CN115803459A - 早期识别植物中的病原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及早期发现植物的病原以及识别这种病原针对化学或生物防治剂的抗性标志。本发明的主题是一种系统、一种方法和一种计算机可读介质，用于借助于序列分析来早期发现在植物处、其上或其中存在病原以及识别抗性标志。

Description

早期识别植物中的病原
本发明涉及早期识别在植物或植物部位中、其附近或其表面的病原以及识别这种病原针对化学或生物防治剂的抗性的标志。本发明的主题是一种系统、一种方法和一种计算机可读介质，用于借助于序列分析来早期识别在植物或植物部位中、其附近或其表面上存在的病原以及识别抗性标志。
早期识别病原对植物的感染是非常重要的。对感染的识别越早，就越能采取适当的措施来防止疾病的爆发和/或传播和/或避免对植物的伤害。
WO2017/194276描述了一种用于检测植物疾病的方法，所述方法基于对植物部位的图片的分析。然而植物可能已被病原群落感染，而不出现可见的症状。另外无法借助于此类图像分析来确定病原群落的抗性状态。
US20120088696A1公开了一种微电化学的多路PCR平台，所述平台可以用于实时地扩增、研究和定量分析目标核苷酸并且例如可以用于快速检测植物疾病。然而，平台必须分别专门为了识别特定的疾病而各自进行适配并且在应用中是相对高耗费的。
有利的是，不仅在早期识别病原，而且还在早期状态下就已经可以确定病原群落中针对防治剂的抗性。
WO2019149626A1涉及在田地中识别抗性标记物。
本发明是对在WO2019149626A1中说明的技术方案的补充。本发明将确定抗性与早期识别植物中的病原相组合。在本说明书中提出的技术方案是高效的、自适应地并且可以向病原和抗性的早期识别中引入其他信息。
本发明的第一个主题提供一种包括以下步骤的方法：
-从植物或植物生长的介质中采集样品，
-识别所述样品中的病原，
-识别所述病原针对防治剂的抗性的标志，
●其中所述病原的识别以及所述抗性的标志的识别借助于对所述样品中的单独核酸或单独肽测序来完成，其中在对单独核酸或单独肽测序时确定核苷酸序列或氨基酸序列，其中将所述核苷酸序列或氨基酸序列与参考序列进行比较，其中所述测序在第一阶段和第二阶段两个阶段中进行，
●其中在所述第一阶段中，在对每一种核酸或每一种肽测序期间将分别确定的序列与至少一个病原序列进行比较，并且
■对于所确定的序列与所述至少一个病原序列不一致的情况，中断对这种核酸或这种肽的进一步测序，
■对于所确定的序列与病原序列一致的情况，确定具有所述病原序列的病原，并且基于所确定的病原来确定至少一种抗性标记物，并且转换到所述第二阶段中，
●其中在所述第二阶段中，将所述样品中的核酸或肽的序列与所确定的所述至少一种抗性标记物和/或与无抗性序列进行比较。
本发明的另一个主题是一种系统，包括：
-测序单元，
-控制及计算单元，以及
-至少一个数据存储器，其中对于至少一种病原存储有至少一个病原序列和至少一种抗性标记物，
其中所述测序单元被配置为用于对植物或植物生长的介质中的样品中的核酸或肽进行测序，并且由此确定在所述样品中的核苷酸或氨基酸的序列，
其中所述测序单元被配置为用于在确定所述序列期间将分别确定的序列传输给所述控制及计算单元，
其中所述控制及计算单元被配置为用于在第一阶段中将各个所传输的核酸或肽的序列与至少一个病原序列进行比较，并且
●对于所传输的序列与所述至少一个病原序列不一致的情况，使得所述测序单元中断对相应的核酸或相应的肽的进一步测序，
●对于所传输的序列与病原序列一致的情况，确定具有所述病原序列的病原，并且利用所确定的病原来确定至少一种抗性标记物，并且转换到第二阶段中，
其中所述控制及计算单元被配置为用于在所述第二阶段中将所述样品中的核酸或肽的序列与所确定的所述至少一种抗性标记物和/或无抗性序列进行比较。
本发明的另一个主题是一种包括命令的计算机可读(存储)介质，所述命令在由计算机执行时使所述计算机执行以下步骤：
-对于多个核酸或肽：从测序单元接收不断增长的在相应的核酸或相应的肽中的核苷酸或氨基酸的排列，
-在接收不断增长的排列期间的第一阶段中：检测核苷酸或氨基酸的所述排列是否一次或多次被包含在至少一个病原序列中，
-对于所述排列没有被包含在病原序列中的情况：将信号传输至所述测序单元，以便中断对所述核酸或肽的进一步测序，
-对于所述排列与病原序列一致的情况：确定具有所述病原序列的病原，并且确定至少一个参考标记物，并且启动第二阶段，
-在所述第二阶段中：将核苷酸或氨基酸的所述排列与所述至少一个参考标记物和/或无抗性序列进行比较。
本发明的另一个主题是一种包括命令的计算机程序，所述命令在由计算机执行所述计算机程序时使所述计算机执行以下步骤：
-对于多个核酸或肽：从测序单元接收不断增长的在相应的核酸或相应的肽中的核苷酸或氨基酸的排列，
-在接收不断增长的排列期间的第一阶段中：检测核苷酸或氨基酸的所述排列是否一次或多次被包含在至少一个病原序列中，
-对于所述排列没有被包含在病原序列中的情况：将信号传输至所述测序单元，以便中断对所述核酸或肽的进一步测序，
-对于所述排列与病原序列一致的情况：确定具有所述病原序列的病原，并且确定至少一个参考标记物，并且启动第二阶段，
-在所述第二阶段中：将核苷酸或氨基酸的所述排列与所述至少一个参考标记物和/或无抗性序列进行比较。
本发明的优选实施方式存在于从属权利要求、本说明书以及附图中。
下面将详细阐释本发明，而不在本发明主题(方法、系统、计算机可读介质、计算机程序)之间进行区分。而以下的阐释应以类似方式适用于所有发明主题，无论其是在何种上下文(方法、系统、计算机可读介质、计算机程序)中进行的。
当在本说明书中或在权利要求书中以一定顺序提及步骤时，这并不一定意味着本发明受限于所提及的顺序。而是可以想到，这些步骤还可以以不同顺序或还可以彼此并行地执行；如果一个步骤以另一个步骤为基础，则必然需要使在基础之上的步骤稍后执行(在具体情况下将会变得清楚)。所提及的顺序由此为本发明的优选的实施方式。
本发明提供了以下手段，即，允许使用者在早期识别病原对植物的感染以及病原针对防治剂的抗性的标志。
术语“病原(Krankheitserreger)”理解为在其他生物体中导致损害健康的过程的微生物或亚细胞刺激体。病原例如可以为藻类、细菌、寄生虫、真菌、朊病毒蛋白、原生生物、病毒或类病毒。在本说明书中，术语“病原体(Pathogen)”与术语病原同义使用。优选地，本发明涉及早期识别损害植物的真菌。
术语“防治剂”理解为可以有效防治病原和/或其传播的试剂。防治剂的例子为杀真菌剂、杀虫剂和除草剂。防治剂通常包括一种或多种活性成分。“活性成分”是在病原中具有特定效果或引起特定反应的化学或生物物质。
术语“抗性”理解为一类的各个病原的特性，这种特性表现在这些个体能够耐受用通常可防治此类病原的防治剂进行的治疗并且能够正常完成或进一步扩展其发育周期。
术语“使用者”理解为实施本发明的人；使用者尤其是利用本发明系统和/或使用安装有本发明计算机程序的计算机以便实施本发明的人。
