CN115691671A - 一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法、装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法、装置，其方法包括：获取待测转录组的三代测序数据；基于参考基因组，对所述三代测序数据进行比对分析，得到一条或多条reads；将每条reads中的多个片段，与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配；根据匹配到的多个不同位置的基因片段是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads；根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分。本发明将基因片段和引物序列的位置作为嵌合reads的判据，并结合模糊匹配能更精确地确定嵌合reads，进而实现对转录组的大量嵌合reads的切分。

Description

一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法、装置

技术领域

本发明属于生物信息技术领域，涉及转录组测序领域，尤其涉及一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法、装置。

背景技术

纳米孔测序是Oxford Nanopore公司研发的三代测序技术，其原理为使待测的DNA或者RNA分子通过一张带有很多纳米孔的生物膜，膜的两侧带有电压，在DNA或者RNA分子通过纳米孔的过程中，会导致纳米孔位置的电流发生变化，不同碱基(A、T、C、G)引起的电流变化会有不同，因此可以通过识别电流信号的波动趋势来识别待测分子上的碱基，从而达到对DNA或者RNA分子的序列进行测定的目的。

但是纳米孔测序的数据中，会有一定比例的嵌合体reads，其形成原因有两种：一种为在对DNA分子进行PCR扩增的过程中，由于引物与DNA模版的非特异性结合，会导致错误的将不同的DNA分子连接到一起，成为嵌合体；第二个形成嵌合体的原因是一条DNA分子在通过纳米孔后，有一定的概率其他的DNA分子会立刻通过相同的纳米孔，由于两个DNA分子过孔的间隔太短，使测序仪器将两个不同的DNA分子读取到一条测序reads上，因此形成嵌合体reads。

现有的基因组切分方法是利用duplex－tools对基因组测序中的嵌合体reads进行切分，但是，其无法切分转录组测序中的嵌合体reads，嵌合体reads由于在同一条reads上包含了两个或多个不同的DNA分子，不能直接用于数据分析，必须将其切分成若干条独立的reads，各自来自于唯一的DNA分子，相比于基因组测序，转录组测序由于待测的DNA分子更短，且需要经过PCR扩增的过程，因此转录组测序中的嵌合体reads比例更高，可高达40％，因此，如何有效的对转录组测序的嵌合体reads进行高效且准确的切分，从而提高测序的准确性，是第三代测序中急需解决的技术问题之一。

发明内容

为有效的对转录组测序的嵌合体reads进行高效且准确的切分，在本发明的第一方面提供了一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法，包括：获取待测转录组的三代测序数据；基于参考基因组，对所述三代测序数据进行比对分析，得到一条或多条reads；判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配；根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads；根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分。

在本发明的一些实施例中，所述判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配包括：将每条reads与参考基因组进行比对，判断所述reads是否与参考基因组中位于不同位置的多个基因的片段匹配。

在本发明的一些实施例中，所述根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads包括：基于edlib局部比对算法，将参考引物序列与每条reads做双序列比对：若至少匹配到一条引物序列，则判断所述reads为嵌合reads。

进一步的，所述基于edlib局部比对算法，将参考引物序列与每条reads做双序列比对包括：通过edlib局部比对算法的HW模式在允许错误匹配的情况下，在reads中找到与引物序列最相似的reads片段。

优选的，所述允许错误匹配包括模糊匹配。

在上述的实施例中，所述根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分包括：根据每条嵌合reads匹配到的参考基因组的多个不同位置的基因片段，确定一个或多个所述嵌合reads的引物序列的位置；基于每个所述嵌合reads的引物序列的位置确定嵌合位点，根据所述嵌合位点将待测转录组中的嵌合reads切分为多个非嵌合reads。

本发明的第二方面，提供了一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分装置，包括：获取模块，用于获取待测转录组的三代测序数据；基于参考基因组，对所述三代测序数据进行比对分析，得到一条或多条reads；第一判断模块，用于判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配；第二判断模块，用于根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads；切分模块，用于根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分。

本发明的第三方面，提供了一种电子设备，包括：一个或多个处理器；存储装置，用于存储一个或多个程序，当所述一个或多个程序被所述一个或多个处理器执行，使得所述一个或多个处理器实现本发明在第一方面提供的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法。

本发明的第四方面，提供了一种计算机可读介质，其上存储有计算机程序，其中，所述计算机程序被处理器执行时实现本发明在第一方面提供的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法。

