CN115725435A - 一种具有自絮凝活性的胶状红长命菌jd21及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有自絮凝活性的胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21及其应用。该菌株分离于山东省东营市黄河三角洲湿地的底泥沉积物，2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC M 2022889。本发明提供的JD21菌株具有较强的自絮凝活性，能够产生高活性的微生物絮凝物质，可以有效沉淀降解水产和畜禽养殖废水中的固体颗粒和有害物质，并可实现对染料废水的有效脱色。而且该菌株生长迅速、具有良好的耐盐和耐热性能，能够净化养殖场舍的臭气，在生态养殖及废(污)水生物净化等方面具有良好的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。涉及一种具有自絮凝活性的胶状红长命菌JD21及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)是进行不放氧光合作用的一大类细菌的总称，广泛存在于海洋、湖泊和土壤等环境中。胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)是目前发现的光合细菌中唯一能够分泌蛋白酶的菌株。
以光合细菌代替活性污泥进行污(废)水处理,可以有效避免剩余污泥造成的二次污染，具有达到出水排放标准限值的同时回收营养及能源的特点，广泛应用于工业废水、养殖废水以及生活污水处理中。但光合细菌体积小、沉降性能差，应用过程中菌体流失严重，需要不断补充新鲜菌体以维持优势性，既影响处理效率，又增加处理能耗和费用。一些学者通过人为添加交联剂使光合细菌细胞相互粘结形成稳固结构的絮凝颗粒，提高菌体沉降性能，可以有效减少光合细菌流失量、提高质量传递效率,并稳定发挥其降解效能。但是如果能够通过环境筛选、诱变育种或者基因编辑的方法获得具有良好絮凝性能的菌株，对推动光合细菌在污(废)水处理中广泛应用，具有重要的生态和经济效益。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种具有自絮凝活性的胶状红长命菌JD21及其应用。该菌株分离于山东省东营市黄河三角洲湿地底泥沉积物，分类鉴定为胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)，命名为JD21。该菌株具有较强的自絮凝活性，能够产生高活性絮凝物质，可通过有效的絮凝沉淀作用，清除水产和畜禽养殖废水中的固体颗粒和有害物质，还可将染料废水快速脱色。而且该菌株生长迅速、具有良好的耐盐和耐热性能，能够净化养殖场舍的臭气，在生态养殖以及废(污)水生物净化等方面具有良好的应用潜力。
本发明可通过以下技术方案实现：
本发明的第一方面，提供一种胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21，从黄河三角洲区域的湿地底泥沉积物中分离，于2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC M 2022889。
本发明的第二方面，提供一种上述胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21分离方法，步骤如下：
(1)取20mL沉积淤泥，加入60mL MPYE培养基，加入液体石蜡以隔绝空气，置于光照恒温培养箱中静置厌氧培养得到红色富集培养液；取10mL红色富集培养液加到含新灭菌的90mL培养基中，再加入液体石蜡静置厌氧培养至培养液变红，以上步骤重复；直到镜检发现大量的优势菌种呈杆形、球形或椭圆形细菌为止；
(2)取富集培养液1mL，用0.9％的生理盐水进行10倍稀释，用双层培养基平板法分离单菌落，用接种环蘸取稀释后的富集培养菌液在固体培养基上划线接种，然后再倒一层已灭菌的2％琼脂的MPYE培养基，冷却凝固后在30℃和光照3 000lx条件下倒置培养7d；待红色菌落长出后，挑单菌落于相同固体培养基平板上划线接种再分离纯化培养7d，获得单一菌种的JD21单菌落，并在MPYE液体培养基中于30℃和光照3 000lx条件下进行扩大培养，得到JD21菌液。
进一步的，静置厌氧培养的培养基配方为：蛋白胨3g/L、酵母膏3g/L、1M MgCl21.6mL/L、1M CaCl2 1.6mL/L。
进一步的，静置厌氧培养中培养条件：光源为日光灯，光照强度2 000～5 000lx，温度30℃。富集静置培养10-15d，直至培养液呈红色。
进一步的，所述双层培养基均为含2％琼脂的MPYE固体培养基。
