些实施方案中，Cas14acrRNA被设计成靶向通过引物M2805/M2811产生的SARS-CoV-2E-基因NEAR扩增子。结果在图68A至图68B中示出。图68A示出了crRNA的位置。R1765和R1764是靶向扩增子的Cas12M08 crRNA。指示了用于Cas12M08的PAM序列，但在此扩增子中没有TTTR PAM可供Cas14使用。图68B示出了Cas14a.1crRNA对NEAR扩增子的性能(在60℃下产生15分钟)。所有测试的crRNA在最少量的来自R3960、R3961和R3962的背景下都能稳健地工作。
在一些实施方案中，如图69所示评估了Klenow(exo-)NEAR测定在IB13缓冲液中在降低的盐浓度下的性能。在这些实施方案中，标准NEAR反应缓冲液由1X IsoAmp缓冲液和0.5X NEBuffer 3.1的混合物构成，这给出了100mM的最终盐浓度。在这些实施方案中，测试了IB13缓冲液在作为盐的KOAc的不同浓度下的变化。在这些缓冲液变化中，使用Klenow(exo-)作为聚合酶的NEAR测定在55℃下进行20分钟。为了读出产生的扩增子的量，对2μL的NEAR扩增子执行Cas12M08 DETECTR测定。结果表明，最佳NEAR性能是在100mM KOAc下达成，这类似于标准NEAR反应缓冲液，并且产生的扩增子的量随着盐的减少而减少。所述测定在80-70mM KOAc下具有可接受的性能。在一些实施方案中，IB13缓冲液的组成为：20mM Tris-HCl，pH 8.8；10mM(NH4)2SO4；50mM KOAc；5mM MgOAc；1％吐温-20；1mg/mL BSA。
一锅sRCA：在单个反应体积中进行滚环扩增与Cas14aDETECTR
本文描述了在单个反应体积中进行样品扩增和检测的各种方法。本文所述的任何装置可被配置为在装置中的同一个孔、腔室、通道或体积中执行扩增和检测。在某些情况下，方法包括在同一体积中同时进行扩增和检测。在某些情况下，方法包括在同一体积中进行有序扩增和检测。在一些实施方案中，样品扩增可包括RCA。
图70在此系统中，将靶核酸添加到含有用于一锅RCA+Cas蛋白反应的组分的系统。所述系统的RCA部分由哑铃形DNA模板、引物和DNA聚合酶构成。对于一些实施方案，反应的DETECTR部分由Cas蛋白(诸如Cas12或Cas14)、靶向由RCA产生的扩增子而不是哑铃形DNA模板的crRNA和FQ ssDNA报告基因构成。将能够与哑铃形DNA模板结合的靶核酸(例如，病毒RNA)添加到所述系统。靶核酸碱基对与DNA模板配对。靶标与DNA模板之间较为广泛的碱基配对导致哑铃的内部碱基配对被破坏，从而为引物打开结合位点。DNA聚合酶之后可使用这个引物来开始RCA。在一些实施方案中，随着RCA的进行，产生含有Cas蛋白的靶位点的扩增子。Cas蛋白通过与crRNA的碱基配对识别这个位点，并且引发对FQ ssDNA报告基因的反式切割。在一些实施方案中，系统含有比其他一锅法更少的组分并且不需要RT酶。
在一些实施方案中，如图71所示，针对sRCA性能对筛选的哑铃形DNA模板进行筛选。在一些实施方案中，用于RCA的四个哑铃形DNA模板含有Cas12或Cas14靶位点。对于这些实施方案，DNA结合染料SYTO9用于监测这些哑铃在RCA中在各种温度下在1小时内是否起作用。如可见于图71中的结果表明只有哑铃4在通过RCA产生DNA方面起作用。在35℃至45℃下看到了所述系统的峰值性能。
对于一些实施方案，如可见于图72中，监测Cas14a检测RCA反应产物的性能。在其他实施方案中，已显示，哑铃4在RCA中起作用，而哑铃1不起作用。在一些实施方案中，将2μL或5μL的RCA反应液添加到20μL Cas14a DETECTR反应液，所述Cas14aDETECTR反应液含有能够检测由RCA产生的扩增子的crRNA，但不含有哑铃形DNA模板。结果表明，Cas14a能够像预期的那样检测扩增子，并且在反应中添加少量RCA的情况下可看到提高的性能。
在一些实施方案中，在一锅测定sRCA中，使用Cas14。此类实施方案的作用结果在图73中示出。作为两个实施方案，在45℃下在两种条件中执行反应。在一个实施方案中，DNA模板(哑铃4)不含有触发寡核苷酸，而在另一个实施方案中，DNA模板确实具有触发寡核苷酸。在具有引发RCA的触发寡核苷酸的实施方案中，与不具有触发寡核苷酸的另一个实施方案相比，观察到更强的信号。这证明Cas14能够在一锅反应中检测RCA扩增子，并且sRCA反应受到触发寡核苷酸的存在的影响。
在一些实施方案中，针对Cas14一锅sRCA测定滴定触发寡核苷酸。对于这个实施方案，确定了引发一锅Cas14 sRCA反应所需的触发寡核苷酸的最小浓度。图74所示的结果表明需要至少0.5nM的触发寡核苷酸来引发sRCA反应。
在一些实施方案中，Cas12M08酶用于一锅sRCA测定中。在其他实施方案中，已显示Cas14能够在一锅sRCA反应中起作用。在此实施方案中，显示了Cas12M08也能够在45℃下在这个测定中起作用。由sRCA反应中包括的ssDNA FQ报告基因的切割产生的结果在图75中示出。这种实施方案的结果表明Cas12M08能够以一锅sRCA形式起作用。在一些实施方案中，触发寡核苷酸储备液的浓度为：(1)40nM储备液＝2nM最终浓度；(2)20pM储备液＝1pM最终浓度；以及(3)20fm储备液＝1fM最终浓度。
图76在一些实施方案中，Cas13被编程为识别RNA靶标(g)。当存在病毒RNA靶标时，切除引物(v)的3’端上的封闭基序。在切除这个封闭基序之后，引物则可用于打开环状模板并且允许使用DNA聚合酶通过RCA进行扩增。随着扩增子的产生，产生了与原始RNA(g)相同的靶序列。然后，这种ssDNA靶序列能够被Cas13识别，这可从引物(v)中切除另外的封闭基团，或者切割产生荧光信号的FQ报告基因。这个系统针对Cas13形成了正反馈回路。
图77在一些实施方案中，用于RCA的两个哑铃形DNA模板含有Cas13 ssDNA靶向位点。在一些实施方案中，DNA结合染料SYTO9用于监测这两个哑铃在30℃下在RCA中是否起作用。通过滴定用于触发扩增的引物来监测两个模板的性能。结果表明，哑铃7(而非哑铃8)与RCA相容，如图77所示。
在一些实施方案中，与Cas13相容的DNA模板用于RCA。图78呈现了此类实施方案的结果，以确定与Cas13相容的DNA模板是否在RCA中起作用。在一些实施方案中，用于sRCA的环状DNA哑铃具有Cas13 ssDNA靶位点，称为哑铃7。在一些实施方案中，DNA结合染料SYTO9用于监测DNA模板针对两种不同的聚合酶使用2nM的触发寡核苷酸(用于sRCA的引物)在不同温度下在RCA中是否起作用。图78所示的结果表明哑铃7能够在30℃至55℃的温度下产生扩增子。由利用哑铃7来在30℃至55℃下产生扩增子组成的这种实施方案能够在一锅反应中使用Cas13酶。
在一些实施方案中，Cas13M26用于一锅sRCA反应中。图79呈现了这种实施方案的结果，其中由RCA产生的扩增子含有能够被Cas13 gRNA识别的ssDNA区域。随着反应的进行，会产生另外的ssDNA靶标，同时激活的Cas13M26会切割FQ RNA报告基因以产生信号。评估了这种反应在各种温度下的性能，并且已显示，Cas13M26能够在30℃至40℃下检测RCA扩增子的这种ssDNA区域，这与先前针对Cas13M26确定的活性温度一致。还比较了两种不同的聚合酶在目标温度下的性能。图79所示的结果表明Cas13可用于一锅反应中，其中RCA是扩增方法，并且在此实施方案中保留了Cas13检测ssDNA的能力。
CasPin：利用Cas13 ssDNA靶向的Cas13正反馈回路
本文描述了信号放大的各种方法。本文所述的任何装置可被配置为在可编程核酸酶已切割报告基因之后执行信号放大。信号放大可提高对复杂样品中稀有靶标的检测。在某些情况下，方法包括利用可编程核酸酶(例如，Cas13)的ssDNA靶向，以在可编程核酸酶与靶核酸结合时产生正反馈回路，以切割另外的报告基因并且放大因靶核酸的存在而产生的信号。
图80呈现了对CasPin的概述。在一些实施方案中，CasPin系统使用两个Cas13群体。一个群体是用靶向诸如病毒基因组的目标RNA的crRNA进行编程。另一个群体用对ssDNA检测最佳的crRNA进行编程。在一些实施方案中，系统还含有由DNA和RNA两者构成的发夹形寡核苷酸。最终，在一些实施方案中，存在用于读出测定结果的FQ RNA报告基因。当Cas13检测到目标RNA时，它可切割FQ RNA报告基因或发夹寡核苷酸上的RNA。当发夹寡核苷酸上的RNA被切割时，它会从DNA中解离出来，从而显露可被另一Cas13 RNP群体识别的ssDNA靶位点。这引发了正反馈回路，其中Cas13识别ssDNA靶标并且切割更多的发夹分子，这增加了系统中靶标的总量，并且导致所述系统的进一步激活。随着这个过程的继续，越来越多的FQRNA报告基因被切割，这将成为测定的最终读出。
图81在一些实施方案中，靶ssDNA序列由紫色矩形指示。RNA环结构可出现在靶链的任一侧(5’、3’或两者)上。与靶位点互补的链可为DNA或RNA。与靶位点互补的链也可能是靶位点的完美匹配者，短于靶位点，或含有错配以帮助破坏稳定性或促进Cas13的反式切割。
在一些实施方案中，在靶位点的任一端上使用两个发夹。图82呈现了这种实施方案的结果，并且表明了阻止Cas13识别ssDNA靶位点的能力。在一些实施方案中，CasPin寡核苷酸具有不同长度的发夹茎。在一些实施方案中，CasPin寡核苷酸不具有茎结构。在一些实施方案中，CasPin寡核苷酸含有另一个DNA序列。对此类实施方案进行评估并且发现它们不会被crRNA识别。对来自制造商的原始寡核苷酸和在Cas13 DETECTR反应中在25℃下已经变性和再折叠的寡核苷酸两者进行了测试。这个实验的结果(图84所示)证明Cas13能够识别靶位点，而不管茎长度如何。在一些实施方案中，茎长度较长的寡核苷酸阻断Cas13识别，而不进行RNA切割以释放结构。手持式微流体装置上的一锅DETECTR
本文描述了用于在手持装置上进行一锅DETECTR测定的各种装置和方法。本文所述的任何装置可被配置为执行一锅DETECTR测定。例如，图10A至图12所示的装置可被配置为进行一锅DETECTR测定。这种实施方案的结果在图106中示出。y轴显示原始荧光(AU)并且x轴显示以分钟计的时间。这三条迹线示出了在三种不同的采集设置下收集的相同数据。由方形表示的迹线(低周期校正平均值)显示了未使检测器饱和的设置，并且因此显示了整个测定过程中信号的完整动态范围。
基于多重DETECTR测定的横向流测定
本文描述了多重检测的各种方法。本文所述的任何装置可被配置用于复用(例如，检测多种靶核酸)。在某些情况下，多重检测可利用一个或多个横向流测定试纸条。
此处描述了用于基于DETECTRTM测定的复用横向流试纸条的各种装置和方法，如图107所示。在一些实施方案中，报告基因(10701)被固定到固体支持物的表面(10700)。在一些实施方案中，可编程核酸酶(例如，Cas复合物)探针(10707)被固定到表面(10700)。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(10707)包含诸如单引导RNA(sgRNA)的引导核酸(10708)。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(10707)可包含被设计为样品的靶核酸的互补体的sgRNA(10708)。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(10707)和报告基因(10701)都被固定到表面(10700)。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(10707)和报告基因(10701)两者足够接近地固定到表面(10700)，使得报告基因(10701)可被可编程核酸酶探针(10707)的可编程核酸酶切割。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(10707)和报告基因(10701)两者足够接近地固定到表面(10700)，使得当靶核酸和可编程核酸酶探针(10707)的sgRNA(10708)是互补体时，报告基因(10701)可在靶核酸与sgRNA(10708)结合之后被可编程核酸酶探针(10707)的可编程核酸酶切割(10709)。在这种实施方案中，这表明存在靶标并且是对靶标的“命中”。在一些实施方案中，与可编程核酸酶探针(10707)的sgRNA(10708)互补的靶核酸的结合导致可编程核酸酶探针(10707)的可编程核酸酶引发对可编程核酸酶的足够接近度内核酸的切割。在一些实施方案中，表面(10700)是在孔的底部。在一些实施方案中，第一可编程核酸酶探针(10707)和第一报告基因(10701)的集合在表面(10700)的一个位置处固定到表面。
在一些实施方案中，如图107A所示，报告基因(10701)可包含表面接头(10702)、核酸(10703)、第二接头(10706)、检测部分(例如，标记)(10704)和亲和分子(例如，结合部分)(10705)。在一些实施方案中，结合部分(10705)是生物素。在一些实施方案中，有超过一个拷贝的相同报告基因(10701)固定到表面。
在一些实施方案中，横向流测定试纸条(10710)用于检测切割的报告基因(10709)。在一些实施方案中，使切割的报告基因(10709)与横向流试纸条(10710)的样品垫(10711)接触。在一些实施方案中，切割的报告基因(10709)与样品垫中存在的缀合颗粒结合。在一些实施方案中，缀合颗粒是金纳米颗粒。在一些实施方案中，金纳米颗粒用抗生物素进行功能化。在一些实施方案中，用抗生物素功能化的金纳米颗粒与在结合部分(10705)中含有一种或多种生物素的切割的报告基因结合。
在一些实施方案中，报告基因含有第二接头。在一些实施方案中，第二接头将一个或多个结合部分键联到核酸。在一些实施方案中，第二接头将一个或多个标记键联到核酸。在一些实施方案中，第二接头将一个或多个结合部分和一个或多个标记两者键联到报告基因的核酸。在一些实施方案中，报告基因是树状物或三倍体分子。
在一些实施方案中，报告基因含有标记。在一些实施方案中，标记是FITC、DIG、TAMRA、Cy5、AF594、Cy3，或任何适于横向流测定的标记。
在一些实施方案中，报告基因可包含用于结合的化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，化学官能团与流动捕获探针上的捕获探针(例如，缀合颗粒或捕获分子)互补。在一些实施方案中，流动捕获探针是用抗生物素功能化的金纳米颗粒。在一些实施方案中，流动捕获探针位于样品垫中。在一些实施方案中，流动捕获探针位于与样品垫接触的缀合垫中，其中横向流测定试纸条可包括样品垫和缀合垫两者，另外其中样品垫和缀合垫两者都与检测区域流体连通。
在一些实施方案中，横向流测定试纸条(10710)含有检测区域(10712)。在一些实施方案中，检测区域(10712)可包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，检测点含有固定捕获探针(例如，捕获分子)。在一些实施方案中，固定捕获探针可包含一种或多种捕获抗体。在一些实施方案中，捕获抗体是抗-FITC、抗-DIG、抗-TAMRA、抗-Cy5、抗-AF594，或能够结合检测部分或缀合物的任何其他适当的捕获抗体。
在一些实施方案中，包含FITC的流动捕获探针被包含抗-FITC抗体的固定捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含TAMRA的流动捕获探针被包含抗-TAMRA抗体的固定捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含DIG的流动捕获探针被包含抗-DIG抗体的固定捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含Cy5的流动捕获探针被包含抗-Cy5抗体的固定捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含AF574的流动捕获探针被包含抗-AF594抗体的固定捕获探针捕获。
在一些实施方案中，横向流测定试纸条(10710)可包括对照线(10714)。在一些实施方案中，对照线(10714)可包含与所有流动捕获探针互补的抗-IgG。在一些实施方案中，当流动捕获探针没有与报告基因结合时，流动捕获探针将被对照线上的抗-IgG捕获，从而向用户确保即使没有从测试线读取到信号也能正常工作。
在一些实施方案中，横向流测定试纸条(10710)可包括样品垫。在一些实施方案中，流动捕获探针可包含抗生物素。在一些实施方案中，流动捕获探针可包含HRP。在一些实施方案中，流动捕获探针可包含HRP-抗生物素。在一些实施方案中，流动捕获探针是HRP-抗生物素DAB/TMB.