本发明的有益效果是：

本发明通过双序列比对中的局部比对算法在reads序列中搜索引物序列，采用模糊匹配搜索，而不是精确匹配，因此对三代测序的序列适配性更好；由于增加了与参考基因组比对的步骤，通过判断reads不同区段是否比对到参考转录组基因数据的不同位置，来确定reads是否为嵌合reads，提高了准确性。引物序列不再固定，可以适用于不同的引物序列；同时考虑reads在参考基因组上的比对位置，使嵌合reads的鉴定和切分更加准确。

附图说明

图1为本发明的一些实施例中的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法的基本流程示意图；

图2为本发明的一些实施例中的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法的具体流程示意图；

图3为本发明的一些实施例中的Edlib局部比对方法中的不同模式示的比对示意图；

图4为本发明的一些实施例中的基于三代测序的转录组嵌合体的切分装置的结构示意图；

图5为本发明的一些实施例中的电子设备的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

为了描述的方便，对本公开中出现的相关术语进行通用性解释：

二代测序：第二代基因测序技术，也叫下一代测序(NGS，Next GenerationSequencing)，主要使用Illumina平台的测序仪器，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，得到的片段读长较短，通常为几十到几百碱基对(bp，base pair)。

三代测序：第三代基因测序技术(TGS，Third Generation Sequencing)，以Pacbio或Oxford Nanopore平台为代表的测序技术，得到的片段读长较长，长度从几kb(千碱基，kilo base)到几十或者几百kb，适用于基因组组装、全长转录组研究等工作。

纳米孔测序：OxfordNanopore公司研发的三代测序技术，其原理为使待测的DNA或者RNA分子通过一张带有很多纳米孔的生物膜，膜的两侧带有电压，在DNA或者RNA分子通过纳米孔的过程中，会导致纳米孔位置的电流发生变化，不同碱基(A、T、C、G)引起的电流变化会有不同，因此可以通过识别电流信号的波动趋势来识别待测分子上的碱基，从而达到对DNA或者RNA分子的序列进行测定的目的。

Reads：测序过程中得到基因片段的一条条序列读序，称之为reads，通常由A、T、C、G四种碱基组成。

PCR：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，特点是能将微量的DNA进行指数级扩增，使其含量大幅增加。

引物：也叫primer，是进行PCR扩增过程中与DNA分子结合的一小段核酸序列，起引导PCR延伸反应的作用。

基因组：指生物体内所有遗传信息的总和，基因组序列包括一条条核酸序列，通常一条核酸序列为一条染色体，由A、T、C、G四种碱基组成。对生物基因组进行测序的过程称为基因组测序。

转录组：指生物体内所有基因转录产物的总和，包括不同种类的RNA分子，每个RNA分子称为转录本，所有转录本的集合即为转录组。对转录组进行测序的过程称为转录组测序。

嵌合体：在对核酸分子进行PCR扩增、或者测序的过程中，由于技术的缺陷，错误的将不同的核酸片段连接到同一条reads上，这种包含不同核酸片段的reads，称为嵌合体。

参考图1或图2，在本发明的第一方面，提供了一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法，包括：S100.获取待测转录组的三代测序数据；基于参考基因组，对所述三代测序数据进行比对分析，得到一条或多条reads；S200.判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配；S300.根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads；S400.根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分。

在本发明的一些实施例的步骤S100中，获取待测转录组的三代测序数据；基于参考基因组，对所述三代测序数据进行比对分析，得到一条或多条reads。

具体地，S101.获取测序数据。首先，利用RNA提取试剂盒对一例人外周血的样品进行RNA提取，然后对提取的RNA进行质检。RNA质检的标准如下：(1)样品的外观性状不含有异物；(2)1％琼脂糖电泳检测样品没有降解及基因组DNA污染，凝胶电泳成像中28s和18s条带清晰；(3)使用NanoDrop^TM One UV－Vis spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific，USA)检测RNA纯度(A260/A280在2.0－2.2之间，A260/A230在1.8－2.1之间)；(4)使用

3.0 Fluorometer(Invitrogen，USA)对RNA进行精确定量；(5)使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent technologies，USA)检测RIN值和28S/18S(28s：18s≥1.5，RIN≥8)。

