CN115725494A - ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎附植中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了ssc‑miR‑92b‑3p在促进猪胚胎附植中的应用。本发明经大量研究得出ssc‑miR‑92b‑3p对猪胚胎附植的促进作用，以及ssc‑miR‑92b‑3p对猪PFKM基因表达的抑制作用；此外本发明还研究得出抑制猪PFKM基因表达可以促进猪胚胎附植，通过ssc‑miR‑92b‑3p抑制猪PFKM基因的表达，促进pTr2细胞的增殖、迁移，进而促进猪胚胎附植，降低猪自发性胎儿丢失的概率。本发明能够解决养猪业自发性胎儿丢失的问题，对于养猪业具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎附植中的应用。
背景技术
妊娠最关键的阶段是胚胎附植阶段，在猪妊娠第12天左右，猪的胚胎在子宫角之间迁移并列腾出合适的空间以寻找合适的位置附着。胚胎的同步发育能力和子宫对胚胎着床的接受能力对于成功的胚胎植入(胚胎附植)至关重要。但猪胚胎的自发性胎儿丢失经常发生，据统计，大约有20％～45％的胚胎在猪妊娠的过程中丢失，大约有20％-30％的胚胎在植入前期(妊娠12-30天)丢失，这成为全球商业化养猪业的一个重大问题。
早期胚胎发育发生在无氧糖酵解的低氧环境下，在低氧的环境下，胎盘细胞被认为可以促进糖酵解并抑制线粒体代谢。磷酸果糖激酶-M(PFKM)是参与糖酵解能量代谢途径中的关键限速酶，PFKM的表达水平对早期胚胎的无氧糖酵解途径具有显著的调控作用。但是，现有技术中仅仅表明PFKM的表达水平的改变可以调节胚胎无氧糖酵解的通量，并没有说明改变PFKM的表达水平与胚胎附植是否有关。
现有技术中关于猪妊娠阶段分子层面的研究多集中在分子表达水平的变化，即妊娠检测诊断分子的研究，如发明人以前的研究表明，猪妊娠早期母体血清中分离的外泌体中ssc-miR-92b-3p的表达水平增加，可以作为母猪早期妊娠的诊断标志物；Stacy MYadava等人研究发现来自脐动脉的外泌体可以被胎盘摄取，且与早期剖腹产分娩的孕妇相比，足月分娩孕妇的胎盘中ssc-miR-92b-3p的表达量显著增加；因此，ssc-miR-92b-3p可以作为猪妊娠检测诊断分子标志物。再如黄涛等人发现，母猪早期血清外泌体中的ssc-miR-192、ssc-miR-146a-5p和ssc-miR-149可联合分析母猪早期的妊娠状况。但是，妊娠后表达水平变化的分子是妊娠发生后机体产生的生理变化，此类研究无法用于解决猪胚胎的自发性胎儿丢失的问题。研究对胚胎附植阶段产生直接影响的分子具有重要的意义。
寻找能够促进胚胎附植的方法对全球养猪业具有相当的必要性。
发明内容
本发明针对现有技术中猪自发性胎儿丢失率高的问题，旨在提供能够促进猪胚胎附植的技术。根据本发明研究，通过外泌体miRNA促进猪胚胎滋养层细胞的增殖与迁移，以达到促进猪胚胎附植的目的，降低猪自发性胎儿丢失的概率。
本发明的首要目的在于提供ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供抑制PFKM基因表达的试剂在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供抑制PFKM基因表达的试剂在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供ssc-miR-92b-3p在抑制猪PFKM基因表达中的应用，或在制备抑制猪PFKM基因表达药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂在抑制猪PFKM基因表达中的应用，或在制备抑制猪PFKM基因表达药物中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种促进猪胚胎附植的方法。
本发明通过一下技术方案实现上述发明目的：
我们的研究发现ssc-miR-92b-3p在猪的子宫内膜和胚胎组织中显著表达，且与空怀母猪相比，妊娠母猪的子宫内膜组织中表达量显著升高。
pTr2细胞是胚胎发育的重要细胞类型，在整个妊娠过程中对胎儿的生长发育发挥着重要的作用。在妊娠的第12天，猪的胚胎由球状迅速转变为丝状并确定他们的附植位置，在胚胎形态和功能转变的这一时间段，有30％-40％的胚胎由于未能延展并使滋养外胚层与母体子宫内膜上皮细胞广泛的接触而导致死亡。我们的结果发现ssc-miR-92b-3p可以促进pTr2细胞的增殖和迁移，以促进胚胎的附植。因此通过提高ssc-miR-92b-3p的表达水平来促进pTr2细胞的增殖和迁移以促进胚胎的附植。我们向小鼠子宫角注射了ssc-miR-92b-3p的抑制剂，发现注射antago-miR-92b-3p一侧的子宫小鼠胚胎附植数量与另一侧注射DEPC水的对照组相比显著减少。