此处描述了用于基于DETECTRTM测定的复用横向流试纸条的各种装置和方法，如图108所示。图108描绘了用于在横向流测定试纸条上进行DETECTRTM测定读出的非限制性示例性工作流。在一些实施方案中，样品(10801)含有一个或多个靶核酸序列。在一些实施方案中，样品(10801)(例如，样品溶液)至少含有第一靶核酸序列和第二靶核酸序列。在一些实施方案中，将样品(10801)引入孔(10802)(例如，D1至D5)中，其中在一个或多个位置处，有诸如sgRNA的不同引导核酸固定到孔的表面。在一些实施方案中，sgRNA是固定到表面的可编程核酸酶探针的一部分。在一些实施方案中，sgRNA被设计成与样品中的靶核酸特异性结合。在一些实施方案中，存在对应于孔表面上的不同位置(例如，位置D1至D5)的不同sgRNA，其中每种不同的sgRNA与样品中可能存在或不存在的不同靶核酸序列互补。在一些实施方案中，除了含有sgRNA的可编程核酸酶探针以外，每个位置都用具有不同官能团的一个或多个报告探针进行功能化。在一些实施方案中，报告探针足够接近以被可编程核酸酶探针切割。在一些实施方案中，如实施例13中所描述，特定sgRNA与所述sgRNA被设计成特异性结合的靶核酸之间的结合允许一个或多个报告基因的部段从对应的核酸上切割并且释放到样品溶液中。在一些实施方案中，报告基因用标记进行功能化。在一些实施方案中，横向流测定试纸条含有包含检测点(例如，10803、10804)的检测区域，其中每个检测点含有不同类型的捕获抗体。在一些实施方案中，每种捕获抗体类型与特定标记类型的报告基因特异性结合。在一些实施方案中，第一检测点(10803)含有捕获抗体抗-FITC。在一些实施方案中，孔(10802)的表面上的位置D5含有第一固定可编程核酸酶探针，所述第一固定可编程核酸酶探针包含对第一靶核酸序列具有特异性的sgRNA。在一些实施方案中，D5另外含有用FITC标记的固定的第一报告基因(10806)。在一些实施方案中，第一靶核酸序列与可编程核酸酶探针的结合导致第一报告基因(10806)的可切割核酸被切割并且释放到溶液中。可替代地或组合地，在一些实施方案中，第二检测点(10804)含有捕获抗体抗-DIG。在一些实施方案中，第二位置D4含有固定的可编程核酸酶探针，所述固定的可编程核酸酶探针包含对第二靶核酸序列具有特异性的sgRNA。在一些实施方案中，D4另外含有用DIG标记的固定的第二报告基因(10805)。因此，在一些实施方案中，在结合第二靶核酸序列时，固定的第二报告基因(10805)被切割并且释放到溶液中。在一些实施方案中，使含有切割的第一报告基因(10805)和第二报告基因(10806)的溶液连同追踪缓冲液一起与横向流测定试纸条的样品垫接触。在一些实施方案中，样品垫在上面设置有一个或多个流动捕获探针(例如，抗生物素-AuNP)。在一些实施方案中，含有切割的第一报告基因和第二报告基因的样品溶液连同追踪缓冲液一起流过样品垫，其中报告基因与缀合物(例如，抗生物素-金纳米颗粒)结合。在一些实施方案中，通过手动移液使含有切割的报告基因的溶液与样品垫接触。在一些实施方案中，使含有切割的报告基因的溶液与从与样品垫流体连接的腔室中吸出的样品垫接触。在一些实施方案中，含有切割的报告基因的溶液因从进行了导致切割的报告基因溶液的测定的腔室中吸出而与样品垫接触。在一些实施方案中，报告基因在样品垫中被切割。在一些实施方案中，报告基因通过DETECTRTM测定在样品垫中被切割。在一些实施方案中，溶液通过毛细管作用或芯吸而被吸入和吸出样品垫。在一些实施方案中，毛细管作用或芯吸是由于液体被吸入吸收垫中而引起的。在一些实施方案中，毛细管作用或芯吸是由于液体被吸入吸收垫中而引起的，由此不需要电力。在一些情况下，溶液因压力梯度而被吸入或吸出样品垫。在一些实施方案中，具有用FITC标记的报告基因(10806)的金纳米颗粒-报告基因缀合物将与含有捕获抗体抗-FITC的第一检测点(10803)选择性地结合，从而表明样品中存在第一靶核酸序列。在一些实施方案中，主要具有用DIG标记的报告基因(10805)的AuNP-报告基因缀合物将与含有捕获抗体抗-DIG的第二检测点(10804)选择性地结合，从而表明样品中存在第二靶核酸序列。以此方式，对于一些实施方案，能够并行检测复用样品中存在的两个或更多个靶核酸序列。
本文描述了如图109所示的基于横向流的检测的各种实施方案。在一些实施方案中，辣根过氧化物酶(HRP)(10901)用于增强基于横向流的DETECTRTM测定的检测。在一些实施方案中，将含有靶核酸序列的样品暴露于表面(10900)，可编程核酸酶探针和报告探针固定在所述表面上。在一些实施方案中，报告探针含有HRP分子。在一些实施方案中，在靶标与引导RNA之间的特异性结合事件之后由可编程核酸酶切割报告基因时，报告基因的切割部分被释放到样品溶液(10906)中。在一些实施方案中，然后将样品溶液暴露于横向流测定试纸条(10902)，所述试纸条包括含有过碳酸钠(10904)的样品垫或与所述样品垫相邻，所述样品垫在暴露于水性溶液时产生H2O2。在一些实施方案中，当样品在芯吸作用下通过该区域时发生过碳酸钠再水合以形成H2O2。在一些实施方案中，底物含有DAB、TMB或任何其他足够的底物。在一些实施方案中，“点”从蓝色变为红色，从而表明存在HRP，并且进而表明对靶核酸序列实现了“命中”。在一些实施方案中，在样品溶液(10908)发生颜色变化时，在溶液中实现读出。
此处描述了利用HRP增强的多重DETECTRTM测定(利用横向流测定试纸条进行读出)的各种方法和装置。在一些实施方案中，在图110中示出了HRP信号增强的多重横向流测定。在一些实施方案中，如图107A至图110所描述实现支持介质的固定表面(11000)和横向流测定试纸条(11010)上的检测，另外的是信号转导不通过金纳米颗粒散射光来进行。相反，在一些实施方案中，用抗生物素标记的AuNP被HRP-抗生物素DAB/TMB取代。在一些实施方案中，HRP被横向流测定试纸条中存在的过碳酸钠激活，所述过碳酸钠通过反应液和/或追踪缓冲液再水合。在一些实施方案中，HRP允许实现足够强的信号，以致于不需要诸如PCR的样品扩增。
本文描述了利用Cas13优先于DNA的RNA切割特异性、HRP信号增强和捕获寡核苷酸探针特异性进行多重靶核酸检测的各种实施方案。在一些实施方案中，如图111所示，样品(11100)含有不同的靶核酸。在一些实施方案中，之后使样品(11100)与在一个或多个位置(例如，五个位置D1至D5)处功能化的孔(11101)的表面接触。在一些实施方案中，存在一个或多个位置。在一些实施方案中，Cas13酶存在于可编程核酸酶探针中。在一些实施方案中，Cas13切割RNA但不切割DNA，从而使得能够使用含有具有DNA和RNA链两者的核酸序列的报告基因(11102)。在一些实施方案中，在靶核酸与sgRNA结合之后，Cas13酶切割报告基因的RNA，并且含有RNA的一部分、完整DNA序列和FITC标记的片段被释放到溶液中。在一些实施方案中，在具有不同报告基因的每个位置或点处并行地重复这个动作。在一些实施方案中，在用于五种不同的靶核酸的位置D1至D5处并行地重复这个动作，从而产生五个不同的报告片段。在一些实施方案中，之后使溶液与横向流测定试纸条的样品垫接触，其中样品垫含有HRP-抗-FITC。在一些实施方案中，用FITC标记的报告片段之后与HRP-抗-FITC结合，从而形成复合物(11103)并且在下游穿越检测区域，从而与含有捕获寡核苷酸的检测点特异性结合，所述捕获寡核苷酸被设计为复合物(11103)中的寡核苷酸的互补体。
图112示出了相隔一周执行两次重复操作的DNA酶测定和基于DETECTR的测定两者的结果。
用于信号增强的引导RNA合并
在一些实施方案中，一个或多个可编程核酸酶探针(11300-11302)用于引导物合并以在如图113A所示的横向流测定中实现增强的信号检测。在一些实施方案中，第一可编程核酸酶探针(11300)可包含与靶核酸的第一片段互补的第一sgRNA。在一些实施方案中，第二可编程核酸酶探针(11301)可包含与相同靶核酸的第二片段互补的第二sgRNA。在一些实施方案中，第三可编程核酸酶探针(11302)可包含与相同靶核酸的第三片段互补的第三sgRNA。在一些实施方案中，第一可编程核酸酶探针、第二可编程核酸酶探针和第三可编程核酸酶探针都位于足够接近之处以允许充分切割报告基因，所述报告基因被标记以指示靶核酸的存在。图113B示出了包括样品垫(11303)、测试线(11304)和对照线(11305)的典型的横向流测定试纸条。
本文描述了进行引导物合并以在横向流测定中实现增强的信号检测的各种实施方案。对于如本文所述的一些实施方案，引导物合并显示出增强的Cas12a活性。图114(描述于实施例20)描绘了DETECTRTM测定的结果，与使用单独的gRNA形式的基于DETECTRTMCas12a的测定相比，所述测定使用合并引导物(合并-gRNA)形式显示了对GF184靶标的增强的基于Cas12a的检测。在图114中，标记为“红色”的y轴显示强度单位，并且x轴显示发生了不同DETECTRTM反应的腔室编号。图115(描述于实施例20)描绘了DETECTRTM测定的结果，与使用单独的引导物形式的基于Cas13a的测定相比，所述测定使用合并引导物形式显示了对SC2靶标的基于Cas13a的检测的增强的灵敏度。
图116(描述于实施例20)示出了对应于每个腔室的用于计数阳性液滴的数量的图像，显示与含有单独形式的引导RNA的Cas13a-DETECTRTM测定样品相比，含有合并的引导RNA的Cas13a-DETECTRTM测定样品在每个靶RNA的起始拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体。
图117(描述于实施例20)示出了在扩增之后对信号强度的测量，显示与含有单独形式的引导RNA的Cas13a-DETECTRTM测定样品相比，含有合并的引导RNA的Cas13a-DETECTRTM测定样品在每个靶模板RNA的起始拷贝中产生更大的信号强度。图118(描述于实施例20)示出了在扩增之后对信号强度的测量，显示与含有单独形式的引导RNA的Cas13a-DETECTRTM测定样品相比，含有合并的引导RNA的Cas13a-DETECTRTM测定样品在每个靶模板RNA的起始拷贝中产生更大的信号强度。图118还示出了通过计数阳性液滴的数量执行的相对定量，显示与含有单独形式的引导RNA的Cas13a-DETECTRTM测定样品相比，含有合并的引导RNA的Cas13a-DETECTRTM测定样品在每个靶模板RNA的起始拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体。
图119(描述于实施例20)示出了与含有单独形式的单一引导物R4684、R4667或R4785(RNA酶P引导物)的Cas13a DETECTRTM样品相比，含有合并引导物(R4637、R4638、R4667、R4676、R4684、R4689、R4691)的Cas13a DETECTRTM测定样品在每个靶标的起始拷贝中并未展现出更高的靶标检测灵敏度。
基于DETECTR的复用横向流PON装置
本文描述了如图120所示用于基于可编程核酸酶(例如，DETECTR)测定的多重横向流测定的各种方法和装置。图120描绘了用于执行多重可编程核酸酶(例如，DETECTR)测定的非限制性示例性手持装置。在一些实施方案中，样品含有一个或多个靶核酸序列。在一些实施方案中，将样品引入样品输入端(12001)(本文也称为样品接口)中并且加载到一个或多个区(例如，加热区域或反应腔室12003)中，所述一个或多个区包括一种或多种干燥或冻干的可编程核酸酶试剂(例如，固定到玻璃珠)。在一些实施方案中，样品接口可被配置为如本文所述浓缩、过滤、裂解或以其他方式制备样品。在一些实施方案中，通过负压源(例如，注射器12007)将负压施加到负压端口(12006)，以便对DETECTR区加载样品。在一些实施方案中，样品是裂解样品。在一些实施方案中，多个DETECTR区(12003)沿着蛇形流体路径(12004)彼此联接。在一些实施方案中，如本文所述，流体路径可为螺旋形的。在一些实施方案中，在包括一个或多个DETECTR区(12003)的扩增区域中执行一种或多种靶核酸的扩增。可对扩增区域(12004)进行加热(例如，加热到55℃，持续20分钟或更短时间)以如本文所述对一种或多种靶核酸进行扩增。在一些实施方案中，扩增区域(12004)可包括散布的聚合物。加热可包括液相化学加热、固相化学加热和电加热(包括但不限于电阻加热/焦耳加热、感应加热、珀尔帖热泵等)。在一些实施方案中，装置包括多个横向流试纸条(12005)。在一些实施方案中，将稀释剂引入稀释剂输入端(12002)中。本领域技术人员应当理解，检测区域(例如，横向流测定区域(12005))可包括如本文所述的任何相容的测定或横向流试纸条。
在一些实施方案中，可涂覆扩增区域(12004)。在一些实施方案中，涂层可为亲水涂层、疏水涂层、无机涂层或有机涂层。在一些实施方案中，涂层可包括聚合物涂层。在一些实施方案中，涂层可包括聚乙二醇涂层。在一些实施方案中，涂层可包括链霉亲和素涂层。在一些实施方案中，散布的聚合物可为拥挤剂。在一些实施方案中，拥挤剂可包括聚乙二醇。
在一些实施方案中，一个或多个反应区或加热区可包括固定到表面(例如，设置在DETECTR区内的玻璃珠)的引导核酸(例如，sgRNA)。在一些实施方案中，引导核酸是固定到表面的可编程核酸酶(例如，Cas-复合物)探针的一部分。在一些实施方案中，引导核酸被设计成与样品中的靶核酸特异性结合。在一些实施方案中，存在对应于表面上的不同位置和/或一个或多个区中的不同表面的不同引导核酸，其中每种不同的引导核酸与样品中可能存在或不存在的不同靶核酸序列互补。在一些实施方案中，除了含有引导核酸的可编程核酸酶探针以外，每个表面位置都用具有不同官能团的一个或多个报告基因进行功能化。在一些实施方案中，报告基因可位于足够接近之处以被可编程核酸酶探针切割。在一些实施方案中，如实施例13中所描述，在特定的引导核酸与所述引导核酸被设计成特异性结合的靶核酸之间结合之后，报告基因被切割并且释放到溶液中。在一些实施方案中，报告基因用检测部分(例如，标记)进行功能化。
在一些实施方案中，可使用化学加热。在一些实施方案中，可使用化学加热来供应能量以引发并进行反应。在一些实施方案中，可使用化学加热来供应能量以引发并进行可编程核酸酶测定反应。在一些实施方案中，可使用化学加热来加热反应区或加热区。在一些实施方案中，可使用化学加热来加热装置的区域、腔室、体积、区、表面或片区。
在一些实施方案中，装置可在设置于扩增区域下游的检测区域中包括一个或多个横向流测定试纸条。每个横向流测定试纸条含有一个或多个检测区域或检测点，其中每个检测区域或检测点含有不同类型的捕获抗体。在一些实施方案中，每个横向流测定试纸条含有不同类型的捕获抗体。在一些实施方案中，每种捕获抗体类型与特定标记类型的报告基因特异性结合。在一些实施方案中，第一横向流测定试纸条含有捕获抗体抗-FITC。在一些实施方案中，第一DETECTR区域或表面位置(例如，在反应腔室或加热区域内)含有固定的可编程核酸酶(例如，Cas-复合物)，所述固定的可编程核酸酶包含对第一靶核酸序列具有特异性的引导核酸(例如，sgRNA)。在一些实施方案中，第一DETECTR区域或表面位置另外含有用第一检测部分(例如，FITC)标记的第一固定报告基因。在一些实施方案中，在结合第一靶核酸序列时，第一固定报告基因被切割并且释放到溶液中。在一些实施方案中，第一检测部分被释放到溶液中并且第一报告基因的其余部分保持固定在表面上。可替代地或组合地，在一些实施方案中，第二横向流测定试纸条含有捕获抗体抗-DIG。在一些实施方案中，第二DETECTR区域或表面位置(例如，在反应腔室或加热区域内)含有固定的可编程核酸酶(例如，Cas复合物)，所述固定的可编程核酸酶包含对第二靶核酸序列具有特异性的引导核酸(例如，sgRNA)。在一些实施方案中，第二DETECTR区域或表面位置另外含有用第二检测部分(例如，DIG)标记的第二固定报告基因。因此，在一些实施方案中，在结合第二靶核酸序列时，第二固定报告基因被切割并且释放到溶液中。在一些实施方案中，第二检测部分被释放到溶液中并且第二报告基因的其余部分保持固定在表面上。
在一些实施方案中，将含有第一切割报告基因和第二切割报告基因的溶液从扩增区域转移到包括第一横向流测定试纸条和第二横向流测定试纸条的横向流区域。在一些实施方案中，将追踪缓冲液或稀释剂引入稀释剂输入端中并且将负压施加到负压端口以使含有第一切割报告基因和第二切割报告基因的溶液与横向流区域的横向流测定试纸条接触，其中报告基因与缀合分子(例如，抗生物素-AuNP)结合。在一些实施方案中，具有用第一检测部分(例如，FITC)标记的第一报告基因的AuNP-报告基因缀合物将与第一横向流测定试纸条上含有第一捕获抗体(例如，抗-FITC)的第一检测区域或检测点选择性地结合，从而表明样品中存在第一靶核酸序列。在一些实施方案中，主要具有用第二检测部分(例如，DIG)标记的第二报告基因的AuNP-报告基因缀合物将与第二横向流测定试纸条上含有第二捕获抗体(例如，抗DIG)的第二检测区域或检测点选择性地结合，从而表明样品中存在第二靶核酸序列。以此方式，对于一些实施方案，能够并行检测复用样品中存在的两个或更多个靶核酸序列。