S102.获取到质检合格的RNA样品后，利用Nanopore平台官方建库试剂盒对RNA进行测序文库构建。

具体地，包括：S1021.取100ng质检合格的总RNA样本，使用全长转录组(cDNA－PCR)测序试剂盒(Oxford Nanopore Technologies，SQK－PCS109)(此处的试剂盒类型仅为举例)，对其进行反转录并完成链置换，合成cDNA第一链；S1022.使用快速条码试剂盒(Oxford Nanopore Technologies，SQK－PBK004)中带有条形码标记的引物LWB01－LWB12，通过后续PCR反应选择全长转录本，并完成扩增同时添加条形码标记(最终扩增循环数通过循环数优化实验确定)；S1023.将快速测序接头连接到PCR产物上，完成测序文库的构建，使用Qubit精确地对建好的cDNA文库进行定量检测。

S103.测序文库制备完成后，将准备好的测序文库加载至PromethION Flow Cell(R9.4.1)芯片(此处的芯片类型仅为举例)，并放入Oxford NanoporePromethION测序仪，选择匹配的测序模式进行测序，测序完成后即可得到fastq格式的测序数据。例如，测序仪下机数据显示，本次测序总共得到20，281，315条reads，总长度29，046，359，402个碱基(29Gb)，reads的平均长度1432个碱基。

在本发明的一些实施例的步骤S200中，所述判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配包括：将每条reads与参考基因组进行比对，判断所述reads是否与参考基因组中位于不同位置的多个基因的片段匹配。

具体地，将测序数据利用minimap2软件比对到参考基因组(比对参数：minimap2－ax splice genome.fadata.fastq)，得到比对后的bam格式文件。

比对结果示例(前5行)如下：

比对结果中每一行表示一个alignment(比对)，共有17列，每一列的含义解释说明如下：

1、reads的ID标识符；

2、reads的长度；

3、alignment在reads上的起始位置；

4、alignment在reads上的终止位置；

5、reads比对到参考基因组的正链(+)还是负链(－)；

6、比对到参考基因组序列的ID标识符；

7、比对到参考基因组序列的长度；

8、alignment在参考基因组序列上的起始位置；

9、alignment在参考基因组序列上的终止位置；

10、alignment中匹配的碱基数目；

11、alignment的长度；

12、alignment的质量值；

13列以后为比对的一系列标签值。本公开主要利用比对结果的前9列进行解析。

在本发明的一些实施例的步骤S300中，所述根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads包括：基于edlib局部比对算法，将参考引物序列与每条reads做双序列比对：若至少匹配到一条引物序列，则判断所述reads为嵌合reads。

具体地，判断一条reads为嵌合reads需满足两个条件：1、一条reads有一段比对到参考基因组上一个位置，而这条reads的另一段比对到参考基因组上的另一个位置；2、比对上参考基因组不同位置的这两段序列中间需要包含引物序列。

如果一条reads不是嵌合体，是正常的reads，则PCR引物或者测序引物只应该出现在reads的两端；而如果一条reads是嵌合reads，则PCR引物或者测序引物会出现在reads的中间。

如下所示，“＝”表示reads上的基因片段，“＞＞”或者“＜＜”表示引物序列，正常的reads只会在两端有引物序列，例如：

＞＞＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＜＜

而嵌合reads中，引物会出现在reads中间，例如(基因片段A与基因片段B发生嵌合，被测序到同一条reads上)：

＞＞＝＝＝＝A＝＝＝＝＜＜＞＞＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝B＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＜＜

对每条reads进行比对判断，如果在reads内部识别到了引物序列，则认为其属于嵌合reads，并将其切分成不同的子reads，如下：

＞＞＝＝＝＝A＝＝＝＝＜＜

＞＞＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝B＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＜＜

在一个示例中，对于如下这条reads：

＠1a33524c－db21－4316－9e50－2d0c710938b5runid＝67e8721595902135970856a9938a6794dce4ae16read＝32386ch＝169start_time＝2021－12－30T22：00：53Zflow_cell_id＝PAI17966protocol_group_id＝basecalledsample_id＝20211230－NPL3956－P6－PAI17966