本研究通过生物信息学预测到PFKM为ssc-miR-92b-3p的靶基因，ssc-miR-92b-3p通过PFKM来影响胚胎的着床和生长。然后通过双荧光素酶报告实验、RT-qPCR、蛋白印迹分析证明了ssc-miR-92b-3p可以抑制PFKM基因的mRNA和蛋白水平的表达。PFKM基因表达水平的下降将会促进pTr2细胞的增殖和迁移以促进胚胎的附植。干扰PFKM基因的表达可以促进pTr2细胞的增殖和迁移，基于此，我们做出推断，在胚胎附植的过程中，胚胎滋养层细胞中的PFKM基因表达量下降，防止糖酵解产生过多的ROS，从而促进胚胎附植。
我们的结果显示，ssc-miR-92b-3p在妊娠母猪胚胎附植期间(P9、12、15)子宫内膜和胚胎中的表达水平不断升高，且显著高于空怀母猪(C9)。此外，ssc-miR-92b-3p可以促进猪胚胎滋养层(pTr2)细胞的增殖和迁移。通过生物信息学预测到ssc-miR-92b-3p的靶基因PFKM，通过双荧光素酶报告实验、qPCR、WB等实验验证了其靶向关系。并发现干扰PFKM基因的表达可以显著促进pTr2细胞的增殖和迁移。我们还发现减少ssc-miR-92b-3p在小鼠子宫的表达将会导致小鼠胚胎植入的数量减少。
因此，在胚胎附植这一过程期间，ssc-miR-92b-3p发挥着重要的作用。
基于上述研究，本发明提供以下应用与方案：
本发明提供了ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植的产品中的应用；其中ssc-miR-92b-3p的序列为UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC。
本发明还提供了促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植的产品中的应用。
优选地，所述促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂包括但不限于ssc-miR-92b-3pmimics。
本发明还提供了ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移的产品中的应用。
本发明还提供了促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移的产品中的应用。
优选地，所述促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂包括但不限于ssc-miR-92b-3pmimics。
本发明还提供了抑制PFKM基因表达的试剂在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植的产品中的应用。
本发明还提供了抑制PFKM基因表达的试剂在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移的产品中的应用。
优选地，所述抑制PFKM基因表达的试剂包括但不限于ssc-miR-92b-3p、si-PFKM-141、si-PFKM-879、si-PFKM-1586；
其中，
si-PFKM-141的序列为S:GGUUCGAGUUGGCAUCUAUTT；
AS:AUAGAUGCCAACUCGAACCTT；
si-PFKM-879的序列为S:GGUAAAGCGUCUGGGAUAUTT；
AS:AUAUCCCAGACGCUUUACCTT
si-PFKM-1586的序列为S:GCAUCCCGUUUGUGGUCAUTT；
AS:AUGACCACAAACGGGAUGCTT。
本发明还提供了ssc-miR-92b-3p在抑制PFKM表达中的应用，或在制备抑制PFKM表达的产品中的应用。
本发明还提供了促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂在抑制PFKM表达中的应用，或在制备抑制PFKM表达的产品中的应用。
优选地，所述促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂包括但不限于ssc-miR-92b-3pmimics。
本发明还提供了一种促进猪胚胎附植的方法，抑制猪PFKM基因表达。
优选地，通过ssc-miR-92b-3p或si-PFKM-141或si-PFKM-879或si-PFKM-1586抑制猪PFKM基因表达；
其中，
si-PFKM-141的序列为S:GGUUCGAGUUGGCAUCUAUTT；
AS:AUAGAUGCCAACUCGAACCTT；
si-PFKM-879的序列为S:GGUAAAGCGUCUGGGAUAUTT；
AS:AUAUCCCAGACGCUUUACCTT
si-PFKM-1586的序列为S:GCAUCCCGUUUGUGGUCAUTT；
AS:AUGACCACAAACGGGAUGCTT。