利用三代测序方法对JD21全基因组序列进行了鉴定，分类学命名为胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)，全基因组序列包含一条环状染色体(大小为4194895bp，GC含量71.52％)和一条环状质粒(大小为17025bp，GC含量62.77％)，编码功能基因3833个。
经培养条件优化，该菌株在人工光源照射(590nm、3000lx时)下，培养液pH值7～8时，最易于在MPYE培养液中形成优势生长。最适生长温度为30℃，最佳接种量为20％～30％。
胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21具有较强的耐盐和耐热性，3％NaCl处理下能够保持正常生长，而在40℃下也能够正常生长。
胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21具有良好自絮凝性，在MPYE培养液中可自然形成絮体，因此，JD21可作为絮凝剂生产菌制备微生物絮凝剂。
本发明的第三方面，提供一种微生物絮凝剂的制备方法，包括如下步骤：
通过平板划线将JD21接种于MPYE平板活化，挑取单菌落于MPYE液体培养基中，在30℃和光照3 000lx条件下进行厌氧静置培养，收集为种子液，将种子液按照10％的接种比例进行扩大培养，30℃和光照3 000lx条件下扩大培养7d；收集发酵液低温离心，收集菌体于无菌试管中；加入等体积的4℃预冷的生理盐水重悬菌体，混匀后于低温离心；然后加入3倍体积的4℃预冷无水乙醇，低温离心，收集絮凝沉淀物，随后低温真空干燥收集絮凝剂粗品；
按絮凝剂粗品、无菌水1比100的体积比将絮凝剂粗品溶解，加入3倍体积的4℃预冷无水乙醇，4℃静置12h后，低温离心，取沉淀物溶于4℃预冷的生理盐水，低温离心，最后低温真空干燥得到絮凝剂纯品。
进一步的，所述低温离心的条件均为4℃和5000r/min条件下离心10min。
进一步的，所述低温真空干燥均为4℃条件下真空干燥10h。
本发明的第四方面，提供上述制备方法制备得到的微生物絮凝剂。
本发明的第五方面，提供上述胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21或所述微生物絮凝剂在处理废水、染料脱色、去除异味中的应用。优选的，所述废水包括养殖污水；所述染料废水包括孔雀石绿、结晶紫、偶氮红、活性黑、溴酚蓝、刚果红；所述异味包括畜禽养殖产生的异味。
胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21菌株及其生产的微生物絮凝剂能够有效絮凝沉淀养殖污水中的固体颗粒和有害物质，保持养殖水质的健康稳定。
胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21菌株及其生产的微生物絮凝剂，通过拌料或者泼洒到水中，能够可以清除养殖污水中的氨态氮和亚硝态氮，净化水质。
胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21菌株及其生产的微生物絮凝剂，可以对染料废水进行有效脱色，所用染料废水包括孔雀石绿、结晶紫、偶氮红、活性黑、溴酚蓝、刚果红。
胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21菌株在畜禽养殖舍中喷洒，可以利用粪尿中的氨态氮，抑制产臭气微生物的繁殖，饲喂和喷洒的结合可大大减少畜禽养殖舍中的臭味，为畜禽提供良好的生长环境。
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)保藏编号为CCTCC M 2022889的胶状红长命菌JD21菌株，具有很强的自絮凝活性，能够产生高活性的微生物絮凝物质，可作为絮凝剂生产菌制备微生物絮凝剂。
(2)胶状红长命菌JD21菌株及其生产的微生物絮凝剂可以有效絮凝沉淀水产和畜禽养殖废水中的固体颗粒和有害物质。
(3)胶状红长命菌JD21菌株及其生产的微生物絮凝剂可以对染料废水进行有效脱色。
(4)胶状红长命菌JD21菌株生长速度快、对盐碱和高温环境适应性较强，能够净化养殖场舍的臭气，在废(污)水生物净化以及生态养殖等方面具有良好的应用潜力。
生物材料保藏信息
胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为，中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2022年6月15日，编号为CCTCC M2022889。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21的全基因组测序结果示意图；
