CN115684099A - 一种碳量子点及其定量检测肿瘤血管抑制剂dx1002的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种碳量子点，它由如下原料制备而成：邻苯二胺、色氨酸、铁盐；本发明碳点荧光稳定、具有抵抗生物背景猝灭能力等优良光学特性以及可被DX1002特异性定量猝灭的特点，以其为荧光探针，构建了定量检测DX1002的方法，该方法可以略过繁琐样本前处理和干扰物的分离，是一种快速、灵敏、经济、高通量的DX1002分析方法，适用于DX1002的体内药动学监测，推进抗癌候选药DX1002的进一步分析研究，也为碳量子点在生物样品的高通量检测应用中提供新方法和思路，更好实现医院及检测中心的快检需求。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针检测领域，具体涉及一种碳量子点及其定量检测肿瘤血管抑制剂DX1002的方法。
背景技术
近年来，全球的肿瘤发病率与死亡率一直持续上升，在中国，肺癌发病率与死亡率已位居全球第一。根据形势所迫，抗肿瘤药物不断研发和进步迫在眉睫，而且，抗肿瘤药物的研发重心已经从传统的细胞毒类药物向着多环节作用的靶点药物方向发展，如新生血管、细胞信号转导分子、提高免疫力、减少癌细胞的脱落等。DX1002是我国自主研发的苯丙烯酸的正丁铵盐，结构如下：
DX1002微溶于水，pKa6.8，最大吸收波长为314nm，是一个有机弱酸铵盐。DX1002于2006年打通合成路线，并申请了国家专利(ZL 200610020818.5)。2017年11月获得国家食品药品监督管理局(CFDA)临床试验批准进入一期临床试验，属于1.1类肿瘤血管抑制剂类新药的候选药，主要用于甲状腺癌、肺癌以及消化道癌等实体癌。按照CFDA的要求，需要在临床试验期间对DX1002的药物动力学/药效动力学(PK/PD)关系进行深入研究。
然而，一直以来体内药物动力学的研究都要求高分辨率、高灵敏度的分析技术，如LC-MS/MS，并伴随着大量的分析样本。为了降低基质效应，必须完成繁琐的样品前处理以便净化待测样品，其过程不仅费时费力，而且可能引入不少的误差，造成分析结果的偏离。光谱法通常认为具有高通量检测能力，但其最大缺陷是专属性差，特别是针对内源性杂质复杂的生物样本，光谱法均无法直接用于检测，如何能够建立一种专属性、高灵敏、高通量和高精准分析方法成为药物分析领域分析工作者不懈追求的目标之一。虽然今天的UHPLC-MS技术已经大大缩短了检测时间，但是，繁琐的前处理过程还继续限制着总的分析时间和误差。
碳量子点简称碳点，是继富勒烯、碳纳米管和石墨稀等纳米材料之后的一种新型零维碳纳米材料(直径≤10nm)，通常可分为石墨烯量子点(GQDs)、碳纳米点(CNDs)和聚合物点(PDs)。2004年由美国南卡罗来纳大学的Xu团队在研究中偶然间发现的，他们在用电泳法纯化电弧放电灰制备单壁碳纳米管时，意外观察到能发出荧光的碳纳米粒子。直至2006年，美国克莱姆森大学科学家Sun团队利用激光消融碳靶物(以石墨粉与粘合剂热压而得)加有机试剂表面钝化处理，制备出能在溶液和固态中发射出强荧光的粒径小于10nm的碳纳米颗粒，他们将这种荧光碳纳米粒子正式命名为碳点(Carbon dots，CDs)。与有机荧光染料相比，碳点的激发和发射光谱宽且连续，呈现一元激发、多元发射的特性；高稳定性的荧光，耐光漂白，可以实现活体组织内的长期标记；且发射波长可调。与传统半导体量子点相比，碳点的生物相容性良好且毒性更低，不含重金属元素。碳点的这些优点使其逐渐受到人们的关注，成为现在研究的热点，它已经在活体成像、生化传感、分析检测等领域表现出很好的应用潜力。
如果能以DX1002为目标药，制备出与DX1002发生特异性荧光强度变化的碳点，利用碳点荧光强度的变化值与DX1002浓度间的定量变化关系，首先构建出体外碳点荧光探针的DX1002含量测定荧光分析法，将为开发出更快速、灵敏、低廉的DX1002定量分析方法用于DX1002的PK研究提供极大的便利。