作为一种优选地可选择的实施方式，
通过注射的方式向猪子宫注射上述ssc-miR-92b-3p或si-PFKM-141或si-PFKM-879或si-PFKM-1586抑制猪PFKM基因表达，注射剂量根据实际生产情况进行常规调整即可。
本发明还提供了一种促进猪胚胎附植的方法，促进猪ssc-miR-92b-3p的表达。
优选地，通过ssc-miR-92b-3p mimics促进猪ssc-miR-92b-3p的表达。
作为一种优选地可选择的实施方式，
通过注射的方式向猪子宫注射上述ssc-miR-92b-3p mimics促进猪ssc-miR-92b-3p的表达，注射剂量根据实际生产情况进行常规调整即可。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎附植中的新应用，研究得出ssc-miR-92b-3p对胚胎附植的促进作用以及ssc-miR-92b-3p对PFKM表达的抑制作用；此外本发明还研究得出抑制PFKM表达可以促进胚胎附植，通过ssc-miR-92b-3p抑制PFKM的表达，促进pTr2细胞的增殖、迁移，进而促进猪胚胎附植，降低猪自发性胎儿丢失的概率。本发明能够解决养猪业自发性胎儿丢失的问题，对于养猪业具有重要的价值和意义。
附图说明
图1为miR-93b-3p在子宫内膜组织和胚胎中的表达情况；其中，图1A为实时荧光定量PCR检测ssc-miR-92b-3p在猪的不同组织中的表达情况；图1B为实时荧光定量PCR检测在假受精第9天(C9)、妊娠第9、12、15天(P9、P12、P15)时，子宫内膜组织和胚胎组织中ssc-miR-92b-3p的表达情况；图1C为荧光原位杂交检测在假受精第9天(C9)、妊娠第9、12、15天(P9、P12、P15)时，子宫内膜组织和胚胎组织中ssc-miR-92b-3p的定位和表达情况，图中GE为腺上皮组织、LE为管腔上皮组织、Tr为胚胎组织，比例尺100μm。
图2为ssc-miR-92b-3p对pTr2细胞增殖能力的影响；其中，图2A为实施例2将ssc-miR-92b-3p的模拟物和抑制剂转染至pTr2细胞中RT-qPCR检测ssc-miR-92b-3p的表达情况；图2B为实施例2CCk8实验检测转染ssc-miR-92b-3pmimics/antagaomir后的细胞增殖能力；图2C、2D为实施例2Edu实验检测转染ssc-miR-92b-3p mimics/antagaomir后的细胞增殖能力；图2E、2F为实施例2划痕实验检测转染ssc-miR-92b-3p mimics/antagaomir后的细胞迁移能力。
图3为实施例3ssc-miR-92b-3p靶向调节pTr2细胞中的PFKM基因的验证实验结果；其中，图3A为通过PITA、miRanda和RNAhybrid分析预测ssc-miR-92b-3p靶基因的结果；图3B为预测ssc-miR-92b-3p与猪PFKM基因3‘UTR的结合位点和突变位点；图3C为共转染野生型(WT)PFKM 3’UTR和ssc-miR-92b-3p模拟物(ssc-miR-92b-3pmimics)、共转突变型(MUT)PFKM 3’UTR和ssc-miR-92b-3p模拟物后，双荧光素酶报告基因测定结果；图3D为RT-qPCR分析向pTr2细胞中转染ssc-miR-92b-3p模拟物后，PFKM基因的mRNA表达水平的结果；图3E为转染ssc-miR-92b-3p模拟物后蛋白印迹分析PFKM基因的蛋白表达水平结果；图3F为转染ssc-miR-92b-3p抑制剂(ssc-miR-92b-3pantagaomir)后蛋白印迹分析PFKM基因的蛋白表达水平结果。
图4为实施例4干扰PFKM基因的表达对pTr2细胞的功能影响的实验结果；其中，图4A为si-PFKM-141、si-PFKM-879、si-PFKM-1586对PFKM基因表达的干扰效果；图4B为蛋白印迹分析si-PFKM-1586对PFKM基因的蛋白表达水平的影响；图4C为CCk8实验的实验结果；图4D为Edu实验的染色结果；图4E为Edu实验的统计结果；图4F为干扰PFKM基因的表达对pTr2细胞迁移的影响。
图5为实施例5验证ssc-miR-92b-3p在小鼠胚胎附植过程中的作用实验结果；其中图5A为在小鼠子宫角注射antago-miR-92b-3p(左侧)和注射DEPC水(右侧)对小鼠胚胎附植的影响；图5B为小鼠子宫角注射antago-miR-92b-3p(左侧)和DEPC水注射子宫角(右侧)小鼠胚胎植入位点数量的比较。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例中所用试剂若非特别说明，均为本领域现有常规试剂，均可通过商业渠道购买获得。实施例中未特别说明的实验操作，均为本领域常规操作或是本领域技术人员根据其掌握的现有技术或公知常识所能理解或知晓的。
以下为本发明使用的部分材料与试剂：
猪滋养层细胞系(porcine trophoblast PTr2)。
