CN115747066A - 一种哺乳动物脑组织/细胞生物节律体外培养系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种哺乳动物脑组织/细胞生物节律体外培养系统，可进行SCN脑片长期的非介入式的自动化培养，并可对其微环境进行充分地调控，可进行生物大分子等外源刺激对生物钟体系作用的机理研究。

Description

一种哺乳动物脑组织/细胞生物节律体外培养系统

技术领域

本发明涉及哺乳动物生物节律的体外培养系统，包括脑组织切片的体外培养和细胞的体外培养，特别涉及一种长周期非介入式的脑片生物节律研究方法，属于生物医药工程领域。

背景技术

哺乳动物的生物节律体系是由众多子生物钟组成的自上而下组织的复杂系统，其中包含细胞自主的细胞生物节律和同步化的器官层面的生物节律。从单细胞水平到器官组织水平来研究认识哺乳动物生物节律的分子机制，对于理解生物节律和宏观层面的生理活动的关系至关重要。在众多子生物钟系统中，位于大脑下丘脑前部的视交叉上核(SCN，suprachiasmatic nucleus)是哺乳动物的中枢时钟，调控着所有器官的生物节律的稳定性。SCN时钟通过外接光刺激跟外界周期信号同步，向其他大脑区域提供时间信息。然后通过这些系统同步身体与各种生理活动相关的外周时钟。所以对生物节律的研究，不仅有助于理解大脑运行的生物机制，也对理解疾病的发生和疾病的治疗提供帮助。SCN作为哺乳动物的中枢时钟，区别于其他器官的地方在于，除了转录-翻译反馈环路决定的细胞自主的生物节律，还存在神经元生物节律之间的耦合，使得神经元之间的自主节律达到同步，最终具有稳定，精准的节律输出，决定大脑以及外周时钟的生物节律的稳定。

目前，来自小鼠的SCN脑片和细胞系是研究哺乳动物生物节律的重要模型系统。其体外培养，特别是SCN脑片的体外培养，是研究和认识生物节律系统背后的生物机制的非常重要且有效的手段，并为未来对哺乳动物生物节律的有效调控提供思路。而SCN脑片的体外培养，不同于传统的浸入式的细胞培养，类器官培养，甚至组织培养。SCN脑片的成功培养，需要一个气液界面的存在，即SCN需要既接触液体又要接触到空气，同时保证养分和氧气的供应。现在对SCN脑片的体外培养，主要手段是培养皿静态培养的方式：将SCN脑片放置于半透膜上，然后放到35mm培养皿中，灌注入适当体积的培养基，浸润半透膜，保证气液界面的存在。最后用玻片和凡士林将培养皿密封。这种静态培养方式存在诸多问题：一个是在长周期的培养过程中，培养基养分的均一性难以保持。第二个问题更换培养基的过程中会导致密封环境被破坏，引入外界的扰动，改变微环境并影响生物钟基因的表达。第三个问题是无法通过周期性的精准外源刺激来研究SCN生物节律对外源药物等的响应。过去几年，微流控芯片技术的发展，对细胞体外培养的方式带来了突飞猛进的进步，但微流控芯片技术更多的是创造一个密闭的浸入式培养系统，并不适用于SCN脑片的气液界面的培养模式。而开放式的培养体系，虽可以创造一个完全符合要求的气液界面，但随之而来的长时间培养过程中的污染问题以及缺乏精准外源控制，也不适用于SCN脑片培养。正因为缺乏一个可精准调控的 SCN脑片体外培养系统/平台，使其作为生物节律研究的重要模型系统，发展受到了很大的限制，远远落后于细胞体外培养的研究进展。目前亟待开发一个可精准调控的SCN脑片体外培养系统。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种哺乳动物脑组织/细胞生物节律体外培养系统，可进行 SCN脑片长期的非介入式的自动化培养，并可对其微环境进行充分地调控，可进行生物大分子等外源刺激对生物钟体系作用的机理研究。基于新系统，我们将其进行了高通量/功能性的扩展，提供了应用于生物节律体系的分子机制和药物作用的新研究平台。

