CN115820486A - 一种复合微生物菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合微生物菌剂及其应用，属于微生物复合菌剂技术领域。为解决堆肥过程中氮流失的问题，本发明提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为1:100～100:1的粉红粘帚霉和贝莱斯芽孢杆菌。本发明提供的复合微生物菌剂显著提高了堆肥过程的微生物群落的丰富度和多样性，增强核心菌群的连通性和复杂性；使氮代谢主要功能基因的丰度显著增加，总氮固定的遗传潜力和相互作用与合作能力增强。此外，堆肥的氨同化途径增强，反硝化作用减弱，显著提高与氨基酸相关的氮代谢能力，减少了堆肥样品中氮物质的损失。本发明的菌剂在生物固氮领域、制备生物固氮微生物复合菌剂、制备生物有机肥、制备土壤调理剂等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种复合微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明属于微生物复合菌剂技术领域，尤其涉及一种复合微生物菌剂及其应用。
背景技术
堆肥是目前广泛应用且能有效处理农业废弃物的方法之一，其实质就是利用微生物在一定温度、湿度和pH条件下，使农业废弃物有机物质发生生物化学降解，形成一种类似腐殖质土壤的物质，用作有机肥料和改良土壤。
生物固氮是指一些微生物通过其体内固氮菌的活动，在常压及一般生物能生存的湿度下，将空气中分子态氮固定下来，转变成氨态氮。固氮菌增加了对作物有效的生物氮的数量，在自然界中每年由微生物所固定的氮素约有1亿多吨，对增加土壤肥力起着很大的作用。
但在堆肥的过程中往往会消耗大量的氮，使所得有机肥的含氮量大大降低。全氮含量的降低可能是由于有机氮被堆肥中的其他细菌氧化成元素氮或氨类物质从堆肥中逸出。堆肥过程中氮素主要以铵态氮、硝态氮存在，铵态氮含量的降低可能是由于一部分铵态氮转化为氨类物质从堆肥中逸出、一部分铵态氮转化为硝态氮；硝态氮被还原成氨类物质或被反硝化为元素氮可能导致硝态氮含量的降低。
由此可知，堆肥过程中微生物群落结构对氮的流失起到关键作用。但目前的研究中，研究人员的重点往往在于对更高效的固氮菌株的筛选，而忽视微生物群落对固氮菌的协同增效作用。因此，目前本领域尚缺乏通过改变堆肥微生物群落结构和氮代谢相关途径来解决堆肥氮流失的方法。
发明内容
为解决堆肥过程中氮流失的问题，本发明提供了一种复合微生物菌剂及其应用。
本发明的技术方案：
一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为1:100～100:1的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
进一步的，所述粉红粘帚霉与贝莱斯芽孢杆菌的活菌数比为5:1、100:1、50:1、10:1、1:5、1:10、1:50或1:100。
一种复合微生物菌剂在生物固氮中的应用。
进一步的，所述在生物固氮中的应用是在提高固氮菌固氮能力中的应用。
进一步的，所述在生物固氮中的应用是在制备生物固氮微生物复合菌剂中的应用。
一种复合微生物菌剂在制备生物有机肥中的应用。
进一步的，所述在制备生物有机肥是利用农业废弃物堆积发酵生产有机肥。
一种复合微生物菌剂在改良培肥土壤中的应用。
进一步的，所述在改良培肥土壤中的应用是在制备土壤调理剂中的应用。
进一步的，所述在改良培肥土壤中的应用是在提高土壤氮含量中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的复合微生物菌剂通过特定比例混合的粉红粘帚霉(Clonostachysrosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，显著提高了堆肥过程的微生物群落的丰富度和多样性，增强核心菌群的连通性和复杂性；使氮代谢主要功能基因的丰度显著增加，总氮固定的遗传潜力和相互作用与合作能力增强。此外，堆肥的氨同化途径增强，反硝化作用减弱，显著提高与氨基酸相关的氮代谢能力，减少了堆肥样品中氮物质的损失。