在一些实施方案中，扩增区域被配置为容纳约200μL的液体(例如，样品溶液和一种或多种试剂)。在一些实施方案中，每个横向流测定试纸条被配置为容纳约80μL的液体(例如，样品溶液和/或追踪缓冲液)。在一些实施方案中，装置可包括多于一个横向流测定试纸条。例如，所述装置可包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个横向流测定试纸条。在一些实施方案中，代替靶序列或除了靶序列以外，一个或多个横向流测定试纸条被配置为检测对照序列。例如，包括六个横向流测定试纸条的装置可包括被配置为检测一个或多个靶序列(例如，五个不同的靶序列)的五个横向流测定试纸条和被配置为检测对照序列的一个横向流测定试纸条。
本文描述了如图121A至图121B所示用于基于可编程核酸酶测定的多重横向流测定的各种方法和装置。图121A至图121B示出了用于并行检测两个或更多个靶核酸序列的即时需求装置的非限制性实例。在一些实施方案中，样品含有一个或多个靶核酸序列。在一些实施方案中，将样品引入样品输入腔室(12101)(本文也称为样品接口)中。样品输入腔室(12101)可被配置为接收包含样品的拭子。在一些实施方案中，样品输入腔室(12101)可包括溶液/缓冲液(例如，裂解缓冲液)以从拭子中取回样品。在一些实施方案中，样品接口可被配置为如本文所述浓缩、过滤、裂解或以其他方式制备样品。在一些实施方案中，将正压施加到样品输入腔室(12101)以使样品溶液从样品输入腔室(12101)移动到反应腔室(12108)(例如，在加热区域内)，所述反应腔室含有如本文所述的一种或多种干燥或冻干的可编程核酸酶(例如，DETECTR)试剂(12109)(例如，固定到玻璃珠)。在一些实施方案中，可通过正压源(例如，压缩气体罐12103)施加正压，以便对反应腔室加载样品溶液。在一些实施方案中，通过联接到正压源(12103)的压力阀(12104)调节压力。在一些实施方案中，正压的施加(例如，通过操作致动器以刺穿包括压缩气体罐的正压源12103)使样品溶液和一种或多种干燥或冻干的试剂(12109)移动到反应腔室(12108)的蛇形扩增区域中。在一些实施方案中，如本文所述，扩增区域可为螺旋形的。在一些实施方案中，在扩增区域(12108)中执行一种或多种靶核酸的扩增。可对扩增区域(12108)进行加热(例如，加热到55℃，持续20分钟或更短时间)以如本文所述对一种或多种靶核酸进行扩增。在一些实施方案中，施加足够的正压打开在扩增区域与检测区域(例如，横向流测定区域(12106))之间的压力阀(12105)。在一些实施方案中，扩增区域(12108)与包括横向流试纸条(12107)的横向流测定区域(12106)之间的阀(12105)可通过按下连接到阀(12105)的按钮来打开。加热可包括液相化学加热、固相化学加热和电加热(包括但不限于电阻加热/焦耳加热、感应加热、珀尔帖热泵等)。在一些实施方案中，稀释剂或追踪缓冲液可经由稀释剂输入端(12102)引入所述系统。在一些实施方案中，打开扩增区域(12108)与横向流测定区域(12106)之间的阀(12105)将样品从扩增区域(12108)转移到横向流测定区域(12106)。在一些实施方案中，在样品从扩增区域(12108)移动到横向流测定区域(12106)时，样品与稀释剂混合。在一些实施方案中，追踪缓冲液将样品从扩增区域(12108)推到横向流测定区域(12106)，而不会显著地稀释样品。
在一些实施方案中，一种或多种可编程核酸酶试剂包含固定到表面(例如，玻璃珠)的引导核酸。在一些实施方案中，引导核酸是固定到表面的可编程核酸酶(例如，Cas-复合物)探针的一部分。在一些实施方案中，引导核酸可被设计成与样品中的靶核酸特异性结合。在一些实施方案中，存在对应于表面上的不同位置和/或一个或多个区中的不同表面的不同引导核酸，其中每种不同的引导核酸与样品中可能存在或不存在的不同靶核酸序列互补。在一些实施方案中，除了含有引导核酸的可编程核酸酶探针以外，每个表面位置都可用具有不同官能团的一个或多个报告基因进行功能化。在一些实施方案中，报告基因位于足够接近之处以被可编程核酸酶探针切割。在一些实施方案中，如实施例13中所描述，在特定sgRNA与引导核酸被设计成特异性结合的靶核酸之间结合之后，报告基因被切割并且释放到溶液中。在一些实施方案中，报告基因用检测部分(例如，标记)进行功能化。
在一些实施方案中，装置可在设置于扩增区域下游的检测区域中包括一个或多个横向流测定试纸条。每个横向流测定试纸条含有一个或多个检测区域或检测点，其中每个检测区域或检测点含有不同类型的捕获抗体。在一些实施方案中，每个横向流测定试纸条可含有不同类型的捕获抗体。在一些实施方案中，每种捕获抗体类型与特定标记类型的报告基因特异性结合。在一些实施方案中，第一横向流测定试纸条含有第一捕获抗体(例如，抗-FITC)。在一些实施方案中，第一表面(例如，珠粒)含有固定的可编程核酸酶(例如，Cas-复合物)，所述固定的可编程核酸酶包含对第一靶核酸序列具有特异性的引导核酸(例如，sgRNA)。在一些实施方案中，第一表面另外含有用第一检测部分(例如，FITC)标记的第一固定报告基因。在一些实施方案中，在结合第一靶核酸序列时，第一固定报告基因被切割并且释放到如本文所述的溶液中。可替代地或组合地，在一些实施方案中，第二横向流测定试纸条含有第二捕获抗体(例如，抗-DIG)。在一些实施方案中，第二表面(例如，珠粒)含有第二固定可编程核酸酶，所述第二固定可编程核酸酶包含对第二靶核酸序列具有特异性的引导核酸。在一些实施方案中，第二表面另外含有用第二检测部分(例如，DIG)标记的第二固定报告基因。因此，在一些实施方案中，在结合第二靶核酸序列时，第二固定报告基因被切割并且释放到溶液中。
在一些实施方案中，将含有第一切割报告基因和第二切割报告基因的溶液从扩增区域转移到包括第一横向流测定试纸条和第二横向流测定试纸条的横向流区域。在一些实施方案中，将追踪缓冲液或稀释剂引入稀释剂输入端或储存器中，并且将负压施加到负压端口以接触横向流区域。压力阀可设置在扩增区域与横向流区域之间，以便在进行扩增之前调节样品溶液从扩增区域到横向流区域的流动。压力阀的致动使得含有第一切割报告基因和第二切割报告基因的溶液能够接触横向流区域的横向流测定试纸条，其中报告基因与缀合分子(例如，抗生物素-AuNP)结合。在一些实施方案中，具有用第一检测部分(例如，FITC)标记的第一报告基因的AuNP-报告基因缀合物将与第一横向流测定试纸条上含有第一捕获抗体(例如，抗-FITC)的第一检测区域或检测点选择性地结合，从而表明样品中存在第一靶核酸序列。在一些实施方案中，主要具有用第二检测部分(例如，DIG)标记的第二报告基因的AuNP-报告基因缀合物将与第二横向流测定试纸条上含有第二捕获抗体(例如，抗DIG)的第二检测区域或检测点选择性地结合，从而表明样品中存在第二靶核酸序列。以此方式，对于一些实施方案，能够并行检测复用样品中存在的两个或更多个靶核酸序列。
在一些实施方案中，扩增区域被配置为容纳约200μL的液体(例如，样品溶液和一种或多种试剂)。在一些实施方案中，每个横向流测定试纸条被配置为容纳约80μL的液体(例如，样品溶液和/或追踪缓冲液)。在一些实施方案中，装置可包括多于一个横向流测定试纸条。例如，所述装置可包括两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个横向流测定试纸条。在一些实施方案中，代替靶序列或除了靶序列以外，一个或多个横向流测定试纸条被配置为检测对照序列。例如，包括六个横向流测定试纸条的装置可包括被配置为检测一个或多个靶序列(例如，五个不同的靶序列)的五个横向流测定试纸条和被配置为检测对照序列的一个横向流测定试纸条。
本文描述了如图122所示用于基于DETECTR测定的多重横向流测定的各种方法和装置。图122示出了即时需求装置的实施方案，所述即时需求装置包括与图120的实施方案基本上相似的横向流测定，但代替负压，利用正压来驱动流体流。在一些实施方案中，装置可包括接收样品的输入端口(12201)。在一些实施方案中，输入端口可被配置为与容纳样品(例如，容纳样品溶液和/或设置在其中的拭子)的鲁尔锁注射器对接。在一些实施方案中，输入端口(12201)可包括球形止回阀(12202)，所述球形止回阀被配置为密封输入端口(12201)直到接收到样品为止。在一些实施方案中，装置可包括冻干试剂(12203)。在一些实施方案中，冻干试剂(12203)可在接收到样品之前储存在密封的样品接口腔室中。在一些实施方案中，装置可包括疏水过滤器(12204和12207)，所述疏水过滤器可透过气体并且被配置为准许液体移动通过所述装置并有助于从中释放驱替气体。在一些实施方案中，装置可包括蛇形通道区域(12205)。在一些实施方案中，蛇形通道区域(12205)被加热。在一些实施方案中，蛇形通道区域(12205)可包括在加热区域内的一个或多个反应区(12206)。在一些实施方案中，反应区(12206)可被配置为执行一个或多个DETECTR测定。在一些实施方案中，反应区(12206)包括扩增酶或试剂。在一些实施方案中，冻干试剂(12203)包含一种或多种扩增酶或试剂，所述扩增酶或试剂在将样品引入样品接口中时复溶并且在复溶之后可连同样品一起转移到反应腔室中。在一些实施方案中，样品接口可被配置为如本文所述浓缩、过滤、裂解或以其他方式制备样品。在一些实施方案中，反应区(12206)包括在存在化学品时改变颜色的视觉测定。在一些实施方案中，蛇形通道区域(12205)是核酸扩增区域。可替代地或组合地，蛇形通道区域可被配置为执行一种或多种基于可编程核酸酶的检测测定。在一些实施方案中，阀可将检测区域(12209)与加热区域(12205)分开。在一些实施方案中，装置可包括压力致裂阀(12208)，所述压力致裂阀在足够的正压下破裂并且一旦破裂就使得流体在两个区域之间移动(并且相反地，在进行正压施加之前防止区域之间的流体移动)。在一些实施方案中，可经由输入端口(12201)将稀释剂或追踪缓冲液注入所述装置中，以破坏压力致裂阀(12208)并且将样品流体从加热/反应区域12205转移到检测区域12209。在一些实施方案中，装置可在输入端口(12201)处接收正气压。在一些实施方案中，使压力致裂阀(12208)破裂允许液体从蛇形通道区域(12205)流向横向流测定区域(12209)。
本文描述了如图123所示用于手持式测定装置的各种方法和装置。图123示出了手持式测定装置的实施方案，所述手持式测定装置包括输入端口(12302)、螺旋形通道加热或反应区域(12303)、第一致动器(12301)、第二致动器(12304)和横向流测定区域(12305)。在一些实施方案中，核酸样品如本文所述在输入端口(12302)处递送，并且所述样品流过螺旋形通道区域(12303)。在一些实施方案中，样品接口12302可被配置为在转移到反应区域12303中之前如本文所述浓缩、过滤或以其他方式制备样品。在一些实施方案中，第一致动器(12301)储存机械能。在一些实施方案中，所储存的机械能被储存为加压气体。在一些实施方案中，所储存的机械能储存在压缩弹簧中。在一些实施方案中，致动第一致动器(12301)释放所储存的机械能。在一些实施方案中，释放所储存的机械能推动流体从样品接口12302通过螺旋形通道区域(12303)。在一些实施方案中，释放所储存的机械能将流体拉过螺旋形通道区域(12303)。在一些实施方案中，螺旋形通道区域可包括扩增酶和试剂。在一些实施方案中，样品接口可包括扩增酶和试剂，所述扩增酶和试剂可与如本文所述的样品一起转移到螺旋形通道区域中。在一些实施方案中，核酸样品如本文所述在螺旋形通道区域(12303)中进行扩增。在一些实施方案中，螺旋形通道区域被加热。在一些实施方案中，第二致动器(12304)储存机械能。在一些实施方案中，所储存的机械能被储存为加压气体。在一些实施方案中，致动第二致动器(12304)释放所储存的机械能。在一些实施方案中，释放所储存的机械能推动样品通过检测(例如，横向流测定)区域(12305)。在一些实施方案中，释放所储存的机械能将样品拉过横向流测定区域(12305)。检测区域可包括如本文所述的一个或多个横向流测定试纸条。
本文描述了如图124所示用于手持式测定装置的各种方法和装置。图124示出了可被配置为例如结合图123中描述的流体流动方案一起使用的手持式测定装置试验电路板的实施方案，所述手持式测定装置试验电路板包括致动器触发器(12404、12405)、致动器(12403)、加热板(12401)或压板(12402)。在一些实施方案中，手持式测定装置可包括单次使用的一次性测定部件。在一些实施方案中，手持式测定装置可包括容纳单次使用的一次性测定部件(例如，盒)的可重复使用的硬件框架。在一些实施方案中，单次使用的一次性测定部件由压板(12402)保持。在一些实施方案中，一次性测定部件包括如本文所述的储存机械能的致动器。在一些实施方案中，致动器由致动器触发器(12404、12405)致动。在一些实施方案中，一次性测定部件由加热板(12401)加热。在一些实施方案中，包括触发器、致动器、加热板、压板和流体部件(包括横向流测定试纸条等)的整个装置在单个一次性单元中(例如，在壳体内)联接在一起。
图125示出了手持式测定装置的流体通道(12501)的实施方案。本文所述的任何装置可包括如图所示的螺旋形流体通道(例如，加热区域或反应区域可包括螺旋形流体通道)。在一些实施方案中，流体通道(12501)的形状基本上是螺旋形的。在一些实施方案中，流体通道(12501)联接到端口(12502)。在一些实施方案中，端口(12502)是输入样品接收器。在一些实施方案中，端口(12502)是输入压力接收器。在一些实施方案中，端口(12502)是输入稀释剂接收器。在一些实施方案中，流体通道(12501)可包括酶或试剂。在一些实施方案中，流体通道(12501)是扩增区域。在一些实施方案中，流体通道(12501)被加热。在一些实施方案中，流体通道(12501)可包括如本文所述的一种或多种DETECTR测定试剂。
图126示出了可在本文所述的任何装置中实现的手持式测定装置的横向流测定区域的实施方案。在一些实施方案中，通向每个横向流试纸条的路径长度是基本上相等的流体路径长度(12601)，以便确保通道之间基本上相等的流体阻力，以实现从反应区域到横向流测定检测区域的横向流测定试纸条的基本上相等的流体转移。流体路径长度被定义为流体从通道的一端移动到通道的另一端所占用的路径长度。
图127A至图127B示出了图124的试验电路板装置与图123的流体装置一起发挥作用。在图127A中，基于弹簧的致动器12703被加载并且盒已准备好将样品添加到样品接口中。在图127B中，基于弹簧的致动器被部分释放并且样品已经从样品接口被拉入螺旋形反应区域中。弹簧被配置为在扩增和/或基于可编程核酸酶的检测反应期间保持在这个位置。
图128A描绘了设置在图123的装置上以进行概念验证测试的化学加热袋。在一些实施方案中，化学加热袋含有包含乙酸钠的溶液和金属按钮，其中按下金属按钮启动放热的结晶反应。一次性用品的样品腔室(12801)被暴露以允许进行样品添加。一次性用品的样品腔室嵌套在加热袋(12802和12803)之间。嵌套在两个袋之间的温度探针(12804)用于测量外部温度。第二温度探针(12805)用于测量样品腔室内部的流体温度。图128B描绘了随时间变化在化学加热袋(12806)处测量以及在第二温度探针(12807)处测量的温度。袋的温度比流体温度高几度。在一些实施方案中，流体的温度大约维持53℃的温度，持续约35分钟。在一些实施方案中，流体的温度大约维持55℃的温度，持续约30分钟。
图129A至图129B示出了横向流测定区域的另外的示例性实施方案。在一些实施方案中，来自加热腔室的样品流体可通过例如由注射器真空产生的抽吸而转移到横向流测定区域。在一些实施方案中，横向流测定试纸条可被排列成如图129A所示的成列的几何形状。在一些实施方案中，横向流测定试纸条可被排列成如图129B所示的径向的几何形状。在一些实施方案中，横向流测定试纸条可被排列成如图126所示的平行的几何形状。在一些实施方案中，横向流试纸条可用于捕获如本文所述的由可编程核酸酶介导的报告基因切割。
图130描绘了用于测试DETECTR反应的试验电路板装置的实施方案。试验电路板保持3D打印用一次性芯片与反应腔室和横向流试纸条。这个实施方案与通过化学和电加热测试DETECTR反应是相容的。在一些实施方案中，装置可包括流体驱动器(13001)。在一些实施方案中，装置可包括化学加热元件(13002)。在一些实施方案中，化学加热元件(13002)可包括含有乙酸钠溶液和金属盘的袋，其中压下金属盘触发乙酸钠溶液中的结晶。在一些实施方案中，加热腔室的温度上升到至少约50℃到至少约60℃。在一些实施方案中，装置可包括聚酰胺电阻加热器。在一些实施方案中，加热腔室的温度上升到至少约54℃到至少约56℃。在一些实施方案中，装置可包括夹具(13003)。在一些实施方案中，装置可包括横向流试纸条(13004)。在一些实施方案中，装置可包括电加热元件(13005)。在一些实施方案中，装置可包括聚酰胺电阻加热器。
本文描述了如图131A至图131B所示用于手持式测定装置的各种方法和装置。在图131A中，DETECTR分析证实了对使用电加热的手持装置的实施方案执行的双重测定的成功扩增。使用HeLa RNA的2000个拷贝和合成SARS-CoV-2RNA的20,000个拷贝来组装2重RT-LAMP测定。该实验在62℃的测定温度下执行30分钟。从芯片中回收扩增产物，并且使用Tecan板读取器执行DETECTR测定以收集结果。将一部分未扩增的主混合物加上样品储存在冰上，并且用作DETECTR反应的阴性对照。所得的DETECTR曲线证实在使用电加热的螺旋形试验电路板装置上进行了稳健的扩增。在图131B中，DETECTR分析证实了在使用化学加热的手持装置的实施方案上的双重测定的成功扩增。使用HeLa RNA的2000个拷贝和合成SARS-CoV-2RNA的20,000个拷贝来组装2重RT-LAMP测定。该实验在55℃的测定温度下执行60分钟。从芯片中回收扩增产物，并且使用Tecan板读取器执行DETECTRTM测定以收集结果。将一部分未扩增的主混合物加上样品储存在冰上，并且用作DETECTR反应的阴性对照。所得的DETECTR曲线证实在使用化学加热的螺旋形试验电路板装置上进行了稳健的扩增。
