CN115804432A - 一种脂质立方液晶纳米光敏剂及其制备方法和食品抗菌剂 - Google Patents
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Abstract
本申请属于抗菌技术领域，尤其涉及一种脂质立方液晶纳米光敏剂及其制备方法和食品抗菌剂；本申请提供的脂质立方液晶纳米光敏剂包括脂质立方液晶纳米粒及其包封的天然光敏剂在可见光有较强的吸收能力，具有很高的单线态氧产率，并且脂质立方液晶纳米粒包封的天然光敏剂还具有天然光敏剂容易溶出、天然光敏剂缓释的功效，从而能够增强天然光敏剂光动力抗菌效果，解决现有技术中天然光敏剂抗菌效果有待提高的技术问题。
Description
技术领域
本申请属于抗菌技术领域，尤其涉及一种脂质立方液晶纳米光敏剂及其制备方法和食品抗菌剂。
背景技术
与传统的高温、化学药剂和生物法等抗菌方法相比，光动力抗菌方法采用多靶点作用模式灭活微生物，效率高、能耗低、不易引起细菌耐药，更好地保持食品的营养和感官特性而受到广泛关注。
光动力抗菌方法是指光敏剂吸收特定波长的光(可见光或者近红外)后从基态激发到单重激发态，随后经历系间穿越过程转变成三重激发态，三重激发态的能量可以将三线态氧分子激发形成单线态氧分子，单线态氧分子具有强氧化性，从而可以直接杀死微生物细胞以此达到抗菌的效果；目前常用的天然光敏剂包括姜黄素、叶绿素、金丝桃素以及芦荟大黄素等，其中，芦荟大黄素在紫外光谱区域具有中等的光吸收能力，且具有抗肿瘤、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎等抗菌抗炎固有功效，然而与姜黄素、叶绿素、金丝桃素类似，芦荟大黄素同样存在易团聚、稳定性差以及单线态氧产率相对较低的缺陷，因此，现有技术中天然光敏剂抗菌效果不佳。
发明内容
有鉴于此，本申请提供了一种脂质立方液晶纳米光敏剂及其制备方法和食品抗菌剂，用于解决现有技术中天然光敏剂抗菌效果有待提高的技术问题。
本申请第一方面提供了一种脂质立方液晶纳米光敏剂，包括两亲性脂质、天然光敏剂以及水；
所述两亲性脂质在水中形成的脂质立方液晶纳米粒包封所述天然光敏剂。
优选的，所述天然光敏剂包括姜黄素、叶绿素、金丝桃素或芦荟大黄素中的任意一种或至少两种。
优选的，所述两亲性脂质包括单油酸甘油酯。
优选的，所述脂质立方液晶纳米光敏剂还包括稳定剂。
优选的，所述稳定剂为泊洛沙姆407。
优选的，所述脂质立方液晶纳米光敏剂的粒径为245.9nm。
本申请第二方面提供了一种脂质立方液晶纳米光敏剂的制备方法，制备方法包括步骤：将溶解两亲性脂质和天然光敏剂的两亲性脂质的乙醇溶液滴加到稳定剂的水溶液中，搅拌挥发乙醇，超声分散，得到脂质立方液晶纳米光敏剂。
优选的，以质量份计算，两亲性脂质的乙醇溶液包括两亲性脂质50～150质量份、天然光敏剂1～3质量份；
所述稳定剂的水溶液包括稳定剂15～30质量份、水15-25质量份。
优选的，所述搅拌的转速为400～600r/min，时间为2～4h。
优选的，所述超声分散的功率为300～600w，时间为3～6min。
优选的，所述两亲性脂质的乙醇溶液的制备方法包括：将两亲性脂质、天然光敏剂加入无水乙醇中溶解，得到两亲性脂质的乙醇溶液。
优选的，所述稳定剂的水溶液的制备方法包括：将稳定剂加入到蒸馏水中溶解，得到稳定剂的水溶液。
本申请第三方面提供了一种食品抗菌剂，包括上述脂质立方液晶纳米光敏剂。
作为优选，所述脂质立方液晶纳米光敏剂中天然光敏剂为芦荟大黄素；
所述食品抗菌剂为金黄色葡萄球菌污染食品抗菌剂。
需要说明的是，相比姜黄素，芦荟大黄素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度较少且同一时间内产生的单线态氧更多，因此，对于金黄色葡萄球菌污染食品，优选使用芦荟大黄素脂质立方液晶纳米光敏剂。