本发明提供的复合微生物减少堆肥样品氮流失的功效使其在生物固氮领域、制备生物固氮微生物复合菌剂、制备生物有机肥、制备土壤调理剂等领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为T1组和T2组堆肥样品中TN的总体趋势变化曲线图；
图2为T1组和T2组堆肥样品中WSN的总体趋势变化曲线图；
图3为T1组和T2组堆肥样品中NO3 --N的总体趋势变化曲线图；
图4为T1组和T2组堆肥样品中NH4 +-N的总体趋势变化曲线图；
图5为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的α多样性指数——chao指数对比图；
图6为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的α多样性指数——ace指数对比图；
图7为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的α多样性指数——shannon指数对比图；
图8为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的α多样性指数——simpson指数对比图；
图9为T1组堆肥样品中微生物群落的共现网络图；
图10为T2组堆肥样品中微生物群落的共现网络图；
图11为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的Lefse分支图；
图12为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的LDA分析图；
图13为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的Metastats差异比较箱型图；
图14为T1组和T2组堆肥样品的kegg通路Circos图；
图15为T1组和T2组堆肥样品的kegg通路Level 1构成饼图；
图16为T1组和T2组堆肥样品的样本聚类图；
图17为T1组和T2组堆肥样品的kegg-通路成分聚类热图；
图18为堆肥过程中微生物主要氮代谢途径示意图；
图19为堆肥过程中氮代谢核心功能基因拷贝数的变化对比图；
图20为T1组堆肥样品中氮相关理化指标、功能基因拷贝数与微生物的相关矩阵图；
图21为T2组堆肥样品中氮相关理化指标、功能基因拷贝数与微生物的相关矩阵图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为5:1的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
实施例2
本实施例提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为100:1的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
实施例3
本实施例提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为50:1的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
实施例4
本实施例提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为10:1的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
实施例5
本实施例提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为1:5的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
实施例6
本实施例提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为1:10的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
实施例7
本实施例提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为1:50的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
