CN115785278A - 一种cik细胞与抗体联合治疗癌症的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CIK细胞与抗体联合治疗癌症的用途，所述抗体包括靶向PD‑1的第一抗原结合域和靶向CD3的第二抗原结合域，可同时靶向PD‑1和CD3两种抗肿瘤靶点，提高治疗的靶向性和有效性；所述双特异性抗体具有全新的氨基酸结构，可与目标抗原高亲和力结合；所述双特异性抗体与CIK细胞联用，通过CD3和PD‑1抗原结合域在肿瘤细胞核CIK细胞间建立免疫联系，能够显著提高抗肿瘤活性，延长动物生存期；优化了CIK细胞的培养方式，获得生物活性更高的CIK细胞。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体提供了一种CIK细胞与抗体联合治疗癌症的用途。
背景技术：
肿瘤是威胁人类生命的第一大“杀手”，单纯依靠手术、放疗和化疗等传统治疗方法已经难以满足日益多样化的临床需求，近年来肿瘤免疫疗法的出现，极大地改变了患者的生存和生活质量，如免疫检查点抑制剂、免疫细胞过继治疗等，在血液肿瘤和实体肿瘤的治疗中均展现了令人惊奇的治疗效果。在众多肿瘤免疫疗法中，细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells，CIK细胞)和程序性死亡受体1(Programmed deathreceptor-1，PD-1)免疫检查点抑制剂表现较为突出。
CIK细胞是非主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)限制性细胞毒性抗肿瘤细胞，在体外从循环前体细胞中扩增而来，CIK细胞具有T细胞和NK细胞的共同特征，有研究认为CIK细胞是终末分化的非分裂细胞，表现出非特异性天然细胞毒性；其他群体代表经历细胞分裂并分化为CIK细胞的祖细胞库，并且该群体缺乏天然细胞毒活性；CIK细胞是获得了NK细胞天然细胞毒潜能的T细胞(参见Franceschetti M.,Pievani A.,et al,Cytokine-induced killer cells are terminally differentiatedactivated CD8 cytotoxic T-EMRA lymphocytes.Exp.Hematol.2009；37:616–628.e2.)。
CIK细胞具有强大的MHC非限制性细胞毒性，可对抗血液和实体恶性肿瘤，无需事先暴露或启动即可识别和杀死肿瘤靶标。CIK细胞的抗肿瘤活性主要限于CD3+CD56+部分。对CD3+CD56+细胞比其CD3+CD56-对应细胞表现出更好的抗肿瘤细胞溶解活性的可能原因是，CD3+CD56+细胞由更高比例的CD8+组成细胞，以及更分化的效应表型、更高含量的颗粒酶。离体扩增的人CD3+CD56+T细胞产生T辅助1(TH1)型细胞因子，对多种肿瘤细胞系以及自体和同种异体新鲜肿瘤分离物具有广泛的非MHC限制性细胞毒性，例如CIK细胞在体外对肺泡横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、多形性胶质母细胞瘤和视网膜母细胞瘤细胞系等显示出细胞毒活性(参见Kuci S.,Rettinger E.,et al.Efficient lysis of rhabdomyosarcoma cellsby cytokine-induced killer cells:Implications for adoptive immunotherapyafter allogeneic stem cell transplantation.Haematologica.2010；95:1579–1586；Wang Y.F.,Kunda P.E.,et al.Cytokine-induced killer cells co-cultured withcomplete tumor antigen-loaded dendritic cells,have enhanced selectivecytotoxicity on carboplatin-resistant retinoblastoma cells.Oncol.Rep.2013；29:1841–1850)。