GTGTTATGGTTCCTTCGTTCAGTTACGTATTGCTAAGCAGTGGTATCAACGCAGTACATGGGGCTCTTTCCCTAAGCAGCCTGAGGTGATCTGTGAAAATGGTTCGCTATTCACTTGACCCGGAGAACCCCACGAAATCATGCAAATCAAGAGGTTCCAATCTTCGTGTTCACTTTAAGAACACTCGTGAAACTGCTCAGGCCATCAAGGGTATGCATATACGAAAAGCCACGAAGTATCTGAAAGATGTCACTTTACAGAAACAGTGTGTACCATTCCGACGTTACAATGGTGGAGTTGGCAGGTGTGCGCAGGCCAAGCAATGGGGCTGGACACAAGGTCGGTGGCCCAAAAAGAGTGCTGAATTTTTGCTGCACATGCTTAAAAACACAGAGAGTAAATGCTGAACTTAAGGGTTTAGATGTAGATTCTCTGGTCATTGAGCATATCCAAGTGAACAAAGCACCTAAGATGCGCCGCCGGACCTACAGAGCTCATGGTCGGATTAACCCATACATGAGCTCTCCCTGCCACATTGAGATGATCCTTACGGAAAAGGAACAGATTATTTTAAACCAGAAGAGGAGGTTGCCCAGAAGAAAAAAGATATCCAGAAGAAACTGAAGAAACAAAAACTTATGGCACGGGAGTAAATTCAGCATTAAAATAAATGTAATTAAAAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAACTACATTACCCTTCTGTGTCCGAGATCGGAAGAGCGTCCGTGTAGAGCAATGGTTGTGTCCTCTACTCGTTCAGTTACGTATTGCTAGCAGTGGTATCAACGCGGAGAGTACATGGGCAGAAATCACATCGCGTCAACACCCGCCGCGGGCCTTCGCGATGCTTTGTTTTAATTAAACAGTCGGATTCCCCTGGTCCGCACCAGTTCTAAGTCGGCTGCTAGGCGCCGGCCGAGGCGAGGCGCCGCGCGGAACCGCGGGCCCGGGGGGCAGACCCCGCGGGGGGGACCGGCCCGCGGCCCCTCCGCCGCCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGGAGGAGGGGGGAACGGGGGGCGGACGGGGCCGGGGGGGTAGGGCGGGGGGACGAACCGCCCCGCCCCGCCGCCCGCCGACCGCCGCCGCCCGACCGCTCCCCGCCCCCAGCGGACGCGCGCGCGACGAGACGTGGGGTGGGGGGGGGGCGCGCCGGCGCCCGCCGGGCTCCCCGGGGGCGGCCGCGACGCCCGCCGCAGCTGGGGCGATCCACGGGAAGGGCCCGGCTCGCGTCCAGAGTCGCCGCCGCCGCCGGCCCCCCGGTGCCCGGGCCCCCCTCGCGGGGGACCGTGCCCCCGCCGCCGGCCCTGTCTCTCAGTTAATACCAAATGTTGGTTGTGTAGCGCACTTGGTTCAGTTACGTATTGCTAGTGGTATCAACGCCGAGTACATGGGACAAATAAGTGGTCTTAGGTCAAGCAGTGGCTCATGACTGTAATCCCATCACTTTGGGAGGCCAAGGTCGTTGGATCGTTTGAGTTTAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGCGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGTCGGGAGTGGTGATATGTGCAGAAGGATCACTTGTGCCTCAGAGGCAGGGGCTGCAGTGAGCTGAGATCATGTCACTGACTGCACTCCAGCCGGGGTGACAAAGTGAAACCCTGTCTCAAAAAACAAGAACAGAAAAAAAAAAACTGTTTAAATAATTAAGATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCTAAGATTTGCGCTGAACTGAGATAAG

可以理解，本公开需要判断这个条reads是否是一条嵌合reads，需要满足上述两个条件。本发明通过解析比对结果文件，发现这条reads比对到参考基因组上的三个位置，如下：

1a33524c－db21－4316－9e50－2d0c710938b5 1797 1453 1756+17 8325744142613175 42613476 300 303 60

1a33524c－db21－4316－9e50－2d0c710938b5 1797 63 688－188037328549488483 49492479 6196270

1a33524c－db21－4316－9e50－2d0c710938b5 1797 807 1340－21467099838444318 8444851 5275358

这条reads总长1797个碱基，其从第63位碱基到第688位碱基比对到了人类参考基因组18号染色体从49488483到49492479位置，而其从第807位碱基到1340位碱基比对到了人类参考基因组21号染色体从8444318到8444851位置，其从第1453位碱基到1756位碱基比对到了17号染色体从42613175到42613476位置。

可以理解，由于三代测序的碱基序列存在一定的错误率，因此不能直接在reads序列中搜索引物序列。本发明利用edlib的局部比对的算法，将引物序列与reads序列做双序列比对，在允许错误匹配的情况下能够在reads序列中找到与引物序列最相似的部分，实现了在reads中搜索引物序列的目的。