实施例8
本实施例提供了一种复合微生物菌剂，包括活菌数比为1:100的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
验证试验一
本试验通过在农业废弃物与鸡粪作为堆肥底物进行堆肥的过程中加入实施例1提供的复合微生物菌剂考察其对堆肥微生物群落的影响及减少氮流失的效果。
试验材料：
农业废弃物(AWs；主要为菜叶)采集于东北农业大学向阳农场。将AWs用机器切碎为2cm2的碎块备用。
新鲜的鸡粪(CM)从东北农业大学养鸡场收集。将鸡粪进行风干粉碎预处理，并用100目的筛网进行过筛。
堆肥底物为等重量混合的AWs和CM共45Kg，放置于60L反应容器中。初始堆肥混合料含水率调整为65％，C/N为25。为了保证良好的供氧条件，每3天手动翻桩一次，每个采样日采样前将混合物完全混合。
本试验设置两个处理组，分别为T1组：未加微生物复合菌剂的空白对照组；
T2组：在堆肥底物中加入实施例1提供的符合微生物菌剂，添加量为底物重量的3％。
堆肥共培养42天，堆肥样品分别于第0天、第7天、第21天和第42天收集。
样品分为两部分，一份堆肥样品保存在4℃，用于理化指标的测定，另一份堆肥样品保存在-80℃，用于微生物的测定。
新鲜堆肥样品风干，用杜马斯氮素计测定总氮(TN)。根据TMECC(2002)测定可溶性氮(WSN)。根据Xu et al.的方法，将1mol/LKCl溶液按1:10的比例混合提取新鲜堆肥样品，然后用比色法测定提取物中NH4 +-N和NO3 --N的含量。
(一)考察不同处理下堆肥氮循环相关理化指标的变化趋势。
图1-图4分别为T1组和T2组堆肥样品中TN、WSN、NO3 --N和NH4 +-N的总体趋势变化曲线图；数据为三次重复正负标准差的平均值。
图1显示，TN的总体趋势是先下降后增加，最后趋于稳定。初始TN损失是由于高温和氨化菌作用下NH4 +-N挥发为NH3造成的。T2组添加实施例1提供的复合微生物菌剂后，TN值在第7天达到最低值为5.72(g/kg)，而T1对照组在第14天达到最低值为6.12(g/kg)。
图2显示，可溶性氮含量在堆肥过程中持续下降。这是由于微生物的固氮作用，将WSN转化为微生物繁殖所需的有机氮，进而转化为供植物吸收的氮肥。随着固氮菌在堆肥后期的作用，全氮含量急剧增加。
图3和图4显示，堆肥初期T2组的NH4 +-N达到最大值，说明在堆肥初期T2的氨化作用强于对照组。当堆肥温度降低时，氨化菌受到抑制，主要作用于硝化菌和反硝化菌。随着微生物的生长和水的大量消耗，强化的硝化作用使底物中的NH4 +-N逐渐转化为NO2-，因此NH4 +-N急剧下降，而NO3 --N稳步上升。
T1和T2组NO3 --N含量均在堆肥结束第42天达到最大值，分别为T1(86.59mg/kg)和T2(92.84mg/kg)。对照组增加了40.31(mg/kg)，T2组增加了47.18(mg/kg)，T2组氮转化为NO3 --N的量增加。
最终，T1对照组堆肥总氮增加7.68％，T2组堆肥总氮增加22.27％。通过比较两种堆肥方式，发现在堆肥基质中添加实施例1提供的复合微生物菌剂有利于减少氮的流失。
(二)考察不同处理的堆肥样品中的微生物群落的α多样性指数，基于相关指数(SparCC)计算的共现网络图，p<0.001:***；p<0.01:**；p<0.05:*；p<0.05NS。
Alpha多样性是对群落内微生物群落多样性的分析。在本实验中，各处理的覆盖指数均高于95％，说明测序结果可以代表样品中实际的微生物。
图5-图8分别为为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的α多样性指数：chao指数对比图、ace指数对比图、shannon指数对比图和simpson指数对比图。
图5和图6为群落结构丰富度分析采用ACE和Chao指数，群落结构多样性分析采用图7和图8的Shannon和Simpson指数。
Chao指数T1(3040.95)，T2(3505.41)，ACE指数T1(3605.86)<T2(4512.34)。T2组的Chao指数和ACE指数均高于T1对照组，说明在堆肥材料中添加实施例1提供的复合微生物菌剂提高了微生物群落丰富度，且ACE指数差异显著(p<0.05)。
