CN115814083A - Ankrd22在制备代谢相关脂肪性肝病治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，公开了ANKRD22在制备代谢相关脂肪性肝病治疗药物中的应用。本发明首次发现ANKRD22与MAFLD之间存在关联，ANKRD22可作为治疗MAFLD的靶标，且能够适应MAFLD的早期治疗需求；此外，本发明还提供了4种能够以ANKRD22为靶点，促进ANKRD22的表达的小分子化合物，对于MAFLD的治疗具有重要的临床潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及ANKRD22为靶标在制备代谢相关脂肪性肝病治疗药物中的应用。
背景技术
代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)是目前全球最常见的慢性肝病，最终可进展至肝硬化、肝癌和肝功能衰竭。MAFLD患者起病隐匿，进展缓慢，一般无症状。大多数患者合并肥胖、2型糖尿病、血脂异常和(或)高血压。目前，国内外大量研究关注于MAFLD的发生发展及其分子机制，但仍无针对MAFLD的特异性早期治疗方案。
国内外MAFLD诊疗指南一致推荐改变生活方式作为治疗脂肪肝及其相关炎症纤维化的一线措施和基石，单纯性脂肪肝患者通过半年以上的生活方式干预就能完全逆转脂肪肝，但生活方式干预治疗的顺从性和持续性是目前MAFLD的治疗难点。
临床上治疗MAFLD的主要治疗方案为护肝及降脂，其中护肝药物(如双环醇、联苯双酯、三磷酸腺苷等)主要针对存在肝功能异常等脂肪性肝炎患者，降脂药物(如他汀类、贝特类、烟酸类等)主要针对合并高血脂、心脑血管疾病等患者；而在MAFLD早期阶段，虽肝脏内存在脂质沉积、脂代谢异常，但外周血中甘油三酯、胆固醇等血脂指标及肝功能指标ALT、AST等尚未提示异常，传统护肝及降脂药物并不适用。
随着分子生物学技术的不断发展，探寻与疾病密切相关的靶基因或细胞亚群已成为靶向治疗研究的重要途径。对于大部分尚未累及肝脏炎症、纤维化和肝功能异常的早期MAFLD患者，探寻靶标以针对性地干预早期MAFLD进展的治疗策略具有重要意义。然而目前尚未报道过能够用于MAFLD治疗的靶基因或靶细胞群，提供一种能够有效改善肝脏脂质堆积的靶标是当前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了ANKRD22在制备代谢相关脂肪性肝病治疗药物中的应用。本发明首次发现ANKRD22与代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)之间存在关联，ANKRD22可作为治疗MAFLD的靶标，且能够适应MAFLD的早期治疗需求。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了ANKRD22作为靶标在制备代谢相关脂肪性肝病治疗药物中的应用。
ANKRD22蛋白是一个具有4个锚蛋白重复基序(ANK)的小分子线粒体蛋白，目前已报道过其在结核病诊治中的应用，但尚未报道过其与代谢相关脂肪性肝病存在联系。
本发明发现，ANKRD22与代谢相关脂肪性肝病之间存在关联，ANKRD22长期缺失会引起MAFLD的发生发展，而ANKRD22的正常表达则有助于避免MAFLD的发生发展，具体表现为：在长期正常饮食饲养后，ANKRD22阴性的小鼠体重和体脂率明显增加，皮下和内脏脂质堆积，尤其肝脏内脂质沉积明显，肝脏甘油三酯水平上调；而ANKRD22阳性的小鼠体重和体脂率增加幅度相对较小，且肝脏内脂质沉积较少，肝脏甘油三酯水平的上调幅度也相对较小。因此，ANKRD22能够作为治疗MAFLD药物开发的靶标。
此外，在MAFLD早期阶段，虽肝脏内存在脂质沉积、脂代谢异常，但外周血中甘油三酯、胆固醇等血脂指标及肝功能指标ALT、AST等尚未提示异常，传统护肝及降脂药物并不适用。而以ANKRD22为靶标的治疗药物能够抑制肝脏内脂质沉积，以及肝脏内甘油三酯水平上调，因而能够适应MAFLD早期治疗的需求，干预MAFLD早期的发生发展，有望突破当前没有针对MAFLD的特异性早期治疗方案的现状。
进一步地，所述药物为减少脂质在肝脏堆积的药物，或者逆转或阻断肝脏脂代谢异常的药物。
进一步地，所述药物为化学药物、核酸、多肽和蛋白质中的一种或多种。
进一步地，所述化学药物包括以下物质中的一种或多种：
(a)结构式(I)～(IV)所示的化合物；
(b)结构式(I)～(IV)所示的化合物中，一个或多个基团被取代和/或一个或多个共价键断裂后的衍生物或混合物；所述衍生物或混合物中，至少含有四个疏水环状结构；
第二方面，本发明提供了提高ANKRD22表达水平的试剂在制备代谢相关脂肪性肝病治疗药物中的应用。