因此，所述基于edlib局部比对算法，将参考引物序列与每条reads做双序列比对包括：通过edlib局部比对算法的HW模式在允许错误匹配的情况下，在reads中找到与引物序列最相似的reads片段。

具体地，Edlib局部比对主要基于Myers’s bit－vector(位相量)实现序列比对过程，而且采用了带状比对(banded alignment)思想，可以进一步提高运算速度和降低内存消耗。Edlib比对模式有三种，分别为NW、SHW和HW模式。假设我们现在有两条序列s1(reads序列)GCTAACTGGC，和s2(引物序列)CGTAGCTG。

参考图3，其示出了三种不同模式的比对示意图。在图3中，两条序列之间匹配的部分用一条竖线表示，在序列比对的打分系统中加分，不匹配的部分在两条序列中用短横线表示(术语gap)，gap会导致在序列比对的打分系统中罚分。序列比对通过动态规划算法在所有的结果中找到最优的比对结果(打分最高)，即找到了s2在s1上的最佳匹配位置。由于NW模式和SHW模式会在引物序列的两端开gap罚分，而本发明只需要找到s2在s1上的最佳匹配位置，而不关心s2的两端与s1的差异，因此本发明采用上述三种比对模式中的HW模式，通过HW模式在允许错误匹配的情况下，利用局部比对在reads序列中快速找到与引物序列最相似的部分，从而能够快速处理长读长数据信息，并能挖掘更精确的引物序列。

结果搜索到reads在不同的比对位置中间存在引物序列，如下加粗部分：

通过以上两步，这条reads满足上述两个条件：1、一条reads有一段比对到参考基因组上一个位置，而另一段比对到参考基因组上的另一个位置；2、比对上参考基因组不同位置的这两段序列中间需要包含引物序列。

因此本发明判断这条reads为一条由三段序列组成的嵌合reads。

在另一个示例中，对于如下这条reads：

＠fff171a0－6eda－4274－82f8－2f1890cd5a99runid＝67e8721595902135970856a9938a6794dce4ae16read＝87021ch＝177start_time＝2021－12－31T08：24：12Zflow_cell_id＝PAI17966protocol_group_id＝basecalledsample_id＝20211230－NPL3956－P6－PAI17966

GTTATTAATTTACTACTCAGTGCATTGCTGCAGTGGTATCAATTGCACGAGTACATGGGGAGGGCTGTGCTTAAACAAACAAAAATAATAACATAAAATGTCTCAAAGGCATTGCCGTGTGCGTCGGGGCACGCACTCTGACCAGTGCCTGCAAAGTATACTTGATGGTTTGGCAAAGCTGAGATGGAGTGGGCTGGGATGGGAGAATAATTAATTTTCTGGCTACAAACTCTCTTGAGCACCCAAATTGTATCTGTGACTCATTATTTATTCATACAGCTAAGTGAGCAGGGGAATGCAGAGGGCTTGCCGGCCACTTTATCACAGCAAATGCTATTGTGAATGCACGGGGCTGTATTCCGGTCCCTGAAATTAAAAAACTTGATGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGCCAGCATTCAAAATTCCCATGCTTAGGGAATCCATTGGGACTTCTCCAGGATGTACTGAATTCAAGGAAGCTTTCTCTAGGTGTAGCAGAAACTGCTGCTGTCATGTCTCTGCTCACCAGGACGTAGCTTCTCTCTACAGACCTTTATTTCTTTCCCTGGAGGCTTCAGTCCATGTTGAAGTGTAAACTCCACTCAGCTCCAGGAGGAATGTGGTTGCTTTCTTTATCACCAGGGGCTTCTTCTACGAGTTGCCTTTGATAGGGAGGCCAGGAAGATAGGCCCAAGCTCAGGGGTGGGATGGGGAGCAGGAAGCCTGTGGGCTTTAGAATCGAGGTATTGGTTTCTCCCTGTCACCATCATCCACCACCTGTGTGAACTTGAGCCATTTATCGAACCTCACGGAGCCCCAAGTTTCTCATCTGTAAACAAGGGGAATGAGCCCTACTTTGTATGGTTGTCAAGAGGATTTGAGACAATATGTATAAAGCAATGGACACGCAGAGGAAGTCAATAAGTACAAGGTAACTCTGAAAATGCCACCAAAGGGAGGCTAGGGACAGGAAAGCCATCTCCGCCAACCTCAAGAACGTGGCCCCGAAGCTGTTCCAGGAACTGGGCATGTATGAGAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCATTCCCTGGTGATACAATTGCCAGATCGGAAGAGCGTCGTGTTACACGACACTCTCCGAGTGTGAAGGAGCCGATTTCACGAATGCGTTTTTTTTTTTTAACCTTAGGCCCAATGATACTTATAGCTGAGTATATAAGAATTTTAATTTCCATTTGCTCAGCCATCATAAAACAATACCAAGTGGAAACCATCTGTAATTACATTTTCAAACACTAATTCACAGAAAGTTAAGCAGAGAGAGATCTATACATCAGTTTAGTCTATTATACTTTAAGCAGATCCAGAGACCATAAAACAACTCAAAGGTAGCCTTCTGCTTCACCAATAGTTTTCCCATTCTTTCGCTATTTATCTCTGATTTTTCAATATCTGGGCTATGACAACAGATCTCTACAAAGAATAAGGGGTAAAGAAGATCTCTAACGATAGCAGATATGTAATTCCAGCTTATCAACTACCTCAATAAGATATAGGAATATCTCATTTTATTGCATTTCACATTGTTTCGCTTCACAGATGCTGCATTTTTTACAAATTTAAGGTGTGTAGCAACCCTGTGTCGAGCAAGCCTATCAGCGCCATTTTTCAAAAAGCATGTGCTCAATTCTTGTGTCTGTGTCACATTTTGGTAATTCTTGCAATATTTCAAACATTTTCATTATTATAATATCTTATGTGGTGGATCTGTGATCAGTGATCTTTGATGTTACTCCCATGTACTCTGCGTTGATACCACTGCAGCAATAC