T1和T2的shannon指数分别为4.90和4.91，差异不大。Simpson指数为T1(0.05)>T2(0.04)。但也有研究发现Simpson指数对物种均匀性更为敏感。Simpson指数值越大，群落多样性越低。由此可见，添加实施例1提供的复合微生物菌剂后堆肥中微生物多样性增加，但差异不明显，这可能是由于初始堆肥基质相同所致。
图9和图10为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的共现网络图；根据物种共现网络图构建了对照组(T1)和实验组(T2)微生物群落在门水平的共生模型。对照组T1的网络共现模型由44个节点和247条边组成，实验组T2的网络共现模型由31个节点和359条边组成。实验组T2的边数和图密度均高于对照组。对照组的节点数高于实验组。
可以直观地观察到在不同环境中相互作用占主导地位的优势种群。通过计算所有样本的相关指数(SparCC)，去除相关系数<0.6和节点丰度小于1％的连接。每个节点的大小与连接数成正比。T1为不添加复合微生物菌剂的堆肥对照组，T2为添加实施例1复合微生物菌剂的处理组。两组间网络拓扑特征有显著差异。由于T1和T2初始堆肥材料相同，因此核心菌群均为4种。对照组(T1)的核心组为放线菌门(7.72％)、拟杆菌门(9.55％)、变形菌门(17.96％)和厚壁菌门(63.74％)。T2的核心菌群为放线菌门(4.27％)、拟杆菌门(8.04％)、变形菌门(30.25％)、厚壁菌门(56.23％)。变形菌门(Proteobacteria)比对照组多12.29％，厚壁菌门(Firmicutes)比对照组少7.51％。其中β亚门变形菌门细菌具有较强的氨氧化能力，可将环境中的氨转化为亚硝酸盐。
结果表明，与对照组(T1)相比，添加复合微生物菌剂后T2组核心菌群的连通性和复杂性增强。由于物种间互补效应能力的提高可以增强物种的代谢效应，因此添加实施例1的复合微生物菌剂更有效地促进微生物的繁殖。
(三)考察不同处理堆肥微生物群落的LEfSe和Metastats差异分析结果，p<0.001:***；p<0.01:**；p<0.05:*；p<0.05NS。
采用LEfSe(LDA Effect Size)分析方法进一步探讨不同处理堆肥中微生物群落标记物，进而分析样品组间微生物丰度的差异特征。由内向外辐射的圆代表进化分支图中从门到属(或种)的分类学层次，圆直径大小与相对丰度大小成正比。
图11为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的Lefse分支图；图12为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的LDA分析图；在Lefse分析中，不同颜色的条形图代表不同类群中LDA评分大于2、丰度显著高的不同物种，条形图的长度代表不同物种的影响。
图片显示，不同处理组富集的菌种差异显著，特别是与CK(T1)相比，T2富集的微生物更多。实施例1的复合微生物菌剂对堆肥细菌有明显的抑制作用。结果显示，T1对照组有30个关键生物标志物，T2组有50个关键生物标志物。对照组T1优势菌群为杆菌属、肠杆菌属、肠球菌科和放线菌属。T2组堆肥样品中富集了心杆菌属、Wohlfahrtiimonadaceae、Oceanospirillales、Clostridia和Bacillius等细菌。这些微生物以有益菌为主。心细菌对NH3具有高度敏感性。海洋螺旋藻具有固氮能力，可用于去除生活污水中的氮，并参与环境中的氮循环。梭状芽胞杆菌具有很强的固氮能力，利用谷氨酰胺合成酶同化氨。
图13为T1组和T2组堆肥样品中微生物群落的Metastats差异比较箱型图；Metastats分析组间样本比较，发现两组在Class水平上有显著差异的菌种，以p值<0.05作为差异显著性的筛选阈值(p<0.05:*；p<0.01:**；p<0.001:***)。
可以看出，9种微生物之间的差异都很显著，其中以杆菌属、梭状芽孢杆菌属和变形菌属最为显著。梭状芽孢杆菌的值为T1(3888.56)<T2(7379.78)，T2组细菌丰度比T1组高89.78％。T1组细菌丰度较T2组高4100.67。在变形菌门中，两组差异为T2(372.22)>T1(102.89)。变形菌门(Proteobacteria)是环境中常见的硝化和氨氧化细菌，可参与硝化和反硝化。