CIK细胞毒性的潜在作用机制尚未完全阐明，但已经确定了一些关键分子和信号通路。用针对CD2、CD3、CD8、CD28、CD56、极晚期抗原4(VLA-4)、T细胞受体(TCR)αβ和MHCI类和II类分子的阻断抗体进行的测试未能抑制细胞毒活性，表明MHC独立的目标识别方法。然而阻断淋巴细胞功能相关抗原1(Lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1)和细胞内细胞粘附分子1(Intracellular cell adhesion molecules-1，ICAM-1)可产生显著抑制作用，表明细胞溶解依赖于细胞间接触(参见Martino Introna and Fabio Correnti,Innovative Clinical Perspectives for CIK Cells in Cancer Patients,Int J MolSci.2018Feb；19(2):358.)。用二丁酰(db)-cAMP处理CIK细胞，防止LFA-1转化为ICAM-1的高亲和力受体，抑制由抗CD3单克隆抗体(mAb)触发的CIK细胞的穿孔素和颗粒酶释放或肿瘤靶点；使用环孢菌素和FK506等免疫抑制药物可以防止CD3-TCR刺激诱导的CIK细胞脱颗粒，但不能阻止与肿瘤靶标相互作用引发的细胞毒性(参见Mehta B.A.,Schmidt-WolfI.G.,et al..Two pathways of exocytosis of cytoplasmic granule contents andtarget cell killing by cytokine-induced CD3+CD56+killer cells.Blood.1995；86:3493–3499)。此外，基于体外和体内以及小鼠和人源细胞获得的已发表结果，CIK细胞在体内显示出非常强的抗白血病和移植物抗白血病(GVL)细胞溶解活性，同时基本上没有移植物抗宿主反应性(GvHD)，这也是CIK细胞疗法的重要优势之一。
CIK细胞最初是从正常供体的外周血循环单核细胞开始产生的，随后证明，它们也可以从新诊断白血病患者(如慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)的单核细胞中产生，且对自体和同种异体CML细胞具有细胞溶解作用。截止目前，CIK细胞的提取方法经过多轮研究和调整，比较经典的做法是：首先从外周血单核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMNC)、淋巴细胞单采术或脐带血开始，需要在第0天依次添加1000U/mL人rIFN-γ，然后添加50ng/mL抗CD3单克隆抗体第+1天OKT3和500IU/mLrIL-2；rIL-2和新鲜的完全X-VIVO培养基每五天添加一次，持续14-21天。尽管这种经典培养方式被普遍采用，但是研究人员仍试图对诱导条件进行改进，以便获得性质更加优良的抗肿瘤细胞。
尽管CIK细胞在对抗肿瘤细胞方面是有效的，但其单独使用往往存在抗肿瘤效用不足，靶向性不强等缺点，故研究人员多试图将其与其他治疗方法联合使用，以便能够相互促进发挥协同效益。例如，Wu等报告了两例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者接受双特异性抗体偶联CIK免疫疗法后，肝细胞癌得到完全缓解(complete response，CR)(参见Tong Wu,Linzhi Zhang，et al.Complete Response to PD-1 Inhibitor inPrimary Hepatocellular Carcinoma Patients Post-Progression on Bi-SpecificAntibody Conjugated CIK Cell Treatment:A Report of Two Cases，Onco TargetsTher.2021；14:5447–5453)；Liang等在用抗Tim-3和抗PD-1抗体阻断Tim-3和PD-1信号转导通路后，将DC-CIK细胞与A549细胞共孵育，可显着增加DC-CIK细胞对A549细胞的杀伤作用，在侵袭和迁移试验中，Transwell小室微孔膜下的A549细胞数量明显减少，抗Tim-3和抗PD-1抗体显着降低了DC-CIK细胞的凋亡(参见Liang Zhou,Qijiu Chen et al.EnhancedInhibitory Effect of DC-CIK Cells on Lung Adenocarcinoma via Anti-Tim-3Antibody and Antiprogrammed Cell Death-1 Antibody and Possible Mechanism,EvidBased Complement Alternat Med.2022Jul31；2022:4097576).