综上所述，本申请提供了一种脂质立方液晶纳米光敏剂及其制备方法和食品抗菌剂，其中，脂质立方液晶纳米光敏剂包括脂质立方液晶纳米粒及其包封的天然光敏剂，脂质立方液晶纳米粒具有独特的内部双水道结构和巨大的膜表面积可以包封各种不同极性和剂量的天然光敏剂，改善天然光敏剂分散性与稳定性，并且与传统的通过化学方法或包埋天然光敏剂的方式形成纳米粒会影响天然抗菌剂光动力反应相比，脂质立方液晶纳米粒包封的天然光敏剂在可见光有较强的吸收能力，并具有很高的单线态氧产率，并且脂质立方液晶纳米粒包封的天然光敏剂还具有天然光敏剂容易溶出、天然光敏剂缓释的功效，从而能够增强天然光敏剂光动力抗菌效果，解决现有技术中天然光敏剂抗菌效果有待提高的技术问题。
附图说明
为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例3提供的脂质立方液晶纳米光敏剂制备流程示意图；
图2为本申请实施例3提供的脂质立方液晶纳米光敏剂、脂质立方液晶纳米粒以及芦荟大黄素抗菌光动力测试结果图；
图3为本申请实施例3提供的脂质立方液晶纳米光敏剂、脂质立方液晶纳米粒以及芦荟大黄素单线态氧的测试结果图；
图4为本申请实施例3提供的脂质立方液晶纳米光敏剂、脂质立方液晶纳米粒以及芦荟大黄素介导光动力后细菌结构表征测试结果图。
具体实施方式
本申请提供了一种脂质立方液晶纳米光敏剂及其制备方法和食品抗菌剂，用于解决现有技术中天然光敏剂抗菌效果有待提高的技术问题。
下面将结合附图对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1
本申请实施例1提供了一种脂质立方液晶纳米光敏剂，脂质立方液晶纳米光敏剂的组成包括两亲性脂质、天然光敏剂以及水；两亲性脂质在水中形成的脂质立方液晶纳米粒包封天然光敏剂，脂质立方液晶纳米粒是指一定浓度的两亲性脂质分散在水溶液中自组装成含双连续水区和脂质区的闭合脂质双层“蜂窝状“结构，该结构具有独特的内部双水道结构和巨大的膜表面积，因而能够包封各种不同极性和剂量的天然光敏剂。
作为优选，天然光敏剂包括姜黄素、叶绿素、金丝桃素或芦荟大黄素中的任意一种或至少两种，本申请进一步优选芦荟大黄素，芦荟大黄素在紫外光谱区域具有中等的光吸收能力，在紫外光谱区域具有较高的单线态氧产率，进行光动力杀菌；同时，相比姜黄素，芦荟大黄素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度较少且同一时间内产生的单线态氧更多。
作为优选，本申请使用的两亲性脂质为单油酸甘油酯。
作为优选，还加入稳定剂，可以提高两亲性脂质在水中形成的脂质立方液晶纳米粒包封天然光敏剂的体系稳定性，防止沉降聚集，本申请中采用的稳定剂为泊洛沙姆407。
本申请提供的脂质立方液晶纳米光敏剂包括脂质立方液晶纳米粒及其包封的天然光敏剂，脂质立方液晶纳米粒具有独特的内部双水道结构和巨大的膜表面积可以包封各种不同极性和剂量的天然光敏剂，改善天然光敏剂分散性与稳定性，并且与传统的通过化学方法或包埋天然光敏剂的方式形成纳米粒会影响天然抗菌剂光动力反应相比，脂质立方液晶纳米粒包封的天然光敏剂在可见光有较强的吸收能力，具有很高的单线态氧产率；同时，天然光敏剂进入立方液晶结构中后由晶体颗粒转变成无定形的分子态，均匀分布于亲脂域中，脂质立方液晶纳米粒双连续水通道与脂质双分子层的巨大交界面积显著增加了天然光敏剂的溶出表面积，天然光敏剂在亲脂域中有较大的溶解度，在溶出层和介质之间形成较大的药物浓度差，可进一步增大天然光敏剂溶出程度，有效克服天然光敏剂溶解屏障；并且，脂质立方液晶的可降解性能够发挥缓释功效，能够缓慢释放天然抗菌剂持续抗菌，有利于天然抗菌剂长效抗菌，脂质立方液晶的脂质双分子层，具有类细胞结构，与细胞有很强的亲和性，显著提高了芦荟大黄素在水中的溶解度、生物利用度，从而解决现有技术中天然光敏剂抗菌效果有待提高的技术问题。
实施例2
本申请实施例2提供了用实施例1所述脂质立方液晶纳米光敏剂的一种制备方法，其中，天然光敏剂选自芦荟大黄素，制备方法包括制备两亲性脂质的乙醇溶液的步骤、制备稳定剂的水溶液的步骤以及制备脂质立方液晶纳米光敏剂的步骤。