不过，尽管CDs的制备工艺已经取得较大的进展，然而其产率低、量子产率不高一直是目前的瓶颈。首先是CDs制备工艺受外界条件影响较大，即使采用的碳源相同，制备的工艺流程相同，但是反应条件(反应温度或者反应时间)的波动，将直接影响到制备出的CDs表面结构，造成CDs的理化性质的差异，特别是荧光特性的差异。其次，研究证明表面钝化和异原子掺杂会改善碳点的荧光量子产率和改变表面结构提供活性位点，当选择的掺杂剂不同，加入量的不同也会影响碳点的表面结构。所以要制备得到与DX1002具有特异性作用且与DX1002具有定量关系的CDs具有很高难度。另外，该CDs还需要规避血浆样本、组织样本等生物样本中的生物介质对碳点的荧光漂白干扰。因而，要实现DX1002的定量检测，对碳点的各项性能都提出了很高的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与DX1002具有特异性作用且与DX1002具有定量关系的碳量子点和一种可略过繁琐生物样本前处理，无分离的高通量DX1002小鼠药代动力学研究与组织分布分析方法。
本发明提供了一种碳量子点，所述碳量子点由如下原料制备而成：邻苯二胺、色氨酸、铁盐。
进一步地，上述铁盐为三氯化铁或其水合物、硫酸铁或其水合物中的至少一种。
更进一步地，上述铁盐为六水合三氯化铁。
进一步地，上述邻苯二胺、色氨酸、铁盐的摩尔比为：4:1:(1.2～12)，优选为4:1:7。
本发明还提供了上述的碳量子点的制备方法，包括如下步骤：
(1)按比例取邻苯二胺、色氨酸、铁盐溶于盐酸的水溶液中；
(2)180～220℃反应1～5h，冷却过滤得滤液，干燥除去溶剂，即得；
优选地，步骤(2)所述反应为200℃反应3h。
本发明还提供了上述的碳量子点在定量检测肿瘤血管抑制剂DX1002的试剂中的用途。
本发明还提供了一种定量检测肿瘤血管抑制剂DX1002的试剂，它含有上述的碳量子点。
本发明还提供了一种定量检测肿瘤血管抑制剂DX1002的方法，包括如下步骤：
(1)取上述的碳量子点，溶于纯水中得到碳量子点溶液，测定碳量子点溶液的荧光强度F0；
(2)将步骤(1)的碳量子点溶液加入待测样品中，混匀得待测溶液；测定待测溶液的荧光强度F；
(3)将步骤(1)和(2)测得的荧光强度F和F0代入回归方程F0/F＝f(Q)中，计算得到Q值即为DX1002的浓度；
其中，所述待测样品为血浆，所述回归方程为：F0/F＝0.0024Q+1.0053；
或，所述待测样品为肝组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+0.9981；
或，所述待测样品为肺组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+0.9986；
或，所述待测样品为肾组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+1.0186；
优选地，步骤(1)和(2)的测定条件为在激发波长560nm下测定发射波长610nm处的荧光强度。
进一步地，上述待测样品中DX1002的浓度为7.5～250μg/mL。
进一步地，上述步骤(2)的待测溶液中碳量子点的浓度为0.125～2.5mg/mL，优选为0.25mg/mL。
回归方程F0/F＝f(Q)表示Q与F0/F之间存在数学上的函数关系；在数学领域，函数f(x)表示的是数集中的元素与另一个数集中的元素之间的等量关系：给定一个数集A，假设其中的元素为x，对A中的元素x施加对应法则f，记作f(x)，得到另一数集B，假设B中的元素为y，则y与x之间的等量关系可以用y＝f(x)表示。因此，本发明的回归方程F0/F＝f(Q)表示的是Q与F0/F之间的一个等量关系，f是对应法则。
本发明碳点荧光稳定、具有抗生物背景猝灭能力等优良光学特性以及可被DX1002定量猝灭的特点，以其为荧光探针，在体外构建了CDs-DX1002荧光猝灭定量方法，并首次将该法用于DX1002的药动学及组织分布分析。本发明的DX1002定量检测方法可以略过繁琐样本前处理，是一种快速、灵敏、经济、高通量的DX1002分析方法，适用于DX1002的药动学监测，通过采用酶标仪的96孔板测定，单位样品分析时间仅需0.25min，比HPLC-MS/MS检测方法(t分析10min)快22倍，首次实现了真正意义上生物样本的超高速测定，得以推进一类创新抗癌候选药DX1002的进一步分析研究。也为碳量子点在生物样品的高通量检测应用中提供新方法和思路，更好实现医院及检测中心的快检需求。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为：OT-FeCDs检测体系的F0/F与不同DX1002浓度的关系；内嵌图为OT-FeCDs检测体系的F0/F与7.5～250μ浓度范围的DX1002的线性关系图。