为了克服上述困难，本发明中提供了双特异抗体及其与CIK细胞的联用应用，所述双特异抗体能够同时靶向PD-1和CD3，提高抗肿瘤治疗的靶向性和有效性；该抗体与CIK细胞联用，不仅能够提高抗肿瘤能力，促进免疫细胞因子分泌，还能够强化肿瘤细胞与CIK细胞之间的免疫连接，从而改善肿瘤治疗效果。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明中提供了一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括靶向PD-1的第一抗原结合域和靶向CD3的第二抗原结合域；所述第一抗原结合域包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区；所述第二抗原结合域包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区。
PD-1是CD28超家族的成员，在活化的T细胞和B细胞表面表达，PD-1受体有两种配体，PD-L1和PD-L2，其中PD-L1主要存在于造血细胞和实质细胞的表面，而PD-L2通常存在于巨噬细胞和DC的表面。在正常组织中，PD-1和PD-L1的结合会保护性地抑制免疫细胞的增殖并诱导活化的T细胞功能障碍，最终降低自身免疫并促进自身耐受。PD-1表达上调已在许多类型的肿瘤中得到报道，包括黑色素瘤、肺癌、肝癌、肾癌和血液恶性肿瘤。PD-L1与上调的PD-1的结合会诱导肿瘤特异性细胞毒性T细胞的凋亡和促进肿瘤细胞逃避免疫介导的破坏免疫抑制作用，而PD-1抗体抑制PD-1与其配体在肿瘤细胞上的相互作用，促进免疫介导的破坏。目前已有多种靶向PD-1或PD-L1的抗体药物上市或正在进行临床试验，并对于肿瘤，尤其是难治疗性肿瘤展现出惊人的效果。因此，本发明中选用PD-1作为目标靶点，设计和筛选抗体。
CD3双特异性抗体(CD3-Bispecific Antibody，CD3-BsAbs)是癌症免疫治疗领域的一种新兴治疗方式，这种抗体通过同时结合肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原和T细胞上的CD3发挥作用，通过CD3-BsAb交联这两种细胞类型可以形成免疫突触，类似于天然T细胞受体(TCR)/肽-主要组织相容性复合体(MHC)复合体，该突触导致T细胞激活，从而分泌能够在此过程中杀死肿瘤细胞的炎性细胞因子和溶细胞分子。由于CIK细胞具有T细胞的某些特性，且已有研究表明CIK细胞群中主要是CD3+CD56+CIK细胞发挥抗肿瘤作用，因此本发明人将CD3-BsAbs移植到与CIK细胞联用的治疗方案中，构建了靶向PD-1和CD3的双特异性抗体。
进一步的，所述双特异性抗体还包括Fc片段，所述第一抗原结合域和第二抗原结合域分别连接于Fc片段N端两侧。
进一步的，所述Fc片段选自人IgG1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明中在双特异性抗体中选用人体中最常见的人IgG1Fc片段，不仅能够延长抗体的体内半衰期，还能够有效抑制移植抗宿主反应，从而降低毒副作用，提高治疗的安全性和有效性。
提供一种药物组合物，包括所述的双特异性抗体和CIK细胞。
本发明中使用双特异性抗体与CIK细胞联合作用，能够有效强化抗肿瘤效果，发挥协同作用。
进一步的，所述CIK细胞的制备方法包括：使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞；所述单个核细胞经INF-γ、IL-1β、抗CD3单克隆抗体、IL-2、IL-15、IL-21诱导而得CIK细胞。
进一步的，所述CIK细胞的制备方法包括：培养所述单个核细胞24h，加入1000-2000U/mL的INF-γ和500-800U/mLIL-1β，37℃，5％CO2饱和湿度培养24h；加入50-200ng/mL抗CD3单克隆抗体和400-800U/mLIL-2、100-200U/mLIL-15、100-200U/mLIL-21，37℃，5％CO2饱和湿度培养；以后每隔两天补充新鲜培养基，以及抗CD3单克隆抗体、IL-2、IL-15、IL-21因子；培养约2周后，流式细胞仪检测CIK细胞表面抗原，获得CIK细胞。