具体的，本发明提供一种哺乳动物脑组织/细胞生物节律体外培养系统，其包括以下部件：

旋钮盖，培养主体，废液缸，密封件和细胞培养小室，其中，旋钮盖内部承接PDMS固化层，用于密封培养主体中的样品室，所述样品室用于放置培养脑片的细胞培养小室，细胞培养小室外侧有密封圈，细胞培养小室位于培养主体的底部之上，培养主体的底部可与废液缸顶部由鲁尔接头连接，可编程注射器泵经由鲁尔接头向培养主体提供外源物质，通过培养主体内部的分层式设计，使外源物质流过含有脑片的不同高度的平面，再经开放式出口进入废液缸外侧的中空区域；培养主体包括透明材料层和分离层，透明材料层位于其底部，可作为光学信号测量窗口进行功能性拓展；废液缸的近中间部分为一预留空间，该空间可用于容纳光学探测器或物镜；培养主体外部连接有温控模块，用于控制系统的温湿度。

根据优选的实施方式，所述细胞培养小室为无菌的插入式细胞培养小室，薄膜为PTFE 半透膜。

根据优选的实施方式，旋钮盖与细胞培养小室之间通过硅胶O-ring进行密封，通过旋钮盖和培养主体的配合螺纹锁紧。

根据优选的实施方式，可编程注射器泵可以装备多路注射器架，可拓展多个独立培养通道，通过鲁尔接头和FEP管路连接注射器和培养主体，注射器泵可通过程序控制运行。

根据优选的实施方式，所述温控模块包括环形加热片，温度传感器，外部温度控制器，固态继电器，触摸屏和水箱，其中环形加热片靠近细胞培养小室，温度传感器置于环形加热片上方的小孔中，以检测反馈实际温度；水箱中的水蒸气通过培养主体上方的孔与样品室相通，提供湿度和一定蒸气压；外部温度控制采用触摸屏，控制器和固态继电器组合的方式，可同时稳定调节多个通道的温度。

根据优选的实施方式，所述培养主体的透明材料层可以使用多聚-L-赖氨酸，胶原或者纤维粘连蛋白等进行包被，用于培养细胞。

根据优选的实施方式，所述系统可进一步集成光学测量模块，通过光学信号测量窗口和废液缸的预留空间，可分别对样品进行高时间分辨率的光信号测量和高空间分辨率的光学成像。

根据优选的实施方式，所述高时间分辨率的光信号可以是通过光电倍增管(PMT)来采集，外接光子计数模块，通过信号转换盒，直接读取PMT的信号。

根据优选的实施方式，所述高空间分辨率的光学成像通过与显微系统的组合来采集，利用10x(高NA)物镜和电荷耦合器件相机通过长时间曝光直接读取。

本发明提供一种基于显微镜系统的多模测量方法，结合化学发光模式和荧光模式，通过对不同基因进行标记，可对脑片和细胞同时进行基因的化学发光和荧光测量，研究不同基因或者信号通路之间的关联性。

本发明的有益之处

本发明的哺乳动物脑组织/细胞生物节律体外培养系统，相比较现有的培养皿培养方法，本系统能够解决SCN脑片培养的诸多方法学限制，如换液过程中的温度漂移，血清休克，微环境干扰等，具有以下优势：

1.半封闭式的设计和可编程的流体控制，能够在长时间培养过程中保持稳定的微环境，零外界扰动和周期性的外源刺激；

2.模块化设计和自动化流程，方便操作及节省人力；

3.可兼顾SCN脑片培养和细胞培养。

附图说明

以下结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

图1.脑组织/细胞自动化培养系统示意图；其中图(A)为系统组装图；图(B)为系统分解图；图(C)为培养主体分解图；

图2.为培养主体剖面图；

图3.为加热模块图；

图4.为基于PMT的多通道系统图，插图为多通道测量结果示意图；

图5.为基于CCD的成像系统图，插图为SCN自发光成像结果；

图6.为实施例1中多通道测量SCN在外源药物作用下的生物节律图，黑色曲线为vip基因双敲除的SCN在周期性外源VIP作用下的生物节律；灰色曲线为vip基因双敲除的SCN在没有外源药物作用下的生物节律；