可以区分出两类抗性；靶点特异的抗性，也被称为靶位点抗性，以及代谢抗性，也被称为非靶位点抗性。
靶点特异的抗性通常由于与防治剂在病原中的靶点(靶)相关联的单个基因处的突变导致。突变例如可以促成目标蛋白质的更强的表达或者促成防治剂的活性成分所结合的位点的变化。对于此类抗性，存在分子生物学测试。
与靶点没有直接关联的抗性(非靶位点抗性)归因于所有其他的机制，例如病原吸收防治剂变缓。
利用本发明尤其可以在早期识别靶位点抗性。
本发明所关注的病原/病原体主要感染植物、尤其栽培植物。术语“栽培植物”理解为通过人类干预而针对性地作为农业作物培育的植物。所生长的栽培植物部位可以适合于人类和/或动物食用。
基本上可想到的是，本发明教导的内容还可以应用到动物、尤其是牲畜上。因此，本发明的另一个主题是在本说明书中讨论的教导内容应用在动物、尤其是牲畜上。
在第一步骤中，采集至少一个样品。术语“采集”不应以任何受限的方式理解。同义术语的一个例子是术语“采样”。
从植物或植物生长的介质中取得样品。术语“介质”不仅包含土壤，还应包括与植物处于接触并且支撑植物和/或为其供应养分的任何其他基质。在水培植物的情况下还可以从包围水培植物的水中取得样品。
优选采集植物的部位作为样品，例如叶、花、茎、根、花粉、表皮和/或所提及的组成部分的一部分和/或所提及的组成部分中的多个组成部分和/或其他组成部分。还可以从“分泌物”如花蜜或树脂中取得样品。优选将植物的各种组织类型取出并组合，以便覆盖多种不同的病原。优选地，植物在采样的时间点处于发育的早期阶段。
植物的发育阶段例如可以以所谓的BBCH编码的形式给出。缩写BBCH在官方上代表联邦农业和林业生物研究中心、联邦植物品种办公室和化学工业(BiologischeBundesanstalt,das Bundessortenamt und die CHemische Industrie)。用于对单子叶和双子叶植物的物候学发育阶段进行统一编码的扩展BBCH量表是联邦农业和林业生物研究中心(BBA)、联邦植物品种办公室(BSA)、农业行业联盟(IVA)和哥洛斯贝伦/埃尔夫特(Groβbeeren/Erfurt)蔬菜与园艺学院(参见例如https://www.julius-kuehn.de/publikationsreihen-des-jki/bbch-skala/)。
优选地，在采样的时间点植物处于BBCH量表的第1主要生长阶段(长叶(主枝))或第2主要生长阶段(形成侧枝)或第3主要生长阶段(主枝/长茎/抽枝(主茎)长长或莲座生长)或第4主要生长阶段(营养性植物部位或营养性繁殖器官/花序或圆锥花序的发育)或者第5主要生长阶段(出现花序)或第6主要生长阶段(开花)。已经发现，在这些早期阶段已经可以在植物中、其附近或其表面检测到真菌和/或真菌孢子，然而植物不一定具有已经可见的疾病症状。在这样的早期时间点的识别允许对植物的早期治疗，以便抑制疾病的爆发和/或病原的增殖和/或传播和/或病原转移到相邻的植物上或者降低其风险。
采样可以自动化地进行。“自动化地”是指，采样在不需人帮助的情况下由一台机器或由多台机器进行。这样的用于自动化采样的机器或设备在本说明书中还被称为“采样单元”。
采样可以借助于移动设备或通过移动设备来进行，所述设备例如在栽培植物的田地中和/或在田地上方移动或被移动。可想到的是，例如使用(优选无人的)地面机器和/或(优选无人的)空中载具(例如无人机)和/或机器人。在温室中适合使用用于自动化采样的机器人。
但是还可以通过固定地建造在一个位置处的一个或多个设备来进行采样。
还可想到的是，使用者(人)自已进行采样。
将样品送至测序单元。所述测序单元被配置为用于确定处于样品中的核酸或肽的序列。
“核酸”是由各种构造单元、即核苷酸构成的大分子，它们在生物体和亚细胞体(例如病毒)中包含遗传信息。核酸在自然界中以两种形式存在：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA是从单细胞细菌到多细胞哺乳动物的所有生物的遗传物质。若干病毒使用RNA而非DNA作为其遗传物质。优选将处于样品中的DNA链测序。
“肽”是包含氨基酸之间的肽键的有机化合物。长肽链还被称为蛋白质。蛋白质存在于每个细胞中并且用作分子“工具”并且依据特殊的结构完成不同的任务，其方式为例如可以实现细胞运动、运输代谢产物、泵送离子、催化化学反应或识别信号物质。在本说明书中术语“肽”和“蛋白质”同义使用。
术语“测序”理解为确定在核酸中的核苷酸排列或者在肽(蛋白质)中的氨基酸排列。相对应地，序列是核苷酸顺序或氨基酸排列。术语“序列(Sequenz)”和“排列(Abfolge)”在本说明书中同义使用。
可想到的是，在所述样品在能被送至测序之前准备该样品。在这样的准备中样品中的细胞被破坏，例如以便释放DNA分子、随后对其进行提取并且在适当时将其碎片化。用于进行准备的相关措施已在现有技术中进行说明(参见例如R.P.Schaudies(Ed.):Biological Identification,Woodhead Publishing Series in Electronic andOptical Materials:Number 59,Elsevier 2014,ISBN 978-0-85709-501-5；JianpingXu:Next-generation Sequencing,Caister Academic Press 2014,ISBN978-1-908230-33-1；Vijai Bhadauria:Next-generation Sequencing and Bioinformatics for PlantScience,Caister Academic Press 2017,ISBN978-1-910190-65-4)。可以使用样品准备单元进行样品处理，其可以为采样单元和/或测序单元的组成部分或者可以为分开的单元。
在样品准备时可以对现有核酸的特定区域进行扩增；然而扩增并非一定必需的。对于一个物种特征性的区域或者可以唯一和/或可靠地识别一个物种的区域进行扩增可能是有意义的。作为此类区域的例子，可以提及ITS区域。