虽然CIK细胞的经典诱导方法已经被提出，但是CIK细胞在使用过程中仍面临传代培养困难，增殖活性不足，肿瘤杀伤能力有限等一系列问题，而优化该细胞的培养条件和培养基质也成为改善CIK细胞性质的常规方式，CN114015650A、CN115109749A、US20220347218A1、US20130059379A1等专利中均提出了有益的尝试。本申请在现有研究技术的基础上，提供了一种可有效改善CIK细胞活性的诱导培养法，通过在不同环节添加INF-γ、IL-1β、抗CD3单克隆抗体、IL-2、IL-15、IL-21等不同组分，还优化了培养步骤和各个因子的使用时间和剂量，从而能够获得活性更高、稳定性更好的CIK细胞。
提供了一种所述双特异性抗体或所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、胶质瘤中的至少一种。
进一步的，所述肿瘤为肺癌。
有益效果
本发明提供了一种双特异抗体及其与CIK细胞的联用应用，具有以下优势：
(1)提供了一种新型双特异性抗体，可同时靶向PD-1和CD3两种抗肿瘤靶点，提高治疗的靶向性和有效性；
(2)所述双特异性抗体具有全新的氨基酸结构，可与目标抗原高亲和力结合；
(3)所述双特异性抗体与CIK细胞联用，通过CD3和PD-1抗原结合域在肿瘤细胞核CIK细胞间建立免疫联系，能够显著提高抗肿瘤活性，延长动物生存期；
(4)优化了CIK细胞的培养方式，获得生物活性更高的CIK细胞。
附图说明
图1：双特异性抗体结构示意图；
图2：双特异性抗体建立肿瘤细胞和CIK细胞间的免疫联系示意图；
图3：细胞水平上抑制肿瘤生长；
图4：TNF-α表达水平；
图5：IL-6表达水平；
图6：动物生存期。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。
以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1双特异性抗体设计和制备
本发明中设计了靶向PD-1和CD3的双特异性抗体，其中靶向PD-1的抗原结合域由发明人在先获得，能够以高亲和力结合目标抗原，其包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区；靶向CD3的抗原结合域包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区。
所述双特异性抗体结构如图1所示，靶向PD-1和CD3的抗原结合域分别连接于人IgG1Fc片段的N端两侧。人工全合成编码所述双特异性抗体的DNA序列，将其克隆到pcDNA3.1表达载体中。使用ExpiCHO TM表达试剂盒(购自Thermo Fisher公司)将所述pcDNA3.1表达载体转染到ExpiCHO细胞中；连续培养转染后细胞10-15天，离心收集细胞培养上清；使用蛋白A磁珠进行蛋白纯化，获得所述双特异性抗体。
用生物分子相互作用分析仪(购自美国Pall公司)测定双特异性抗体对目标抗原的亲和力，用Protein A传感器固化所述抗体，将目标抗原蛋白梯度稀释后，与固化有抗体的Protein A传感器结合、解离，分别得到结合常数(Kon)、解离常数(Koff)和最抗体亲和力常数(KD)，结果如表1所示，所述双特异性抗体可与目标抗原高效结合。
表1抗体亲和力检测
如图2所示，本发明所述提供了双特异性抗体，可同时结合目标肿瘤细胞和CIK细胞，并在二者之间建立免疫连接，提高CIK细胞治疗的靶向性；而且通过结合PD-1目标抗原，还能够接触肿瘤细胞的免疫抑制，提高CIK细胞治疗的有效性。
实施例2 CIK细胞制备
在无菌环境下，采集健康志愿者外周血，加入淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)混合均匀后，2500g离心20min分离单个核细胞；用毛细血管小心吸取单个核细胞层，然后用无菌PBS洗涤3-5次，3000g离心20min，重复2次；用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬细胞，并调整细胞密度为5×106个/mL，取1mL细胞悬液接种于细胞培养瓶中，37℃，5％CO2饱和湿度培养，获得单个核细胞。