图7.为实施例2中SCN在外源药物作用下的单细胞生物节律图。图(A)为SCN在周期性外源VIP作用下的时序图像；图(B)为SCN整体生物节律曲线；图(C)为SCN单细胞生物节律热图；

图8.为实施例3中多通道测量细胞的生物节律图。黑色实线和黑色虚线分别是两个独立通道测量的per2基因双敲除的小鼠成纤维细胞的生物节律。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

本发明中，所涉及的位置相关的词语，例如“上”“下”“左”“右”“垂直”“水平”“X 方向”“Y方向”“前”“后”“高”“低”“内”“外”表述的是相对的位置关系，并不代表具体的位置。本领域技术人员可以理解的，当调整整个装置的方向的时候，所有的位置关系都会发生相应的变化。

需要说明的是，当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中设置的元件。

本发明提供一种哺乳动物脑组织/细胞生物节律体外培养系统，命名为‘Brain-Slice-In-A-Chamber’(BaSIC)系统(图1)。其中(a)脑组织/细胞自动化培养系统BaSIC 主体；其中图(b)中为BaSIC系统的组成模块，包括旋钮盖，培养主体，废液缸和密封件等。其中101为旋钮盖，为环状结构，由圆盘状PDMS 1011和PEEK加工而成的环形手拧件 1012组成，其作用是固定以及密封细胞培养小室103，防止液体从外侧溢出，并通过1011保持气体从外侧到103内的充分扩散和样品室的透光性。105为培养主体。101和105之间通过螺纹进行配合锁紧；102和104为环形硅胶密封O圈，其作用是保持细胞培养小室103的密封性；103为细胞培养小室，其为商用的无菌的插入式细胞培养小室(Millicell)，为透明部件，直径12mm，由聚丙烯制成，形状圆筒状，底部有一承托薄膜，为亲水性的PTFE半透膜，浸润后呈透明化，在细胞培养的过程中，水分子或者化学小分子可以通过半透膜扩散到达培养脑片或者细胞的位置。

105为培养主体，由玻璃层和两层通过机械加工的PEEK层等组成。其结构如(c)中所示。

106为废液缸，通过机械加工聚甲醛(POM)材料制作而成，类环形结构，用于存储培养过程中产生的废液。其中间部分保持中空，空间可容纳光学探测器或物镜。106与105之间利用106材料的弹性形变进行锁紧。

107为手拧鲁尔接头，为PEEK材料，其作用是锁紧外接管路，与内部流体管路联通并锁紧。

图(c)为105的结构分解图，其左图和右图分别为不同角度的视图。其中1051和1054为机械加工PEEK件，作为支撑件，其中1051部分开有窗口和流体管路缓冲区域。1054部分开有圆形窗口，以容纳圆形玻璃片，作为样品观测窗口。1052,1053和1055为切割无菌双面胶。其中1052和1053用于粘结密封1051和1054PEEK件，同时1052上留有流体通路，与1051和1054上的结构共同组成培养主体内的流体通路。1055用于粘结1054PEEK件和1056玻璃件，其上同时留有流体通路。1056为1mm厚的圆形石英玻璃，其作用一是作为底部光学观测窗口，二是作为底部承托件，与1054和1055共同组成样品底部的密闭流体通路。

BaSIC系统的组成模块，包括旋钮盖，培养主体，废液缸和密封件，可分拆可组装，并可重复利用。组装完成后可以承接直径12mm或30mm的细胞培养小室(Millicell)。此商业化的插入式细胞培养小室，由聚丙烯制成，承托薄膜为亲水性的PTFE半透膜，浸润后呈透明化，可进行光学信号测量(图1)。培养主体由玻璃层和两层PEEK材料通过机械加工完成的分离层组成。玻璃层位于底部，可作为光学信号测量窗口进行功能性拓展。旋钮盖用PEEK 材料通过机械加工制作而成，内部承接PDMS固化层，既密封样品室又可保持透气透光性。废液缸用聚甲醛(POM)材料通过机械加工制作而成，其中间部分保持中空，空间可容纳光学探测器或物镜。