其中，制备两亲性脂质的乙醇溶液的步骤包括称取0.1g单油酸甘油酯置于瓶中，加入2mg芦荟大黄素，再加入无水乙醇1ml，超声30min，水浴60℃加热搅拌30min使其充分溶解，制备得到两亲性脂质的乙醇溶液。
制备稳定剂的水溶液的步骤包括称取25mg泊洛沙姆407置于100ml烧杯中，加入20ml蒸馏水，水浴60℃中加热使溶解，制备得到稳定剂的水溶液。
制备脂质立方液晶纳米光敏剂的步骤包括将两亲性脂质的乙醇溶液缓慢滴加到稳定剂的水溶液中，以500r/min室温下搅拌3h，挥发乙醇，再300W超声5min，超声20次(间隔5s)，制备得到脂质立方液晶纳米光敏剂，脂质立方液晶纳米光敏剂为粒径较均一的芦荟大黄素脂质立方液晶纳米光敏剂混悬液。
实施例3
本申请实施例3提供了用实施例1所述脂质立方液晶纳米光敏剂的另一种制备方法，其中，天然光敏剂选自芦荟大黄素，制备方法包括制备两亲性脂质的乙醇溶液的步骤、制备稳定剂的水溶液的步骤以及制备脂质立方液晶纳米光敏剂的步骤。
其中，制备两亲性脂质的乙醇溶液的步骤包括称取0.05g单油酸甘油酯置于瓶中，加入3mg芦荟大黄素，再加入无水乙醇1ml，超声30min，水浴55℃加热搅拌30min使其充分溶解，制备得到两亲性脂质的乙醇溶液，作为A相。
制备稳定剂的水溶液的步骤包括称取15mg泊洛沙姆407置于100ml烧杯中，加入15ml蒸馏水，水浴55℃中加热使溶解，制备得到稳定剂的水溶液，作为B相。
制备脂质立方液晶纳米光敏剂的步骤包括将两亲性脂质的乙醇溶液缓慢滴加到稳定剂的水溶液中，以500r/min室温下搅拌2h，挥发乙醇，再500W超声6min，超声30次(间隔5s)，制备得到脂质立方液晶纳米光敏剂，脂质立方液晶纳米光敏剂为粒径较均一的芦荟大黄素脂质立方液晶纳米光敏剂混悬液。
实施例4
本申请实施例4提供了一种食品抗菌剂，包括实施例1-3中所述脂质立方液晶纳米光敏剂。
本申请提供的食品抗菌剂能吸收可见光后从基态激发到单重激发态，随后经历系间穿越过程转变成三重激发态，三重激发态的能量可以将三线态氧分子激发形成单线态氧分子，单线态氧分子具有强氧化性，配合芦荟大黄素等天然光敏剂本身具有的抗菌抗炎功效，可以直接杀死微生物细胞以此达到抗菌的效果，并且由于芦荟大黄素等天然光敏剂来源于芦荟叶、掌叶大黄或药用大黄的根茎或其他天然植物，作为食品抗菌剂使用较为安全。
对比例1
本申请对比例1提供了一种脂质立方液晶纳米粒，制备方法与实施例3的区别在于，脂质立方液晶纳米粒没有包封天然光敏剂。
测试例1
本申请测试例1提供了实施例3制备得到的脂质立方液晶纳米光敏剂(AE-LCNP)、对比例1制备得到的脂质立方液晶纳米粒(LCNP)以及芦荟大黄素(AE)的性能测试，性能测试包括抗菌光动力测试、单线态氧的测试以及细菌结构表征测试。
其中，抗菌光动力测试过程为挑取3-5个独立的菌落至新鲜的LB液体培养基中37℃下培养12h生长到稳定期，标定菌液浓度，稀释至108cfu/mL后，将菌悬液1：100稀释为106cfu/mL的菌悬液，备用。将AE-LCNP、LCNP和AE用蒸馏水稀释10倍，将0.5ml稀释药液和0.5ml菌液加入到1mlEP管中作为实验组，0.5ml蒸馏水和0.5ml菌液加入到1ml离心管中作为空白组，用蓝光灯照射10min，避光处理为对照试验组。未处理的菌液空白作为100％的细菌生长对照，每个抑菌实验平行重复三次。抗菌光动力测试结果如图2所示，脂质立方液晶纳米粒(LCNP)中细菌大规模生长繁殖，脂质立方液晶纳米粒(LCNP)抗菌率为12％，基本上没有抗菌性能；而芦荟大黄素(AE)中细菌小规模生长，质立方液晶纳米粒(LCNP)抗菌率为71％，具有较好的抗菌性能，而脂质立方液晶纳米光敏剂(AE-LCNP)中细菌没有生长，脂质立方液晶纳米光敏剂(AE-LCNP)抗菌率接近100％，这说明脂质立方液晶纳米粒包封芦荟大黄素等天然光敏剂后，能够提高芦荟大黄素抗菌性能。