首先通过解析比对结果，发现这条reads的两端序列分别比对到了参考基因组上的两个不同的位置，如下：

fff171a0－6eda－4274－82f8－2f1890cd5a99 1815 1153 1779+12 13327530911622695711622758461863160

fff171a0－6eda－4274－82f8－2f1890cd5a99 1815 59 1065－214670998335037919 35047930 9941019 60

这条reads总长1815个碱基，从第59位碱基到第1065位碱基比对到了人类参考基因组上的21号染色体从35037919到35047930，而其从第1153位碱基到1779位碱基比对到了人类参考基因组上12号染色体从116226957到116227584的位置。

然后在reads内部模糊匹配引物序列，发现在两段不同比对位置的序列中间搜索到了引物序列，如下加粗部分：

＠fff171a0－6eda－4274－82f8－2f1890cd5a99runid＝67e8721595902135970856a9938a6794dce4ae16read＝87021ch＝177start_time＝2021－12－31T08：24：12Zflow_cell_id＝PAI17966protocol_group_id＝basecalledsample_id＝20211230－NPL3956－P6－PAI17966

通过以上两步，这条reads满足上述两个条件：1、一条reads有一段比对到参考基因组上一个位置，而另一段比对到参考基因组上的另一个位置；2、比对上参考基因组不同位置的这两段序列中间需要包含引物序列。因此判断这条reads为一条由两条序列组成的嵌合reads。

在上述的实施例的步骤S400中，所述根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分包括：根据每条嵌合reads匹配到的参考基因组的多个不同位置的基因片段，确定一个或多个所述嵌合reads的引物序列的位置；基于每个所述嵌合reads的引物序列的位置确定嵌合位点，根据所述嵌合位点将待测转录组中的嵌合reads切分为多个非嵌合reads。

具体地，在判断一条reads为嵌合reads之后，根据比对上参考基因组不同位置的两段序列中间的引物序列，找到发生嵌合的具体位点，提高切分的准确性，以避免引入假阳性；然后，从该位点将这条reads切开为不同的reads，得到非嵌合reads。

例如，以上述实施示例1为例，

在判断其是否为嵌合reads的过程中已经发现：其从第63位碱基到第688位碱基比对到了人类参考基因组18号染色体从49488483到49492479位置，而其从第807位碱基到1340位碱基比对到了人类参考基因组21号染色体从8444318到8444851位置，其从第1453位碱基到1756位碱基比对到了17号染色体从42613175到42613476位置。

其第688位碱基与第807位碱基中间，匹配到了引物序列“AGCAGTGGTATCAACGCGGAGAGTACATGGG”，因此，在其807位碱基之前减去匹配到的引物序列长度31，即可得到将嵌合reads切开的具体位置：第(807－31＝776)位碱基。然后，以第776位碱基为断点，第一位到第775位为切分后的第一条reads，第776位碱基到最后为切分后的第二条reads，即通过切分嵌合reads得到了两条非嵌合的reads。