进一步的，培养主体内部利用分层式设计(图2)，使培养基流过不同高度的平面，以减少气泡在培养小室下方空间的聚集和产生。培养基入口通过PEEK鲁尔接头连接管路，出口采用开放式设计，使培养基以最小的流阻进入废液缸。这样可以避免在长期培养过程中，流阻导致液体渗透培养小室的半透膜而浸没SCN脑片，破坏培养稳定性。

图2中，1011为PDMS层，为圆盘状，其作用为透光透气，并辅助密封脑片/细胞培养小室；201为样品培养小室上部空间，为圆柱形空间，在培养过程中充满空气，保证培养脑片所必需的气体氛围；202为包含SCN区域的小鼠脑片，其被放置在103的半透膜上，底部接触半透膜，保证脑片培养过程中所必需的养分供给，并可进行外源小分子刺激；203为充满培养主体105流体通路的培养基，在培养过程中，培养基单向流动，在出口处以最小的流阻流入废液缸106，其出口上部窗口与加热模块联通。

进一步的，培养基和外源药物通过两台外接可编程注射器泵(Harvard仪器)供给。注射器泵装备12路注射器架，最多可拓展至12个独立培养通道。管路采用1/16”聚全氟乙丙烯 (FEP)管，通过PEEK鲁尔接头连接注射器和培养主体。注射器泵通过自主编写的LabVIEW程序控制运行，可进行周期性灌流及药物刺激。

进一步的，本发明的玻璃观测窗口，可通过Poly-L-lysine，collagen或者Fibronectin等进行包被，进行细胞的培养，提供同时可适用于单细胞的生物钟研究平台，并进一步的可进行细胞和SCN脑片的共培养研究。

进一步的，本发明设计了独立的温控模块，在多通道模式下可对每个通道进行单独的温度控制。温控系统由环形陶瓷加热片(MCH)，PT100温度传感器，外部PID温度控制器，固态继电器，触摸屏和铝合金水箱组成(图3)。

图3中，(a)虚线框区域为加热模块。加热模块整体可放置于BaSIC主体之上，无需锁定，为BaSIC在细胞培养过程中提供恒温恒湿条件。

(b)加热模块剖面图。其中(301)为水箱，圆柱形中空结构，通过机械加工方式用铝合金加工而成，表面进行阳极氧化，其上部的盖子可打开。内部空间可装入无菌水，在加热过程中，水蒸气通过与培养主体相通的管路联通，为培养主体(105)流体通路出口处(203)提供一定的湿度，保证在长期培养过程中出口处的流体流动。

302为pt100热敏电阻探头，探头尺寸为2.3*2.1*0.9mm，放置于(301)中的其中一个管路中，通过导热硅胶固定，与外接PID控制器连接，其作用为探测反馈培养小室103附近的实时温度。

303为环形陶瓷加热片(MCH)，圆环状结构，外径55mm，内径36mm，厚度2mm，通过导热硅胶与301粘合固定，为301以及培养主体105和培养小室103提供恒定的温度。外部通过工业触摸屏，PID控制器和固态继电器组合的方式，为脑片/细胞培养保持37℃恒定温度。

301铝合金水箱表面为阳极氧化层。环形MCH置于系统的最底部，靠近样品小室，且保持在同一水平面。PT100温度传感器置于MCH上方的小孔中，以检测反馈实际温度。加热片和传感器通过导热硅胶与铝合金水箱粘合固定。在MCH加热样品室的过程中，水箱中水蒸气会通过BaSIC上方的垂直孔与样品室相通，提供样品室周围的湿度和一定蒸气压。外部温度控制采用工业触摸屏，PID控制器和固态继电器组合的方式，可同时稳定调节八个通道的温度，操作方便。独立温控系统和灌流系统的配合，可使SCN脑片和细胞培养脱离CO2 培养箱的限制。