图2胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21形态和絮凝性观察；
图3胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21及絮凝剂对染料的脱色效果；
图4胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21的耐盐和耐热性鉴定。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1胶状红长命菌JD21的分离及鉴定
从黄河三角洲区域湿地，采集底泥沉积物。取20mL沉积淤泥于100mL锥形瓶中，加入60mL MPYE培养基，并用液体石蜡隔绝空气，置于光照恒温培养箱中静置厌氧培养。培养基配方为：蛋白胨3g/L、酵母膏3g/L、1M MgCl21.6mL/L、1M CaCl2 1.6mL/L。培养条件：光源为日光灯，光照强度2 000～5 000lx，温度30℃。富集静置培养10-15d，直至培养液呈红色。取10mL富集液加入到含90mL培养基的灭菌锥形瓶中，液体石蜡封闭后在30℃和光照3000lx条件下静置培养至变红，直到镜检发现大量的优势菌种呈杆形、球形或椭圆形细菌。
取富集培养液1mL，用0.9％的生理盐水进行10倍稀释，MPYE固体培平板分离单菌落，在30℃和光照3 000lx条件下倒置培养7d。待红色菌落长出后，挑单菌落于相同固体培养基平板上划线接种再分离纯化培养7d，获得单一菌种的JD21单菌落，并扩大培养，得到JD21菌液。经培养条件优化，该菌株在人工光源照射(590nm、3000lx时)下，培养液pH值7～8时，最易于在MPYE培养液中形成优势生长。最适生长温度为30℃，最佳接种量为20％～30％。
利用三代测序方法对JD21全基因组序列进行了鉴定，分类学命名为胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)，全基因组序列包含一条环状染色体(大小为4194895bp，GC含量71.52％)和一条环状质粒(大小为17025bp，GC含量62.77％)，编码功能基因3833个(图1)。
实施例2胶状红长命菌JD21自絮凝性的粉剂及微生物絮凝剂的制备
胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21具有良好自絮凝性，在MPYE培养液中可自然形成絮体(图2)。
利用JD21菌株作为絮凝剂生产菌制备微生物絮凝剂。通过平板划线将JD21接种于MPYE平板活化，挑取单菌落于MPYE液体培养基中，在30℃和光照3 000lx条件下进行厌氧静置培养，收集为种子液，将种子液按照10％的接种比例进行扩大培养，30℃和光照3 000lx条件下扩大培养7d。收集发酵液于高速冷冻离心机4℃和5000r/min条件下离心10min，收集菌体于无菌试管中。加入等体积的4℃预冷的生理盐水重悬菌体，混匀后于4℃和5000r/min条件下离心10min。然后加入3倍体积的4℃预冷无水乙醇，4℃和5000r/min条件下离心10min，收集絮凝沉淀物，随后4℃条件下真空干燥6h收集絮凝剂粗品。
随后按菌体：无菌水1：:100的体积比将粗品溶解，加入3倍体积的4℃预冷无水乙醇，4℃静置12h后，4℃和5000r/min条件下离心10min，取沉淀物溶于4℃预冷的生理盐水，4℃和5000r/min条件下离心10min，最后4℃条件下真空干燥10h得到絮凝剂纯品。
实施例3胶状红长命菌JD21菌株及其生产的微生物絮凝剂对养殖污水净化
养殖污水样品采自济南市长清区青鱼养殖池，水体呈黄绿色且透明度较低，带有臭味，使用前测量污水样品中的污染指标。取大小形状相同，容积约为5L的塑料箱，分别加入3L污水样品，在试验组中分别投入JD21菌株和其生产的微生物絮凝剂，空白对照组中不加菌株及絮凝剂。将样品置于室温下，自然光照射，5d后测定水样中的硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮含量和CODMn，记录各个指标的变化情况。
表1胶状红长命菌JD21及其絮凝剂处理水产养殖废水的效果
结果显示：投入JD21菌株和其生产的微生物絮凝剂处理5d后，养殖污水样品中的硝酸盐氮含量、亚硝酸盐氮含量、氨氮含量和CODMn含量均显著下降(表1)。
实施例4胶状红长命菌JD21菌株及其生产的微生物絮凝剂对染料废水的脱色
实验采用常见染料配制实验样品，分别配制了孔雀石绿、结晶紫、偶氮红、活性黑、溴酚蓝、刚果红染料。设置3个试验组：1为对照组，2为加入JD21菌株，3为加入微生物絮凝剂，7d后观察脱色效果。
结果显示：投入7d后，JD21菌株和我微生物絮凝剂对所示的几种染料均有一定的脱色效果，其中对孔雀石绿、偶氮红、活性黑、刚果红染料的脱色效果比较明显(图3)。.