对测序数据的切分结果显示，本公开成功切分5998473条嵌合reads。本发明提供切分方法能够提高对嵌合reads的识别更加准确，切分更多的嵌合reads，进而提高测序的准确性。

实施例2

参考图4，本发明的第二方面，提供了一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分装置1，包括：获取模块11，用于获取待测转录组的三代测序数据；基于参考基因组，对所述三代测序数据进行比对分析，得到一条或多条reads；第一判断模块12，用于判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配；第二判断模块13，用于根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads；切分模块14，用于根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分。

进一步的，所述切分模块14包括：确定单元，用于根据每条嵌合reads匹配到的参考基因组的多个不同位置的基因片段，确定一个或多个所述嵌合reads的引物序列的位置；切分单元，用于基于每个所述嵌合reads的引物序列的位置确定嵌合位点，根据所述嵌合位点将待测转录组中的嵌合reads切分为多个非嵌合reads。

实施例3

参考图5，本发明的第三方面，提供了一种电子设备，包括：一个或多个处理器；存储装置，用于存储一个或多个程序，当所述一个或多个程序被所述一个或多个处理器执行，使得所述一个或多个处理器实现本发明在第一方面的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法。

电子设备500可以包括处理装置(例如中央处理器、图形处理器等)501，其可以根据存储在只读存储器(ROM)502中的程序或者从存储装置508加载到随机访问存储器(RAM)503中的程序而执行各种适当的动作和处理。在RAM503中，还存储有电子设备500操作所需的各种程序和数据。处理装置501、ROM 502以及RAM 503通过总线504彼此相连。输入/输出(I/O)接口505也连接至总线504。

通常以下装置可以连接至I/O接口505：包括例如触摸屏、触摸板、键盘、鼠标、摄像头、麦克风、加速度计、陀螺仪等的输入装置506；包括例如液晶显示器(LCD)、扬声器、振动器等的输出装置507；包括例如硬盘等的存储装置508；以及通信装置509。通信装置509可以允许电子设备500与其他设备进行无线或有线通信以交换数据。虽然图5示出了具有各种装置的电子设备500，但是应理解的是，并不要求实施或具备所有示出的装置。可以替代地实施或具备更多或更少的装置。图5中示出的每个方框可以代表一个装置，也可以根据需要代表多个装置。

特别地，根据本公开的实施例，上文参考流程图描述的过程可以被实现为计算机软件程序。例如，本公开的实施例包括一种计算机程序产品，其包括承载在计算机可读介质上的计算机程序，该计算机程序包含用于执行流程图所示的方法的程序代码。在这样的实施例中，该计算机程序可以通过通信装置509从网络上被下载和安装，或者从存储装置508被安装，或者从ROM502被安装。在该计算机程序被处理装置501执行时，执行本公开的实施例的方法中限定的上述功能。需要说明的是，本公开的实施例所描述的计算机可读介质可以是计算机可读信号介质或者计算机可读存储介质或者是上述两者的任意组合。计算机可读存储介质例如可以是——但不限于——电、磁、光、电磁、红外线、或半导体的系统、装置或器件，或者任意以上的组合。计算机可读存储介质的更具体的例子可以包括但不限于：具有一个或多个导线的电连接、便携式计算机磁盘、硬盘、随机访问存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦式可编程只读存储器(EPROM或闪存)、光纤、便携式紧凑磁盘只读存储器(CD－ROM)、光存储器件、磁存储器件、或者上述的任意合适的组合。在本公开的实施例中，计算机可读存储介质可以是任何包含或存储程序的有形介质，该程序可以被指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用。而在本公开的实施例中，计算机可读信号介质可以包括在基带中或者作为载波一部分传播的数据信号，其中承载了计算机可读的程序代码。这种传播的数据信号可以采用多种形式，包括但不限于电磁信号、光信号或上述的任意合适的组合。计算机可读信号介质还可以是计算机可读存储介质以外的任何计算机可读介质，该计算机可读信号介质可以发送、传播或者传输用于由指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用的程序。计算机可读介质上包含的程序代码可以用任何适当的介质传输，包括但不限于：电线、光缆、RF(射频)等等，或者上述的任意合适的组合。

上述计算机可读介质可以是上述电子设备中所包含的；也可以是单独存在，而未装配入该电子设备中。上述计算机可读介质承载有一个或者多个计算机程序，当上述一个或者多个程序被该电子设备执行时，使得该电子设备：