图2为：(A)OT-FeCDs的TEM图；(B)OT-FeCDs的FT-IR谱图。
图3为：稳定性考察碳点荧光强度受盐离子浓度(A)、酸碱度(B)、紫外照射时间(C)、室温存放时间(D)的影响。
图4为：待检测体系中不同的OT-FeCDs的浓度与DX1002的荧光淬灭关系。
图5为：SOCDs、OCDs、OTCDs、OFCDs碳点检测体系的F0/F与不同DX1002浓度的关系。
图6为：不同温度下碳点OT-FeCDs与DX1002的猝灭关系。
图7为：OT-FeCDs与生物组织混合后荧光图谱。
图8为：DX1002的药-时曲线。
图9为：DX1002的组织分布情况。
具体实施方式
本发明邻苯二胺购自天津市科密欧化学试剂有限公司；色氨酸购自上海麦克林生化科技有限公司；罗丹明6G、硫酸奎宁(98％)购自上海麦克林生化科技有限公司；CaCl2、KCl、MgCl2购自天津市致远化学试剂有限公司；NaCl、CuCl2、浓盐酸购自广东省化学试剂工程技术研究开发中心；FeCl3·6H2O购自成都市科龙化工试剂厂；蔗糖、葡萄糖购自天津市科密欧化学试剂有限公司；亮氨酸、甘氨酸、组氨酸、丙氨酸均购自上海麦克林生化科技有限公司；实验所用试剂均为分析级。DX1002由广州安好医药科技有限公司自制。
实验动物:昆明小鼠(5～6周，雌性，体质量18～24g，购自成都达硕实验动物有限公司)
实施例1、本发明碳量子点的合成
称取0.108g邻苯二胺、0.05g色氨酸，0.5gFeCl3·6H2O，加入200μL浓盐酸，加水10ml，超声溶解，混合均匀后置反应釜中，200℃加热3h，冷却转出，滤过得本发明碳量子点(OT-FeCDs)溶液，冷冻干燥得黑色粉末状固体，即为本发明碳量子点OT-FeCDs。
实施例2、本发明碳量子点定量检测DX1002方法的建立
取250mg DX1002对照品，精密称定，加入100mL超纯水，超声溶解，转移至250mL的棕色容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，即得1mg/mL DX1002对照品溶液。将该溶液稀释至一系列浓度，备用。
测定方法：取精密量取配制OT-FeCDs溶液(1mg/mL)、不同浓度DX1002对照品溶液各50μL于0.5mL的EP管中，精密加入超纯水100μL，混匀后的待测溶液中OT-FeCDs浓度为0.25mg/mL，精密量取混匀后的溶液体系170μL于96孔板内，酶标仪测定各孔荧光值(Ex/Em＝560/610nm)，得到不同浓度DX1002溶液对应的与OT-FeCDs作用后的荧光强度F，制作荧光淬灭程度(F0/F)-浓度(Q)标准曲线(F0为未加入猝灭剂OT-FeCDs的体系荧光强度)。
证实OT-FeCDs与DX1002在体外具良好线性关系。如图1所示，二者在7.5～250μg/mL的DX1002浓度范围内具有良好线性关系。
在体外线性关系的基础上，考察了生物样本体系荧光强度与DX1002浓度间的线性关系。将上述测定方法中的超纯水替换为生物样本体系：血浆、肝组织匀浆液、肺组织匀浆液、肾组织匀浆液，按照同样的方法测定并制作标准曲线。
结果证实在7.5～250μg/ml DX1002浓度范围内，生物样本荧光强度与DX1002浓度均存在较好线性关系，线性方程如表1所示：
表1生物样本线性及范围
因此，采用碳量子点OT-FeCDs定量检测DX1002的方法如下：
(1)取权利要求碳量子点OT-FeCDs，溶于纯水中得到1mg/mL的OT-FeCDs溶液；
(2)将步骤(1)的碳量子点溶液加入待测样品(血浆、肝组织匀浆液、肺组织匀浆液或肾组织匀浆液)中，混匀得溶液；
(3)酶标仪测定荧光值(Ex/Em＝560/610nm)：测定待测样品的荧光强度F0，测定步骤(2)的溶液的荧光强度F；
(4)将步骤(3)测得的荧光强度F和F0代入回归方程F0/F＝f(Q)中，计算得到Q值即为DX1002的浓度；
其中，所述待测样品为血浆，所述回归方程为：F0/F＝0.0024Q+1.0053；