ITS区域(ITS：Internal Transcribed Spacer，内部转录间隔区)是在系统发生学研究中经常使用的核苷酸序列。ITS区域为具有高可变性序列的基因间的未编码区域；它因此特别适合用于在种、属和科的低分类学层级上确定亲缘关系。这种区域的序列分析尤其可是用于真菌的属和科的识别(参见例如T.M.Pryce等人:Rapid Identification offungi by sequencing the ITS l and ITS2 regions using an automated capillaryelectrophoresis System；Medical Mycology October 2003,4 1,369-381；R.H.Nilsson等人:A Comprehensive,Automatically Updated Fungal ITS Sequence Dataset fiorReference-Based Chimera Control in Environmental Sequencing Efforts,MicrobesEnviron.2015Jun；30(2):145-150；A.J.Buehler等人:Internal transcribed spacer(ITS)sequencing reveals considerable fungal diversity in dairy products,DairySei.2017；100(11):8814-8825；C.L.Schoch等人:Nuclear ribosomal internaltranscribed spacer(ITS)region as a universal DNA barcode marker fior Fungi,PNAS April 17,2012 109(16)6241-6246)。通过将所确定的ITS序列与待识别的真菌菌株的5.8S rRNA基因序列进行对比，确定了用作分类学组别关联的基础的序列相似性。ITS区域的核苷酸序列为约500-600个碱基对。除了对于所有真菌而言的序列相同的高度保守区之外，还存在可变区。这些可变区可以是对于真菌的种、属或组而言特征性的识别标志。由此，对这些子序列的分析可以实现对真菌菌株的分类学关联。
由于ITS区域作为分别具有多个数百次至数千次串联重复的副本的基因族多次出现，所以ITS区域针对单一的核基因按计量比被过度表达并且由此对于分子系统发生学研究中是容易获取的。对于分子系统发生学研究而言使用ITS区域的另一个优点是由其位置决定的。ITS区域位于rRNA基因簇中。它由两个序列片段组成，即内部转录间隔区1(ITS-1)和内部转录间隔区2(ITS-2)，这些内部转录间隔区位于高度保守的rDNA基因26S、5.8S和18S之间。由于这种位置，高度保守的rDNA基因的rDNA序列片段可以用作引物序列。ITS-1和ITS-2序列借助于PCR的扩增因此是容易实现的。
对样品中存在的核酸或肽的测序通过测序单元来进行。优选地，借助于基于纳米技术的方法进行测序(参见例如M.Loose等人:Real-time selective sequencing usingnanopore technology,Nature Methods 2016,Vol.13No.9,751-758)。在纳米孔测序中例如将核酸从酶(解螺旋酶)单独地运输穿过位于不传导的聚合物隔膜中的纳米尺寸的孔。如果在这个隔膜上施加电压，则产生穿过孔的离子流，其大小取决于孔中的碱基。因此可以通过测量DNA/RNA易位穿过孔期间的离子电流来测量碱基排列以及对碱基的任何修饰。
本发明的测序可以在第一阶段和第二阶段至少两个阶段中进行。第一阶段用于了解样品中到底是否存在病原。只有当在第一阶段中识别了病原时，才进行第二阶段。第二阶段用于识别所识别病原针对一种或多种防治剂的抗性的标志。在这两个阶段中对核酸或肽进行测序并且由此确定核苷酸排列和氨基酸排列。在这两个阶段中在确定过程期间将所确定的序列与参考序列进行比较。在第一阶段中进行所确定的排列与至少一个病原序列的比较。优选地与多个病原序列进行比较。如果在所确定的核苷酸排列或氨基酸排列与病原序列之间出现一致性，则可以认为所述病原被包含在样品中。以此方式可以确定被包含在样品中的病原。在第二阶段中进行所确定的排列与过去已经在所确定的病原上观察到的至少一种抗性标记物和/或与无抗性序列的比较。这种比较用于识别所识别的病原针对一种或多种防治剂存在抗性的标志。无抗性序列是不具有病原针对防治剂的抗性的标志的、所述病原的核苷酸排列或氨基酸排列。病原序列、抗性标记物和无抗性序列为可以例如从一个或多个数据库中得知的参考序列。
首先应详细考察第一阶段。
通常，在样品中存在的核酸或肽的一大部分归因于植物，尤其当所述样品为植物的组成部分时。然而植物核酸或植物蛋白质的序列的确定具有次要的意义。因此，根据本发明，一旦发现核酸或肽不是源自病原(而是例如源自植物)，就中断测序的第一阶段中对核酸或肽的测序。
为此在测序期间将测序结果与一个或多个病原序列进行比较。即，在确定核酸中的核苷酸排列或肽中的氨基酸排列的同时，分别检查所述核苷酸排列或氨基酸排列是否被包含在一个或多个病原序列中。以一个例子来阐释这一点。首先确定核酸中的第一个核苷酸，然后确定第二个，以此类推。核苷酸的排列随着每一个继续确定的核苷酸而增长。当已经确定了排列中的另一个核苷酸时，检查(不断增长的)排列是否被包含在一个或多个病原序列中。例如四个核苷酸的排列有较高概率被包含在病原序列的一个或多个位置处。但是在二十个核苷酸的排列的情况下已经可能使得这个排列不再会出现在病原序列中的任何位置。一旦发现在测序时确定的核苷酸的排列没有被包含在一个或多个病原序列的任何位置处，则可以结束测序；此时对所述核苷酸排列中的其他核苷酸的任何确定都是无意义的；已经了解到当前被测序的核酸不可能是病原的核酸。这类似地还适用于确定样品中的肽中的氨基酸排列。
用于在测序的第一阶段中进行比较的所述至少一个病原序列为经定义的病原的对于所述病原(或经定义的病原组，例如一个种或属或亚科或科或亚目或目或纲的病原)而言特异的核苷酸序列或氨基酸序列。借助于这样的特异的病原序列可以由此推导出具体的病原(或者病原组)。这样的病原序列可以例如为完全或部分包括ITS区域的核酸序列。无论如何，所述病原序列必须为与作为研究对象的植物的序列不同的序列。
在一个优选的实施方式中，基于关于植物、关于采样时间点、关于采样位置、关于在采样时间点和/或在采样时间点之前经限定的时间段期间(例如天气数据和/或气候数据)的环境条件(温度、空气压力、空气湿度、降水量等)和/或关于历史(例如在过去观察到的病原和/或疾病)的信息来(自动)选择一个或多个病原序列。例如，某些疾病仅在某些植物中出现。当取得某一种植物的样品时，可以选择可以感染这种植物并且可以触发疾病的病原的病原序列。另外，病原通常仅在某些区域中并且仅在某些环境条件下出现。采样的位置给出了关于区域和通常在这些区域中出现的病原的信息。在采样时间点和/或在采样时间点之前经定义的时间段(例如四周或三周或两周或一周或若干天)中的环境条件给出了关于究竟能够观察到哪些病原或可以排除哪些病原的信息。在过去已经在采样位置或附近观察到的病原(无论是直接地还是借助于例如疾病症状而间接地观察到)在当前也可能出现(如果环境条件和相应观察的植物允许的话)，因此可以(并且应当)选择这样的病原的特异病原序列，因为它(所述病原)在过去已经出现过。
由此，本发明的一个优选的实施方式包括以下步骤：
(1)确定植物
(2)确定能够感染所述植物的至少一种病原(所述病原在过去曾经感染过此类植物)
(3)确定所确定的所述至少一种病原的至少一个病原序列
(4)从所述植物或所述植物生长的介质中采集样品，
(5)识别所述样品中的病原
(6)确定所识别病原的至少一种抗性标记物
(7)识别所识别病原针对防治剂的抗性的标志。
本发明的另一个优选的实施方式包括以下步骤：
(1)确定植物
(2)确定所述植物所暴露的和/或已经暴露的环境条件
(3)确定能够感染所述植物的至少一种病原(所述病原在过去曾经感染过此类植物)