进一步地，所述提高ANKRD22表达水平的试剂为提高单核细胞和/或巨噬细胞中ANKRD22 mRNA和/或ANKRD22蛋白质表达水平的试剂。
本发明人团队研究发现，ANKRD22在肝脏组织细胞内几乎不表达，在ANKRD22长期缺失下，可能是由单核-巨噬细胞(包括肝脏枯否细胞)介导的脂代谢异常(肝脏脂质沉积)，即，由于单核-巨噬细胞内的ANKRD22表达障碍而造成了MAFLD的发生发展。因此，通过提高单核细胞和/或巨噬细胞内ANKRD22的表达水平，能够用于MAFLD的治疗，干预MAFLD的发生发展。
进一步地，所述提高ANKRD22表达水平的试剂为多肽、蛋白质、化学药物和基因编辑体系中的一种或多种。
目前，提高ANKRD22 mRNA或蛋白质表达水平的有效手段包括多肽和蛋白质(包括抗体)，以及化学药物、基因编辑体系，借由这些手段提高ANKRD22的表达水平，能够作为治疗MAFLD的途径。
进一步地，所述提高ANKRD22表达水平的试剂包括γ干扰素和/或其衍生物。
经实验证实，γ干扰素(IFN-γ)能够激活巨噬细胞，促进其中ANKRD22的表达，因此，γ干扰素能够作为治疗MAFLD的治疗手段之一。
进一步地，所述化学药物包括以下物质中的一种或多种：
(a)结构式(I)～(IV)所示的化合物；
(b)结构式(I)～(IV)所示的化合物中，一个或多个基团被取代和/或一个或多个共价键断裂后的衍生物或混合物；所述衍生物或混合物中，至少含有四个疏水环状结构；
经试验，结构(I)～(IV)所示的4种化合物能够促进ANKRD22的表达，有望用于MAFLD的治疗。
进一步地，所述基因编辑体系包括用于将ANKRD22基因和/或ANKRD22蛋白输送入单核细胞和/或巨噬细胞或枯否细胞中的试剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次发现ANKRD22与MAFLD之间存在关联，ANKRD22可作为治疗MAFLD的靶标，且能够适应MAFLD的早期治疗需求；
(2)本发明提供了4种能够以ANKRD22为靶点，促进ANKRD22表达的小分子化合物，对于MAFLD的治疗具有重要的临床潜在应用前景。
附图说明
图1为ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)和ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)在正常饮食喂养32天(8W)和180天(180d)时的脏器组织。其中，图1(A)为各脏器组织的照片；图1(B)为肝脏组织病理切片的镜检图。
图2为ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)和ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)在正常饮食喂养0～184天内的体重变化情况。
图3为ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)和ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)在正常饮食喂养32天(8W)和180天(180d)时的体脂率。
图4为ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)和ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)在正常饮食喂养32天(8W)和180天(180d)时的核磁成像。
图5为ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)和ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)在正常饮食喂养32天和180天时肝脏组织中脂质相关指标检测结果。
图6为ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)和ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)在正常饮食喂养180天时肝脏组织内的脂质水平。其中，图6(A)～图6(F)分别为肝脏组织内胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白(APOB)和脂蛋白a(LPa)的水平。
图7为肝脏和胃黏膜中ANKRD22的表达情况。其中，图7(A)为肝脏和胃黏膜中ANKRD22蛋白表达情况；图7(B)为肝脏和胃黏膜中ANKRD22表达情况。