综合分析结果表明，T1和T2样品的微生物种类差异较大，有明显的标记物。此外，在丰度较高的几个物种中这种差异更明显，可以认为它们的组间差异明显。在T2中添加微生物提高了堆肥产物的固氮能力。
(四)从三个层面预测了不同堆肥样品细菌群落的潜在代谢功能。
在三个水平上分析样本的kegg通路功能丰度。图14为T1组和T2组堆肥样品的kegg通路Circos图；图15为T1组和T2组堆肥样品的kegg通路Level 1构成饼图；图16为T1组和T2组堆肥样品的样本聚类图；图17为T1组和T2组堆肥样品的kegg-通路成分聚类热图。
图14显示，选取前10条路径，用Circos地图显示，样本宽度与路径丰度成正比。图15显示，KEGG所涉及的代谢途径在第1层被分为6个分支:细胞过程；环境信息处理；基于信息处理；人类疾病:新陈代谢；有机系统。代谢和遗传信息处理是调节微生物代谢的重要组成部分。这两部分所占比例最大，说明微生物的生理活性对堆肥过程影响较大。除HumanDiseases代谢途径外，T2组其他5种代谢途径均大于对照组T1。特别是在代谢途径上，同组代谢的相对比例分别为T1(78.58％)和T2(79.06％)。此外，实验T2组实际代谢途径的总丰度比实验T1组高5.22％，说明代谢途径在堆肥样品的总代谢中起着重要作用。另外，对照T1组的Human Diseases途径比对照T2组多0.03％，说明T2组的堆肥样品更无害。
图16显示，使用Level2的kegg-pathway来比较丰度差异。发现T1和T2在氨基酸代谢、代谢、其他氨基酸代谢、脂质代谢等通路中均表现出较高的相对丰富度。与氮循环相关的途径为氨基酸代谢:T1(274467.31)<T2(292368.72)和其他氨基酸代谢:T1(172236.80)<T2(178732.01)。上述结果表明，粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的混合可以显著改善堆肥样品中氨基酸相关的氮代谢。
选取T1和T2组在第7天、第21天和第42天的样本，根据kegg pathway-level 3选择与微生物相关的最常见的94条代谢途径进行聚类热图分析。
图17显示，T1和T2组在堆肥第7天的共同趋势是代谢和生化合成相关的某些代谢途径的丰度更大(如脂肪酸生物合成；细菌的趋化性和d-丙氨酸代谢)可能是细菌的趋化性和d-丙氨酸代谢使少数能够抵抗高温的微生物存活，因为堆肥的温度很高，这可能是增加特定代谢物的丰度。随着堆肥进行到第21天，温度下降，这有利于微生物的大量繁殖。与生物体发育能量相关的途径显著增加，如酮体的合成和降解、泛酸和辅酶a生物合成具有较高的代谢丰度。这些生物合成促进了堆肥过程中腐殖质的形成。堆肥后期(第42天)，微生物群落关系最优，各途径均显著增加。此时各种有益微生物活性最强，各种促进植物生长的化合物含量达到峰值，最终成为合格的堆肥商品。
图18为堆肥过程中微生物主要氮代谢途径示意图；最直观地展示氮循环能力的途径是氮代谢，T2氮代谢途径的丰度比T1多14.25％。和氮代谢与精氨酸生物合成(map00220)；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(map00250)和氰基氨基酸代谢(map00460)等途径密切相关。精氨酸不仅是人体蛋白质的组成部分，而且是合成多种生物活性物质的前体。例如，鸟氨酸是精氨酸的产物之一，是合成多胺的前体。谷氨酸等通过代谢生成尿素铵尿素(NH4 +-N)，通过鸟氨酸循环生成尿素。上述三条代谢途径的丰度值分别为T2>T1。其中，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径的丰度T2比T1高8.56％。精氨酸和脯氨酸代谢途径丰度为T1(16174.04)和T2(16852.67)。
最后得出结论，堆肥代谢途径的变化主要是由微生物的生理活动引起的。在堆肥样品中添加粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)复合菌剂可以显著提高堆肥样品的氮相关代谢能力，使堆肥样品更具无害性。