(4)确定所确定的所述至少一种病原的至少一个病原序列
(5)从所述植物或所述植物生长的介质中采集样品，
(6)识别所述样品中的病原
(7)确定所识别病原的至少一种抗性标记物
(8)识别所识别病原针对防治剂的抗性的标志。
例如可以通过使用者将对应的信息输入到本发明的系统中来确定植物和/或确定环境条件。植物的指定例如可以以如下方式进行，使用者向本发明的系统中输入植物的名称或者植物的种类的名称或者植物/植物种类的编码(例如根据国际栽培植物命名编码，缩写ICNCP)，或者从列表或菜单中选择关于植物的信息，或者例如在本发明系统的监视器上借助于植物的图形显示(例如照片或图像)选择植物。
还可想到的是，使用者指定在田地中培养的植物并且在适当时附加地指定田地的地理坐标。本发明的系统可以被配置为借助于所指定的植物和在适当时所述地理坐标在数据库中确定可能在此植物种处出现病原。借助于地理坐标例如可以确定当前的天气数据和/或过去的天气数据。可想到的是，对于在植物处可能出现的病原选择模型，所述模型借助于天气数据来计算这种病原在当前时间段出现在所指定的植物处的概率。可想到的是，仅详细观察在当前时间段出现在所指定的植物处的概率大于阈值(最小概率)的病原。阈值可以以经验方式确定或者由使用者自由确定。
由此，本发明的一个优选的实施方式包括以下步骤：
(1)确定植物
(2)确定能够感染所述植物的至少一种病原(所述病原在过去曾经感染过此类植物)
(3)确定所述植物所暴露的或已经暴露的环境条件，
(4)计算在当前的时间点在所述植物处出现所述至少一种病原的概率
(5)将所述概率与预先定义的阈值进行比较
(6)确定所述概率高于所述阈值的那些所确定病原的病原序列
(7)从所述植物或所述植物生长的介质中采集样品，
(8)识别所述样品中的病原
(9)确定所识别病原的至少一种抗性标记物，
(10)识别所识别病原针对防治剂的抗性的标志。
所述一个或多个病原序列优选作为FM指数存在。FM指数是基于Burrows-Wheeler变换并且由P.Ferragina和G.Manzini开发的经压缩的全文本子字符串指数(参见例如P.Ferragina和G.Manzini:Opportunistic Data Structures with Applications,Proceedings of the 41st Annual Symposium on Foundations of Computer Science2000；390-398)。名称FM指数表示Minute空间中的全文本指数。FM指数是一种机会性数据结构，不仅能够实现对输入文本的压缩还能够实现快速的子字符串查询。FM指数可以用于高效地确定经压缩的输入文本之内出现的模式的数量并且定位每一次出现的位置。查询时间以及所需的存储空间相对于输入数据的大小具有亚线性的复杂度。
将刚刚确定的核苷酸排列或氨基酸排列与一个或多个病原序列的比较可以由控制及计算单元进行。这样的控制及计算单元可以为一台或多台计算机。控制及计算单元可以为测序单元的组成部分或者为分开的单元。控制及计算单元可以访问一个或多个数据存储器。在所述至少一个数据存储器中存储有至少一个病原序列。控制及计算单元将所述至少一个病原序列加载到工作存储器中，在其确定期间接收核苷酸排列(对于核苷酸而言或者在多个核苷酸的片段中为核苷酸)，并且检查(不断增长)的核苷酸排列是否一次或多次出现在病原序列中。
在确定核苷酸期间使用序列中(不断增长)的核苷酸排列来进行比较的技术在现有技术中已有描述(参见例如S.Kovaka等人:Targeted nanopore sequencing by real-time mapping of raw electrical Signal with UNCALLED,https://doi.org/10.1101/2020.02.03.931923)。
一旦发现所确定的核苷酸或氨基酸排列在所述至少一个病原序列中没有在任何位置出现，则中断对相应分子的测序并且由此停止对所述分子的进一步测序。中断确定核苷酸排列的技术在现有技术中已有描述(参见例如A.Payne等人:Nanopore adaptivesequencing for mixed samples,whole exome capture and targeted panels,https://doi.org/10.1101/2020.02.03.926956)。在纳米孔技术的情况下例如可以借助于电压脉冲将被引导穿过孔的核酸从孔中运送出来并且于是中断进一步的测序。
如果在预先限定的时间段之内没有测序到具有病原序列的核酸或肽，则可以假定在样品中没有病原。所述预先限定的时间段可以以经验方式确定。可以输出在样品中没有发现病原的通知。
一旦发现样品中的核酸或肽序列与特定的病原序列一致，就可以假设样品中有对应的病原。即可以从对病原序列的知识自动地得出相应的病原。对于如此确定的病原而言，借助于数据库来检查是否存在针对一种或多种防治剂的已知的抗性。“已知的”是指过去在所述病原群落中已经观察到对应的抗性。如果已经观察到至少一种抗性，则确定至少一种抗性标记物。
“抗性标记物”理解为如下的基因信息，所述基因信息给出关于有害生物是否可能、刚刚或已经演化出针对防治剂的抗性的信息。
对于许多病原而言，哪些序列指示所述病原演化出或具有针对防治剂的抗性是已知的(参见例如：S.Omrane等人:Plasticity of the MFS1 Promoter Leads to MultidrugResistance in the Wheat Pathogen Zymoseptoria tritici,https://doi.org/10.1128/mSphere.00393-17；Y.Choi等人:Identification of Genes Related toFungicide Resistance in Fusarium fufikuroi,Mycohiology.2017,45(2):101-104；K.J.Brent:Fungicie Resistance in crop pathogens:How can it he managed？ISBN90-72398-07-6；K.G.Zulak等人:Improved Detection and Monitoring of FungicideResistance in Blumeria graminis f.sp.hordei With High-Throughput GenotypeQuantifi cation hy Digital PCR,Front Microbiol.2018,9:706；M.de miccolis等人:Genetics of Fungicide Resistance,DOI:10.1007/978-4-431-55642-8_2；H.B.Deising等人:Mechanisms and significance of fungicide resistance,Braz.J.Microbiol.2008,Vol.39No.2；L.Kanetis等人:Fungicide resistance profileand genetic structure of Botrytis cinerea from greenhouse crops in Cyprus,Eur.J.Plant.Pathol.2017,147,527-540；J.L.Beckerman:Detection of FungicideResistance,DOI:10.5772/55981；L.Yang等人:Cross-resistance of the pathogenicfungus Alternaria alternata to fungicides with different modes of action,BMCMicrobiol 2019,19,205)。