图132描绘了DETECTR反应，其中在图130的具有一次性芯片的与图122所示的装置的类似的实验电路板装置上执行横向流读出。对一次性芯片加载200μL含有经过RT-LAMP扩增的SARS-CoV-2N-基因的DETECTR主混合物。使用电加热器将一次性芯片在试验电路板装置上温育20分钟。将“追踪”缓冲液施加到样品输入端口，以稀释DETECTR反应液并且将所述反应液移动到横向流试纸条上。在对结果照相之前，允许试纸条吸收DETECTR反应液，持续四分钟。在所述装置上温育之前移除反应液的一部分并且将所述部分用作“脱离装置”的阴性对照。对于测试，使用Milenia HybridDetect横向流试纸条，对于所述横向流试纸条，将对照条置于较低位置(13201)并且将SARS-CoV-2N-基因条置于对照的远侧(13202)。
本文公开了用于优化诊断应用的蛋白质和制剂的方法。用于CRISPR诊断的理想的Cas蛋白是一种快速、强劲且敏感的蛋白。快速蛋白质能够减少诊断测定的周转时间。当诸如在一锅DETECTR测定中与其他分子过程结合时，强劲的酶更有可能取得成功。敏感的酶在少量扩增产物下或在取消预扩增并直接检测靶核酸时实现了较低的检测限。图133示出了用于评估、表征和优化诊断应用的蛋白质的过程的流程图。可基于热稳定性、与各种测定缓冲液的相容性和敏感性而评估蛋白质。图134展示了示出使用Labcyte Echo的过程的工作流的示意图。与手动或半自动化设置相比，使用Labcyte echo实现了快4.5倍的酶评估和表征。
可编程核酸酶系统(例如，Cas蛋白和引导核酸的组合)的初始优化涉及对候选系统在各种缓冲液中以及在35℃至60℃的温度下的性能进行筛选。被选择用于筛选的缓冲液包括用于DETECTR测定中的缓冲液和其他Cas活性缓冲液。缓冲液可包括一系列的盐类型、盐浓度、抗衡离子类型和对聚合酶性能很重要的各种添加剂。
图135示出了三个候选Cas酶试验的结果。Cas酶的反式切割测定的结果例示了观察到的酶性能之间的差异。例如，CasM.1382在Cas缓冲液#2中表现强劲，而在Amp缓冲液#1中几乎没有活性。在Mg+2含量较高的Cas缓冲液#3中，在无靶标对照中观察到了升高的背景信号。CasM.1346在各种缓冲液中都显示出强劲的表现。来自这个酶的动力学曲线表明它快速且敏感，这导致在多个温度下出现了大幅初始信号增加，但所述酶会迅速变性并且在超过40℃的温度下没有表现出持续的活性。与CasM.1346相比，CasM.1740显示出较慢的活性。CasM.1740在高达50℃的温度下显示出强劲且持续的活性，而在55℃下却并非如此，这表明CasM.1740是热稳定Cas蛋白，并且可与用于直接检测的各种测定设计相容或在与其他信号放大过程结合时是相容的。
图136示出了三种候选Cas酶在不同温度和缓冲液下的性能。
图137示出了在存在三种另外的缓冲液的情况下在35℃下用CasM.1740进行的测试的结果。CasM.1740在一些聚合酶缓冲液和许多酶活性缓冲液中具有强劲的活性。结果显示，酶的性能可通过使用某些缓冲液来优化或增强。
图138一些系统尽管能起作用但不具有稳健的检测限，诸如CasM.1714。一些系统的表现类似于或可能优于对照系统CasM.26。
图139示出了评估在35℃和证明蛋白质对CasM.1740起作用所处的最高温度下的检测限的实验的结果。在35℃和50℃下，酶的性能与检测5pM靶标的能力相似。
图140示出了研究添加剂和测定制剂对蛋白质性能的影响的实验的结果。添加剂包括用于冻干的添加剂(例如，海藻糖)、用于稳定蛋白质性能的添加剂(例如，BSA)以及用于减少含水量和拥挤反应的添加剂(例如，PEG)。测定制剂包括用于一锅DETECTR和两锅DETECTR反应中的缓冲液、酶、引物和dNTP浓缩物。在一些情况下，添加剂具有很小或没有影响(例如，CasM.1382和CasM.1698)，并且在一些情况下，添加剂增强酶的性能(例如，CasM.1434)。一些酶或多或少地耐受测定制剂。例如，CasM.1698在两锅DETECTR测定制剂中表现良好，而在一锅DETECTR测定制剂中活性降低。相比之下，CasM.1382在不使用添加剂时显示出与CasM.1698相似的性能，而在一锅DETECTR测定制剂中几乎完全被抑制。这表明CasM.1382在一系列测定条件下可能更加稳健。
图141、图142和图143示出了研究Cas蛋白对单核苷酸突变的敏感性的实验的结果。对突变具有高敏感性的蛋白质可能可用于基因分型应用，诸如检测病毒株或疾病等位基因的体细胞基因分型。同时，对突变具有低敏感性的蛋白质可能可用于稳健检测最重要的测定。为了评估每种蛋白质的单核苷酸突变敏感性，合成了一系列合成dsDNA靶分子，所述靶分子在沿着靶位点和PAM区域中的每个位置处含有所有4种潜在突变。如先前所确定的，在最佳条件下筛选每种蛋白质。对于对单核苷酸突变具有强敏感性的蛋白质，仅针对与gRNA中的核苷酸匹配的核苷酸在DETECTR测定中观察到了高信号。对于对单核苷酸突变具有低敏感性的蛋白质，针对一种或多种核苷酸在DETECTR测定中观察到了高信号，而不管核苷酸是否与gRNA中的核苷酸匹配。图141示出了针对CasM.124070的结果，所述结果显示出强的单核苷酸突变敏感性。图142示出了针对CasM.08的结果，所述结果显示敏感性取决于靶位点。图143示出了针对具有相同靶位点的CasM.124070和CasM.08的结果，所述结果显示不同蛋白质对相同靶位点具有不同敏感性。
图144A至图144B制备RNP复合物并且在系统的最佳温度下与靶DNA或RNA温育30分钟。将各种浓度的淬灭荧光报告基因添加到所述系统，并且使用板读取器来测量随时间变化的荧光。在各个机器和温度上针对每种蛋白质将结果归一化。分析每个系统的Michaelis-Menten动力学。结果显示，在Cas效应子之间存在催化效率的显著差异。结果表明，具有最高催化效率的系统倾向于具有最低检测限。
图145总结了各种Cas酶的性能结果。
如本文所用的术语“样品接口”、“样品输入端”、“输入端口”、“输入端”、“端口”通常是指装置的被配置为接收样品的一部分。
如本文所用的术语“加热区域”、“受热区域”、“加热腔室”、“加热体积”、“加热区”、“加热表面”、“加热片区”等通常是指装置的与加热单元热连通的一部分。
如本文所用的术语“加热器”、“加热单元”、“加热元件”、“热源”等通常是指被配置为产生热量并与装置的一部分热连通的元件。
如本文所用的术语“试剂混合物”、“试剂主混合物”、“试剂”等通常是指包含参与配制试剂混合物所针对的反应的一种或多种化学品的制剂。
如本文所用的术语“非循环温度曲线”通常是指循环的或正弦的温度曲线，因为所述温度曲线具有初始温度、目标温度和最终温度。
如本文所用的术语“捕获探针”、“捕获分子”等通常是指与靶分子选择性地结合，而与可被洗掉的其他分子仅非特异性结合的分子。
如本文所用的术语“收集管”通常是指用于收集样品并将样品递送到装置的样品接口的隔室。在一些实施方案中，收集管可为便携式的。在一些实施方案中，收集管是注射器。
实施例
给出以下实施例是为了说明本发明的各种实施方案，而不意味着以任何方式限制本发明。目前的实施例连同本文所述的方法目前代表优选实施方案，是示例性的，而不意图限制本发明的范围。本领域技术人员将想到其中的变化以及由所附权利要求的范围限定的本发明的精神范围内所涵盖的其他用途。
实施例1：使用DETECTR反应对HERC2基因进行电化学检测
DETECTR先前已被证明是用于检测诸如SARS-CoV-2的病原体的强大技术(Broughton等人，2020)。已证明电化学检测显示出比基于荧光的测定低大约两个数量级的检测限(Lou等人，2015)。在此实施例中，电化学探针被集成到DETECTR测定中。
使用以下电化学探针：5’-2XXTTATTXX–3’；其中2＝5’6-FAM；X＝二茂铁dT并且3＝3’生物素TEG。另外，使用DropSensμSTAT通过探针来进行循环伏安法和方波伏安法两者。使用ECL仪器和DropSens丝网印刷碳电极。观察DETECTR反应的初始时间点与最终时间点之间的信号差异。实现了对50fM.HERC2靶标的检测，这远低于在荧光测定下已经观察到的浓度。图13：呈现了用电化学报告基因进行的HERC2 DETECTR反应的氧化曲线。误差条表示同一解决方案的两次测量的标准偏差，每次测量使用三条迹线。观察到40nA的信号差异，从而表明存在50fM的HERC2靶标。图14：呈现了用电化学报告基因进行的HERC2 DETECTR反应的还原曲线。误差条表示同一解决方案的两次测量的标准偏差，每次测量使用三条迹线。30nA的信号差异表明在反应33分钟之后存在50nM的HERC2。图15：呈现了使用24μM电化学报告基因在HERC2DETECTR反应前后取得的所得的循环伏安图。每条迹线是同一解决方案的三次扫描的平均值，并且误差条表示标准偏差，并且两个伏安图之间的可辨别的差异表明存在24μM的报告基因。
实施例2：SARS-CoV-2电化学DETECTR反应
对作为SARS-CoV-2基因组的一部分的DNA序列使用以下电化学探针：5’-2XXTTATTXX–3’；其中2＝5’6-FAM；X＝二茂铁dT；并且3＝3’生物素TEG。使用DropSensμSTATECL仪器和DropSens丝网印刷碳电极执行方波伏安法测量。使用500fM的靶标，在DETECTR反应的初始时间点与最终时间点之间检测到了信号差异。图16呈现了用电化学报告基因进行的SARS-CoV-2DETECTR反应的氧化曲线。误差条表示来自每次测量的三条迹线的标准偏差。详细的实验条件如下。根据图18制备DETECTR混合物。使用稀释的储备报告基因1/10(1μL报告基因加上9μL不含核酸酶的水)来制得240μM储备液。在37℃下将DETECTR主混合物温育30分钟并添加报告基因之后，将反应混合物分成具有152μL主混合物加上8μL靶标(1X TE或10pM储备液浓度基因片段)的两份等分试样。最终靶标浓度为500fM。在t＝0处移除用于测量的55μL等分试样，然后在电化学测量之前将其余部分在37℃下在加热块上温育20分钟。使用具有根据图19的参数的方波伏安法。每次测量使用一滴50μL的溶液。在使用之前，用1mL的1X TE漂洗每个电极并且用压缩空气干燥。
如下进行数据分析。丢弃前2次扫描，因为它们通常具有来自电极上的因电压施加而清除的碎片的异常信号。针对每个样品对其余3次扫描求平均值，并且计算标准偏差和方差系数。然后将平均电流迹线导入PeakFit软件中以进行基线校正。之后导出校正后的迹线，并且使用原始CV值来计算误差的标准偏差。应当注意，所使用的报告基因的等分试样经历了多次冷冻-解冻循环。来自用原始参数集进行的测量的数据有噪声，并且没有进行充分分析。这个峰值的位置与先前的实验不同，其中在0.15V附近观察到峰值。值得注意的是，报告基因的等分试样经历了多次冷冻-解冻循环，因此它可能已经降解。作为对照，还将流入用于确定相对信号的LAMP缓冲液。在先前的实验中，LAMP缓冲液已经用镁激活，然后重新冷冻。无添加地流入LAMP缓冲液，而不存在任何稀释。来自LAMP缓冲液的信号远高于来自DETECTR反应的信号，如可见于图17中。还发现来自阴性对照的在t＝0处的信号高于来自其他DETECTR反应的信号。然而，这次测量是在用原始参数进行第一次测量之后对该样品和电极进行的第二次测量。总之，SARS-CoV-2电化学DETECTR实现了针对SARS-CoV-2病毒的可检测的结果。
实施例3：评估经生物素修饰的gRNA对Cas13的功能
本实验的目的是评估生物素化的gRNA在溶液中和固定在表面上时对Cas13a的功能。在此实验中，进行了经生物素修饰的gRNA(mod023)的三次重复操作和未经生物素修饰的gRNA(R0003)的三次重复操作。对mod023报告基因和R0003对照进行了三次重复的“无靶标对照”或NTC操作。该程序如下进行：
(1)将gRNA稀释至20uM。
(2)制备使用gRNA的Cas12M08复合反应。将测试和对照复合物稀释至100pM最终浓度。在两种条件下进行复合反应，各自重复3次，从而针对每种gRNA产生6个反应。关于复合混合物细节请参见图16。
(3)将样品在37℃下温育30分钟。
(4)添加报告基因底物。
(5)将反应保持在冰上直至下一个步骤。
(6)将13uL的1X MBuffer 1添加到384孔板上的孔中。
(7)添加5μL的复合反应液。
(8)在扩增后罩壳中，将2uL的1nM靶标(分别)转移到冰上的384孔板并且保持在其中。
(9)用光学透明的密封件将板密封。
(10)以2000rcf减速旋转30秒。
(11)在37℃下在具有扩展增益设置的板读取器上读取30分钟。
图32A和图32B分别示出了在溶液中的mod023(经生物素修饰的报告基因)和R003(未经生物素修饰的报告基因)的结果。结果显示，经生物素修饰的gRNA在溶液中具有与未经生物素修饰的gRNA相似的性能。图32C示出了用生物素修饰并固定到表面的gRNA的结果。图32D示出了未用生物素修饰但以与C相同的方式沉积在表面上的gRNA的结果。图32E类似于图32A和图32B示出了未经修饰且在溶液中的gRNA的结果。这些结果一起显示，通过生物素修饰和表面固定化，维持了功能，并且DETECTR测定性能没有受到不利影响。
实施例4：优化链霉亲和素载片上的报告基因温育时间
本实验的目的是验证30分钟温育时间是否足以产生强信号测定信号。以两个浓度进行测定。使用的程序如下：
1.在1x洗涤缓冲液中制备处于1uM和5uM的REP072 rep106稀释液。1X洗涤缓冲液由25mM Tris、150mM NaCl；pH 7.2；0.1％ BSA和0.05％
Figure BDA0004036779040001701
洗涤剂构成。
2.使用疏水笔如图33以及图34A和图34B所示对新鲜链霉亲和素载片的孔进行标记。
3.将3uL各自的稀释液点样在经链霉亲和素涂覆的载片上(一式三份)。
4.将载片在室温下温育30分钟并且对所述载片进行避光性覆盖。
5.从每个点中取出3uL的稀释液。
6.对每个点添加5uL的1X洗涤缓冲液，并且上下混合3次。将这个洗涤步骤重复三次。
7.添加50μL的1X洗涤缓冲液并且温育5分钟。
8.然后在kim wipe上轻拍载片以移除所有溶液，之后抵靠着kim wipe轻轻地拍打所有四侧以清理边缘。
9.然后在GelDoc上对载片进行成像(SYBR Blue设置，在调整后的增益设置下自动曝光)。
图33示出了测试报告基因Rep072和阴性对照Rep106的结果。Rep072在5μM下的重复显示出最强的信号，并且Rep072在1μM浓度下的三次重复显示出接下来的最强的信号。对于5μM和1μM浓度两者，阴性对照报告基因rep106都显示出相同的低信号(或根本无信号)。这个结果显示了FAM-生物素化的报告基因在5μM和1μM两个浓度下经过30分钟温育时间的特异性结合。图34A至图34B示出了类似的结果，其中报告基因在图34A中处于5mM并且在图34B中处于2.5mM。图34A和图34B的顶排示出了展现出明亮荧光的点，并且图34A和图34B的底排示出了展现出类似低荧光的点。
实施例5：用于固定化的基于淬灭剂的报告基因测试
在固定的DETECTR测定中测试基于荧光淬灭剂的报告基因。使用用链霉亲和素功能化的板和经生物素标记的报告基因。图36示出了本实验中使用的报告基因的序列和其他细节。使用了以下程序：
1.制备报告基因rep072、rep104、rep105、rep117、rep118的储备液以与板读取器结合。报告基因结合细节可见于图37A中。
2.然后使用mod018序列制备复合反应，所述mod018序列用生物素TEG进行5’修饰。有关序列mod018的更多细节请参见图36。复合混合物细节可见于图37B中。
3.将复合反应在37℃下温育30分钟。
4.以(50:50比率)制备RNP和报告基因的稀释液的载网，各自存在足够的材料以进行2次反应。
5.用100μL的1X MBuffer1将96孔经链霉亲和素涂覆的板的孔预漂洗两次。
6.然后添加25μL的复合物和25μL报告基因混合物。
7.用箔密封件将板密封。
8.然后在间歇振荡(在Thermomixer上每2分钟以1000rpm振荡15秒)下在25℃下使结合进行30分钟。
9.然后使板短暂地减速旋转。
10.移除上清液。
11.用100μL 1X MBuffer-1洗涤一次。1X MBuffer-1由20mM咪唑7.5、25mM KCl、5mM MgCl2、10μg/mL BSA、0.01％ Igepal Ca-630和5％甘油构成。
12.用100μL 1X MBuffer-3洗涤一次。1X MBuffer-3由20mM HEPES pH 7.5、2mMKOAc、5mM MgOAc、1％甘油和0.00016％Triton-X 100构成。
13.将50μl的1X MBuffer3添加到每个孔。
14.将5μL的靶标/不将靶标添加到1X MBuffer3中，靶标体积＝每个反应5μL(GF577 PCR产物1:10)。
15.用箔密封件将板密封。
16.在间歇振荡下在测量FAM强度的板读取器中在37℃下温育90分钟。
17.短暂地减速旋转。
18.将20μL的上清液转移到384孔板的孔并且测量FAM荧光强度(单次读取)。