或，所述待测样品为肝组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+0.9981；
或，所述待测样品为肺组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+0.9986；
或，所述待测样品为肾组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+1.0186。
对比例1、碳量子点SOCDs的制备
将新鲜菠菜切成小块，取适量菠菜碎块用80％的乙醇溶液，浸泡30min，将菠菜提取物过滤，滤液蒸发(50℃)除去乙醇后，将所得的绿色澄清溶液进行冷冻干燥处理，收集冻干的绿色粉末，即为碳点前驱体。取碳点前驱体三份，各0.05g，加入25mL乙醇使其溶解，形成透明溶液。将上述三份溶液分别转移到50mL的聚四氟乙烯反应釜中，在120℃，150℃，180℃下加热6h，自然冷却至室温，分别用定性滤纸和0.22μm滤膜过滤，滤液经冷冻干燥，得到SOCDs疏松粉末。
考察了在不同温度下反应得到的SOCDs三个碳点的荧光性质，虽然存在一定的差异；但相同点是具有双发射，激发波长由380nm增至460nm的过程中，蓝黄区发射具有激发依赖性，近红外区的发射不依赖激发波长，该碳点的最大发射波长为680nm。
对比例2、碳量子点OCDs的制备
称取邻苯二胺0.2g，加入10mL超纯水和10mL乙醇，超声处理10min后将上述溶液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，180℃下反应12h，分别用定性滤纸和0.22μm滤膜过滤后冷冻干燥，得到OCDs粉末。
在激发波长从360nm增至460nm过程中，OCDs的荧光强度先增强后减弱，其发射峰不随激发波长改变，在420nm的波长激发下可产生565nm的最大发射。
对比例3、碳量子点OTCDs的制备
分别称取邻苯二胺0.2g，酪氨酸0.335g(两者的摩尔比为1:1)置于50mL烧杯，依次加入10mL的超纯水和10mL的乙醇，超声处理10min，将上述溶液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中180℃下反应12h，产物分别用定性滤纸和0.22μm滤膜过滤后冷冻干燥，得到OTCDs粉末。
在激发波长从360nm增至460nm过程中，OTCDs的荧光强度先增强后减弱，其发射波长不随激发波长的改变而改变，在380nm的波长激发下可产生565nm的最大发射。
对比例4、碳量子点OFCDs的制备
称取0.1g邻苯二胺溶于10mL乙醇，加入叶酸水溶液(10mgFA加入10mL纯水)，超声处理10min后转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，在180℃下加热反应12h，取出反应物过滤，干燥即得OFCDs。
在激发波长从360nm增至460nm的过程中，OFCDs-2的荧光强度先增强后减弱，该碳点发射波长不依赖激发波长，在420nm的波长激发下可产生572nm的最大发射。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、本发明碳量子点的原料比例筛选
按照表2所示的原料配比，参照实施例1的制备方法制备了一系列OT-FeCDs碳量子点，并检测其量子产率，结果见表2。
表2OT-FeCDs碳量子点的原料比例筛选
可见，当邻苯二胺、色氨酸、铁盐的摩尔比为4:1:7时，碳量子点的量子产率最高，最适于作为检测用碳点。
实验例2、本发明碳量子点的表征
1、碳量子点的合成结果：将实施例1制备的一滴OT-FeCDs溶液滴于铜网自然晾干后，用透射电子显微镜(TEM，H-600，Hitachi,Japan)观察其形貌、粒径(图2A)，可见其呈单分散的类球形颗粒，粒径均一，集中在5nm。取冻干的OT-FeCDs粉末与溴化钾粉末，一定比例混合均匀后压制成透明薄片，于红外光谱仪测定红外吸收光谱(图2B)，可看出在3301.58cm-1有一较宽吸收带，这源于O-H和N-H的伸缩振动，1055.83cm-1处吸收归于C-N伸缩振动，1573.62cm–1及1481.30cm-1处吸收则可归于N-H和C-O弯曲振动。这表明OT-FeCDs主要元素为C、N、O且表面存在较多羟基与氨基，证实了本发明OT-FeCDs碳点的成功合成。