即，“抗性标记物”是在有抗性的群落的核酸或肽中发现的并且负责抗性或有助于抗性的核苷酸序列或氨基酸序列。在此例如可以涉及抗性病原中的针对同类的无抗性种具有变异的靶序列。在此将“靶”定义为防治剂在病原处的靶点。靶序列的基因变化可能造成防治剂不再有效或效用降低。
如果对所识别的病原而言已知没有抗性，则可以输出通知：在样品中识别出了何种病原并且对于所述病原而言已知没有抗性。
一旦识别出了样品中的病原并且确定了所述病原的至少一种抗性标记物，则启动测序的第二阶段。
在第二阶段中，继续对样品中的核酸或肽进行测序；但是在第二阶段中焦点在于识别所识别病原针对一种或多种防治剂的抗性的标志。为此，将在测序时所确定的核苷酸或氨基酸排列与所述至少一种抗性标记物和/或与无抗性序列进行比较。
如果在测序时没有出现与所述至少一种抗性标记物的序列一致的核苷酸或氨基酸排列，则可以认为在样品中所识别的病原不具有已知的抗性。可以输出通知：已经发现了何种病原以及没有发现针对防治剂存在已知的抗性的标志。但是如果出现相对于无抗性序列的偏差，则可能是存在(尚)未知的抗性和/或病原演化出了(尚未知的)抗性。在这种情况下可以输出通知：已经发现何种病原以及发现了存在针对防治剂的已知抗性的标志，但是在核苷酸或氨基酸排列中存在相对于无抗性序列的偏差，可能/应当进一步考察。
如果在测序时出现与抗性标记物的序列一致的核苷酸或氨基酸排列，则这是存在(已知的)抗性的标志。可以输出通知，所述通知说明：在样品中发现了病原，所述病原具有抗性标志并且可能抗性可能是已知的，例如通过一致的抗性标记物。
由此，在一个优选的实施方式中，“识别所识别病原针对防治剂的抗性的标志”的步骤包括以下子步骤：
(1)将所述样品中的核酸或肽序列与所确定的所述至少一种抗性标记物和/或无抗性序列进行比较
(2)对于所述抗性标记物没有出现在所述样品中的核酸或肽序列中并且样品的序列对应于无抗性序列的情况：输出对于所识别的病原没有发现抗性标志的通知，
(3)对于所述抗性标记物没有出现在所述样品中的核酸或肽序列中并且样品的序列不对应于无抗性序列的情况：输出对于所识别的病原没有发现已知的抗性标志、但是发现了相对于无抗性序列有偏差的通知，
(4)对于所述抗性标记物出现在所述序列中的一个或多个序列中的情况：输出对于所识别的病原发现了抗性标志的通知，并且输出关于所述抗性的通知。
可想到的是，抗性病原的核酸或肽的序列与无抗性病原的对应序列仅相差一个核苷酸或少数几个核苷酸或者仅相差一个氨基酸或少数几个氨基酸。在另一方面，在对各种核酸或肽测序时总是会出现错误。因此，如果识别了具有根据抗性标记物的序列的核酸或肽时，理论上可能的是在此出现了错误。因此，可想到的是，只有当发现了具有根据抗性标记物的序列的最小数量的核酸或氨基酸时才认为存在抗性标志。
由此，在一个优选的实施方式中，“识别所识别病原针对防治剂的抗性的标志”的步骤包括以下子步骤：
(1)将所述样品中的核酸或肽序列与所确定的所述至少一种抗性标记物进行比较，
(2)对于所述抗性标记物没有出现在所述样品中的核酸或肽序列中或者所述抗性标记物出现在小于预先限定的最小数量的数量的核酸中的情况：输出对于所识别的病原没有发现抗性标志的通知，
(3)对于所述抗性标记物出现在最小数量的序列中或者以大于所述最小数量的数量出现的情况：输出对于所识别的病原发现了抗性标志的通知，并且输出关于所述抗性的通知。
在本发明的一个优选的实施方式中，在测序的第二阶段中不仅将样品中的核酸或肽序列与抗性标记物进行比较，而且还与同一种的无抗性病原的对应序列进行比较。这个序列在本说明书中还被称为无抗性序列。这个无抗性序列也是参考序列。
可想到的是，在样品中发现源自病原的核酸或肽，但是其中其序列既不对应于抗性标记物也不对应于无抗性序列。它可能为在某些情况下可能导致仍未知的抗性的突变。即，通过将样品中的核酸或肽的序列与无抗性序列的对比，可以在早期识别新的、在某些情况下发展的抗性。
由此，本发明的一个优选的实施方式包括以下步骤：
-从植物或植物生长的介质中采集样品
-识别所述样品中的病原
-确定所识别的病原的至少一种抗性标记物以及确定所识别的病原的无抗性序列
-通过将所述样品中的核酸或肽序列与所确定的所述至少一种抗性标记物以及所述无抗性序列进行比较，识别所识别的病原针对防治剂的抗性的标志
-对于一个序列或者其数量大于或等于最小数量的序列既不具有与所述至少一种抗性标记物的一致性也不具有与所述无抗性序列的一致性的情况：输出通知，表明在所述样品中识别出这样的病原，其具有指向新的和/或发展的抗性的变异。
还对于样品中可能检测到病原但是所述病原的抗性并非已知的情况，可以启动测序的第二阶段，例如以便在病原处分析靶序列并且在适当时识别指示演化的抗性的突变。在这样的情况下，不将所确定的核苷酸或氨基酸排列与抗性标记物进行比较，而是与靶序列进行比较。靶序列也是参考序列。靶序列、无抗性序列和参考标记物在本说明书中还被称为指示抗性的序列，因为借助于这些序列片段可以确定抗性或没有抗性。
由此，本发明的一个优选的实施方式包括以下步骤：
-从植物或植物生长的介质中采集样品
-识别所述样品中的病原
-确定所识别的病原的靶序列
-通过将所述样品中的核酸或肽序列与所述靶序列进行比较，识别所识别病原针对防治剂的新的抗性的标志
-对于一个序列或者其数量大于或等于最小数量的序列显示出所述靶序列的变异的情况：输出知，表明在所述样品中识别出这样的病原，其具有指向新的和/或发展的抗性的变异。
在一个优选的实施方式中，确定在样品中找到的具有根据所述抗性标记物的序列的核酸或肽的频率QR，并且确定在所述样品中找到的具有根据无抗性序列的序列的核酸或肽的频率QNR。可以将所确定的频率QR和QNR相除(例如QR/QNR)。可想到的是，只有当所述比率超过预先限定的最小值时才假定存在抗性标志。所述最小值可以以经验方式确定。
由此，本发明的一个优选的实施方式包括以下步骤：
-从植物或植物生长的介质中采集样品
-识别所述样品中的病原
-确定所识别病原的至少一种抗性标记物以及确定所识别的病原的无抗性序列
-将所述样品中的核酸或肽序列与所确定的所述至少一种抗性标记物以及所述无抗性序列进行比较
-确定在所述样品中找到的具有符合所述抗性标记物的序列的核酸或肽的频率QR，确定在所述样品中找到的具有符合无抗性序列的序列的核酸或肽的频率QNR，计算所确定的频率QR和QNR的比率，并且将所述比率与预先限定的最小值进行比较