结果在图27A至图27E中示出。正如预测的那样，阳性对照显示出正斜率，从而表明在反应过程中结合增加。这是由于FAM染料在结合和反式切割时释放到溶液中，如可见于图27B中。在rep104中，切割点是在FAM与生物素之间，而所有报告基因中的生物素都是链霉亲和素表面的附着点。图27C绘制了rep105的对照靶标结合动力学图。Rep105由生物素-FAM-T16-FQ构成。在这种情况下，经链霉亲和素涂覆的表面会发出荧光，因为FAM染料与淬灭剂之间的区域在结合之后被切割并且释放淬灭剂。图27D绘制了rep117的对照靶标结合动力学图。Rep117由生物素-FAM-T20-FQ构成。在此实施方案中，其中在FAM染料与淬灭剂之间切割报告基因，从而允许淬灭剂在结合和反式切割时释放到溶液中。这进而允许表面发出荧光。图27E绘制了rep118的对照靶标结合动力学图。Rep118由FAM-T20-生物素-FQ构成。在此实施方案中，溶液发出荧光，因为在结合之后，在生物素与FAM之间的核酸区域被反式切割，从而将FAM释放到溶液中。
实施例6：固定化化优化-复合物形成步骤
本实验的目的是确定使gRNA和报告基因与板结合是否使得DETECTR测定与结合CAS蛋白-gRNA复合物和报告基因一样有效。这消除了用gRNA和CAS蛋白的预复合物对表面进行功能化的需求，从而允许实现更简单的制造过程。另外，通过允许更严格的洗涤可实现更高的特异性。使用了以下程序。
1.如图38A所示设计实验。
2.根据图38B中所呈现的条件使报告基因rep117的储备溶液与板结合。
3.然后根据图39A中所呈现的条件来制备mod018(5'生物素-TEG R1763 SARS-CoV-2N-基因)和R1763 CDC-N2-武汉的复合反应。
4.针对每一者制取两组完整的复合混合物并且根据图39B在不存在Cas12M08的情况下获得两种混合物。
5.在37℃下将复合反应温育30分钟。
6.用50μL的1X MBuffer1将96孔经链霉亲和素涂覆的板的孔预漂洗两次。
7.将25μL报告基因添加到每个孔。
8.将25μL的复合物添加到A1-D2，将25μL 1x MB1添加到A3-D4，并且将25μL cRNA混合物添加到A5-D6。
9.用箔密封件将板密封。
10.然后在间歇振荡(在Thermomixer上每2分钟以1000rpm振荡15秒)下在25℃下使结合反应进行30分钟。
11.使链霉亲和素板短暂地减速旋转。
12.移除上清液。
13.用100μL 1X MBuffer-1洗涤两次。
14.用100μL 1X MBuffer-3洗涤一次。
15.将50μl的1X MBuffer3添加到孔A1-D2。
16.将25μL 1XMB3和25μL的复合物添加到“含溶液”孔A3-D4。
17.将47.5μL 1XMB3和2.5μL Cas12M08(50uL MM)添加到每个“稍后添加蛋白质”孔A5-D6。
18.将5μL以1:10稀释的纯化的LAMP产物添加到(+)靶标孔。
19.用光学透明的密封件将板密封。
20.在板读取器上进行读取-FAM，37℃，90分钟。
本实验的结果在图29A至图29F中示出，显示可与靶标一起添加CAS蛋白并且仍然实现复合和信号。图29A至图29C示出了测试的第一次重复的结果。图29D至图29F示出了测试的第二次重复的结果。图29A和图29D示出了生物素化的报告基因以及生物素化的RNA和CAS蛋白的复合物两者都被固定的结果。然后在此处添加活性缓冲液和靶标。图29B和图29E示出了生物素化的报告基因被固定并且包括gRNA和CAS蛋白的所有其他反应组分被引入溶液中的结果。图29C和图29F示出了生物素化的报告基因和生物素化的gRNA被固定，然后添加缓冲液、CAS蛋白和靶标的结果。在这些结果中，如图29F所示，观察到只有在gRNA和报告基因被固定时才可检测到CAS蛋白和gRNA的复合以及结合时的报告基因信号。
实施例7：固定靶标区分的展示
本实验的目的是展示针对DETECTR反应中的固定报告基因的靶标区分。本实验中使用的实验设计在图40A中示出。使用了以下程序。
1.如图40A所示计划实验。该实验包括3种gRNA，包括mod018、mod025和mod024。使用了两个靶标和两个对照。两个靶标是N-基因和RNA酶P。两个对照是：(1)不含靶标的所有其他反应组分和(2)水。
2.如图40B所示制备随后与板结合的报告基因rep117的储备溶液。
3.分别针对三种gRNA：mod018、mod024和mod025与报告基因制备复合反应液：
(1)生物素-TEG R1763 SARS-CoV-2N-基因，
(2)5'生物素-TEG R777猛犸象，
(3)5'生物素-TEG R1965 RNA酶P。反应条件在图41A中示出。
4.用50μL的1X MBuffer1将96孔经链霉亲和素涂覆的板的孔预漂洗两次。
5.将25μL报告基因添加到每个孔。
6.将25μL复合混合物添加到孔。
7.用箔密封件将板密封。
8.然后在间歇振荡(在Thermomixer上每2分钟以1000rpm振荡15秒)下在25℃下使结合反应进行30分钟。
9.如下进行FASTR方案：
a.所使用的引物：
I.SARS-CoV-2：M2062 CDC N2-FWD/M2063 CDC N2-REV。
II.RNA酶P：POP7 8F/6R。关于反应条件请参见图41B。
II.a.将4μL的主混合物移液到MBS 96孔板的孔中。
b.添加1uL twist RNA稀释液。
c.1000个拷贝/uL：7.8uL在42.2uL H2O中为6400c/uL。
d.在165℃下用箔密封件将板密封1.5秒。
e.根据图42所示的条件在MBS NEXTGENPCR热循环仪上运行以下PCR方案。
f.从热循环仪上移除板。
g.以2000rpm减速旋转30秒。
h.保持在冰上，直到准备好使用。
10.使链霉亲和素板短暂地减速旋转。
11.移除上清液。
12.用100μL 1X MBuffer-1洗涤两次。
13.用100μL 1X MBuffer-3洗涤一次。
14.添加50uL 1XMB3 15mM Mg2+。
15.将FASTR中的4μL的靶标添加到靶标孔。
16.用光学透明的密封件将板密封。
17.在板读取器上进行读取-FAM，37℃，90分钟。
结果在图31A至图31C中示出。图31A呈现了报告基因mod018的结果，其显示了对N-基因靶标的特异性。图31B呈现了报告基因mod025的结果，其显示了对RNA酶P靶标的特异性。图31C呈现了mod024的结果，正如预测那样没有显示出信号，因为不存在靶标。
实施例8：一锅RT-LAMP的功能测试。
本实验的目的是测试由RT-LAMP和基于Cas12M08酶的DETECTR主混合物构成的一锅反应的功能。将两种主混合物一起共冻干成一种主混合物。由于最佳反应温度差异，反应在功能上是不相容的，因此独立地评估所述反应。RT-LAMP主混合物显示出类似于液体对照的反应特性。在图99A中示出了针对RT-LAMP测定的结果并且在图99B中示出了针对Cas12M08测定的结果。图100所示的结果展示了由RT-LAMP和Cas12M08 DETECTR主混合物构成的“一锅”反应共冻干成一种主混合物并且复溶。图100所示的结果展示了基于反应曲线的活性。
实施例9：Cas14a1 DETECTR
本实验的目的是研究在比RT-LAMP测定所需更高的温度下起作用的Cas14a1。在此实施例中，温度高达55℃。图101所示的结果证明Cas14a1能够被冻干并复溶，其活性与对照相当。
实施例10：基于Cas12M08的一锅DETECTR测定的功能测试
本实验的目的是研究同时含有RT-LAMP和DETECTR反应试剂的合并和冻干的主混合物的性能。此外，这项研究显示预冻干混合物在冻干之前两周是稳定的。由于Cas12M08与RT-LAMP扩增条件不相容，因此在功能上分开测试RT-LAMP和基于Cas12M08的DETECTR的一起冻干的主混合物。这些数据显示了强劲的RT-LAMP和基于Cas12M08的DETECTR活性，这与冻干之前两周在4℃下储存的主混合物相当。结果在图102A和图102B中示出。
实施例11：小体积冻干反应
在本实施例之前，冻干样品体积经证明处于250μL，并且在玻璃小瓶中发挥作用。这个实施例提供了8孔塑料联排管中的25μL样品的冻干数据。另外，预冻干(在4℃下3周)值相当，显示主混合物的稳定性，如可见于图103中。包括15％海藻糖的反应试剂的冻干的主混合物的差示扫描量热法结果在图104中示出。观察到109.89℃的半高中点。这些结果一起证明反应试剂的主混合物在整个冻干过程中在较小体积下是稳定的。
实施例12：手持式微流体装置上的一锅DETECTR
在本实验中，评估了手持式微流体装置中一锅DETECTR测定的性能。在此处，一锅法是指将RT-LAMP和DETECTR试剂冻干为试剂的一种主混合物。在手持式微流体装置上执行的功能包括：样品摄入；从样品中进行RNA提取；将样品与CRISPR反应物混合；以及将混合物转移到孔中以将混合物加热到反应温度。在所述装置中，混合物被加热，并且随着时间的推移而连续监测荧光。图106显示了在3种不同的数据采集设置下绘制的结果。由方形组成的系列显示了不会使检测器饱和的设置，并且因此显示了在整个测定生命周期中信号的完整动态范围。根据这一数据，确定DETECTR测定在微型化的手持式微流体装置上进行时是起作用的。
实施例13：基于DETECTR的横向流测定试纸条
本实施例的目的是展示如图107A至图107B所示使用横向流测定(LFA)试纸条进行基于DETECTRTM的多重测定以实现并行读出。为了执行DETECTRTM测定，对表面(10700)固定可编程核酸酶探针(10707)和报告探针(10701)。在此实施例中，表面是与LFA试纸条分开的孔的底部。报告探针(10701)含有表面接头(10702)、可切割的核酸序列(10703)、标记(10704)和用于试纸条的流动捕获探针(10705)的结合部分。在此实施例中，结合部分是生物素。标记和结合部分通过第二接头(10706)附着于核酸(10703)，其中在本实施例中，接头是树状物或三倍体分子。可编程核酸酶探针(10707)含有表面接头和可编程核酸酶(例如，Cas酶)，进而含有sgRNA(10708)。sgRNA含有重复单元(或发夹)和识别序列。识别序列是样品的靶核酸的互补体。经抗生物素标记的金纳米颗粒位于LFA试纸条(10710)的样品垫(10711)中，如图107B所示。在此实施例中，第一步骤是使表面(10700)与含有靶核酸的样品接触。在与固定的可编程核酸酶探针(10707)的sgRNA(10708)互补的靶核酸结合之后，固定在附近的报告基因(10701)被可编程核酸酶切割，从而将报告基因的切割部段(10709)释放到溶液中。然后使现在含有切割报告基因的对应于样品中存在的靶核酸的样品溶液与横向流测定试纸条(10710)的样品垫(10711)接触。在此实施例中，样品垫在上面设置有流动捕获探针(例如，经抗生物素标记的金纳米颗粒)。一旦含有释放的报告基因部段的样品溶液与样品垫接触，所述样品溶液就会流过样品垫(例如，通过芯吸)。样品溶液中的切割报告基因接触抗生物素金纳米颗粒流动捕获探针并且在溶液中接触时与所述流动捕获探针结合。报告基因和纳米颗粒的复合物然后通过毛细管作用与液体样品的其余部分一起在下游穿过横向流测定试纸条的检测区域(10712)。在此实施例中，检测区域(10712)可包括六个检测点(10713)，其中每个检测点(10713)含有对报告基因的染料(10704)具有特异性的不同捕获抗体类型。在此实施例中，染料(10704)是FITC，并且固定捕获探针是功能化到检测点(10713)的抗-FITC抗体，从而允许特异性检测经FITC标记的报告基因以及对其他靶核酸具有特异性的其他报告基因。存在对照线(10714)，用抗-IgG功能化，使得未与经FITC标记的报告片段(例如，检测部分)结合的所有流动捕获探针都被捕获和检测。应注意，在此实施例中，多个标记和结合部分经由检测部分(10706)的树枝状接头而存在以放大信号。在此实施例中，存在多个检测点(10713)，从而允许实现并行检测复用样品的可能性，如实施例14中所解释。
实施例14：基于DETECTR的多重横向流测定试纸条
本实施例的目的是展示利用多重“Hotpot”测定的横向流测定试纸条工作流，如图108所示。在此实施例中，样品(10801)含有靶核酸序列1和2。使样品(10801)与孔的表面(10802)接触，其中在五个位置D1至D5中的每一个位置处都有不同的sgRNA固定到表面。例如，如图108所示，5种不同的sgRNA中的每一种是固定在五个不同位置D1至D5中的5种不同的可编程核酸酶探针(例如，参见图107)的一部分。另外，5种不同的sgRNA中的每一种都被设计成与样品中的不同靶核酸特异性结合，从而允许样品复用。除了含有sgRNA的固定的可编程核酸酶探针以外，D1至D5的每个位置都用具有不同官能团的报告探针进行功能化。报告探针足够接近以被可编程核酸酶探针切割。因此，如实施例13中所描述，在sgRNA与sgRNA被设计成特异性结合的靶核酸之间结合之后，报告基因被切割并且释放到溶液中。在此实施例中，D4和D5各自含有用两种不同的标记或捕获抗体识别元素标记的报告基因。一旦样品与孔(D1至D5)接触，报告基因的相应切割部段就会被释放到样品溶液中(如实施例13中所描述)。然后使具有释放的报告基因的样品溶液与样品垫接触，在此实施例中，所述样品垫位于横向流测定中。在此实施例中，每个检测点含有不同类型的捕获抗体，其中每种捕获抗体类型与报告基因的特定标记特异性结合。对于这个实施例，检测点(10803)含有捕获抗体抗-FITC，而孔D5含有1)固定的Cas-复合物，包含对第一靶核酸序列具有特异性的sgRNA，以及2)用FITC标记的固定的报告基因(10806)。因此，在第一靶核酸序列与对应的sgRNA结合之后，对应的固定报告基因(10806)与对应的核酸之间的键联(例如参见图107中的参考符号10701)被切割，从而将报告基因释放到溶液中。相比之下，对于这个实施例，检测点(10804)含有捕获抗体抗-DIG，而孔D4含有1)固定的Cas复合物，包含对第二靶核酸序列具有特异性的sgRNA，以及2)用DIG标记的固定的报告基因(10805)。因此，在第二靶核酸序列与对应的sgRNA结合之后，对应的固定报告基因(10805)与对应的核酸之间的键联(例如参见图107中的参考符号10701)被切割，从而将报告基因释放到溶液中。然后使现在含有切割报告基因(10805和10806)的溶液与LFA试纸条的样品垫与追踪缓冲液接触，其中报告基因与设置在样品垫上的流动捕获探针(例如，抗生物素-AuNP)结合并且拾取所述流动捕获探针。具有用FITC标记的报告基因(10806)的AuNP-报告基因缀合物将与含有捕获抗体抗-FITC的检测点(10803)选择性地结合，从而表明样品中存在第一靶核酸序列。具有用DIG标记的报告基因(10805)的AuNP-报告基因缀合物将与含有捕获抗体抗-DIG的检测点(10804)选择性地结合，从而表明样品中存在第二靶核酸序列。以此方式，能够并行检测复用样品中存在的2个或更多个靶核酸序列。在一些实例中，检测点在规定位置彼此间隔开来，使得在给定检测点处对报告基因的检测将与特定靶核酸相关。
实施例15：HRP增强的基于DETECTR的横向流测定试纸条
本实施例的目的是展示如图109所示的辣根过氧化物酶(HRP)纸基检测。在此处，“纸基”是指横向流测定试纸条。就像在实施例7和8中一样，使含有靶核酸序列的蓝色液体样品暴露于表面，在所述表面上固定有CRISPR-Cas/gRNA探针和报告探针。在本实施例中，报告探针含有HRP分子。在靶标与引导RNA之间的特异性结合事件之后由Cas酶(例如，可编程核酸酶)切割报告基因时，报告基因的切割部分被释放到样品溶液中。在此实施例中，然后使具有报告分子的释放部段的样品溶液与包括含有过碳酸钠的样品垫的横向流测定试纸条接触，从而在水合时产生H2O2。当样品在芯吸作用下通过样品垫和横向流测定到达检测点时发生过碳酸钠再水合以形成H2O2，如在先前的实施例7和8中所描述。在本实施例中，横向流测定试纸条含有化学底物DAB和TMB，它们会激活从蓝色到红色的颜色变化，从而表明存在HRP，并且进而表明对靶核酸序列实现了“命中”。HRP的化学催化性质实现了信号放大。可替代地，在样品溶液发生从蓝色到红色的颜色变化时，也可在溶液中完成读出。
实施例16：HRP增强的基于DETECTR的多重横向流测定试纸条
本实施例的目的是展示如图110所示的HRP信号增强的多重横向流测定。如在先前的实施例中所描述实现固定表面(11000)和横向流测定试纸条(11010)上的检测，另外的是信号转导不通过金纳米颗粒散射光来进行。相反，用抗生物素标记的AuNP被HRP-抗生物素DAB/TMB取代。HRP被LFA试纸条中存在的过碳酸钠激活，所述过碳酸钠通过反应液和/或追踪缓冲液再水合。以此方式，HRP允许实现足够强的信号，以致于不需要诸如PCR的样品扩增。以与实施例14中所描述相同的方式完成多重检测。
实施例17：利用捕获寡核苷酸探针特异性的基于Cas13的HRP增强的DETECTR LFA
本实施例的目的是展示利用Cas13优先于DNA的RNA切割特异性、HRP信号增强和捕获寡核苷酸探针特异性进行多重靶核酸检测，如图111所示。在本实施例中，样品(11100)含有不同的靶核酸。之后使样品(11100)与在五个位置D1至D5处功能化的孔的表面(11101)接触，如在实施例14中所描述。在此处的区别在于Cas13酶存在于Cas-复合物探针中。Cas13切割RNA，但不切割DNA。这使得能够使用含有核酸序列的报告基因(11102)，一个核酸序列由DNA构成，而另一个核酸序列由RNA构成。在靶核酸与sgRNA结合之后，Cas13酶切割报告基因的RNA，并且含有以下各项的片段被释放到溶液中：RNA的一部分、完整DNA序列；以及FITC标记。在用于五种不同的靶核酸的每个点D1至D5处并行地重复这个动作，从而产生5个不同的报告片段。之后使溶液与LFA试纸条的样品垫接触，其中样品垫含有HRP-抗-FITC。用FITC标记的报告片段之后与HRP-抗-FITC结合，从而形成复合物(11103)并且在下游穿越检测区域，从而与含有捕获寡核苷酸的检测点特异性结合，所述捕获寡核苷酸被设计为复合物(11103)中的寡核苷酸的互补体。以此方式，如实施例14中所描述的复用样品的并行检测是可能的。