进一步的，本发明可集成光学测量模块，通过玻璃观测窗口和废液缸预留空间，可对样品进行高时间分辨率的光信号测量和高空间分辨率的光学成像。

进一步的，模块化和小型化的设计使培养系统不受培养箱的空间限制，既可以进行多通道拓展，也能够进行功能性扩展，集成到现有的显微测量系统中。生物节律的高分辨时序动态曲线通过光电倍增管(PMT)来采集，并拓展至8通道(图4)。

图4中，其中401为培养器件，包括BaSIC和加热模块，其作用是恒温培养脑片或细胞样品；402为底座，铝合金材料加工而成，表面阳极氧化，作用为支撑固定401；403为光电倍增管(PMT)，探测微弱光信号，通过407与光子计数模块相连接，利用LabVIEW程序进行光学信号测量；404为光学板，通过402安装固定多通道系统；405为培养单元外接注射器泵管路示意，为BaSIC提供恒定培养基供给；406为302和303外接温控系统线路示意；407 为PMT外接光子计数模块线路示意。

每个通道配有独立的温控通路，灌流通路和信号采集通路。多通道信号的采集由NI PXI 系统完成。NI PXI系统安装光子计数模块，通过一个8-12通道的信号转换盒，直接读取PMT 的信号。自主编写的LabVIEW程序用来读取信号，处理数据并生成曲线。生物节律的高分辨空间动态曲线，通过与显微系统的组合来采集。利用10x(高NA)物镜和长时间曝光电荷耦合器件相机(Andor iKon CCD)(图5)，和Andor Solis软件或者自己编写的u-manager脚本文件通过长时间曝光直接读取。

图5中，501为培养器件，包括BaSIC和加热模块，其作用是恒温培养脑片或细胞样品；

502为适配显微镜的底座，铝合金加工而成，作用为固定501于显微镜平移台；

503为10倍物镜，作用为观测样品和收集微弱光学信号；

504为反射镜，将来源于样品的光信号反射到505的探测芯片上；

505为Andor CCD光学信号探测器，用于样品光信号的收集和成像。外接电脑通过软件控制CCD进行成像，及外接水冷模块，以保持CCD芯片在低温下运行；

506为302和303外接温控系统线路示意；

507为培养单元外接注射器泵管路示意，为BaSIC提供恒定培养基供给。

进一步的，本发明可提供一种基于显微镜系统的多模测量方法，结合化学发光模式和荧光模式，通过对不同基因进行标记，可对SCN脑片和细胞同时进行生物钟相关基因的化学发光和荧光测量，研究不同基因或者信号通路之间的关联性以及对哺乳动物生物节律的影响。

本发明中所涉及到的方向性的词语，例如上，下等，应该描述为一般性的表述。其意义为相对的位置关系。并不需要将这些词语理解为特定的方向。比较一般的，当将装置置于稍微倾斜的台面的时候，相应的位置关系的词语需要做出相应的调整。

实施例1

小鼠SCN脑片的体外长周期培养和实时化学发光测量---多通道测量

本例利用多通道系统研究了SCN脑片在外源周期性药物作用下的生物节律。

1.SCN脑切片准备：

实验中所用的小鼠都表达有mPer2启动子驱动的荧光素酶报告基因(简写为mPer2-luc)。荧光素酶在单细胞中的功能半衰期约为1.2小时。准备2-5个月大的小鼠，本实验用到野生型小鼠和vip基因敲除的小鼠，并且都表达了Per2-LUC基因，用于自发光探测。将小鼠放入 100流明/平方米光照的箱子底部，经过至少两周时间的12小时/12小时的亮暗周期循环。然后在光照结束后的4-6小时内杀死小鼠，这样可以将SCN的生物节律相位移动降至最小。在 15分钟内，切片取出小鼠的SCN区域。准备SCN切片需要的设备和溶剂如下：

1)B27 supplement 50x(Invitrogen,Catalog:17504-044)