(五)考察不同堆肥样品中氮代谢途径相关指标与微生物丰度的相关性。
通过PICRUSt2函数来预测微生物在好氧堆肥过程中的氮代谢及其关键基因表达量。
图19为堆肥过程中氮代谢核心功能基因拷贝数的变化对比图；在堆肥氮代谢途径中，额外添加复合微生物菌剂的主要功能基因丰度(T2)高于普通堆肥(T1)。这些结果表明，粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的混合显著提高了氮代谢主要功能基因的丰度。
固氮微生物能够将空气中的N2转化为能更好地被植物吸收的铵盐。这个过程是由微生物酶氮化酶催化的)。固氮微生物含有编码固氮酶的基因(包括nifH、nifK、nifD等)，其中编码固氮酶铁蛋白组分的nifH基因因其高度保守性，常被选为研究固氮微生物群落结构的标记基因。测试环境中固氮的遗传潜力。本实验中nifH基因的表达量为T1(142.46)和T2(230)，说明T2中微生物总固氮的遗传潜力更强。在堆肥过程中，T1中nifH基因的表达量由48.29(D7)增加到273.12(D42)。T2组由393.86(D7)下降至120.49(D42)。这些结果表明，添加微生物剂可以增强堆肥早期的固氮作用。
Nagatani等的实验结果证实了细菌中的氨同化途径:铵→谷氨酰胺→谷氨酸，谷氨酸合成酶在细菌中广泛分布。gdhA基因是谷氨酸脱氢酶的主要功能基因，在细菌氨同化途径中起着重要作用。gdhA的表达量为T1(19609.06)和T2(25781.13)。此外，在堆肥过程中，两组的gdhA基因表达总体呈增加趋势，说明整个堆肥过程始终朝着谷氨酸铵铵的方向运行，这与本试验NH4 +-N的整体变化结果相对应。
细菌中与氮循环相关的nasA基因的产物是同化硝酸盐还原酶，这是硝酸盐/亚硝酸盐同化所必需的。T2组nasA基因表达量较T1组高54.12％。这是NO2-→NO3-的关键基因，基因含量直接代表转化效率，与堆肥过程中NO3--n含量增加的结果相对应。反硝化是一种呼吸过程，通常发生在无氧或缺氧条件下。反硝化由NO3-→NO2-→NO→N2O→N2四个反应步骤组成，是一种主要的氧化亚氮(N2O)的来源，一种强有力的温室气体。四种还原酶最终将硝酸盐还原为氮可以解释堆肥过程中氮的流失，因此在堆肥过程中应尽量减少反硝化。亚硝酸盐还原酶是这一呼吸过程中的关键酶，合成这一关键酶的关键基因是nirk和nirB。两种基因的表达量随堆肥量的增加而增加，其中nirk基因的平均表达量为T1(1365.69)>T2(1098.72)，nirB基因的平均表达量为T1(12198.42)<T2(18177.91)。一些研究发现nirK的丰度与N2O排放相关，而nirK是一个核心基因，因此nirK被认为是反硝化过程中N2O排放的主要贡献者。相比之下，减少N2O排放的关键酶是NosZ，它催化N2O还原为N2。在堆肥试验中，NosZ基因在T2中的表达量比T1高50.49％，这可能促进了N2O向N2的还原。一般来说，添加微生物剂可以减缓农业垃圾堆肥的反硝化过程。但是，不能用基因的和或差直接表示氮代谢水平，因为每个基因的作用和步骤不同，对氮代谢的贡献也不同。因此，应进一步探讨堆肥中微生物群落结构的变化与氮代谢的关系。
图20和图21为T1组和T2组堆肥样品中氮相关理化指标、功能基因拷贝数与微生物的相关矩阵图；当颜色由粉色变为蓝色时，相关性由负变为正。
通过热图比较T1和T2组堆肥中氮素相关指标(理化性质和基因表达)与微生物丰度(Class水平)的相关性。T1组(CK)中只有Proteobacteria与NO3 --N显著相关(相关系数r>0.8)，而T2组中NO3 --N与Bacilli显著相关。细菌；厚壁菌门；Gammaproteobacteria；变形菌门。变形菌门的相关系数为T1(r＝0.991)>T2(r＝0.925)。NO3 --N与微生物整体的相关性增强，而与单个细菌的相关性减弱，说明堆肥过程中复合微生物菌剂的额外添加增强了微生物的相互作用与合作能力。