实施例18：利用Cas14的HRP增强的基于DETECTRTM的横向流测定试纸条
本实施例的目的是展示如图109所示的辣根过氧化物酶(HRP)纸基检测。在此处，“纸基”是指横向流测定试纸条。就像在实施例13和14中一样，使含有靶核酸序列的蓝色液体样品暴露于表面，在所述表面上固定有可编程核酸酶探针和报告探针。在本实施例中，报告探针含有HRP分子。在靶标与引导核酸之间的特异性结合事件之后由Cas14酶切割报告基因时，报告基因的切割部分被释放到样品溶液中。在此实施例中，然后使样品溶液与包括含有过碳酸钠的样品垫的横向流测定试纸条接触，从而在水合时产生H2O2。就像在先前的实施例13和14中所描述，当样品在芯吸作用下通过该区域时发生过碳酸钠再水合以形成H2O2。由于底物含有DAB、TMB等…，“点”从蓝色变为红色，从而表明存在HRP，并且进而表明对靶核酸序列实现了“命中”。以此方式，HRP实现了信号放大。可替代地，如图109所示，在样品溶液发生从蓝色到红色的颜色变化时，也可在溶液中完成读出。
实施例19：HRP-T20-生物素基于DETECTRTM的测定
本实施例的目的是展示HRP型基于DETECTRTM的测定。在本实施例中，报告基因被Cas复合物或溶液中的DNA酶切割。切割的报告基因与HRP-T20-生物素发生反应。然后将上清液添加到含有TMB和H2O2的反应体积以产生彩色信号。之后通过溶液的光密度测量来检测切割的报告基因-HRP缀合物。从反应开始就获取光密度测量值。实验分两组执行，每组包括2次操作，其中每组相隔1周进行。在每一组的每次操作中分开使用DNA酶和DETECTRTM。在DNA酶操作中，1nM的HRP靶寡核苷酸用于填充循环系列。结果在图112中示出。本实施例的意义在于，HRP和DETECTRTM两者的多次转换对诸如PCR的样品扩增实现了替代的信号放大。
实施例20：用于在DETECTR测定中实现增强的靶标检测信号的引导物合并
将被设计成与单个靶分子内的不同区域结合的引导RNA合并，以作为增强DETECTR测定中的靶标检测信号的策略。例如，在这种策略中，每个DETECTRTM反应都含有CRISPR-CasRNP复合物池，所述复合物中的每一者靶向单个分子内的不同区域。正如以下段落中所讨论的，这种策略通过以下方式产生对靶标检测的提高的敏感性：使用更多数量的复合物/单个靶标，使得信号是足够强的以在泊松分布(不到一个拷贝/液滴)内检测并且提供对样品中靶标数量的定量评估。
为了使用Cas12a核酸酶测试引导物合并对靶标检测的影响，首先，制备Cas12a复合混合物。R1965(脱靶引导物)、R1767、R3164、R3178引导物以合并的gRNA形式(选自R1767、R3164或R3178的三种引导物中的两种或更多种的池)，或以单gRNA形式(其中R1767、R3164、R3178单独存在)存在于Cas12a复合混合物中，并且将混合物在37℃下温育20分钟。从起始稀释浓度产生模板RNA(GF184)的2倍稀释系列(其中将5.4μl的处于0.1ng/μL的GF184添加到44.6μl的不含核酸酶的水)。然后如表2所示组装包含Cas12复合物、报告底物、荧光素、缓冲液和稀释模板(GF184或脱靶模板GF577)的DETECTR主混合物。之后将DETECTR混合物加载到Stilla Sapphire芯片上并且放置到Naica Geode中。晶体由每个样品的数千个液滴产生。不执行扩增步骤。在红色通道中测量来自Sapphire芯片的信号。DETECTR测定的结果显示，与使用单独引导物形式的基于DETECTR Cas12a的测定相比，所述测定使用合并引导物形式显示了对GF184靶标的增强的基于Cas12a的检测。例如，DETECTR测定显示与来自分别含有单独引导物形式的R1767和R3178的腔室2或腔室4的信号相比，来自含有两种引导物R1767和R3178的池的腔室5的信号有所增强，如图114所示。类似地，DETECTR测定显示与来自含有两种引导物(R1767和R3178)的池的腔室5的信号相比，并与来自分别含有单独引导物形式的R1767、R3164和R3178的腔室2、腔室3或腔室4的信号相比，来自含有三种引导物(R1767、R3164和R3178)的池的腔室9的信号有所增强，如图114所示。
表2显示了条件、每个腔室的拷贝、液滴数和每个腔室的拷贝/液滴。
腔室 条件 拷贝/腔室 #液滴 拷贝/液滴
1 脱靶引导物(1965) 2.5x10<sup>7</sup> 29336 852
2 单R1767 2.5x10<sup>7</sup> 26838 931
3 单R3164 2.5x10<sup>7</sup> 29590 845
4 单R3178 2.5x10<sup>7</sup> 27769 900
5 2者池(R1767、R3178) 2.5x10<sup>7</sup> 27929 895
6 2者池(R1767、R3178) 1.25x10<sup>7</sup> 28787 434
7 2者池(R1767、R3178) 6.125x10<sup>6</sup> 27503 223
8 2者池(R1767、R3178) 0 28814 0
9 3者池(R1767、R3164、R3178) 2.5x10<sup>7</sup> 27881 897
10 3者池(R1767、R3164、R3178) 1.25x10<sup>7</sup> 29523 423
11 3者池(R1767、R3164、R3178) 6.125x10<sup>6</sup> 28957 211
12 3者池(R1767、R3164、R3178) 0 29087 0
在Cas13a核酸酶的情况下也观察到了用引导物合并对靶标检测实现了增强的敏感性。在这些测定中，制备Cas13a复合混合物，其中R002(脱靶引导物)、R4517、R4519、R4530引导物以合并gRNA形式(三种引导物R4517、R4519和R4530中的两种或更多种的池)或单gRNA形式(其中R4517、R4519和R4530单独存在)存在，并且将混合物在37℃下温育20分钟。然后如表3所示组装包含Cas13a复合物、FAM-U5报告底物、缓冲液和稀释的模板SC2 RNA(或脱靶模板5S-87)的DETECTR主混合物。之后将DETECTR混合物加载到Stilla Sapphire芯片上并且放置到
Figure BDA0004036779040001862
Geode系统中。从每个样品的液滴中产生晶体，并且在37℃下温育(未执行扩增步骤)。在Cy5通道中测量来自Sapphire芯片的信号。DETECTR测定的结果显示，与使用单一引导物形式的SC2靶RNA的基于Cas13a的检测相比，使用合并引导物形式的SC2靶RNA的基于Cas13a的检测有所增强。例如，DETECTR测定显示，与来自含有浓度为1x 106个拷贝的模板并分别含有单独引导物形式的引导物R4517、R4519和R4530的腔室2、腔室4或腔室6的信号相比，来自含有浓度为1x106个拷贝的模板以及三种引导物R4517、R4519和R4530的池的腔室8(饱和-未显示)的信号有所增强，如图115所示。类似地，DETECTR测定显示，与来自含有浓度为1x 106个拷贝的模板并分别含有单独引导物形式的R1767、R3164和R3178的腔室2、腔室6或腔室4的信号相比，来自含有浓度为1x 105个拷贝的模板以及三种引导物(R1767、R3164和R3178)的池的腔室9的信号有所增强，如图115所示。
表3显示了条件、每个腔室的拷贝、每个腔室的液滴数和每个腔室的每个液滴的拷贝。
Figure BDA0004036779040001861
Figure BDA0004036779040001871
接下来，对含有合并引导物形式与单一引导物形式的引导RNA的Cas13a数字液滴DETECTR测定中靶标检测的灵敏度进行测定。针对每种gRNA(R4637、R4638、R4667、R4676、R4684、R4689、R4691或R4785(RNA酶P))制备DETECTR反应主混合物，并且除了gRNA以外，所述主混合物还包含Cas13a核酸酶和报告底物。在复合之后，将2μL各RNP组合成合并gRNA形式(七种gRNA的池，即R4637、R4638、R4676、R4689、R4691、R4667和R4684)或保留为单gRNA形式(其中R4667、R4684和R4785(RNA酶P)单独存在)。稀释模板RNA(Twist SC2、ATCC SC2和5s-87脱靶)以获得一系列模板浓度。通过如表4所示将Cas13a-gRNA RNP与来自先前步骤的稀释的模板RNA组合来组装指向模板RNA(Twist SC2、ATCC SC2和5s-87脱靶模板RNA)的检测的DETECTR反应。将组装的DETECTR反应加载到Stilla Sapphire芯片上的腔室中。将芯片放置到
Figure BDA0004036779040001872
Geode系统中并且使用液滴产生程序产生晶体并对所述晶体进行成像以显示含有检测到的靶标的液滴。
将含有合并引导物(R4637、R4638、R4667、R4676、R4684、R4689、R4691)的DETECTR测定的靶标检测灵敏度与含有单独形式的单一引导物R4684、R4667、R4785(RNA酶P引导物)的DETECTR测定的靶标检测灵敏度进行比较。通过计数这些阳性液滴的数量而执行的相对定量显示，与含有单独形式的引导RNA的样品相比，含有合并引导RNA的样品在每个起始靶RNA的拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体，如图116所示。例如，来自腔室1的阳性液滴的数量高于腔室2和3中的液滴的数量；并且来自腔室5的液滴的数量高于腔室6和7中的液滴的数量，如图116所示。来自芯片的靶标检测信号强度的测量也证实，含有合并引导物(R4637、R4638、R4667、R4676、R4684、R4689、R4691)的DETECTR测定的每个起始靶RNA的拷贝的靶标检测灵敏度高于含有单独形式的单一引导物R4684、R4667、R4785(RNA酶P引导物)的DETECTR测定的靶标检测灵敏度，如图117所示。例如，来自腔室1(含有七种引导物的池和Twist SC2模板RNA)的信号强度高于腔室2和3(在存在Twist SC2 RNA的情况下分别含有单独形式的R4684和R4667 gRNA)中的信号强度；并且来自腔室5(含有七种引导物的池和ATCCSC2模板RNA)的信号强度高于腔室6和7(在存在ATCC SC2 RNA的情况下分别含有单独形式的R4684和R4667 gRNA)中的信号强度，如图117所示。类似地，来自腔室5(含有七种引导物的池和ATCC SC2模板RNA)的信号强度高于腔室6(含有单独形式的gRNA R4684和ATCC SC2RNA)中的信号强度、来自腔室8(在存在ATCC SC2模板RNA的情况下含有单独形式的对照RNA酶P gRNA)的信号强度以及来自腔室12(在不存在模板RNA的情况下含有七种合并gRNA)的信号强度，如图117所示。
在腔室5(含有七种引导物的池和ATCC SC2模板RNA)中观察到的含有扩增靶标(每个起始靶RNA的拷贝)的液滴数量的相对定量高于在腔室6(含有单独形式的gRNA R4684和ATCC SC2 RNA)中观察到的液滴数量、在腔室8(在存在ATCC SC2模板RNA的情况下含有单独形式的对照RNA酶P gRNA)中观察到的液滴数量以及在腔室12(在不存在模板RNA的情况下含有七种合并的gRNA)中观察到的液滴数量，如图118所示。当以实验台测定形式进行测定时，将含有合并引导物(R4637、R4638、R4667、R4676、R4684、R4689、R4691)的测定的靶标检测灵敏度与含有单独形式的单一引导物R4684、R4667、R4785(RNA酶P引导物)的测定的靶标检测灵敏度进行比较，如图119所示。实验台测定的结果显示，含有合并引导物(R4637、R4638、R4667、R4676、R4684、R4689、R4691)的样品不高于含有单独形式的单一引导物R4684、R4667或R4785(RNA酶P引导物)的样品中的靶标检测灵敏度，如图119所示。
表4显示了每个腔室的引导池和模板。
Figure BDA0004036779040001881
Figure BDA0004036779040001891
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以举例的方式提供。在不脱离本发明的情况下本领域技术人员现将进行各种变化、改变和替换。应当理解，可采用本文所述的实施方案的各种替代方案。这意味着所附权利要求限定本发明的范围并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构因此被涵盖。

Claims (187)

1.一种用于检测靶核酸的装置，所述装置包括：
a.样品接口，所述样品接口被配置为接收包含靶核酸的样品；
b.加热区域，所述加热区域与所述样品接口流体连通并且被配置为对经由所述样品接口接收的所述样品进行扩增；
c.检测区域，所述检测区域与所述加热区域流体连通；以及
d.可编程核酸酶探针，所述可编程核酸酶探针设置在所述样品接口、所述加热区域和/或所述检测区域内；
其中经由所述加热区域、所述样品接口和/或所述检测区域内所述可编程核酸酶探针与所述靶核酸之间的选择性结合而产生信号；
其中所述检测区域被配置为检测对应于所述靶核酸的存在的所述信号；并且
其中在所述样品接口处接收到所述样品之后不到30分钟的时间内确定所述靶核酸的存在或不存在。
2.如权利要求1所述的装置，所述装置还包括包含扩增试剂的试剂混合物。
3.如权利要求2所述的装置，其中所述试剂混合物是冻干的。
4.如权利要求2至3中任一项所述的装置，其中所述试剂混合物位于所述装置的与所述样品接口和所述加热区域两者流体连通的区域中。
5.如权利要求2至4中任一项所述的装置，其中所述试剂混合物位于所述样品接口、所述加热区域、所述检测区域和/或所述样品接口与所述加热区域之间的区域内。
6.如权利要求1所述的装置，其中所述加热区域包括扩增试剂。
7.如权利要求1所述的装置，其中所述样品经由环介导等温扩增(LAMP)进行扩增。
8.如权利要求1所述的装置，其中所述加热区域被配置为维持等温或非循环温度曲线。
9.如权利要求8所述的装置，其中所述等温或非循环温度曲线是在约30℃至约60℃之间。
10.如权利要求8所述的装置，其中所述等温或非循环温度曲线为约55℃至约60℃。
11.如权利要求1所述的装置，其中所述样品接口包括被配置为接收含有所述样品的拭子的隔室。
12.如权利要求11所述的装置，其中所述隔室包括被配置为将所述样品从所述拭子转移到所述装置的刮刀。
13.如权利要求11所述的装置，其中所述隔室含有被配置为从所述拭子中提取所述样品的接口溶液。
14.如权利要求13所述的装置，其中所述接口溶液包括缓冲溶液或裂解缓冲溶液。
15.如权利要求1所述的装置，其中所述样品接口被配置为经由移液从拭子接收所述样品。
16.如权利要求1所述的装置，其中所述样品接口包括被配置为从含有所述样品的容器接收所述样品的隔室。
17.如权利要求16所述的装置，其中所述容器包括注射器。
18.如权利要求1所述的装置，其中注射器接口包括用于从中接收所述样品的开口。
19.如权利要求18所述的装置，其中所述注射器接口开口与以下各项流体连通：i)所述加热区域，和/或ii)与所述加热区域流体连通的另一个隔室。
20.如权利要求1所述的装置，其中所述样品接口被配置为接收作为流体的所述样品。
21.如权利要求1所述的装置，其中所述加热区域和所述检测区域设置在所述装置上的相同位置。
22.如权利要求1所述的装置，其中所述加热区域和所述检测区域设置在所述装置的同一隔室内。
23.如权利要求1所述的装置，其中所述加热区域包括用于供流体移动穿过其中的通道。
24.如权利要求23所述的装置，其中所述通道与所述样品接口和所述检测区域直接或间接地流体连通，从而使得所述样品能够从所述样品接口移动到所述检测区域。
25.如权利要求23所述的装置，其中所述通道包括螺旋构造或蛇形构造。
26.如权利要求23所述的装置，所述装置还包括用于供流体移动穿过其中的两个或更多个通道，其中所述两个或更多个通道中的至少一个通道被配置为使所述样品从所述样品接口移动到所述检测区域。
27.如权利要求23至26中任一项所述的装置，其中所述加热区域的每个通道包括一个或多个可移动机构。
28.如权利要求27所述的装置，其中所述一个或多个可移动机构包括：i)第一可移动机构，所述第一可移动机构是在所述样品接口与所述加热区域之间以用于控制所述样品在它们之间的转移，和/或ii)第二可移动机构，所述第二可移动机构是在所述加热区域与所述检测区域之间以用于控制所述样品在它们之间的转移。
29.如权利要求27所述的装置，其中所述加热区域的至少一个通道包括被配置为将所述样品分为两个或更多个子样品的两个或更多个加热隔室，其中所述两个或更多个隔室经由所述一个或多个可移动机构中的可移动机构而彼此分开。
30.如权利要求29所述的装置，其中每个加热隔室被配置为由对应的加热元件加热。