2)Millicell细胞培养小室(EMD Millipore，Catalog：PICM01250)

3)DMEM Medium Powder(Sigma-Aldrich，Catalog：D2902)

4)HEPES溶液(Invitrogen，Catalog：15630-056)

5)HBSS 10x溶液(Invitrogen，Catalog：14065-049)

6)7.5％NaHCO3溶液(Invitrogen，Catalog：25080-060)

7)10,000U/ml Penicillin-Streptomycin(Invitrogen，Catalog：15140-122)

8)D-Luciferin,Sodium Salt(GoldBio，Catalog：LUCNA)

9)Vibratome(Campden Instruments)

准备SCN切片的操作过程：

1)准备需要的溶液

a)培养基

加入A Pack of DMEM powder；20mL 50x B27 Supplement；4.7mL 7.5％ NaHCO3；10

mL HEPES溶液；2.5mL 10,000U/ml Penicillin-Streptomycin；3.5g D-glucose；然后加入800ml无菌双重蒸馏水。用NaOH者HCl将溶液pH调至7.2，并用无菌双重蒸馏水将总体积调至1L。最后过滤。使用之前加入D-luciferin(0.1mM)，避光并保存于4℃。

b)Hank缓冲液

加入10mL 10,000U/ml的penicillin/streptomycin溶液，5mL 7.5％NaHCO₃和10mL HEPES缓冲液到100mL 10x HBSS储存溶液中，然后加入800mL无菌双重蒸馏水。调整pH到7.2并用无菌双重蒸馏水将体积调至1L。最后过滤溶液并保存在4℃。

c)VIP溶液

VIP为鼠源VIP，为包含有28个氨基酸的多肽。将合成VIP粉末溶解于10mL培养基中，得到所需浓度的VIP溶液，保存于4℃。

(蛋白序列为HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN，由强耀公司化学合成)

2)准备SCN切片，包括野生型SCN和vip基因敲除的SCN。

a)通过颈椎脱位法迅速杀死小鼠。用眼科剪刀迅速去除眼球。接着用剪刀迅速切下小鼠头部。

b)用眼科剪刀小心的切下颅骨，并快速剥离小鼠大脑。将预冷的Hank缓冲液加入60mm直径的培养皿中，并用Hank缓冲液冲洗剥离的小鼠大脑。

c)在大脑和小脑的结合处切一个冠状切口。

d)将小鼠大脑固定在震动切片机的平台上。固定时，确保小鼠大脑垂直于切片平台。

e)将切片平台灌注预冷的Hank缓冲液。

f)将切片机调节到以最快的震动频率和稍慢的切割速度进行切片。将切割厚度调至 200微米进行切片。

g)将包含SCN的脑片用消毒的小刷子转移至装有培养基的培养皿中，并在体式显微镜下将SCN部分找出并用手术刀在显微镜下切出。(一般一只老鼠可以切出两片包含 SCN的脑片，每片大概500微米X 500微米的大小)

h)用消毒的小吸管或者枪头将SCN切片转移到细胞培养小室的半透膜上，并吸干半透膜上剩余的培养基。

2.BaSIC灌流系统准备：

主体组装：三层之间通过打印的无菌胶带(品牌)进行粘合，并室温下过夜放置，增加各层之间粘附强度，达到半永久粘合。最后，两层PEEK部件之间，通过epoxy胶进行点加固，并放置过夜。完成后，作为整体使用。

旋钮盖内部PDMS填充：将旋钮盖倒置与硅片上，注入PDMS(10:1混合)，烘箱80度固化后两小时后，作为透光窗口和密封透气层。(注：PDMS可透气)

1)将BaSIC灌流培养系统拆解，放入75％酒精中浸泡过夜；然后所有部件用去离子水清洗2-3次，空气中晾干；组装灌流培养系统；(超净台中准备)

2)鲁尔接头和FEP管路分别用75％酒精和去离子水冲洗；(超净台中)