-对于所述比率大于或等于所述最小值的情况：输出对于所识别的病原发现了抗性标志的通知，并且输出关于所述抗性的通知。
本说明书中对于将核酸序列或肽序列与所述至少一个病原序列所述的内容在其他方面类似地适用于对于将核酸序列或肽序列与所述至少一种抗性标记物和/或无抗性序列和/或靶序列进行比较：
●为了还尽可能高效地进行测序的第二阶段并且为了防止测序的大部分落在植物的核酸或肽或病原的非靶序列上，在测序的第二阶段中，一旦发现刚刚测序的核酸或刚刚测序的肽不可能源自病原的靶序列(因为所确定的排列没有出现在病原靶序列中)，也可以中断对单个核酸或肽的测序。
●所述至少一种抗性标记物和/或无抗性序列优选作为FM指数存在。
●控制及计算单元可以将所述至少一种抗性标记物和/或无抗性序列加载到工作存储器中，并且在其确定期间接收(不断增长的)核苷酸排列或氨基酸排列并且将其与所述至少一种抗性标记物和/或与无抗性序列进行比较。
在实施本发明时输出信息和/或通知可以例如以图片和/或文本和/或语音的形式进行。可以将信息和/或通知显示在显示屏(监视器)上、通过打印机打印出来、存储在数据存储器中和/或经由网络传输给另一台计算机。
关于已经被识别的病原的信息例如可以是病原的名称。还可以输出以下信息：在哪个样品中发现了病原，和/或样品是在哪个位置收集的和/或在哪个时间点进行的采样和/或从哪个植物取得样品。
关于已经识别的抗性的信息可以包括抗性的名称、受抗性影响的目标和/或所识别的病原耐受的一种或多种防治剂或者一种或多种活性成分的名称。
本发明的植物样品分析的结果可以以各种方式使用。对于已经识别了其中没有发现存在抗性或出现新抗性的标志的病原的情况，可以提出可用于防治所述病原的一种防治剂或多种防治剂。对于已经识别了其中发现了存在已知抗性的标志的情况，可以提出所述抗性对其无效的防治剂。这样的防治剂于是还可以是使用电能、热能(例如以水蒸气或火焰的形式)、电磁辐射(UV辐射、激光照射)和/或机械手段来去除受感染的植物或植物部位。
因为本发明还可以由自主系统在田地中现场执行，所以本发明的系统还可以包括用于防治病原的防治设备，所述防治设备可以在(自动化地)选择用于防治所识别的病原的防治剂之后自动化地应用所选择的防治剂。
根据本发明对病原和抗性的分析结果还可以记录在病原卡中。这样的“病原卡”是地表的一部分的表示，其中对于地表上的多个位置记录了关于在对应位置是否已经观察到病原以及在病原中是否已经发现了针对防治剂的(已有的或演化的或可能的)抗性的标志的信息。病原卡优选为数字式病原卡。
术语“数字式”是指所述卡可以由机器、通常由计算机系统处理。
“处理”理解为用于电子数据处理(EDV)的已知方法。
数字式病原卡优选为一块田地或包括一块田地的多块相邻田地或一个区域的数字表示。优选地，对于各种病原和/或对于各种防治剂或防治剂组和/或对于可能出现病原的特定植物产生分开的病原卡，所述防治剂组具有相同的活性成分或活性成分的相同化学/生物学类型(例如化学结构类别)或相同的作用机制或相同的靶点(靶)。优选地可以将分开的数字式病原卡彼此关联，也就是说虚拟地叠放。
在一个优选的实施方式中，对于数字式病原卡上的存在一个或多个分析结果的每一个位置，保存对其进行相应分析的一个或多个时间点。
在一个优选的实施方式中，将多个数字式病原卡彼此关联，使得它们展示一种或多种抗性的分布的时间演化。
优选地可以将数字式病原卡与其他数字式卡片组合；例如与关于土地品质、关于水管理、关于所培育的栽培植物、关于温度(在经限定的时间点和/或对于经限定的时间段，例如以平均温度和/或最低温度和/或最高温度的形式)、关于降水量(在经限定的时间点和/或对于经限定的时间段，例如以平均降水量和/或最小降水量和/或最大降水量的形式)、关于阳光照射、关于大气运动(风向和风力)、关于过去出现的一种或多种病原的感染、关于已经采取过的农业措施(例如播种、浇水、犁地、施用植物保护剂、给予养料和类似措施)等的数字卡。在数字卡中记录的参数值可以是测量值和/或预测值。
病原卡可以例如为农业人员提供在他的田地(或他的多块田地)的哪些区域中存在病原以及存在或传播哪种抗性的有价值的信息。可以分析传播模式，以便调查病原和/或抗性的出现和/或传播的原因。在多次时间上彼此相继的分析中，农业人员获得了对病原和/或抗性传播的洞见。然后他可以采取措施来防治病原和/或抗性。在病原卡中，农业人员还可以辨别在相邻田地中是否已经观察到被(有抗性的)病原感染。这些信息可以帮助他为其田地采取预防性措施。
此外，详细的、几乎实时生成的数字式病原卡与其他数据(例如太阳照射、温度、空气湿度和风向)的组合允许准确地预测有抗性和无抗性病原的传播。这允许针对性地防治或预防性处理邻接的区域、以及针对性地使用防治剂。
另外，针对性地检测环境中病原群落的基因信息允许估算针对某一防治剂的将来的抗性演化。
在本发明方法的另一个步骤中，可以(基于病原卡)建议和/或执行用于防治病原和/或演化出的抗性的措施。首先可以借助于在样品中已经识别的病原来识别用于防治病原的一种或多种防治剂。这例如可以通过在一个或多个数据库中查询来进行。在所述一个或多个数据库中可以储存有关于防治剂和防治剂所针对的病原的信息。对于所识别的病原具有抗性的情况，可以在第二个步骤中检查是否存在针对从所述至少一个数据库中确定的防治剂中的一种或多种防治剂的抗性。可以识别所识别病原对其没有抗性的那种或那些种防治剂。然后可以用所识别的防治剂(之一)对植物进行处理。如果病原针对由所述至少一个数据库中确定的所有防治剂都有抗性，则可以识别、建议和/或实施用于防治病原和/或疾病传播的替代性措施，例如：完全机械地移除所涉及的植物、轮作、火焰焚烧、通过冷冻摧毁、通过电能摧毁、通过电磁能量(例如借助于UV光、激光)摧毁和/或类似措施。
本发明可以完全或部分地用计算机系统实施。“计算机系统”是一种用于电子数据处理的系统，所述系统借助于可编程的计算规则来处理数据。这样的系统通常包括控制及计算单元以及外设，所述控制及计算单元通常还称为“计算机”，即包括用于执行逻辑操作的处理器以及用于加载计算机程序的工作存储器的单元。
“外设”在计算机技术中是指连接到计算机并且用于控制计算机和/或用作输入输出设备的所有设备。其例子为监视器(显示屏)、打印机、扫描仪、鼠标、键盘、摇杆、驱动器、摄像头、麦克风、扬声器等。内部连接器和扩展卡在计算机技术中也算作外设。
当今的计算机系统通常分为桌面PC、便携PC、膝上计算机、笔记本电脑、上网本电脑、平板PC和所谓的手持设备(例如智能手机)；所有这些系统都可以用于实施本发明。
向计算机系统中输入(例如用于由使用者进行控制)经由输入装置例如键盘、鼠标、麦克风、触敏显示器和/或类似装置进行。输出经由一个或多个输出单元进行，所述输出单元尤其可以为监视器(显示屏)、打印机和/或数据存储器。
下面将借助于具体实施例和附图详细阐释本发明，而并不意图将本发明限制在这些实施例、在这些实施例中所示的特征和/或特征组合。
在附图中：
图1示意性示出本发明的系统的实施方式。系统(10)包括采样单元(11)、测序单元(12)、控制及计算单元(13)、数据存储器(14)和输出单元(15)。