实施例5胶状红长命菌JD21菌株对养殖粪污的除臭效果
选择济南市历城区一养猪场的两块粪污池进行试验研究。粪污池A中共有20吨粪污，将其中10吨粪污移入另一块清理过的粪污池B中，在粪污转移过程中喷洒JD21菌液。将喷施过菌液的粪污池B作为试验组，粪污池A剩余10吨粪污不喷施菌液作为对照组。24h后各检测一次NH3、H2S浓度，考察除臭效果。
表2胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21消除养殖粪污臭味的效果
结果显示：在经JD21菌株处理24h后，养殖粪污中的NH3、H2S的浓度均显著下降(表2)。
实施例6胶状红长命菌JD21耐盐性和耐热性的鉴定
(1)耐盐实验
在MPYE平板上活化胶状红长命菌JD21，挑取菌落划线于含有不同浓度NaCl的MPYE平板，在30℃条件下静置培养48h，观察菌落生长情况。
结果发现，JD21有较强的耐盐性，在3％NaCl处理下JD21能够保持正常生长，在4％和5％NaCl处理下JD21也能保持一定的生长速率(图4A)。
(2)耐热实验
在MPYE平板上活化胶状红长命菌JD21，挑取菌落划线于MPYE平板。将平板置于不同温度下静置培养48h，观察菌落生长情况。
结果发现：JD21具有较强的耐热性，在40℃下还能够正常生长。在45℃下也能保持一定的生长速率，在50℃下生长收到明显抑制(图4B)。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21，其特征在于，所述胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21从黄河三角洲区域的湿地底泥沉积物中分离，2022年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC M 2022889。
2.一种权利要求1所述的胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21的分离方法，其特征在于，所述分离方法步骤如下：
(1)取20mL沉积淤泥，加入60mL MPYE培养基，加入液体石蜡以隔绝空气，置于光照恒温培养箱中静置厌氧培养得到红色富集培养液；取10mL红色富集培养液加到含新灭菌的90mL培养基中，再加入液体石蜡静置厌氧培养至培养液变红，以上步骤重复；直到镜检发现大量的优势菌种呈杆形、球形或椭圆形细菌为止；
(2)取富集培养液1mL，用0.9％的生理盐水进行10倍稀释，用双层培养基平板法分离单菌落，用接种环蘸取稀释后的富集培养菌液在固体培养基上划线接种，然后再倒一层已灭菌的2％琼脂的MPYE培养基，冷却凝固后在30℃和光照3 000lx条件下倒置培养7d；待红色菌落长出后，挑单菌落于相同固体培养基平板上划线接种再分离纯化培养7d，获得单一菌种的JD21单菌落，并在MPYE液体培养基中于30℃和光照3 000lx条件下进行扩大培养，得到JD21菌液。
3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，静置厌氧培养的培养基配方为：蛋白胨3g/L、酵母膏3g/L、1M MgCl2 1.6mL/L、1M CaCl2 1.6mL/L。
4.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，静置厌氧培养中培养条件：光源为日光灯，光照强度2 000～5 000lx，温度30℃；富集静置培养10-15d，直至培养液呈红色。
5.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述双层培养基均为含2％琼脂的MPYE固体培养基。
6.一种微生物絮凝剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
通过平板划线将JD21接种于MPYE平板活化，挑取单菌落于MPYE液体培养基中，在30℃和光照3 000lx条件下进行厌氧静置培养，收集为种子液，将种子液按照10％的接种比例进行扩大培养，30℃和光照3 000lx条件下扩大培养7d；收集发酵液低温离心，收集菌体于无菌试管中；加入等体积的4℃预冷的生理盐水重悬菌体，混匀后于低温离心；然后加入3倍体积的4℃预冷无水乙醇，低温离心，收集絮凝沉淀物，随后低温真空干燥收集絮凝剂粗品；
按絮凝剂粗品、无菌水1比100的体积比将絮凝剂粗品溶解，加入3倍体积的4℃预冷无水乙醇，4℃静置12h后，低温离心，取沉淀物溶于4℃预冷的生理盐水，低温离心，最后低温真空干燥得到絮凝剂纯品。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述低温离心的条件均为4℃和5000r/min条件下离心10min。
8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述低温真空干燥均为4℃条件下真空干燥10h。
9.一种如权利要求6-8任一项所述制备方法制备得到的微生物絮凝剂。
10.如权利要求1所述胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)JD21或权利要求9所述微生物絮凝剂在处理废水、染料脱色、去除异味中的应用；
优选的，所述废水包括养殖污水；
优选的，所述染料废水包括孔雀石绿、结晶紫、偶氮红、活性黑、溴酚蓝、刚果红；
优选的，所述异味包括畜禽养殖产生的异味。
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2022
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