单线态氧的测试过程为以吲哚菁绿(ICG)用作检测单线态氧的探针。将ICG(2mg)溶于10mL蒸馏水中，形成浓度为200μg/mL的原液，将其置于黑暗中保存。将稀释药液与ICG溶液以9：1比例混合，然后将光照组用420-430nm的蓝光照射10min。每隔20min，使用紫外-可见吸收光谱测量溶液在780nm处的吸光度，以检测单线态氧的产生。设置暗对照组与只加ICG的空白对照，以检查在不同照射时间下产生的单线态氧。实验重复三次，取平均值；单线态氧的测试结果如图3所示，未经光照的组分OD值基本保持不变，可见避光条件下不产生单线态氧。光照后脂质立方液晶纳米光敏剂(AE-LCNP)的OD值下降程度比芦荟大黄素(AE)和脂质立方液晶纳米粒(LCNP)的OD值大，说明脂质立方液晶纳米光敏剂(AE-LCNP)可以释放更多的单线态氧杀死细菌。
细菌结构表征测试过程为将金葡菌过夜培养，然后将培养后的金葡菌取1ml离心(10min，4000rpm)弃上清液，并用pbs缓冲溶液洗涤三次后与1ml稀释药液混合，处理15min后光照10min，然后进行离心(10min，8000rpm)，处理完后用PBS清洗三次，然后用2.5％戊二醛固定过夜，离心并用pbs清洗，再用30％、50％、70％、90％、100％不同浓度梯度的乙醇溶液进行脱水，每次处理5min，脱水结束后用无水乙醇重悬并分散，用透射电镜观察细菌形态；细菌结构表征测试结果如图4所示，从图4可以看出，光照后脂质立方液晶纳米粒(LCNP)组的细胞仍然具有光滑的细胞表面，细菌细胞结构没有被破坏，说明脂质立方液晶纳米粒(LCNP)没有发挥抗菌效果，而光照处理后芦荟大黄素(AE)以及脂质立方液晶纳米光敏剂(AE-LCNP)组中的细菌细胞发生细胞变形和表面塌陷，细胞质内容物泄漏，说明光照处理后芦荟大黄素(AE)以及脂质立方液晶纳米光敏剂(AE-LCNP)均能发挥抗菌效果，并且，脂质立方液晶纳米光敏剂(AE-LCNP)抗菌效果更好，这是由于脂质立方液晶纳米粒包封的芦荟大黄素在可见光有较强的吸收能力，并具有很高的单线态氧产率，并且脂质立方液晶纳米粒包封的芦荟大黄素还具有芦荟大黄素容易溶出、芦荟大黄素缓释的功效，从而能够增强芦荟大黄素光动力抗菌效果。
以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种脂质立方液晶纳米光敏剂，其特征在于，包括两亲性脂质、天然光敏剂以及水；
所述两亲性脂质在水中形成的脂质立方液晶纳米粒包封所述天然光敏剂。
2.根据权利要求1所述的一种脂质立方液晶纳米光敏剂，其特征在于，所述天然光敏剂包括姜黄素、叶绿素、金丝桃素或芦荟大黄素中的任意一种或至少两种。
3.根据权利要求1所述的一种脂质立方液晶纳米光敏剂，其特征在于，所述两亲性脂质包括单油酸甘油酯。
4.根据权利要求1所述的一种脂质立方液晶纳米光敏剂，其特征在于，所述脂质立方液晶纳米光敏剂还包括稳定剂。
5.根据权利要求1所述的一种脂质立方液晶纳米光敏剂，其特征在于，所述脂质立方液晶纳米光敏剂的平均粒径为245.9nm。
6.权利要求1-5任一项所述的一种脂质立方液晶纳米光敏剂的制备方法，其特征在于，制备方法包括步骤：将溶解两亲性脂质和天然光敏剂的两亲性脂质的乙醇溶液滴加到含有稳定剂的水溶液中，搅拌挥发乙醇，超声分散，得到脂质立方液晶纳米光敏剂。
7.根据权利要求6所述的一种脂质立方液晶纳米光敏剂的制备方法，其特征在于，以质量份计算，所述两亲性脂质的乙醇溶液包括两亲性脂质50～150质量份、天然光敏剂1～3质量份；
所述稳定剂的水溶液包括稳定剂15～30质量份、水15-25质量份。
8.根据权利要求6所述的一种脂质立方液晶纳米光敏剂的制备方法，其特征在于，所述两亲性脂质的乙醇溶液的制备方法包括：将两亲性脂质、天然光敏剂加入无水乙醇中溶解，得到两亲性脂质的乙醇溶液。
9.根据权利要求6所述的一种脂质立方液晶纳米光敏剂的制备方法，其特征在于，所述稳定剂的水溶液的制备方法包括：将稳定剂加入到蒸馏水中溶解，得到稳定剂的水溶液。
10.一种食品抗菌剂，其特征在于，包括权利要求1-5任一项所述的脂质立方液晶纳米光敏剂。
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