图8为细胞因子(IFN-γ、IL-4和IL-10)刺激对ANKRD22表达的影响情况。其中，图8(A)为细胞因子刺激对THP-1细胞中ANKRD22表达的影响；图8(B)为细胞因子刺激对ImKC细胞中ANKRD22表达的影响；图8(C)为细胞因子刺激对Lo2细胞、Lx2细胞和THP-1细胞中ANKRD22蛋白表达的影响。
图9为ANKRD22阳性小鼠(WT)和ANKRD22阴性小鼠(KO)在正常饮食喂养32天(8W+)和180天(180d+)时的单核细胞检测结果。其中，图9(A)为单核细胞百分比(MO％)；图9(B)为单核细胞计数(MO#)。
图10为ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)和ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)在正常饮食喂养32天(8W)和180天(180d)时肝脏内CD68阳性巨噬细胞免疫组化染色图。
图11为4种小分子化合物对LS-174T细胞中ANKRD22表达水平的影响情况。
图12为4种小分子化合物对LS-174T细胞中Ca2+浓度的影响情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：ANKRD22阴性小鼠可引起MAFLD的发生发展
将动物养在恒定温度和湿度下，12小时的光-暗循环饲养室内。饲料和水可用自由采食。所有动物的程序，按照动物福利伦理委批准的程序进行。
ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)：来自浙江省中医药大学实验动物中心，ANKRD22基因正常表达；小鼠在出生后，进行正常饮食喂养，每组实验至少6只小鼠。
ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)：委托赛业(广州)生物科技有限公司构建，ANKRD22基因缺失；小鼠在出生后，进行正常饮食喂养，每组实验至少6只小鼠。
在对小鼠给予正常饮食喂养的0～184天内，每周两次测量并记录体重，结果见图2。从图2可以看出，在长期正常饮食喂养的过程中，ANKRD22阴性小鼠的体重增加速度明显高于ANKRD22阳性小鼠。
在正常饮食喂养的第32天(8W)、第180天(180d)，进行小鼠体成分检测，测得的体脂率见图3。从图3可以看出，在长期正常饮食喂养的过程中，ANKRD22阴性小鼠的体脂率明显增加，而ANKRD22阳性小鼠的体脂率增加幅度相对较小。
在正常饮食喂养的第32天(8W)、第180天(180d)，进行小动物核磁成像，结果见图4。从图4可以看出，在长期正常饮食喂养的过程中，ANKRD22阴性小鼠出现了明显的全身皮下脂肪及内脏脂肪堆积，而ANKRD22阳性小鼠体内的脂肪堆积相对较少。
在正常饮食喂养的第32天(8W)、第180天(180d)，将小鼠进行CO2气体麻醉，处死后分离各脏器组织，进行大体拍照，结果见图1(A)。随后，取组织一部分置于4％多聚甲醛中固定过夜，一部分置于液氮中速冻，保存于-80℃。将肝脏组织制成切片，免疫组化染色后进行镜检，结果见图1(B)。从图1可以看出，在长期正常饮食喂养的过程中，ANKRD22阴性小鼠肝脏内脂质沉积明显，肝脏内有脂肪大空泡形成，而ANKRD22阳性小鼠肝脏内脂肪沉积较少，未见明显的脂肪大空泡。
结论：ANKRD22长期缺失会引起小鼠MAFLD的发生发展，而ANKRD22正常表达则有助于避免MAFLD的发生发展。
实施例2：ANKRD22阴性小鼠肝脏内脂代谢异常
取实施例1中正常饮食喂养第32天、第180天的ANKRD22阳性和ANKRD22阴性小鼠的肝脏组织，进行非靶向脂质质谱检测，结果见图5。图5显示了小鼠肝脏内脂质成分的变化情况，从中可以看出，ANKRD22长期缺失可引起小鼠肝脏内甘油三酯水平上调。
将正常饮食喂养第180天的小鼠肝脏组织匀浆后，检测组织内甘油三酯、胆固醇等脂质水平，结果见图6。从图6可以看出，在长期正常饮食喂养过程中，ANKRD22阴性小鼠肝脏内的甘油三酯水平明显上调，而ANKRD22阳性小鼠的上调幅度相对较小。
结论：ANKRD22长期缺失会引起小鼠肝脏内脂代谢异常、甘油三酯水平上调，而ANKRD22正常表达则能够抑制肝脏内脂代谢异常和甘油三酯水平上调。
实施例3：巨噬细胞介导ANKRD22阴性小鼠的脂质沉积
取人和小鼠来源肝脏组织及胃黏膜组织(作为阳性对照)，研磨后提取、裂解蛋白，通过免疫印记和RT-qPCR检测ANKRD22表达情况，结果见图7。从图7可以看出，ANKRD22在胃内高表达，在肝脏内几乎不表达。
对人巨噬细胞THP-1、小鼠肝脏枯否细胞ImKC、人肝细胞Lo2、人肝星状细胞Lx2给予细胞因子(IFN-γ、IL-4和IL-10)刺激，即，在细胞培养液中添加20ng/mL浓度的细胞因子(IFN-γ、IL-4和IL-10)作用48h；通过免疫印记和RT-qPCR检测ANKRD22的表达水平，结果见图8。从图8可以看出，给予IFN-γ刺激后，巨噬细胞、枯否细胞被活化，ANKRD22表达水平上调，而肝细胞、肝星状细胞中ANKRD22表达无明显变化。