3)将温控系统的铝合金骨架用75％酒精擦拭，注入去离子水，旋紧盖子；将(校准的) 温控系统设定实验温度为37℃，加热并稳定在设定温度；

4)根据实验要求，选择不同的注射器型号，分别预装入培养基，药物等；(超净台中)

5)将切好的小鼠野生型SCN脑片样品和vip敲除的SCN脑片样品，分别放入12mm的培养小室中，放入组装好的灌流培养系统中，旋钮盖与培养小室之间通过硅胶O-ring进行密封，通过旋钮盖和培养主体的配合螺纹锁紧；(超净台中)

6)通过鲁尔接头和FEP管路，连接注射器和灌流培养系统，并安装好废液缸，最后将培养基充满管路和培养小室下方空间；(超净台中)

7)将组装好预装样品的灌流培养系统移到探测器上，并盖上预处理加热的铝合金水箱，注射器预装到注射器泵中；

8)启动信号采集程序和自动灌流程序；设定信号读取采集周期，和灌流时间，速度，和给药间隔等参数；PMT信号读数一般设置1分钟的读取时间，每五分钟读取一次；培养基灌流速度可设置低至0.5ul/min到1ul/min，持续灌流；外源药物灌流速度可设置2.5ul/min-3u/min 的速度，持续时间2-4小时。药物刺激一般每24小时进行一次。

9)开始测量。

3.测量结果：如图6中所示，为多通道测量系统中，vip基因双敲除SCN脑片在周期性药物刺激和没有药物刺激下，生物节律的实时曲线。

实施例2

小鼠SCN脑片的体外长周期培养和实时化学发光测量---成像测量

本例利用SCN成像系统研究了vip双基因敲除的SCN脑片在外源药物周期性作用下的单细胞生物节律，其培养基配置，SCN切片准备，器件准备步骤均见实施例1。准备好的器件放置到显微镜平台，开启CCD的水冷设备，将CCD循环水温度调至20℃，CCD工作温度可降至-90℃。启动Solis测量软件，设置曝光时间为30分钟；其他实验设计，如灌流系统，加热系统设计，见实施例1。

SCN在外源药物作用下的生物节律以及单细胞生物节律结果见图7。

实施例3

小鼠成纤维细胞的体外长周期培养和生物节律实时化学发光测量

本例探索了多通道测量系统应用于小鼠成纤维细胞长周期培养和生物节律化学发光测量的实例。本实验中用的细胞系为小鼠成纤维细胞系，基因型为per2双基因敲除。

细胞准备流程：

通过慢病毒载体基因转导的方法构建永生化的per2双基因敲除的成纤维细胞和per1双基因敲除的成纤维细胞。

需要的设备和溶剂如下：

1)B27 supplement 50x(Invitrogen,Catalog:17504-044)

2)Millicell细胞培养小室(EMD Millipore,Catalog:PICM01250)

3)Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)(gibco,Catalog:C11965500BT)

4)DPBS溶液(gibco,Catalog:14190-144)

5)0.25％ Trypsin-EDTA(gibco,Catalog:C25200-056)

6)Poly-L-lysine溶液(Sigma-Aldrich,Catalog:P4707)

7)DMEM Medium powder(Sigma-Aldrich,Catalog:D2902)

8)HEPES溶液(Invitrogen,Catalog:15630-056)

9)7.5％ NaHCO3溶液(Invitrogen,Catalog:25080-060)

10)10,000U/ml Penicillin-Streptomycin(Invitrogen,Catalog:15140-122)

11)D-Luciferin,Potassium Salt(GoldBio,Catalog:LUCK)

准备的操作过程如下：

1)准备记录培养基：加入A Pack of DMEM powder；20mL 50x B27 Supplement；4.7mL

7.5％ NaHCO3；10mL HEPES溶液；2.5mL 10,000U/ml Penicillin-Streptomycin；3.5g D-glucose；然后加入800ml无菌双重蒸馏水。用NaOH者HCl将溶液pH调至7.2，并用无菌双重蒸馏水将总体积调至1L。最后过滤。使用之前加入D-luciferin(0.1mM)，避光并保存于4℃。