所述单个核细胞培养24h后，加入1000U/mL的INF-γ(购自北京双鹭药业股份有限公司)和600U/mL IL-1β(购自美国peprotech公司)，37℃，5％CO2饱和湿度培养24h后，加入100ng/mL抗CD3单克隆抗体(购自军事医学科学院)和500U/mL IL-2(购自北京双鹭药业股份有限公司)、200U/mL IL-15(购自美国peprotech公司)、100U/mL IL-21(购自美国peprotech公司)，37℃，5％CO2饱和湿度培养；以后每隔两天补充新鲜培养基，以及抗CD3单克隆抗体、IL-2、IL-15、IL-21等细胞因子；培养约2周后，流式细胞仪检测CIK细胞表面抗原，其中CD3+CD56+的CIK细胞比例达50％以上，可以进行后续实验研究。
实施例3细胞水平抗肿瘤研究
肺癌是令人困扰的难治疗性恶性肿瘤之一，有报道称，肺癌是死亡率排名第三的恶性肿瘤，但是目前仍无有效治愈手段。CIK细胞和PD-1抗体均已被报道，可用于治疗肺癌患者，因此本发明以肺癌为目标适应症，研究本发明所提供的CIK细胞和双特异性抗体的抗肿瘤效果。
本实施例中选用人人非小细胞肺癌细胞系H1299(本发明人保存)作为研究对象，考察相应抗肿瘤能力。复苏冻存保藏的H1299细胞，接种于以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养，当细胞融合度达到85％以上时进行后续实验。
使用0.25％胰酶消化细胞，经RPMI-1640培养基重悬并调节细胞浓度，然后将所述H1299细胞接种于96孔板中，每孔接种1×104个细胞，37℃、5％CO2、饱和湿度培养过夜后，将其分为4组，分别为：抗体组(加入100μg/mL的抗PD-1和CD3双特异性抗体)，CIK组(按与肿瘤细胞1:1比例加入本发明中所提供的CIK细胞)，联合组(加入100μg/mL的抗PD-1和CD3双特异性抗体和与肿瘤细胞1:1比例本发明中所提供的CIK细胞)，对照组(加入等体积的培养基，作为阴性对照)。37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养24h后，使用MTT法检测细胞存活率，所述细胞存活率＝给药组OD值/对照组OD值。
如图3所示，在体外细胞实验中双特异性抗体的效果最差，这能是由于抗体需要借助于机体内部的免疫调节系统才能发挥更强的肿瘤免疫效用，故在体外实验中效果受到限制；CIK细胞表现出了相对较强的抗肿瘤活性，可直接诱导肿瘤细胞凋亡，抑制其生长；CIK细胞和双特异性抗体的联合，展现出了强烈的抗肿瘤活性，我们推测可能是用于靶向PD-1和CD3的双特异性抗体，可解除肿瘤细胞的免疫逃逸机制，进而与CIK细胞产生协同抗肿瘤效果。
实施例4动物水平抗肿瘤研究
4.1肺癌动物模型制备
本节中采用原位肺癌模型验证双特异性抗体和CIK细胞的抗肿瘤能力，这种动物模型与普通皮下肿瘤模型相比，更接近肺癌的生理环境，从而能够有效模拟肺癌患者的体内肿瘤环境，提供更加可信的实验数据。
培养H1299细胞，具体方法同上，当细胞达到对数生长期时，胰酶消化后离心收集细胞，用无菌生理盐水重悬细胞；选取BALB/c裸鼠，腹腔注射浓度为4％的水合氯醛溶液麻醉，小鼠右侧卧位，定位于小鼠左侧腋下以碘伏消毒并备皮，切割长度约1cm切口，钝性分离至肋骨表面，可见明显呼吸及肺脏活动，在肋骨上缘用微量注射器垂直穿刺约3mm，缓慢注射细胞悬液(含2×106个细胞)，期间保持互相通畅，防止形成气胸，注射完毕后碘伏消毒并缝合伤口。
4.2动物给药
实验动物造模两周后，将其随机分为4组，分别为：抗体组，尾静脉注射100μg/kg所述双特异抗体，每周给药2次，共给药2周；CIK组，尾静脉注射2×106个CIK细胞；联合组，尾静脉注射2×106个CIK细胞，并且注射100μg/kg所述双特异抗体，抗体每周给药2次，共给药2周；对照组，尾静脉注射等体积生理盐水。
4.3细胞因子检测
给药治疗2周后，尾静脉取血，3000g离心15min收集血清。使用ELISA试剂盒(购自美国R&D公司)检测给药2周后，动物血清中的TNF-α和IL-6含量，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。如图4、图5所示，使用本发明中所述双特异性抗体或CIK细胞治疗，可显著促进TNF-α和IL-6分泌，二者并无显著差异，上述两种细胞因子是体内主要抗肿瘤免疫因子之一，能够激活多种免疫途径发挥抗肿瘤作用；联合使用所述双特异性抗体，TNF-α和IL-6分泌水平显著提高，明显高于其他两个治疗组，说明同时使用抗体和CIK细胞更具有应用前景。
4.4动物生存期