胎牛血清，DMEM/F12培养基，胰蛋白酶(美国，Gibco)；
Lipofectamine 3000Transfection Reagent，PowerUP SYBR Green Master Mix(美国，Thermo Fisher)；
TRIzol，BCA蛋白定量试剂盒(美国，Invitrogen)；
重组人胰岛素(Insulin human recombinant)，Cell Counting Kit(CCK-8)(中国，翊圣)；
BeyoClick EdU-555细胞增殖检测试剂盒(中国，碧云天)；
PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser(Perfect Real Time)(日本，TaKaRa)；
PVDF膜(美国，Millipore)；
Tubulin抗体(中国，赛维尔)，PFKM抗体(英国，Abcam)；
ssc-miR-92b-3p antagomir/mimics及PFKM小干扰(si-PFKM)及对照(中国，吉玛)。
本发明在实验过程中RT-qPCR、WB等数据结果来自至少三个独立实验的平均值±标志差，使用GraphPad Prism8.0软件分析数据并作图，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05表示差异显著，图中用*表示，P＜0.01表示差异极显著，图中用**或****表示。
实施例1母猪妊娠早期ssc-miR-92b-3p在子宫内膜和胚胎组织中表达上升
1、组织样本采集
本实施例挑选了年龄和遗传背景相似的健康大白猪，对其进行同期发情处理，观察到发情后对其进行人工授精处理(记录为第0天)，一组(8头)进行假输精(非妊娠组)，另一组(8头)进行冷冻新鲜精液输精(人工受精)，人工受精完成后，即认为母猪进入妊娠状态。
其中，同期发情的处理方法如下：
在发情周期的14-18天，每头每天饲喂20毫克孕酮，母猪在停止饲喂后的4-8天内同期出现发情。
(1)子宫内膜组织
分别取假受精第9天和妊娠第9天、12天、15天母猪的子宫，在子宫内侧纵向打开并收集子宫内膜组织，立即放入液氮中速冻并转移至-80℃冰箱保存备用。
(2)胚胎组织
分别在假受精第9天和妊娠第9天、12天、15天，将母猪解剖，拿出猪的子宫，用DPBS从子宫一侧将胚胎从子宫中冲洗出来。立即放入液氮中速冻并转移至-80℃冰箱保存备用。
(3)猪各组织采样
母猪屠宰后，将猪的各个组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、卵巢、输卵管)拿出来，用DPBS清洗干净，每种组织取一小块放入冻存管中立即放到液氮中后转移到-80℃冰箱保存。
2、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)
通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ssc-miR-92b-3p在猪的各种组织中的表达水平；为了确定ssc-miR-92b-3p是否与胚胎附植相关，通过RT-qPCR检测了ssc-miR-92b-3p在空怀母猪和妊娠早期猪子宫内膜和胚胎组织中的表达水平。
(1)实验方法
利用TRIzol从胚胎滋养层细胞、子宫内膜、猪组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、卵巢、输卵管)中提取RNA，并使用分光光度计测定RNA浓度，使用反转录试剂盒(TaKaRa)逆转录成cDNA，再配制qPCR反应体系(如表1所示)，使用荧光定量PCR仪测定基因的相对表达水平，荧光定量PCR程序如表2所示，ssc-miR-92b-3p和基因的表达水平用U6和β-actin作为内参，按照2-ΔΔCt公式计算。
逆转录生成cDNA时使用的引物序列为：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGGCCG-3’
RT-qPCR使用的引物序列为：
Ssc-miR-92b-3p-F-q：CTGGTAGGTATTGCACTCGTCCCG
Ssc-miR-92b-3p-R-q：CTCAACTGGTGTCGTGGA
表1 Realtime PCR体系
表2 qPCR程序(两步法)：
(2)实验结果
RT-qPCR实验结果如图1A和图1B所示，结果显示，ssc-miR-92b-3p在猪的一系列组织中广泛表达(图1A)。假受精第9天(C9)、妊娠第9、12、15天(P9、12、15)，ssc-miR-92b-3p在子宫内膜组织和胚胎组织中的表达逐渐增加。
3、荧光原位杂交(FISH)
使用FISH法检测ssc-miR-92b-3p在子宫内膜组织和胚胎组织中的定位和相对定量，ssc-miR-92b-3p的探针序列为5’-UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC-3’Cy3红色标记。荧光原位杂交由武汉赛维尔生物科技有限公司完成。