NO3 --N不是由一个微生物调控的，而是由微生物共同调控的。两组中放线菌属(Actinobacteria)和丹毒菌属(Erysipelotrichia)与NH4 +-N高度相关，T1(CK)组r值分别为0.983和0.947。T2组的相关系数分别为0.940和0.998。两种细菌与NH4 +-N的相关性变化不大，但T2组微生物总数与NH4 +-N的相关系数趋于极值，正相关细菌的相关系数接近1，负相关细菌的相关系数接近-1。这可能是由于在T2组中添加了额外的微生物剂，改善了各细菌的功能，从整体上增强了堆肥的氨同化方式。
T1组中，Bacteria和Proteobacteria与所有基因的表达变化均呈正相关，而其他微生物则大部分呈负相关。这说明在对照组中，这两种微生物支持了堆肥中大部分与氮代谢相关的功能，而其余微生物对氮代谢的贡献较小。T2组种鉴定出的5种细菌与氮相关指标:(TN；硝态氮；nirK；nirB；nosZ；norB；nasA；gdhA)均呈正相关。gdhA的相关性均为正，说明这些微生物与T2中相关的氮代谢途径密切相关，其中Proteobacteria与基因改变的相关性最强。变形菌门也被称为代谢灵活菌，在适当的条件下进行相关的氮代谢活动。Proteobacteria中已鉴定出nirK、nosZ、norB等关键基因的相关序列。变形菌也被发现含有主要的nifH基因，这可能有助于固氮。在两次堆肥试验中，放线菌属和丹毒菌属与nifH基因的相关性为>0.8。放线菌是最原始的固氮微生物之一，其基因组序列中也揭示了nifH序列的存在。这也间接证实了本实验的准确性。
由此可见，在堆肥中粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)复合微生物菌剂，可以显著提高微生物群落的丰富度和多样性，增强核心菌群的连通性和复杂性。氮代谢主要功能基因的丰度显著增加，总氮固定的遗传潜力和相互作用与合作能力增强。此外，堆肥的氨同化途径增强，反硝化作用减弱。显著提高与氨基酸相关的氮代谢能力有利于减少堆肥样品中氮物质的损失。
在两组堆肥试验中，Actinobacteria和Erysipelotrichia与固氮核心基因nifH基因的相关系数均大于0.8，说明这两种细菌具有较强的固氮能力。T2组氮代谢主要功能基因丰度显著增加，总氮固定遗传潜力增强。在堆肥中添加粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)复合微生物菌剂可以通过改变微生物群落结构和改变氮代谢相关途径来减少堆肥样品中氮的流失。

Claims (10)

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，包括活菌数比为1:100～100:1的粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，所述粉红粘帚霉的菌种保藏编号为：CGMCC No.1977，所述贝莱斯芽孢杆菌的菌种保藏编号为CGMCC No.15766。
2.根据权利要求1所述一种复合微生物菌剂，其特征在于，所述粉红粘帚霉与贝莱斯芽孢杆菌的活菌数比为5:1、100:1、50:1、10:1、1:5、1:10、1:50或1:100。
3.一种如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在生物固氮中的应用。
4.根据权利要求3所述一种复合微生物菌剂在生物固氮中的应用，其特征在于，所述在生物固氮中的应用是在提高固氮菌固氮能力中的应用。
5.根据权利要求3或4所述一种复合微生物菌剂在生物固氮中的应用，其特征在于，所述在生物固氮中的应用是在制备生物固氮微生物复合菌剂中的应用。
6.一种如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在制备生物有机肥中的应用。
7.根据权利要求6所述一种复合微生物菌剂在制备生物有机肥中的应用，其特征在于，所述在制备生物有机肥是利用农业废弃物堆积发酵生产有机肥。
8.一种如权利要求1或2所述复合微生物菌剂在改良培肥土壤中的应用。
9.根据权利要求8所述一种复合微生物菌剂在改良培肥土壤中的应用，其特征在于，所述在改良培肥土壤中的应用是在制备土壤调理剂中的应用。
10.根据权利要求8或9所述一种复合微生物菌剂在改良培肥土壤中的应用，其特征在于，所述在改良培肥土壤中的应用是在提高土壤氮含量中的应用。
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