可以以一种或多种程序设计语言或其组合来编写用于执行本公开的实施例的操作的计算机程序代码，程序设计语言包括面向对象的程序设计语言—诸如Java、Smalltalk、C++、Python，还包括常规的过程式程序设计语言—诸如“C”语言或类似的程序设计语言。程序代码可以完全地在用户计算机上执行、部分地在用户计算机上执行、作为一个独立的软件包执行、部分在用户计算机上部分在远程计算机上执行、或者完全在远程计算机或服务器上执行。在涉及远程计算机的情形中，远程计算机可以通过任意种类的网络——包括局域网(LAN)或广域网(WAN)——连接到用户计算机，或者，可以连接到外部计算机(例如利用因特网服务提供商来通过因特网连接)。

附图中的流程图和框图，图示了按照本公开各种实施例的系统、方法和计算机程序产品的可能实现的体系架构、功能和操作。在这点上，流程图或框图中的每个方框可以代表一个模块、程序段、或代码的一部分，该模块、程序段、或代码的一部分包含一个或多个用于实现规定的逻辑功能的可执行指令。也应当注意，在有些作为替换的实现中，方框中所标注的功能也可以以不同于附图中所标注的顺序发生。例如，两个接连地表示的方框实际上可以基本并行地执行，它们有时也可以按相反的顺序执行，这依所涉及的功能而定。需要注意的是，框图和/或流程图中的每个方框、以及框图和/或流程图中的方框的组合，可以用执行规定的功能或操作的专用的基于硬件的系统来实现，或者可以用专用硬件与计算机指令的组合来实现。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法，其特征在于，包括：

获取待测转录组的三代测序数据；基于参考基因组，对所述三代测序数据进行比对分析，得到一条或多条reads；

判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配；

根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads；

根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分。

2.根据权利要求1所述的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法，其特征在于，所述判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配包括：

将每条reads与参考基因组进行比对，判断所述reads是否与参考基因组中位于不同位置的多个基因的片段匹配。

3.根据权利要求1所述的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法，其特征在于，所述根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads包括：

基于edlib局部比对算法，将参考引物序列与每条reads做双序列比对：若至少匹配到一条引物序列，则判断所述reads为嵌合reads。

4.根据权利要求3所述的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法，其特征在于，所述基于edlib局部比对算法，将参考引物序列与每条reads做双序列比对包括：

通过edlib局部比对算法的HW模式在允许错误匹配的情况下，在reads中找到与引物序列最相似的reads片段。

5.根据权利要求4所述的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法，其特征在于，所述允许错误匹配包括模糊匹配。

6.根据权利要求1至5任一项所述的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法，所述根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分包括：

根据每条嵌合reads匹配到的参考基因组的多个不同位置的基因片段，确定一个或多个所述嵌合reads的引物序列的位置；

基于每个所述嵌合reads的引物序列的位置确定嵌合位点，根据所述嵌合位点将待测转录组中的嵌合reads切分为多个非嵌合reads。

7.一种基于三代测序的转录组嵌合体的切分装置，其特征在于，包括：

获取模块，用于获取待测转录组的三代测序数据；基于参考基因组，对所述三代测序数据进行比对分析，得到一条或多条reads；

第一判断模块，用于判断每条reads中的多个片段，是否与位于参考基因组的多个不同位置的基因片段匹配；

第二判断模块，用于根据匹配到的多个不同位置的基因片段对应的reads片段内，是否包含引物序列，判断每条reads是否为嵌合reads；

切分模块，用于根据每条嵌合reads的引物序列在reads的位置，确定嵌合位点并根据其对所述转录组数据进行切分。

8.根据权利要求7所述的基于三代测序的转录组嵌合体的切分装置，其特征在于，所述切分模块包括：

确定单元，用于根据每条嵌合reads匹配到的参考基因组的多个不同位置的基因片段，确定一个或多个所述嵌合reads的引物序列的位置；

切分单元，用于基于每个所述嵌合reads的引物序列的位置确定嵌合位点，根据所述嵌合位点将待测转录组中的嵌合reads切分为多个非嵌合reads。

9.一种电子设备，其特征在于，包括：一个或多个处理器；存储装置，用于存储一个或多个程序，当所述一个或多个程序被所述一个或多个处理器执行，使得所述一个或多个处理器实现如权利要求1至6任一项所述的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法。

10.一种存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，其中，所述计算机程序被处理器执行时实现如权利要求1至6任一项所述的基于三代测序的转录组嵌合体的切分方法。

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