(1)基本的操作流程如下：
将子宫内膜组织(子宫内膜组织中带有胚胎组织)洗净后立即放入4％多聚甲醛中固定12h以上，固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡进行包埋，切片后放至62℃烤箱中烤片2h，依次将切片进行脱蜡和脱水。自然晾干后，将切片放在修复液中煮沸10-15min，自然冷却，滴加蛋白酶K(20μg/mL)37℃消化，纯水冲洗后PBS洗3次，每次5min。向切片上滴加预杂交液，37℃条件下孵育1h，去除预杂交液，滴加含有探针的杂交液在37℃恒温箱中杂交过夜。孵育完成后洗去杂交液，用2xSSC，37℃洗10min，1xSSC，37℃洗2x5min，0.5xSSC室温洗10min。在避光环境下滴加DAPI染液孵育8min，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。将切片置于荧光显微镜下观察并采集图像。
(2)实验结果
荧光原位杂交结果如图1C所示。结果显示P9、P12、P15子宫内膜组织中的ssc-miR-92b-3p的表达水平逐渐升高，胚胎组织中的ssc-miR-92b-3p表达水平在这三个时期也是逐渐升高的。
综合上述实验结果，表明miR-92b-3p在胚胎附植阶段，在子宫内膜和胚胎组织中均呈升高的趋势，可能对胚胎附植发挥着重要作用。
实施例2 ssc-miR-92b-3p对胚胎滋养层细胞(pTr2)的功能影响
为了探究ssc-miR-92b-3p在胚胎滋养层细胞(pTr2)中的作用，将ssc-miR-92b-3pmimics/antagaomir(ssc-miR-92b-3p模拟物/抑制剂)转染到胚胎滋养层细胞(pTr2)中，并以转染了ssc-miR-92b-3p Inhibitor NC/mimics NC的pTr2细胞作为对照，使用RT-qPCR检测ssc-miR-92b-3p的表达水平、CCK-8实验和Edu实验检测pTr2的增殖情况、划痕实验检测pTr2的迁移情况。
一、胚胎滋养层细胞(pTr2)的培养
在添加有1％双抗(Gibco)，0.5％胰岛素(翊圣)和10％胎牛血清(Gibco)的DMEM/F12基础培养基于10cm板培养pTr2，并置于5％CO2、37℃的恒温细胞培养箱中培养，当细胞密度达到80％时，用0.25％胰蛋白酶消化，铺板，进行后续实验。
二、细胞转染
将处于对数生长期的pTr2细胞接种于6孔板中，过夜培养至细胞密度达到50％～70％时，用Lipofectamine 3000Transfection Reagent转染ssc-miR-92b-3pmimics/antagomir/mimics NC/inhibitor NC，转染后放入细胞培养箱中继续培养，8小时后换液，进行后续实验。
ssc-miR-92b-3p mimics的序列为：S:UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC
AS:AGGCCGGGACGAGUGCAAUAUU
ssc-miR-92b-3p antagomir的序列为：GGAGGCCGGGACGAGUGCAAUA
ssc-miR-92b-3p mimicsNC的序列为：S:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
AS:ACGUGACACGUUCGGAGAATT
ssc-miR-92b-3p inhibitor NC的序列为：CAGUACUUUUGUGUAGUACAA
三、RT-qPCR实验
(1)实验方法
对转染了ssc-miR-92b-3p mimics/antagomir/mimics NC/inhibitor NC的pTr2细胞进行RT-qPCR实验检测ssc-miR-92b-3p的表达情况，具体实验过程同实施例1。
(2)实验结果
RT-qPCR结果显示转染ssc-miR-92b-3p mimics后ssc-miR-92b-3p的表达水平显著升高；转染ssc-miR-92b-3pantagaomir后ssc-miR-92b-3p的表达水平显著降低(图2A)。
四、Cell-Counting Kit-8(CCK-8)实验
(1)实验方法
采用CCK-8试剂盒(CCK-8，上海翊圣生物科技有限公司)检测转染ssc-miR-92b-3pmimics/antagomir/mimics NC/inhibitor NC后12h、24h、48h、72h的细胞增殖活性。
取生长状态良好，生长密度达到90％的10cm板中的pTr2细胞，用0.25％的胰酶将细胞从细胞培养板上消化下来，离心去上清，加入30mL的含10％FBS的DMEM/F12培养基，混匀得细胞悬液，铺在4个96孔板中，每个96孔板每个孔加入100μL的细胞悬液，待细胞密度达到40％左右，向细胞中转染ssc-miR-92b-3p mimics/antagomir/mimics NC/inhibitorNC，分别在12h、24h、48h、72h时向每孔细胞中加入10μL CCK8溶液，加入后放置于37℃细胞培养箱中培养2h，然后使用多功能酶标仪测定每个孔板在450nm处的光密度(OD)。