借助于采样单元(11)可以从植物P或植物P生长的介质中取得样品。可以对样品进行处理并且送至测序单元(12)。
借助于测序单元(12)确定处于样品中的核酸的序列。
控制及计算单元(13)用于控制本发明系统(10)的各个部件以及协调数据流和信号流。控制及计算单元可以为已经借助于本发明的计算机程序进行了对应配置以执行本文所述步骤的通用计算机(英文general purpose Computer)。
控制及计算单元(13)与数据存储器(14)相连，控制及计算单元可以为了比较目的从数据存储器中调用一个或多个病原序列以及一个或多个指示抗性的序列。
控制及计算单元(13)从测序单元(12)接收不断增长的核酸序列。
在第一阶段中，控制及计算单元(13)检查不断增长的序列是否被包含在一个或多个病原序列中。一旦发现不断增长的核酸序列没有被包含在所述至少一个病原序列中，控制及计算单元(13)就向测序单元(12)发送信号。通过所述信号中断对核酸的测序并且开始对新的核酸进行测序。一旦发现核酸序列与病原序列一致，控制及计算单元(13)就致使输出单元(15)输出关于其序列与核酸序列一致的病原的信息。另外，控制及计算单元(13)转换到第二阶段。
在第二阶段中，控制及计算单元(13)检查不断增长的样品中的核酸序列与抗性标记物、无抗性序列和/或靶序列是否具有一致性。一旦发现核酸序列与指示抗性的序列一致，控制及计算单元(13)就致使输出单元(15)输出关于抗性的信息。
图2示意性且示例性地以流程图形式示出由计算机执行的步骤，在所述计算机的工作存储器中加载有本发明的计算机程序。这些步骤被分为两个阶段Ph1和Ph2。步骤(201)、(202)、(203)、(204)、(205)和(206)与第一阶段相关联。步骤(208)、(209)、(210)、(211)、(212)、(213)和(214)与第二阶段相关联。步骤(207)被指配给第一阶段并且产生第一阶段Ph1向第二阶段Ph2的转换。计算机以执行阶段Ph1中的步骤开始并且当存在经定义的条件(见下)时转换到阶段Ph2。
(201)计算机从数据存储器中加载多个病原序列P。
(202)计算机接收不断增长的核酸序列S。
(203)计算机检查不断增长的核酸序列S是否被包含在病原序列P中(S∈P？)。
(206)对于不断增长的序列S没有被包含在病原序列P中的情况，计算机发送信号，所述信号导致终止对当前被测序的核酸的测序。替代于此，对新的核酸进行测序并且计算机接收新的核酸的不断增长的序列S。
(204)如果不断增长的序列S被包含在病原序列P中，则检查借助于当前的信息是否能够认为，可以将序列S与来自P中的特定病原相关联(S＝P？)。
(205)对于当前信息尚不足以得出所述序列源自特定病原的判断的情况，继续对所述核酸的测序。
(207)对于当前信息足以得出所述序列源自特定病原的判断的情况，在对应的样品中识别出所述病原。可以输出关于所述病原的信息并且计算机发送信号，所述信号导致终止对当前被测序的核酸的测序。另外，转换到测序的第二阶段Ph2。
(208)计算机从数据存储器中加载所识别的病原的至少一个指示抗性的序列R，其中所述至少一个指示抗性的序列可以包括抗性标记物、无抗性序列和/或靶序列。
(209)计算机接收不断增长的新的核酸序列S。
(210)计算机检查不断增长的序列S是否被包含在所述至少一个指示抗性的序列R中(S∈R？)。
(213)对于不断增长的序列S没有被包含在指示抗性的序列中的情况，计算机发送信号，所述信号导致终止对当前被测序的核酸的测序。替代于此，对新的核酸进行测序并且计算机接收新的核酸的不断增长的序列S。
(211)如果不断增长的序列S被包含在指示抗性的序列R中，则检查借助于当前的信息是否能够假定，所述病原具有对应的抗性(S＝R？)。
(212)对于当前信息尚不足以得出所述病原具有抗性的判断的情况，继续对所述核酸的测序。
(214)对于当前信息足以得出所述病原具有抗性的判断的情况，输出关于抗性的信息。
图3示意性示出本发明的系统的另一个实施方式。系统(10)包括测序单元(12)、控制及计算单元(13)、数据存储器(14)和输出单元(15)。
控制及计算单元(13)和输出单元(15)为标准计算机系统(例如膝上计算机)的组成部分。控制及计算单元(13)从测序单元(12)接收数据，其中这些数据代表不断增长的核苷酸或氨基酸的排列。控制及计算单元(13)另外还经由网络(例如国际互联网，在此由云(C)代表)与数据库(14)相连。可想到的是，存在多个数据库。还可想到的是，数据库是计算机系统的组成部分。控制及计算单元(13)从所述至少一个数据库获取至少一个病原序列和在适当时至少一个指示抗性的序列。
可想到的是，所述至少一个数据库还可以提供关于环境条件的数据、关于防治剂的数据、关于植物和植物种类的数据、关于病原的数据和/或类似数据。另外可想到的是，在所述至少一个数据库中存储有用于基于关于植物和/或关于环境条件的信息来计算在当前时间点植物处出现病原的概率的一个或多个模型，所述模型可以被控制及计算单元(13)调用并且用于计算目的。

Claims (16)

1.一种方法，包括以下步骤：
-从植物或植物生长的介质中采集样品，
-识别所述样品中的病原，
-识别所述病原针对防治剂的抗性的标志，
●其中所述病原的识别以及所述抗性的标志的识别借助于对所述样品中的单独核酸或单独肽测序来完成，其中在对单独核酸或单独肽测序时确定核苷酸序列或氨基酸序列，其中将所述核苷酸序列或氨基酸序列与参考序列进行比较，其中所述测序在第一阶段和第二阶段两个阶段中进行，
●其中在所述第一阶段中，在对每一种核酸或每一种肽测序期间将分别确定的序列与至少一个病原序列进行比较，并且
■对于所确定的序列与所述至少一个病原序列不一致的情况，中断对这种核酸或这种肽的进一步测序，
■对于所确定的序列与病原序列一致的情况，确定具有所述病原序列的病原，并且基于所确定的病原来确定至少一种抗性标记物，并且转换到所述第二阶段中，
●其中在所述第二阶段中，将所述样品中的核酸或肽的序列与所确定的所述至少一种抗性标记物和/或与无抗性序列进行比较。
2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
-确定植物；
-确定能够感染所述植物的至少一种病原；
-对于所确定的所述至少一种病原，确定至少一个病原序列；
-从所述植物或所述植物生长的介质中采集样品，
-识别所述样品中的病原；
-确定所识别的病原的至少一种抗性标记物，
-识别所识别病原针对防治剂的抗性标志。
3.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
-确定植物；
-确定所述植物所暴露的和/或已被暴露的环境条件；
-确定能够感染所述植物的至少一种病原；
-对于所确定的所述至少一种病原，确定至少一个病原序列；
-从所述植物或所述植物生长的介质中采集样品，
-识别所述样品中的病原；
-确定所识别的病原的至少一种抗性标记物，
-识别所识别病原针对防治剂的抗性标志。
4.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