在实施例1中，在正常饮食喂养的第32天(8W)、第180天(180d)，将ANKRD22阳性小鼠(ANKRD22-WT)和ANKRD22阴性小鼠(ANKRD22-KO)进行CO2气体麻醉，眼球取血收集血样，检测血常规及血生化，结果见表1，其中，单核细胞百分比(MO％)和单核细胞计数(MO#)见图9。从表1和图9可以看出，ANKRD22长期缺失会引起小鼠外周血单核细胞数量绝对值和百分比显著降低。
表1
在正常饮食喂养的第32天(8W)、第180天(180d)，将ANKRD22阳性小鼠和ANKRD22阴性小鼠处死后取肝脏组织，免疫组化染色CD68标志，结果见图10。从图10可以看出，ANKRD22长期缺失会引起小鼠肝脏内CD68阳性巨噬细胞数量增多。
结论：ANKRD22长期缺失会引起小鼠外周血单核细胞减少，肝脏内CD68阳性巨噬细胞增多；并且，肝脏组织内ANKRD22几乎不表达，而巨噬细胞被激活后，其中的ANKRD22表达上调。因此，在ANKRD22长期缺失下可能是由巨噬细胞(包括肝脏枯否细胞)介导的脂代谢异常(肝脏脂质沉积)。
实施例4：促进ANKRD22表达的小分子化合物
将表2中的4种小分子化合物分别作用于LS-174T细胞(该细胞中ANKRD22本底表达较高)24h，提取、裂解蛋白后，通过免疫印迹检测小分子化合物作用后ANKRD22表达水平的改变，结果见图11。从图11可以看出，这4种小分子均能促进ANKRD22的表达。
将表2中的4种小分子化合物分别作用于THP-1细胞24h后，用Fluo-4流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度变化，并测定FITC平均荧光强度，结果见图12。从图12可以看出，该4个小分子化合物均可增加THP-1细胞内的Ca2+浓度，其中化合物F637-1182和Y504-9387在较低浓度即可增加THP-1细胞内的Ca2+浓度。
表2
结论：表2中的4种小分子化合物能够促进ANKRD22的表达，有望用于MAFLD的治疗。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.ANKRD22作为靶标在制备代谢相关脂肪性肝病治疗药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为减少脂质在肝脏堆积的药物，或者逆转或阻断肝脏脂代谢异常的药物。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为化学药物、核酸、多肽和蛋白质中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述化学药物包括以下物质中的一种或多种：
(a)结构式(I)～(IV)所示的化合物；
(b)结构式(I)～(IV)所示的化合物中，一个或多个基团被取代和/或一个或多个共价键断裂后的衍生物或混合物；所述衍生物或混合物中，至少含有四个疏水环状结构；
5.提高ANKRD22表达水平的试剂在制备代谢相关脂肪性肝病治疗药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高ANKRD22表达水平的试剂为提高单核细胞和/或巨噬细胞中ANKRD22 mRNA和/或ANKRD22蛋白质表达水平的试剂。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述提高ANKRD22表达水平的试剂为多肽、蛋白质、化学药物和基因编辑体系中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述提高ANKRD22表达水平的试剂包括γ干扰素和/或其衍生物。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述化学药物包括以下物质中的一种或多种：
(a)结构式(I)～(IV)所示的化合物；
(b)结构式(I)～(IV)所示的化合物中，一个或多个基团被取代和/或一个或多个共价键断裂后的衍生物或混合物；所述衍生物或混合物中，至少含有四个疏水环状结构；
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因编辑体系包括用于将ANKRD22基因和/或ANKRD22蛋白输送入单核细胞和/或巨噬细胞中的试剂。
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