(2)实验结果
Cell-Counting Kit-8(CCK-8)结果显示，ssc-miR-92b-3p的升高显著促进了pTr2的增殖，ssc-miR-92b-3p的降低显著抑制了pTr2的增殖(图2B)。
五、Edu实验
(1)实验方法
采用BeyoClickTMEdu-555细胞增殖检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测转染ssc-miR-92b-3p mimics/antagomir/mimics NC/inhibitor NC后48h的细胞增殖状况。
取生长状态良好，生长密度达到90％的10cm板中的pTr2细胞，将细胞转移至96孔板中(铺板过程同CCK-8实验)，待细胞密度达到40％左右，向细胞中转染ssc-miR-92b-3pmimics/antagomir/mimics NC/inhibitor NC，转染后48h向96孔板中加入配制好的2X的Edu工作液，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养2h完成Edu标记；Edu标记完成后，去除培养液，用DPBS清洗两次，每次3min，用4％多聚甲醛室温固定15min，用DPBS清洗两次，用细胞通透液(上海碧云天生物技术有限公司)通透10min，然后用DPBS清洗两次，每孔(96孔板)加入70μL配制好的Click反应液(根据试剂盒说明书配制)，室温避光孵育30min，吸弃Click反应液，用DPBS清洗两次，最后加入DAPI室温孵育8min染细胞核，吸弃DAPI溶液，用DPBS洗涤2次，随后即可进行荧光检测，具体过程为使用尼康的荧光倒置显微镜拍照，结果中红色的细胞是新增殖的细胞，人工数细胞数量。
(2)实验结果
Edu实验结果表明ssc-miR-92b-3p的升高显著促进了pTr2的增殖；ssc-miR-92b-3p的降低显著抑制了pTr2的增殖(图2C、图2D)。
六、划痕实验
(1)实验方法
在细胞转染ssc-miR-92b-3p mimics/antagomir/mimics NC/inhibitor NC 48h后，用大枪头在6孔板上垂直划出线状划痕，并将细胞培养基换成无血清培养基。在0、12h观察细胞迁移和划痕愈合的情况并拍摄照片。随机选取3个视野利用ImageJ软件计算愈合的面积获得细胞迁移率。
(2)实验结果
划痕实验结果表明ssc-miR-92b-3p的升高显著促进了pTr2的迁移；ssc-miR-92b-3p的降低显著抑制了pTr2的迁移(图2E、图2F)。
图2中miRNAmimicsNC表示ssc-miR-92b-3p mimicsNC；miR-92b-3p mimics表示ssc-miR-92b-3p mimics；miRNAinhibitor NC表示ssc-miR-92b-3p inhibitor NC；miR-92b-3p antagomir表示ssc-miR-92b-3p antagomir。
综合上述实验结果，ssc-miR-92b-3p的升高显著促进了pTr2的增殖、迁移；ssc-miR-92b-3p的降低显著抑制了pTr2的增殖、迁移。
实施例3 ssc-miR-92b-3p靶向调控pTr2细胞中的PFKM基因
使用PITA、miRanda和RNAhybrid分析预测到PFKM为ssc-miR-92b-3p的靶标(图3A)。接着构建了携带有PFKM 3＇-UTR的野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告质粒(PGLO-PFKM-WT和PGLO-PFKM-MUT)，通过双荧光素酶报告基因测定实验进一步验证了两者的靶向关系。
一、质粒构建和双荧光素酶报告基因测定
(1)质粒构建
将与ssc-miR-92b-3p结合的猪的PFKM基因的3＇-UTR结合位点克隆到PGLO载体中构建野生型(WT)双荧光素酶报告质粒，并通过定点诱变构建突变型(MUT)荧光素酶报告质粒(图3B)。
(2)双荧光素酶报告基因测定
PK-15细胞(猪肾细胞)用添加有1％双抗(Gibco)，5％胎牛血清的DMEM基础培养基并置于5％CO2、37℃的恒温细胞培养箱中培养。进行实验时，将PK-15细胞以1x104个/孔接种至细胞培养板中，当细胞密度达到60％-80％时，使用Lipofectamine 3000转染试剂将ssc-miR-92b-3p mimics和双荧光素酶报告质粒(PGLO-PFKM-WT或PGLO-PFKM-MUT)转染至PK-15细胞，转染6小时后换液。转染24小时后收集细胞，并使用双荧光素酶检测试剂盒(翊圣)检测荧光素酶活性。
(3)实验结果