每天观察动物状态，记录实验动物生存期，并绘制生存期曲线。结果如图6所示，与对照组相比，各个治疗组的动物生存期显著延长；令人意料不到的是，双特异性抗体或CIK细胞组无显著差异，二者在动物模型中的抗肿瘤效果类似，早期判断双特异性抗体在体内可激活T细胞、NK细胞等自身免疫细胞，还能够与肿瘤细胞表面的PD-1受体结合，解除免疫逃逸现象，因而在这种双重肿瘤免疫强化的作用下，其抗肿瘤效果能够得到强化，但实验结果表明其体内抗肿瘤活性并未明显强于CIK细胞。我们预计其中的原因包括两个方面，一方面是本发明中对CIK细胞诱导方法进行了改进，在经典方法的基础上优化了诱导试剂的组合、剂量和加入时机，使得CIK细胞的抗肿瘤活性加强；另一方面，靶向PD-1和CD3的双特异抗体虽然在体内能够结合目标抗原，但是由于本发明中使用了肺癌原位模型，肿瘤组织的发生发展更加迅速且接近自然状态，使得模型动物自身免疫系统受损严重，诸如T细胞、NK细胞等免疫细胞的活性受到较大限制，故未表现出更强的抗肿瘤活性。在联合组中，动物生存期却得到了明显延长，这可能与体外回输未受到机体免疫抑制的新鲜CIK细胞有关，也说明本发明中所提供的双特异性抗体与CIK细胞联用可产生令人惊奇的协同效果，提高抗肿瘤活性。
Claims (9)
1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括靶向PD-1的第一抗原结合域和靶向CD3的第二抗原结合域；所述第一抗原结合域包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区；所述第二抗原结合域包括氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述双特异性抗体还包括Fc片段，所述第一抗原结合域和第二抗原结合域分别连接于Fc片段N端两侧。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于：所述Fc片段选自人IgG1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.一种药物组合物，包括权利要求1-3任一项所述的双特异性抗体和CIK细胞。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于：所述CIK细胞的制备方法包括：使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞；所述单个核细胞经INF-γ、IL-1β、抗CD3单克隆抗体、IL-2、IL-15、IL-21诱导而得CIK细胞。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于：所述CIK细胞的制备方法包括：培养所述单个核细胞24h，加入1000-2000U/mL的INF-γ和500-800U/mLIL-1β，37℃，5％CO2饱和湿度培养24h；加入50-200ng/mL抗CD3单克隆抗体和400-800U/mLIL-2、100-200U/mLIL-15、100-200U/mLIL-21，37℃，5％CO2饱和湿度培养；以后每隔两天补充新鲜培养基，以及抗CD3单克隆抗体、IL-2、IL-15、IL-21；培养约2周后，流式细胞仪检测CIK细胞表面抗原，获得CIK细胞。
7.一种如权利要求1-3任一项所述双特异性抗体或如权利要求4-6任一项所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、膀胱癌、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、胶质瘤中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为肺癌。
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|---|---|---|---|---|
| CN118047874A (zh) * | 2024-02-19 | 2024-05-17 | 北京润州生物科技有限公司 | 一种双特异性抗体及其与t细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用 |
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2022
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