31.如权利要求30所述的装置，其中所述装置的至少一个加热元件包括化学加热元件。
32.如权利要求31所述的装置，其中至少一个化学加热元件是乙酸钠。
33.如权利要求1所述的装置，其中所述加热区域包括与所述样品接口和所述检测区域流体连通的腔室。
34.如权利要求1至33中任一项所述的装置，其中所述加热区域包括固定在其中的报告基因，其中所述报告基因被配置为经由激活的可编程核酸酶与所述靶核酸之间的所述选择性结合而释放检测部分，从而使得能够产生所述信号。
35.如权利要求34所述的装置，其中所述报告基因经由固定在所述加热区域的表面上的支持物而固定在所述加热区域中。
36.如权利要求35所述的装置，其中所述支持物包括珠粒、涂层和散布的聚合物。
37.如权利要求35所述的装置，其中所述支持物包括固体支持物。
38.如权利要求35所述的装置，其中所述加热区域的所述表面包括为所述表面的凹陷部分的孔，其中所述支持物设置在所述孔内。
39.如权利要求1所述的装置，所述装置还包括一个或多个通道以将所述样品从所述样品接口移动到所述检测区域。
40.如权利要求39所述的装置，其中所述一个或多个通道位于所述样品接口内，位于所述样品接口与所述加热区域之间，位于所述加热区域内，位于所述加热区域与所述检测区域之间和/或位于所述检测区域内。
41.如权利要求40所述的装置，其中所述一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组连续布置的通道。
42.如权利要求40所述的装置，其中所述一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组平行布置的通道(平行通道)，从而使得所述样品能够在所述至少一组平行通道的每个通道内分为子样品。
43.如权利要求40所述的装置，其中所述一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组通道，所述至少一组通道被配置为使所述样品从所述装置内的第一位置移动到所述装置内的第二位置，从而使得所述样品能够在所述至少一组通道的每个通道内分为子样品。
44.如权利要求43所述的装置，其中所述至少一组通道包括具有不同长度和/或不同构造的两个或更多个通道，从而使得能够为两个或更多个对应的子样品指定特定条件。
45.如权利要求44所述的装置，其中所述特定条件包括指定的加热温度范围、指定的加热持续时间、在所述装置上的任何区域或位置内的指定的停留时间、特定温育时间、与特定试剂的接触或其任何组合。
46.如权利要求43所述的装置，其中所述至少一组通道包括具有相同长度和/或构造的两个或更多个通道，从而使得能够为两个或更多个对应的子样品指定特定条件。
47.如权利要求39至46中任一项所述的装置，其中所述一个或多个通道中的通道包括径向构造、螺旋构造、蛇形构造、线性构造或其任何组合。
48.如权利要求1所述的装置，所述装置还包括至少一个致动器。
49.如权利要求48所述的装置，其中所述至少一个致动器包括柱塞、弹簧致动柱塞或弹簧机构。
50.如权利要求48所述的装置，其中所述至少一个致动器是手动致动的。
51.如权利要求48所述的装置，其中所述至少一个致动器中的第一致动器被配置为经由所述第一致动器的手动致动而将所述样品从所述样品接口移动到所述加热区域。
52.如权利要求48所述的装置，其中所述至少一个致动器中的第二致动器被配置为经由所述第二致动器的手动致动而将所述检测部分从所述加热区域移动到所述检测区域。
53.如权利要求1所述的装置，其中所述装置被配置为在没有电力的情况下手动地操作。
54.如权利要求1所述的装置，所述装置还包括电源。
55.如权利要求1所述的装置，其中所述电源包括一个或多个电池。
56.如权利要求1所述的装置，其中所述加热区域被配置为经由加热元件加热所述样品。
57.如权利要求56所述的装置，其中所述加热元件包括化学加热元件。
58.如权利要求57所述的装置，其中所述化学加热元件是乙酸钠。
59.如权利要求1所述的装置，其中所述信号是视觉可检测的。
60.如权利要求1所述的装置，其中所述可编程核酸酶包含引导核酸。
61.如权利要求60所述的装置，其中所述引导核酸被修饰。
62.如权利要求61所述的装置，其中所述引导核酸用至少一个甲基进行修饰。
63.如权利要求60所述的装置，其中所述可编程核酸酶还包括Cas酶。
64.如权利要求63所述的装置，其中所述Cas酶选自由以下各项组成的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a、Cas14a1和CasPhi。
65.如权利要求1所述的装置，其中所述靶核酸指示呼吸道病症或呼吸道病原体。
66.如权利要求65所述的装置，其中所述呼吸道病症或呼吸道病原体选自由以下各项组成的组：SARS-CoV-2和对应的变体、29E、NL63、OC43、HKU1、MERS-CoV、MERS、SARS-CoV(SARS)、甲型流感、乙型流感、RSV、鼻病毒、A族链球菌和TB。
67.如权利要求1所述的装置，其中所述装置被配置为区分病毒感染与细菌感染。
68.如权利要求1所述的装置，其中所述靶核酸指示性传播感染(STI)或与女性健康相关的感染。
69.如权利要求68所述的装置，其中所述STI或与女性健康相关的感染选自由以下各项组成的组：CT、NG、MG、TV、HPV、念珠菌、细菌性阴道炎、梅毒和UTI。
70.如权利要求1所述的装置，其中所述靶核酸包含单核苷酸多态性(SNP)。
71.如权利要求70所述的装置，其中所述SNP指示NASH病症或α-1病症。
72.如权利要求1所述的装置，其中所述靶核酸是选自由以下各项组成的组的血源性病原体：HIV、HBV、HCV和寨卡病毒。
73.如权利要求1所述的装置，其中所述靶核酸指示幽门螺杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、诺如病毒、HSV和脑膜炎。
74.如权利要求1所述的装置，所述装置还包括物理过滤器，所述物理过滤器被配置为从所述样品中过滤不包含所述靶核酸的一个或多个颗粒。
75.如权利要求74所述的装置，其中所述物理过滤器位于所述样品接口与所述加热区域之间并且与所述样品接口和所述加热区域流体连通。
76.如权利要求1所述的装置，其中所述可编程核酸酶、所述引导核酸或所述报告基因通过键联固定到装置表面。
77.如权利要求76所述的装置，其中所述键联包括共价键、非共价键、静电键、链霉亲和素与生物素之间的键、酰胺键或其任何组合。
78.如权利要求76所述的装置，其中所述键联包括非特异性吸收。
79.如权利要求76、77或78所述的装置，其中所述可编程核酸酶通过所述键联固定到所述装置表面，其中所述键联是在所述可编程核酸酶与所述表面之间。
80.如权利要求76所述的装置，其中所述报告基因通过所述键联固定到所述装置表面，其中所述键联是在所述报告基因与所述表面之间。
81.如权利要求76所述的装置，其中所述引导核酸通过所述键联固定到所述表面，其中所述键联是在所述引导核酸的5’端与所述表面之间。
82.如权利要求76所述的装置，其中所述引导核酸通过所述键联固定到所述表面，其中所述键联是在所述引导核酸的3’端与所述表面之间。
83.如权利要求1至82中任一项所述的装置，所述装置还包括多种引导核酸，其中所述多种引导核酸中的每种引导核酸与所述靶核酸的不同片段互补或部分互补。
84.如权利要求1至83中任一项所述的装置，其中所述样品包括含有所述靶核酸的所述样品、含有所述扩增试剂的所述样品、所述扩增的样品和/或含有所述检测部分的所述样品。
85.一种用于检测样品中的靶核酸的装置，所述装置包括：
a.样品接口，所述样品接口用于接收所述样品；
b.加热区域，所述加热区域与所述样品接口流体连通，所述加热区域包括：
i.可编程核酸酶，所述可编程核酸酶包含引导核酸，以及
ii.报告基因，其中所述可编程核酸酶通过所述引导核酸与靶核酸之间的选择性结合而激活，其中所述报告基因被配置为在被所述激活的可编程核酸酶切割时释放检测部分；
c.化学加热元件，所述化学加热元件被配置为将热量提供到所述加热区域；
d.检测区域，所述检测区域与所述加热区域流体连通，其中所述检测区域被配置为检测由所述释放的检测部分产生的信号；
e.第一手动致动器，所述第一手动致动器被配置为将所述样品从所述加热区域转移到所述检测区域；以及
f.试剂混合物，所述试剂混合物包含扩增试剂，其中所述试剂混合物设置在所述样品接口、所述加热区域、所述检测区域内和/或设置在所述样品接口与所述加热区域之间，
其中所述装置被配置为经由所述产生的信号而在不到30分钟的时间内确定所述靶核酸的存在或不存在。
86.如权利要求85所述的装置，其中所述试剂混合物是冻干的。
87.如权利要求85所述的装置，其中所述加热区域被配置为对所述靶核酸进行扩增。
88.如权利要求85所述的装置，其中所述加热区域包括所述扩增试剂。
89.如权利要求85所述的装置，其中所述靶核酸经由环介导等温扩增(LAMP)进行扩增。
90.如权利要求85所述的装置，其中所述加热区域被配置为维持等温或非循环温度曲线。
91.如权利要求85所述的装置，其中所述等温或非循环温度曲线是在约30℃至约60℃之间。
92.如权利要求85所述的装置，其中所述等温或非循环温度曲线为约55℃至约60℃。
93.如权利要求85所述的装置，其中所述样品接口包括被配置为接收含有所述样品的拭子的隔室。
94.如权利要求86所述的装置，其中所述隔室包括被配置为将所述样品从所述拭子转移到所述装置的刮刀。
95.如权利要求86所述的装置，其中所述隔室含有被配置为从所述拭子中提取所述样品的接口溶液。
96.如权利要求95所述的装置，其中所述接口溶液包括缓冲溶液或裂解缓冲溶液。
97.如权利要求85所述的装置，其中所述样品接口被配置为经由移液从拭子接收所述样品。
98.如权利要求85所述的装置，其中所述样品接口包括被配置为从含有所述样品的容器接收所述样品的隔室。
99.如权利要求98所述的装置，其中所述容器包括注射器。
100.如权利要求85所述的装置，其中注射器接口包括用于从中接收所述样品的开口。
101.如权利要求100所述的装置，其中所述注射器接口开口与以下各项流体连通：所述加热区域或与所述加热区域流体连通的另一个隔室。
102.如权利要求85所述的装置，其中所述样品接口被配置为接收作为流体的所述样品。
103.如权利要求85所述的装置，其中所述加热区域和所述检测区域设置在所述装置上的相同位置。
104.如权利要求85所述的装置，其中所述加热区域和所述检测区域设置在所述装置的同一隔室内。
105.如权利要求85所述的装置，其中所述加热区域包括用于供流体移动穿过其中的通道。
106.如权利要求105所述的装置，其中所述通道与所述样品接口和所述检测区域直接或间接地流体连通，从而使得所述样品能够从所述样品接口移动到所述检测区域。
107.如权利要求105所述的装置，其中所述通道包括螺旋构造或蛇形构造。
108.如权利要求105所述的装置，所述装置还包括用于供流体移动穿过其中的两个或更多个通道，其中所述两个或更多个通道中的至少一个通道被配置为使所述样品从所述样品接口移动到所述检测区域。
109.如权利要求105至108中任一项所述的装置，其中所述加热区域的每个通道包括一个或多个可移动机构。
110.如权利要求109所述的装置，其中所述一个或多个可移动机构包括：i)第一可移动机构，所述第一可移动机构是在所述样品接口与所述加热区域之间以用于控制所述样品在它们之间的转移，和/或ii)第二可移动机构，所述第二可移动机构是在所述加热区域与所述检测区域之间以用于控制所述样品在它们之间的转移。
111.如权利要求109所述的装置，其中所述加热区域的至少一个通道包括被配置为将所述样品分为两个或更多个子样品的两个或更多个加热隔室，其中所述两个或更多个隔室经由所述一个或多个可移动机构中的可移动机构而彼此分开。
112.如权利要求111所述的装置，其中每个加热隔室被配置为由至少一个加热元件的对应的加热元件加热。
113.如权利要求112所述的装置，其中所述装置的所述至少一个加热元件包括化学加热元件。
114.如权利要求113所述的装置，其中所述至少一个化学加热元件是乙酸钠。
115.如权利要求85所述的装置，其中所述加热区域包括腔室。
116.如权利要求85至115中任一项所述的装置，其中所述加热区域包括固定在其中的所述报告基因。
117.如权利要求116所述的装置，其中所述报告基因经由固定在所述加热区域的表面上的支持物而固定在所述加热区域中。
118.如权利要求117所述的装置，其中所述支持物包括珠粒、涂层和散布的聚合物。
119.如权利要求117所述的装置，其中所述支持物包括固体支持物。
120.如权利要求117所述的装置，其中所述加热区域的所述表面包括为所述表面的凹陷部分的孔，其中所述支持物设置在所述孔内。
121.如权利要求85所述的装置，所述装置还包括一个或多个通道以将所述样品从所述样品接口移动到所述检测区域。
122.如权利要求121所述的装置，其中所述一个或多个通道位于所述样品接口内，位于所述样品接口与所述加热区域之间，位于所述加热区域内，位于所述加热区域与所述检测区域之间和/或位于所述检测区域内。
123.如权利要求121所述的装置，其中所述一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组连续布置的通道。
124.如权利要求121所述的装置，其中所述一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组平行布置的平行通道(平行通道)，从而使得所述样品能够在所述至少一组平行通道的每个通道内分为子样品。
125.如权利要求121所述的装置，其中所述一个或多个通道包括多个通道，其中所述多个通道包括至少一组通道，所述至少一组通道被配置为使所述样品从所述装置内的第一位置移动到所述装置内的第二位置，从而使得所述样品能够在所述至少一组通道的每个通道内分为子样品。
126.如权利要求125所述的装置，其中所述至少一组通道包括具有不同长度和/或不同构造的两个或更多个通道，从而使得能够为两个或更多个对应的子样品指定特定条件。
127.如权利要求126所述的装置，其中所述特定条件包括指定的加热温度范围、指定的加热持续时间、在所述装置上的任何区域或位置内的指定的停留时间、特定温育时间、与特定试剂的接触或其任何组合。
128.如权利要求126所述的装置，其中所述至少一组通道包括具有相同长度和/或构造的两个或更多个通道，从而使得能够为两个或更多个对应的子样品指定特定条件。
129.如权利要求121至128中任一项所述的装置，其中所述一个或多个通道中的通道包括径向构造、螺旋构造、蛇形构造、线性构造或其任何组合。
130.如权利要求85所述的装置，其中至少一个致动器包括柱塞、弹簧致动柱塞或弹簧机构。
131.如权利要求85所述的装置，其中所述装置被配置为在没有电力的情况下手动地操作。
132.如权利要求85所述的装置，所述装置还包括电源。
133.如权利要求85所述的装置，其中所述电源包括一个或多个电池。
134.如权利要求85所述的装置，其中所述加热区域被配置为经由加热元件加热所述样品。
135.如权利要求134所述的装置，其中所述加热元件包括化学加热元件。
136.如权利要求135所述的装置，其中所述化学加热元件是乙酸钠。
137.如权利要求85所述的装置，其中所述信号是视觉可检测的。
138.如权利要求85所述的装置，其中所述引导核酸被修饰。
139.如权利要求85所述的装置，其中所述引导核酸用至少一个甲基进行修饰。
140.如权利要求85所述的装置，其中所述可编程核酸酶还包含Cas酶。
141.如权利要求140所述的装置，其中所述Cas酶选自由以下各项组成的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a、Cas14a1和CasPhi。
142.如权利要求85所述的装置，其中所述靶核酸指示呼吸道病症或呼吸道病原体。
143.如权利要求142所述的装置，其中所述呼吸道病症或呼吸道病原体选自由以下各项组成的组：SARS-CoV-2和对应的变体、29E、NL63、OC43、HKU1、MERS-CoV、MERS、SARS-CoV(SARS)、甲型流感、乙型流感、RSV、鼻病毒、A族链球菌和TB。
144.如权利要求85所述的装置，其中所述装置被配置为区分病毒感染与细菌感染。
145.如权利要求85所述的装置，其中所述靶核酸指示性传播感染(STI)或与女性健康相关的感染。
146.如权利要求145所述的装置，其中所述STI或与女性健康相关的感染选自由以下各项组成的组：CT、NG、MG、TV、HPV、念珠菌、细菌性阴道炎、梅毒和UTI。
147.如权利要求85所述的装置，其中所述靶核酸包含单核苷酸多态性(SNP)。
148.如权利要求147所述的装置，其中所述SNP指示NASH病症或α-1病症。
149.如权利要求85所述的装置，其中所述靶核酸是选自由以下各项组成的组的血源性病原体：HIV、HBV、HCV和寨卡病毒。
150.如权利要求85所述的装置，其中所述靶核酸指示幽门螺杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、诺如病毒、HSV和脑膜炎。
151.如权利要求85所述的装置，所述装置还包括物理过滤器，所述物理过滤器被配置为从所述样品中过滤不包含所述靶核酸的一个或多个颗粒。
152.如权利要求151所述的装置，其中所述物理过滤器位于所述样品接口与所述加热区域之间并且与所述样品接口和所述加热区域流体连通。
153.如权利要求85所述的装置，其中所述可编程核酸酶、所述引导核酸或所述报告基因通过键联固定到装置表面。