实验结果如图3C所示，结果显示，当ssc-miR-92b-3p mimics与野生型荧光素酶报告质粒(PGLO-PFKM-WT)共转染时，荧光素酶活性显著降低；而当ssc-miR-92b-3p mimics与突变型荧光素酶报告质粒(PGLO-PFKM-MUT)共转染时，荧光素酶活性没有明显变化(图3C)。结果表明了ssc-miR-92b-3p直接靶向PFKM基因。
使用实时荧光定量(qPCR)实验和蛋白免疫印迹分析(WB)验证miR-92b-3p与PFKM基因的靶向关系。
二、实时荧光定量PCR(qPCR)
(1)实验方法
向pTr2细胞转染ssc-miR-92b-3p mimics，以转染ssc-miR-92b-3p mimicsNC的pTr2细胞作为对照；转染后48h提取细胞RNA，使用实时荧光定量PCR检测PFKM基因的RNA表达水平，具体过程同实施例1。
(2)实验结果
实时荧光定量PCR的结果如图3D所示，结果显示，向pTr2细胞转染ssc-miR-92b-3pmimics后PFKM基因的RNA表达水平下降。
三、蛋白免疫印迹分析(WB)
(1)实验方法
向pTr2细胞转染ssc-miR-92b-3p mimics、ssc-miR-92b-3p antagomir培养48h后提取细胞蛋白，以转染ssc-miR-92b-3p mimicsNC/inhibitor NC的pTr2细胞为对照，使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解转染后的细胞提取蛋白质。样品通过加热变性，通过SDS-PAGE电泳仪电泳分离蛋白并转移到PVDF膜上，用5％脱脂牛奶常温摇床封闭2.5小时，使用TBST清洗后加入PFKM抗体(Abcam，1:1000)和tubulin抗体4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次后，加入山羊抗兔IgG或抗鼠IgG二抗(1:2000)在37℃下孵育1小时，利用化学发光液对目的蛋白条带进行显色，使用Image J软件对相对蛋白质水平进行量化。
(2)实验结果
蛋白免疫印迹分析实验结果显示，向pTr2细胞转染ssc-miR-92b-3p mimics后，PFKM基因的蛋白水平表达下降(图3E)；转染ssc-miR-92b-3p antagomir后，蛋白水平表达显著升高(图3F)。
上述结果表明，PFKM基因是ssc-miR-92b-3p的靶基因。
磷酸果糖激酶(PFKM)是一种将6-磷酸果糖催化为1,6-二磷酸果糖的酶，它是糖酵解过程中关键的限速酶。在胚胎附植期猪子宫腔内的葡萄糖和果糖丰度增加，用作胎儿生长和发育的主要能量底物。哺乳动物体内过多的糖酵解会引起NADPH的大量产生，并通过在生物质膜和内质网上表达的NOX(NADPH oxidase，NADPH氧化酶)将NADPH中的电子转移到氧上，将会产生大量的ROS。
实施例4 PFKM基因在pTr2细胞中的作用
为了探究PFKM对pTr2细胞的功能影响，针对PFKM基因设计了3条不同位置的干扰片段(si-PFKM-141、si-PFKM-879、si-PFKM-1586)，将这3条si-PFKM分别转染到pTr2细胞中(转染方法同实施例2)，使用实时荧光定量PCR(方法同实施例1)、蛋白免疫印迹分析(方法同实施例3)检测转染si-PFKM后PFKM基因的RNA和蛋白质表达水平。
其中，上述3个干扰片段的序列如下所示：
si-PFKM-141的序列：S:GGUUCGAGUUGGCAUCUAUTT
AS:AUAGAUGCCAACUCGAACCTT
si-PFKM-879的序列：S:GGUAAAGCGUCUGGGAUAUTT
AS:AUAUCCCAGACGCUUUACCTT
si-PFKM-1586的序列：S:GCAUCCCGUUUGUGGUCAUTT
AS:AUGACCACAAACGGGAUGCTT
实时荧光定量PCR结果显示，si-PFKM-141、si-PFKM-879、si-PFKM-1586这3条干扰片段均能使PFKM基因的表达水平降低，但si-PFKM-1586这条小干扰片段干扰PFKM基因表达的效果最显著，最能抑制PFKM基因表达(图4A)，蛋白免疫印迹分析结果显示si-PFKM-1586能显著干扰PFKM基因蛋白表达水平(图4B)。
因此选取si-PFKM-1586做后续功能验证。
继续对转染si-PFKM-1586的pTr2细胞进行CCK-8实验(具体实验过程同实施例2)、Edu实验(具体实验过程同实施例2)和划痕实验(具体实验过程同实施例2)，检测si-PFKM-1586对pTr2细胞增殖和迁移的影响。
CCK-8(图4C)和Edu(图4D、图4E)实验结果表明si-PFKM-1586显著促进了pTr2细胞的增殖，也即干扰PFKM的表达可显著促进pTr2细胞的增殖；划痕实验显示干扰PFKM的表达可以显著促进pTr2细胞的迁移(图4F)。
实施例5在小鼠模型中抑制ssc-miR-92b-3p的表达阻碍小鼠胚胎的着床