2、进行OT-FeCDs荧光稳定性考察实验：
(1)评估离子强度影响：向一定浓度的OT-FeCDs溶液中加入不同浓度的NaCl溶液(0-12mM)，在equipped with xenon lamp荧光分光光度计(RF-6000，Shimadzu，Japan)中进行荧光测量，测量的溶液体系中碳点溶液浓度为0.25mg/mL。结果如图3A所示，说明离子强度对OT-FeCDs的荧光无明显影响。
(2)评估pH的影响：向一定浓度的OT-FeCDs溶液中加入系列BR缓冲液(pH＝2.0-11.0，10％v/v)，在equipped with xenon lamp荧光分光光度计(RF-6000，Shimadzu，Japan)中进行荧光测量，测量的溶液体系中碳点溶液浓度为0.25mg/mL。结果如图3B所示，说明pH对OT-FeCDs的荧光无明显影响。
(3)评估紫外照射的影响：对OT-FeCDs溶液进行连续UV照射一定时间，在equippedwith xenon lamp荧光分光光度计(RF-6000，Shimadzu，Japan)中进行荧光测量，测量的溶液体系中碳点溶液浓度为0.25mg/mL。结果如图3C所示，说明紫外照射5h对OT-FeCDs的荧光无明显影响。
(4)室温放置贮存条件的影响：将OT-FeCDs溶液在室温下放置一段时间，在equipped with xenon lamp荧光分光光度计(RF-6000，Shimadzu，Japan)中进行荧光测量，测量的溶液体系中碳点溶液浓度为0.25mg/mL。结果如图3C所示，说明室温放置48h对OT-FeCDs的荧光无明显影响。
上述结果证实本发明的碳量子点对离子强度、pH变化、紫外照射均不敏感，在室温下长时间储存，荧光强度也无明显变化；说明本发明的碳量子点具有很好的稳定性，便于储存运输和实际临床应用。
实验例3、本发明碳量子点OT-FeCDs淬灭DX1002定量关系的验证
1、检测体系中碳量子点OT-FeCDs的浓度对OT-FeCDs与DX1002淬灭关系的影响：精密量取配制不同浓度的OT-FeCDs溶液和浓度为20、60、100、300、500μg/ml的DX1002对照品溶液各50μL于0.5mL的EP管中，精密加入超纯水100μL，混匀得待测溶液后精密量取170μL于96孔板内，酶标仪测定各孔荧光值(Ex/Em＝560/610nm)，得到不同浓度OT-FeCDs溶液对应的与DX1002作用后的荧光强度F，制作荧光淬灭程度(F0/F)-浓度(Q)的标准曲线(F0为未加入猝灭剂OT-FeCDs的体系荧光强度)。
从图4可以看出，待测溶液中的碳点浓度在0.25～2.5mg/mL范围内，与DX1002均有定量淬灭关系，其中，当待测溶液中碳点浓度为0.25mg/mL时,与DX1002猝灭关系最为明显，因此，后续的测试均采用保证待测溶液中为0.25mg/mL的碳点浓度进行。
2、检测体系中DX1002的浓度对OT-FeCDs与DX1002淬灭关系的影响：按照实施例2的测定方法：精密量取配制OT-FeCDs溶液(1mg/mL)和不同浓度DX1002对照品溶液各50μL于0.5mL的EP管中，精密加入超纯水100μL，混匀得待测溶液后精密量取170μL于96孔板内，酶标仪测定各孔荧光值(Ex/Em＝560/610nm)，得到不同浓度DX1002溶液对应的与OT-FeCDs作用后的荧光强度F，制作荧光淬灭程度(F0/F)-浓度(Q)的标准曲线(F0为未加入猝灭剂OT-FeCDs的体系荧光强度)。
如图1所示，证实OT-FeCDs与DX1002在7.5～250μg/mL的DX1002浓度范围内具有良好线性关系。
同样按照实施例2的测定方法，将OT-FeCDs碳量子点替换为对比例1～4的碳量子点：
对比例1：酶标仪测定各孔荧光值(Ex/Em＝420/680nm)，得到不同浓度DX1002溶液对应的与SOCDs作用后的荧光强度；
对比例2：酶标仪测定各孔荧光值(Ex/Em＝420/565nm)，得到不同浓度DX1002溶液对应的与OCDs作用后的荧光强度；
对比例3：酶标仪测定各孔荧光值(Ex/Em＝380/565nm)，得到不同浓度DX1002溶液对应的与OTCDs作用后的荧光强度；
对比例4：酶标仪测定各孔荧光值(Ex/Em＝420/572nm)，得到不同浓度DX1002溶液对应的与OFCDs作用后的荧光强度；
各个对比例中不同浓度DX1002溶液对应的荧光强度关系如图5所示。从图5可以看出，对比例1～4的碳点与DX1002均不存在定量淬灭/增强效应，荧光强度和DX1002浓度不存在定量线性关系，对比例的碳点均无法用于定量检测DX1002。
3、温度对淬灭关系的影响：参考文献Spectrochimica acta,Part A.Molecularand biomolecular spectroscopy,2019,212167-172和Talanta:The InternationalJournal of Pure and Applied Analytical Chemistry,2018,188788-794中的方法，验证温度对本发明碳点对DX1002淬灭关系的影响。从图6可以看出，温度在25～45℃的变化对本发明碳量子段OT-FeCDs与DX1002的荧光定量淬灭关系没有影响。
上述结果说明，以本发明特定的原料和方法制备得到的碳点OT-FeCDs相比于其它多种碳点而言，在较广的浓度范围内与DX1002具有明显的定量淬灭关系，检测体系中碳点OT-FeCDs的浓度变化和温度变化对定量淬灭关系无明显影响，因此，本发明的碳点OT-FeCDs非常适合应用于定量检测DX1002的试剂中，进行DX1002定量检测方法的建立。
实验例4、生物样品背景对本发明OT-FeCDs碳点荧光的影响
分别取100μL血浆及组织匀浆液空白样本于0.5mL EP管中,加入50μL1mg/ml OT-FeCDs溶液，50μL纯水，混匀后加入荧光微量比色皿中，荧光分光光度计测定其荧光光谱。如图7，血浆及组织匀浆液对碳点荧光干扰较小，混合后碳点荧光强度略有下降但荧光峰位不受影响，最大激发及发射仍为560/610nm，说明碳点荧光抗干扰能力强，可应用于生物血浆、组织匀浆样品中进行DX1002定量检测。
实验例5、本发明定量检测生物样品中DX1002的方法分析与验证
1、可行性分析：根据实施例1～2的线性方程分析，可以看出生物样品体系荧光猝灭程度与DX1002浓度在水溶液、血浆及组织匀浆液中均具良好线性关系，说明生物背景对本碳点荧光干扰小。分析血浆样品时，无需前处理，只要确保所采血样不发生溶血，尽可能保证血浆样本的澄清度，即可保证分析结果的准确性；而收集生物组织样本时，通过组织灌流可最大程度除去血样的干扰，获取纯净的组织样本，保证测量结果的准确度。因此，以OT-FeCDs为荧光探针，建立各生物样本中DX1002的荧光分析法具有可行性。
2、精密度与回收率
按照实施例2的测定方法进行不同浓度水平DX1002溶液的回收率实验，结果如表3所示，各生物样本中DX1002加入量分别为10.0、20.0、30.0μg时，测得血浆中DX1002回收率在93.3％～102％,日内、日间精密度RSD分别为1.87％和2.23％；组织中DX1002回收率平均值在96.5％～102％，日内、日间平均RSD分别为2.14％和1.96％。说明本法用于血浆及组织样本的实际检测均具有良好准确度和精密度，具实用性。
表3生物样本中DX1002回收率实验
3、选择性
考察生物样本中下述常见离子、糖类、氨基酸等潜在共存物质对DX1002-OT-FeCDs体系荧光强度的影响：K+(100g·L-1)、Mg2+(100g·L-1)、Na+(100g·L-1)、Ca2+(100g·L-1)、Fe3+(0.2g·L-1)、Cu2+(0.2g·L-1)、蔗糖(100g·L-1)、葡萄糖(100g·L-1)、亮氨酸(10g·L-1)、甘氨酸(100g·L-1)、组氨酸(10g·L-1)、丙氨酸(10g·L-1)。于0.5mL的EP管中加入50μL1mg/mLOT-FeCDs溶液、50μL0.2mg/mLDX1002溶液及100μL上述共存物质溶液，考察方法选择性，记录荧光值。
结果如表4，当相对误差在±5.0％以内,考察的生物样本中常见的潜在共存物质对体系的荧光信号几乎无干扰，说明本法具有一定专属性，可进行DX1002的含量检测。
表4共存物质的选择性考察
实验例6、实际样本检测药代动力学分析和组织分布研究
1、药代动力学分析：将实施例2建立的OT-FeCDs-DX1002生物样本分析方法运用于实际样本检测中，使用DAS 2.0软件对小鼠灌胃DX1002后血浆药-时曲线进行拟合分析，药-时曲线如图8；药物在血浆中的主要药动学参数如表5所示。
表5DX1002药动学参数
与常用的LC-MS/MS法单样本分析相比，本法单样品分析时间仅需0.2s，免除了质谱分析繁琐的前处理过程，大大节省分析时间，降低成本，且可同时测定60份样品的荧光强度，总分析时间缩短近1500倍，可实现高通量的药代动力学测量。
2、组织分布研究小鼠灌胃给予400mg/ml DX1002后，按照实施例2的方法对DX1002在5、25、240min的组织分布进行定量测定。图9为不同时间点DX1002在组织中的含量，可见DX1002作为肺癌治疗药物在肺内能够维持较长时间的高浓度水平，说明DX1002具有一定组织分布的靶向性。
可见，本发明检测方法为DX1002的药效学研究提供了有效手段。
综上，本发明提供了一种碳量子点，具有荧光稳定、抗生物背景猝灭能力等优良光学特性以及可被DX1002定量猝灭的特点，以其为荧光探针，构建了定量检测DX1002的方法，该方法可以略过繁琐样本前处理，是一种快速、灵敏、经济、高通量的DX1002分析方法，适用于DX1002的药动学监测，推进抗癌候选药DX1002的进一步分析研究，也为碳量子点在生物样品的高通量检测应用中提供新方法和思路，更好实现医院及检测中心的快检需求。
Claims (10)
1.一种碳量子点，其特征在于，所述碳量子点由如下原料制备而成：邻苯二胺、色氨酸、铁盐。
2.如权利要求1所述的碳量子点，其特征在于，所述铁盐为三氯化铁或其水合物、硫酸铁或其水合物中的至少一种。
3.如权利要求2所述的碳量子点，其特征在于，所述铁盐为六水合三氯化铁。
4.如权利要求1～3任一项所述的碳量子点，其特征在于，所述邻苯二胺、色氨酸、铁盐的摩尔比为：4:1:(1.2～12)，优选为4:1:7。
5.权利要求1～4任一项所述的碳量子点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)按比例取邻苯二胺、色氨酸、铁盐溶于盐酸的水溶液中；
(2)180～220℃反应1～5h，冷却过滤得滤液，干燥除去溶剂，即得；
优选地，步骤(2)所述反应为200℃反应3h。
6.权利要求1～4任一项所述的碳量子点在定量检测肿瘤血管抑制剂DX1002的试剂中的用途。
7.一种定量检测肿瘤血管抑制剂DX1002的试剂，其特征在于，它含有权利要求1～4任一项所述的碳量子点。
8.一种定量检测肿瘤血管抑制剂DX1002的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取权利要求1～4任一项所述的碳量子点，溶于纯水中得到碳量子点溶液，测定碳量子点溶液的荧光强度F0；
(2)将步骤(1)的碳量子点溶液加入待测样品中，混匀得待测溶液；测定待测溶液的荧光强度F；
(3)将步骤(1)和(2)测得的荧光强度F和F0代入回归方程F0/F＝f(Q)中，计算得到Q值即为DX1002的浓度；
其中，所述待测样品为血浆，所述回归方程为：F0/F＝0.0024Q+1.0053；
或，所述待测样品为肝组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+0.9981；
或，所述待测样品为肺组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+0.9986；
或，所述待测样品为肾组织液，所述回归方程为：F0/F＝0.0021Q+1.0186；
优选地，步骤(1)和(2)的测定条件为在激发波长560nm下测定发射波长610nm处的荧光强度。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述待测样品中DX1002的浓度为7.5～250μg/mL。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，步骤(2)的待测溶液中碳量子点的浓度为0.125～2.5mg/mL，优选为0.25mg/mL。
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