-确定植物；
-确定能够感染所述植物的至少一种病原；
-确定所述植物所暴露的或已被暴露的环境条件，
-计算在当前的时间点植物出现所述至少一种病原的概率；
-将所述概率与预先定义的阈值进行比较；
-确定所述概率高于所述阈值的那些所确定病原的病原序列；
-从所述植物或所述植物生长的介质中采集样品，
-识别所述样品中的病原；
-确定所识别的病原的至少一种抗性标记物，
-识别所识别病原针对防治剂的抗性标志。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中识别所识别病原针对防治剂的抗性标志的步骤包括以下子步骤：
-将所述样品中的核酸或肽序列与所确定的所述至少一种抗性标记物进行比较，
-对于所述抗性标记物没有出现在所述样品的核酸或肽序列任一种中的情况：输出通知指示对于所识别的病原没有发现抗性标志，
-对于所述抗性标记物出现在所述序列中的一个或多个序列中的情况：输出对于所识别的病原发现了抗性标志的通知，并且输出关于所述抗性的通知。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中识别所识别病原针对防治剂的抗性标志的步骤包括以下子步骤：
-将所述样品中的核酸或肽序列与所确定的所述至少一种抗性标记物进行比较，
-对于所述抗性标记物没有出现在所述样品中的核酸或肽序列的任一个中或者所述抗性标记物出现的核酸数量小于预先限定的最小数量的情况：输出对于所识别病原没有发现抗性标志的通知，
-对于所述抗性标记物出现最小数量的序列或者出现数量大于所述最小数量的情况：输出对于所识别病原发现了抗性标志的通知，并且输出关于所述抗性的通知。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，包括以下步骤：
-从植物或植物生长的介质中采集样品；
-识别所述样品中的病原；
-确定所识别病原的至少一种抗性标记物以及确定所识别病原的无抗性序列；
-通过将所述样品中的核酸或肽序列与所确定的所述至少一种抗性标记物以及所述无抗性序列进行比较，识别所识别病原针对防治剂的抗性标志；
-对于一个序列或者其数量大于或等于最小数量的序列既不具有与所述至少一种抗性标记物的一致性也不具有与所述无抗性序列的一致性的情况：输出通知，表明在所述样品中识别出这样的病原，其具有指向新的和/或发展的抗性的变异。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，包括以下步骤：
-从植物或植物生长的介质中采集样品；
-识别所述样品中的病原；
-确定所识别的病原的靶序列；
-通过将所述样品中的核酸或肽序列与所述靶序列进行比较，从而识别所识别病原针对防治剂的新的抗性标志；
-对于一个序列或者其数量大于或等于最小数量的序列显示出相对于所述靶序列的变异的情况：输出通知，表明在所述样品中识别了这样具有变异的病原，其具有指向新的和/或发展的抗性的变异。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，包括以下步骤：
-从植物或植物生长的介质中采集样品；
-识别所述样品中的病原；
-确定所识别病原的至少一种抗性标记物以及确定所识别病原的无抗性序列；
-将所述样品中的核酸或肽序列与所确定的所述至少一种抗性标记物以及所述无抗性序列进行比较；
-确定在所述样品中找到具有符合所述抗性标记物的序列的核酸或肽的频率QR，确定在所述样品中找到的具有符合无抗性序列的序列的核酸或肽的频率QNR，计算所确定的频率QR和QNR的比率，并且将所述比率与预先限定的最小值进行比较；
-对于所述比率大于或等于所述最小值的情况：输出通知，表明对于所识别的病原发现了抗性标志，并且输出关于所述抗性的通知。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述植物的样品为所述植物的一个或多个叶片。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中根据BBCH量表所述植物处于第1或2或3至6的主要生长阶段。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述病原序列为真菌或细菌、病毒的DNA核苷酸排列。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
-建立和/或更新病原卡，其中在所述病原卡中登记有位置，其中在所述位置处采集了所述植物的样品，其中对于所述位置给出在所述植物中是否已经识别了病原的指示，并且对于在所述植物中已经识别了病原的情况，给出所述病原是否具有针对防治剂的抗性的指示，以及
-输出所述病原卡，优选将所述病原卡显示在显示屏上和/或将所述病原卡输出到打印机和/或将所述病原卡传输给用于自动化地执行防治所识别病原的措施的设备。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
-在考虑到可能已被识别的抗性的情况下，确定用于防治所识别病原的防治剂，
-使用所确定的防治剂，采取用于防治所述植物的病原的措施。
15.一种系统，包括：
-测序单元，
-控制及计算单元，以及
-至少一个数据存储器，其中对于至少一种病原存储有至少一个病原序列和至少一种抗性标记物，
其中所述测序单元被配置为用于对植物或植物生长的介质中的样品中的核酸或肽进行测序，并且由此确定所述样品中的核苷酸或氨基酸的序列，
其中所述测序单元被配置为用于在确定所述序列期间将分别确定的序列传输给所述控制及计算单元，
其中所述控制及计算单元被配置为用于在第一阶段中将各个所传输的核酸或肽的序列与至少一个病原序列进行比较，并且
●对于所传输的序列与所述至少一个病原序列不一致的情况，使得所述测序单元中断对相应的核酸或相应的肽的进一步测序，
●对于所传输的序列与病原序列一致的情况，确定具有所述病原序列的病原，并且利用所确定的病原来确定至少一种抗性标记物，并且转换到第二阶段中，
其中所述控制及计算单元被配置为用于在所述第二阶段中将所述样品中的核酸或肽的序列与至少一种所确定的抗性标记物和/或无抗性序列进行比较。
16.一种包括命令的计算机可读(存储)介质，所述命令在由计算机执行时使所述计算机执行以下步骤：
-对于多个核酸或肽：从测序单元接收不断增长的在相应的核酸或相应的肽中的核苷酸或氨基酸的排列，
-在接收不断增长的排列期间的第一阶段中：检测核苷酸或氨基酸的所述排列是否一次或多次被包含在至少一个病原序列中，
-对于所述排列没有被包含在病原序列中的情况：将信号传输至所述测序单元，以便中断对所述核酸或肽的进一步测序，
-对于所述排列与病原序列一致的情况：确定具有所述病原序列的病原，并且确定至少一个参考标记物，并且启动第二阶段，
-在所述第二阶段中：将核苷酸或氨基酸的所述排列与所述至少一个参考标记物和/或无抗性序列进行比较。
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