我们通过体内小鼠模型进一步验证了ssc-miR-92b-3p在胚胎附植中的作用。在小鼠妊娠的第3天，将ssc-miR-92b-3p antagomir注射到小鼠子宫的一侧子宫角中，另一侧子宫角注射DEPC水作为对照，具体过程为在小鼠妊娠第3天时，将孕鼠麻醉后，分别将20μMssc-miR-92b-3p antagomir的10μL溶液或10μL DEPC水注射至两侧子宫角，缝合伤口，放在37度环境下苏醒。在妊娠第7天解剖小鼠并观察胚胎附植的情况，统计胚胎附植数。
实验结果如图5所示，结果显示注射ssc-miR-92b-3p antagomir一侧的子宫中胚胎附植数目显著小于另一侧的对照组(图5A、图5B)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植的产品中的应用；其中ssc-miR-92b-3p的序列为UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC。
2.促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植的产品中的应用。
3.ssc-miR-92b-3p在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移的产品中的应用。
4.促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂或ssc-miR-92b-3p类似物在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移的产品中的应用。
5.抑制PFKM基因表达的试剂在促进猪胚胎附植中的应用，或在制备促进猪胚胎附植的产品中的应用。
6.抑制PFKM基因表达的试剂在促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移中的应用，或在制备促进猪胚胎滋养层细胞增殖/迁移的产品中的应用。
7.ssc-miR-92b-3p在抑制PFKM表达中的应用，或在制备抑制PFKM表达的产品中的应用。
8.促进ssc-miR-92b-3p表达的试剂在抑制PFKM表达中的应用，或在制备抑制PFKM表达的产品中的应用。
9.一种促进猪胚胎附植的方法，其特征在于，抑制猪PFKM基因表达。
10.一种促进猪胚胎附植的方法，其特征在于，促进猪ssc-miR-92b-3p的表达。
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Citations (2)
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| US20170016067A1 (en) * | 2014-02-27 | 2017-01-19 | Queen Mary University Of London | Biomarkers For Endometriosis |
| CN110804659A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-02-18 | 华南农业大学 | 一种血清外泌体ssc-miR-92b-3p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用 |
-
2022
- 2022-11-09 CN CN202211400260.9A patent/CN115725494A/zh active Pending
Patent Citations (2)
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| CN110804659A (zh) * | 2019-10-23 | 2020-02-18 | 华南农业大学 | 一种血清外泌体ssc-miR-92b-3p作为母猪早期妊娠诊断分子标志物的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RENWU HUA: "Extracellular vesicles derived from endometrial epithelial cells deliver exogenous miR-92b-3p to affect the function of embryonic trophoblast cells via targeting TSC1 and DKK3", REPRODUCTIVE BIOLOGY AND ENDOCRINOLOGY, vol. 20, no. 1, 25 October 2022 (2022-10-25), pages 1 - 14 * |
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