2)准备细胞

a)用Poly-L-lysine(1mg/mL)来包被玻璃观测窗口，包被2h后，去除Poly-L-lysine，并用无菌双重蒸馏水清洗。

b)准备细胞，用DMEM培养基在37℃5％ CO2条件下培养细胞，在进行记录之前，先用PBS清洗，再用0.25％ Trypsin-EDTA消化细胞，并用DMEM将细胞重悬。将适量的细胞悬液转移至玻璃观测窗口处，待细胞贴壁后，用记录培养基进行换液。

3)BaSIC灌流系统准备：

a)将BaSIC灌流培养系统拆解，放入75％酒精中浸泡过夜；然后所有部件用双蒸水清洗2-3次，空气中晾干；组装灌流培养系统；(超净台中准备)

b)用Poly-L-lysine(1mg/mL)将灌流培养系统的玻璃层进行包被，两小时后移除Poly-L-lysine，并用双蒸水冲洗一遍。然后把细胞(浓度)用移液枪移入玻璃层上，将旋钮盖旋紧密封，放入37℃培养箱过夜，等待细胞贴壁。(超净台中)

其他步骤见实施例1。

其他步骤(灌流系统，加热系统，以及测量准备等)见实施例1。

利用多通道系统测量per2双基因敲除成纤维细胞生物节律结果见图8。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种哺乳动物脑组织/细胞生物节律体外培养系统，其包括以下部件：旋钮盖，培养主体，废液缸，密封件和细胞培养小室，其中，旋钮盖内部承接PDMS固化层，用于密封培养主体中的样品室，所述样品室用于放置细胞培养小室，细胞培养小室外侧有密封圈，细胞培养小室位于培养主体的底部之上；培养主体的底部可与废液缸顶部由鲁尔接头连接；可编程注射器泵经由鲁尔接头向培养主体提供外源物质，通过培养主体内部的分层式设计，使外源物质流过含有细胞的不同高度的平面，再经开放式出口进入废液缸外侧的中空区域；培养主体包括透明材料层和分离层，透明材料层位于其底部，可作为光学信号测量窗口进行功能性拓展；废液缸的近中间部分为一预留空间，该空间可用于容纳光学探测器或物镜；培养主体外部连接有温控模块，用于控制系统的温湿度。

2.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述细胞培养小室为无菌的插入式细胞培养小室，薄膜为PTFE半透膜。

3.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，旋钮盖与细胞培养小室之间通过硅胶O-ring进行密封，通过旋钮盖和培养主体的配合螺纹锁紧。

4.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，可编程注射器泵可以装备多路注射器架，可拓展多个独立培养通道，通过鲁尔接头和FEP管路连接注射器和培养主体，注射器泵可通过程序控制运行。

5.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述温控模块包括环形加热片，温度传感器，外部温度控制器，固态继电器，触摸屏和水箱，其中环形加热片靠近细胞培养小室，温度传感器置于环形加热片上方的小孔中，以检测反馈实际温度；水箱中的水蒸气通过培养主体上方的孔与样品室相通，提供湿度和一定蒸气压；外部温度控制采用触摸屏，控制器和固态继电器组合的方式，可同时稳定调节多个通道的温度。

6.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述培养主体的透明材料层可以使用多聚-L-赖氨酸，胶原或者纤维粘连蛋白等进行包被，用于培养细胞。

7.根据权利要求1所述的培养系统，其特征在于，所述系统可进一步集成光学测量模块，通过光学信号测量窗口和废液缸的预留空间，可分别对样品进行高时间分辨率的光信号测量和高空间分辨率的光学成像。

8.根据权利要求7所述的培养系统，其特征在于，所述高时间分辨率的光信号可以是通过光电倍增管(PMT)来采集，外接光子计数模块，通过信号转换盒，直接读取PMT的信号。

9.根据权利要求7所述的培养系统，其特征在于，所述高空间分辨率的光学成像通过与显微系统的组合来采集，利用10x(高NA)物镜和电荷耦合器件相机通过长时间曝光直接读取。

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