154.如权利要求153所述的装置，其中所述键联包括共价键、非共价键、静电键、链霉亲和素与生物素之间的键、酰胺键或其任何组合。
155.如权利要求153所述的装置，其中所述键联包括非特异性吸收。
156.如权利要求153、154或155所述的装置，其中所述可编程核酸酶通过所述键联固定到所述装置表面，其中所述键联是在所述可编程核酸酶与所述表面之间。
157.如权利要求153所述的装置，其中所述报告基因通过所述键联固定到所述装置表面，其中所述键联是在所述报告基因与所述表面之间。
158.如权利要求153所述的装置，其中所述引导核酸通过所述键联固定到所述表面，其中所述键联是在所述引导核酸的5’端与所述表面之间。
159.如权利要求153所述的装置，其中所述引导核酸通过所述键联固定到所述表面，其中所述键联是在所述引导核酸的3’端与所述表面之间。
160.如权利要求85至159中任一项所述的装置，所述装置还包括多种引导核酸，其中所述多种引导核酸中的每种引导核酸与所述靶核酸的不同片段互补或部分互补。
161.如权利要求85至160中任一项所述的装置，其中所述样品包括含有所述靶核酸的所述样品、含有所述扩增试剂的所述样品、所述扩增的样品和/或含有所述检测部分的所述样品。
162.一种用于多重检测样品中的多种靶核酸的微阵列装置，所述微阵列装置包括：
a.样品接口，所述样品接口用于接收所述样品；
b.试剂混合物，所述试剂混合物包含扩增试剂；
c.加热区域，所述加热区域与所述样品接口流体连通；以及
d.检测区域，所述检测区域包括表面，所述表面包括微阵列形式的多个检测点，其中所述多个检测点中的每一个包括报告探针，其中每个报告探针被配置为经由激活的可编程核酸酶的切割而释放检测部分，
其中所述多个检测点中的每一个包括不同的可编程核酸酶探针，并且
其中所述装置被配置为经由所述多个检测点中的每一个处的每个报告基因的每个检测部分的释放而在不到30分钟的时间内确定所述多种靶核酸中的每一种的存在或不存在。
163.如权利要求162所述的装置，其中所述至少一个可编程核酸酶探针包含Cas酶。
164.如权利要求163所述的装置，其中至少一种可编程核酸酶的每种Cas酶选自包括以下各项的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a和Cas14a1。
165.如权利要求162至164中任一项所述的装置，所述装置包括如权利要求85至161中任一项所述的装置。
166.一种用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a.拭子；
b.洗脱试剂；
c.裂解试剂；
d.装置，所述装置包括：
i.样品接口，所述样品接口用于接收所述样品；
ii.加热区域，所述加热区域与所述样品接口流体连通并且被配置为接收所述样品，所述加热区域包括设置在所述加热区域内的包含引导核酸的可编程核酸酶和报告基因，其中所述可编程核酸酶通过所述引导核酸与所述靶核酸之间的选择性结合而激活，其中所述报告基因被配置为经由所述激活的可编程核酸酶而释放检测部分；
iii.化学加热元件，所述化学加热元件被配置为将热量提供到所述加热区域；
iv.检测区域，所述检测区域与所述加热区域和所述样品接口流体连通，其中所述检测区域被配置为检测由所述释放的检测部分产生的信号，从而检测所述靶核酸的存在；以及
v.试剂混合物，所述试剂混合物包含扩增试剂，其中所述试剂混合物设置在所述样品接口、所述加热区域、所述检测区域内和/或设置在所述样品接口与所述加热区域之间，并且其中所述装置被配置为经由所述释放的检测部分而在不到30分钟的时间内确定所述靶核酸的存在或不存在。
167.如权利要求166所述的试剂盒，其中所述样品接口被配置为从所述拭子接收所述样品。
168.如权利要求166所述的试剂盒，所述试剂盒还包括收集管，其中所述收集管被配置为接纳所述拭子，其中所述拭子中所含的所述样品被转移到所述收集管，并且其中所述收集管与所述装置是分开的。
169.如权利要求168所述的试剂盒，其中所述收集管被配置为插入所述样品接口中以将所述样品转移到所述装置。
170.如权利要求168所述的试剂盒，其中所述收集管是注射器。
171.如权利要求166所述的试剂盒，所述试剂盒还包括含有所述洗脱试剂和/或所述裂解试剂的第一容器。
172.如权利要求166所述的试剂盒，所述试剂盒还包括稀释试剂。
173.如权利要求172所述的试剂盒，所述试剂盒还包括含有所述稀释试剂的第二容器。
174.如权利要求166至173中任一项所述的试剂盒，其中所述可编程核酸酶包括Cas酶。
175.如权利要求174所述的试剂盒，其中所述Cas酶选自包括以下各项的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a和Cas14a1。
176.如权利要求166至175中任一项所述的试剂盒，其中所述装置包括如权利要求85至161中任一项所述的装置。
177.一种用于检测样品中的靶核酸的方法，所述方法包括：
a.提供装置，所述装置被配置为在将样品引入所述装置中之后不到30分钟内确定靶核酸的存在或不存在，所述装置包括样品接口、与所述样品接口流体连通的加热区域以及与所述加热区域流体连通的检测区域；
b.将所述样品引入所述装置的所述样品接口中；
c.将所述样品与包含扩增试剂的试剂混合物混合以产生混合样品溶液；
d.将所述混合样品溶液从所述样品接口转移到所述加热区域；
e.通过在所述加热区域中加热所述混合样品溶液来对所述样品进行扩增；
f.执行基于可编程核酸酶的测定，其中引导核酸与所述靶核酸之间的选择性结合激活可编程核酸酶探针，所述可编程核酸酶探针被配置为切割报告探针，从而在存在所述靶核酸时将检测部分释放到所述样品溶液中；
g.将具有所述扩增样品的所述混合样品溶液从所述加热区域转移到所述检测区域；以及
h.经由所述检测区域中对所述释放的检测部分的捕获而确定所述样品中所述靶核酸的存在或不存在。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述对所述靶核酸进行扩增和所述执行所述可编程核酸酶测定在所述加热区域中作为一锅反应执行。
179.如权利要求178所述的方法，其中所述一锅反应是在约30℃至60℃之间执行。
180.如权利要求178所述的方法，其中所述一锅反应是在约55℃下执行。
181.如权利要求178所述的方法，其中所述一锅反应的所述可编程核酸酶包括Cas酶，所述Cas酶选自包括以下各项的组：Cas12、Cas13、Cas14、Cas14a和Cas14a1。
182.如权利要求177所述的方法，所述方法还包括在进入所述加热区域之前对具有所述试剂混合物的所述样品进行过滤。
183.如权利要求182所述的方法，其中所述对所述样品进行过滤包括从所述样品中过滤不包含所述靶核酸的一个或多个颗粒。
184.如权利要求182所述的方法，其中过滤器位于所述样品接口与所述加热区域之间并且与所述样品接口和所述加热区域流体连通。
185.如权利要求177所述的方法，所述方法还包括多种引导核酸，所述多种引导核酸中的每种引导核酸与所述靶核酸的不同片段互补或部分互补。
186.如权利要求177所述的方法，所述方法还包括在步骤(a)之前：
i.提供包括样品溶液的收集管，所述样品溶液包含所述靶核酸；以及
ii.经由将所述收集管插入所述装置的样品接口中而将所述样品溶液转移到所述装置，其中所述样品溶液溶解并且与包含扩增试剂的冻干反应混合物混合。
187.如权利要求177至186中任一项所述的方法，其中所述装置包括如权利要求85至161中任一项所述的装置。
CN202180047814.9A 2020-05-29 2021-05-28 可编程核酸酶诊断装置 Pending CN115835920A (zh)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063032455P 2020-05-29 2020-05-29
US63/032,455 2020-05-29
US202063113798P 2020-11-13 2020-11-13
US63/113,798 2020-11-13
US202163151592P 2021-02-19 2021-02-19
US63/151,592 2021-02-19
US202163166538P 2021-03-26 2021-03-26
US63/166,538 2021-03-26
US202163181130P 2021-04-28 2021-04-28
US63/181,130 2021-04-28
PCT/US2021/035031 WO2021243308A2 (en) 2020-05-29 2021-05-28 Programmable nuclease diagnostic device

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115835920A true CN115835920A (zh) 2023-03-21

Family

ID=78745750

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180047814.9A Pending CN115835920A (zh) 2020-05-29 2021-05-28 可编程核酸酶诊断装置

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4156910A2 (zh)
JP (1) JP2023527850A (zh)
KR (1) KR20230019451A (zh)
CN (1) CN115835920A (zh)
AU (1) AU2021279039A1 (zh)
CA (1) CA3178629A1 (zh)
WO (1) WO2021243308A2 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4373963A2 (en) 2021-07-21 2024-05-29 Montana State University Nucleic acid detection using type iii crispr complex
WO2023077095A2 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Mammoth Biosciences, Inc. Effector proteins, compositions, systems, devices, kits and methods of use thereof
WO2024040202A1 (en) * 2022-08-19 2024-02-22 Mammoth Biosciences, Inc. Fusion proteins and uses thereof for precision editing

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009023060A2 (en) * 2007-06-06 2009-02-19 Program For Appropriate Technology In Health (Path) Chemical temperature control
EP2627787B1 (en) * 2010-10-14 2017-04-19 Rheonix, Inc. Quantitative multiplexed identification of nucleic acid targets
US9469871B2 (en) * 2011-04-14 2016-10-18 Corporos Inc. Methods and apparatus for point-of-care nucleic acid amplification and detection
CN109072205A (zh) * 2016-02-10 2018-12-21 密歇根大学董事会 核酸的检测
CN109661273B (zh) * 2016-06-30 2022-11-04 维斯比医学公司 用于核酸提取的装置和方法
DK3596232T3 (da) * 2017-03-12 2023-08-07 Ilytica Llc Digitale molekylanalyser
EP3830301B1 (en) * 2018-08-01 2024-05-22 Mammoth Biosciences, Inc. Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
US20220107328A1 (en) * 2018-08-14 2022-04-07 Camp4 Therapeutics Corporation Methods of treating liver diseases
KR20220035376A (ko) * 2019-06-18 2022-03-22 매머드 바이오사이언시즈 인크. 핵산 검출을 위한 분석 및 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CA3178629A1 (en) 2021-12-02
EP4156910A2 (en) 2023-04-05
WO2021243308A3 (en) 2022-01-06
WO2021243308A2 (en) 2021-12-02
JP2023527850A (ja) 2023-06-30
KR20230019451A (ko) 2023-02-08
AU2021279039A1 (en) 2023-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11761029B2 (en) Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
US20220119788A1 (en) Programmable nuclease improvements and compositions and methods for nucleic acid amplification and detection
CN114650883B (zh) 用于检测核酸的测定和方法
US20220136038A1 (en) COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING MODIFIED NUCLEIC ACIDS AND AMPLIFYING ssDNA
CN115835920A (zh) 可编程核酸酶诊断装置
US20240102084A1 (en) Compositions and methods for detection of a nucleic acid
US20230159992A1 (en) High throughput single-chamber programmable nuclease assay
EP4263821A2 (en) Methods and compositions for performing a detection assay
WO2022266513A2 (en) Devices, systems, and methods for analysis of nucleic acids
WO2022011261A2 (en) Rapid diagnostic test
WO2022132833A1 (en) Single-buffer compositions for nucleic acid detection
WO2022271873A2 (en) Programmable nuclease diagnostic device
WO2024020373A2 (en) Devices, systems and methods for analysis of nucleic acids
WO2023122508A2 (en) Programmable nuclease-based assay improvements
US20220099662A1 (en) Programmable nuclease compositions and methods of use thereof
WO2024040112A2 (en) Signal amplification assays for nucleic acid detection
WO2023122648A1 (en) Devices, systems, and methods for detecting target nucleic acids
de Stigter et al. Bioluminescent Intercalating Dyes for Ratiometric Nucleic Acid Detection
AU2022272723A9 (en) Methods for making libraries for nucleic acid sequencing
EP4341392A1 (en) Multiplexed unbiased nucleic acid amplification method

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20230321

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication