CN115671365B - 交联重组胶原蛋白海绵及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种交联重组胶原蛋白海绵及其制备方法和应用。所述方法先将重组胶原蛋白和白杨素粉末溶于碱性溶液中形成预混液，然后加入交联剂进行交联反应，得到交联重组胶原蛋白水凝胶，经溶胀后依次进行两次冷冻干燥，制得交联重组胶原蛋白海绵。本发明制备方法简单，通过交联改善胶原蛋白的力学性能和水解性，同时引入生物活性小分子化合物白杨素，使得交联重组胶原蛋白海绵覆盖于伤口后可随着胶原蛋白的降解缓释出白杨素，降低促炎因子和炎症介质的产生，进一步促进创面的愈合。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种交联重组胶原蛋白海绵及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，具有一定的形态结构，含有丰富的血管和神经网络，能不断地进行新陈代谢，且具有自我修复功能。然而很多因素会导致皮肤损伤，每年有数百万人由于不同程度的皮肤损伤需要接受治疗。对于普通创伤，正常机体一般可以自我修复，然而对于一些损伤面积过大或一些由疾病引起的慢性伤口，单纯依靠皮肤自身的修复无法完全愈合，必须借助医疗手段辅助治疗。随着组织修复机理不断被探索，人们发现开发具有良好组织相容性，植入或覆盖创面不与机体发生不良反应，且能治疗或代替机体中的缺损组织，促进创面修复的创伤修复材料变得十分重要。
创伤修复的目的是使创面愈合，并恢复相应的生理功能。创面修复材料不仅可暂时代替皮肤起到屏障功能的部分作用，还可提供有利于组织新生的环境，进而加速创面愈合。胶原蛋白作为一种功能性蛋白，具有支撑、保护、链接功能以及各种机械性质，还具备控制分子通透、促进伤口愈合及组织修复、调控细胞与组织的生理功能。目前组织工程对创面修复最常用的研究方法是在创面修复材料中添加生长因子，但其存在的半衰期短、蛋白质不稳定、高使用剂量、成本高和可能伴随出现的副作用等问题，限制了其进一步使用。
小分子是简单的生化成分，其可通过信号级联引发某些细胞反应，维持在生物环境中的活性，已逐渐替代生长因子应用于组织再生领域。白杨素是一种天然黄酮类的生物活性小分子化合物，广泛存在于多种植物、蜂胶和蜂蜜中。研究表明，白杨素具有抗炎、抗氧化和抗血管内皮损伤等作用。
目前对于胶原蛋白海绵的研究，如中国专利申请200510028759.1公开了胶原蛋白海绵的制备工艺，该胶原蛋白来源于牛跟腱；中国专利申请201110361186.X公开了胶原蛋白海绵的制备工艺，该胶原蛋白来源于猪皮。上述胶原蛋白海绵的原料均取自于天然来源的胶原蛋白，但其难以修饰，并可能产生致病和免疫不良反应及批次间的差异性等问题。中国专利申请201410555591.9公开了一种重组人源胶原蛋白生物海绵的制备方法，上述方法所制备海绵的原料为胶原蛋白和壳聚糖，壳聚糖的使用有使皮肤发生炎症反应的风险。
发明内容
本发明提供一种用于手术创面充填，具有止血、减轻炎症反应并促进创面愈合并恢复相应生理功能的交联重组胶原蛋白海绵及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
交联重组胶原蛋白海绵的制备方法，具体步骤如下：
(1)将重组胶原蛋白和白杨素粉末溶于碱性溶液中，得到pH值为10～13的预混液，其中重组胶原蛋白质量为碱性溶液质量的7wt％～15wt％，白杨素粉末质量为碱性溶液质量的0.1wt％～5wt％；
(2)将交联剂加入预混液中，混合均匀后得到混合溶液；
(3)将混合溶液在55～85℃下水浴加热，进行交联反应，得到交联重组胶原蛋白水凝胶；
(4)将交联重组胶原蛋白水凝胶置于水中溶胀；
(5)将溶胀的交联重组胶原蛋白水凝胶置于真空冷冻干燥机中进行预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品；
(6)将第一次冷冻干燥的交联重组胶原蛋白海绵置于水中进行搅拌清洗，再将其置于真空冷冻干燥机中进行预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
优选地，步骤(1)中，重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris发酵所产生。
优选地，步骤(1)中，碱性溶液为氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液。
优选地，步骤(1)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.04mmol/L～100mmol/L，更优选为0.04mmol/L～12.5mmol/L。
优选地，步骤(1)中，重组胶原蛋白质量为碱性溶液质量的9wt％～12wt％。
优选地，步骤(1)中，白杨素粉末质量为碱性溶液质量的0.5wt％～4wt％。
优选地，步骤(5)中，预混液的pH值为10～12。
优选地，步骤(2)中，交联剂选自1,4-丁二醇二环氧甘油醚(BDDE)、3-氯-1,2-环氧丙烷、1,3-二环氧丁烷、碳化二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷等环氧类化合物，优选为1,4-丁二醇二环氧甘油醚(BDDE)。
优选地，步骤(2)中，1,4-丁二醇二环氧甘油醚质量为预混液质量的0.8wt％～4wt％，更优选为1wt％～2wt％。
优选地，步骤(3)中，水浴加热温度为60～70℃。
优选地，步骤(3)中，交联反应时间为2～24h，更优选为8～16h。
优选地，步骤(4)中，水为纯化水或注射用水，溶胀时间为0.2～24h，更优选为0.5～8h。
优选地，步骤(6)中，水为纯化水或注射用水，清洗时间为4～48h，更优选为8～24h。
进一步地，本发明提供上述制备方法制得的交联重组胶原蛋白海绵。
更进一步地，本发明提供上述交联重组胶原蛋白海绵在制备创面修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明以重组胶原蛋白为原料，消除了动物源胶原蛋白病毒隐患的制约，经过交联优化可改善胶原蛋白的力学性能和水解性，同时引入生物活性小分子化合物白杨素，通过迈克尔加成反应，白杨素被接枝在重组胶原蛋白上，使得交联重组胶原蛋白海绵覆盖于伤口后可随着胶原蛋白的降解缓释出白杨素，降低促炎因子和炎症介质的产生，进一步促进创面的愈合。
附图说明
图1为实施例5和对比例9的白杨素体外累积释放曲线。
图2为实施例5和对比例2的大鼠损伤部位图。
图3为不同时间点植入实施例5、对比例2和对比例9的样品后的创面组织中的IL-6和TNF-α的含量图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
将0.7g重组胶原蛋白和0.01g的白杨素溶于10g浓度为2.5mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为11的预混液。再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为70℃，反应时间为8h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀0.5h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗24h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
实施例2
将1.5g重组胶原蛋白和0.3g的白杨素溶于10g浓度为0.04mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为10的预混液。再将0.0944g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为85℃，反应时间为8h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀0.5h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗24h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
实施例3
将1g重组胶原蛋白和0.05g的白杨素溶于10g浓度为2.5mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为11的预混液。再将0.11g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为2h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀0.5h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗24h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
实施例4
将1g重组胶原蛋白和0.2g的白杨素溶于10g浓度为0.04mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为10的预混液。再将0.168g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为55℃，反应时间为24h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀0.5h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗24h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
实施例5
将1g重组胶原蛋白和0.3g的白杨素溶于10g浓度为0.05mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为10.5的预混液，再将0.113g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为16h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀0.5h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗24h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
实施例6
将1g重组胶原蛋白和0.5g的白杨素溶于10g浓度为2.5mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为11的预混液，再将0.23g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为16h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀0.2h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗48h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
实施例7
将1g重组胶原蛋白和0.2g的白杨素溶于10g浓度为5mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为11.7的预混液，再将0.448g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为55℃，反应时间为24h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀24h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗4h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
实施例8
将1.2g重组胶原蛋白和0.4g的白杨素溶于10g浓度为12.5mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为12的预混液，再将0.23g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为70℃，反应时间为24h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀0.5h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗24h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
实施例9
将0.9g重组胶原蛋白和0.05g的白杨素溶于10g浓度为100mmol/L的氢氧化钠溶液中混合均匀得pH值为13的预混液，再将0.3g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为80℃，反应时间为4h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶。将交联重组胶原蛋白水凝胶置于纯化水中溶胀4h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第一次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品。将交联重组胶原蛋白海绵半成品置于纯化水中，清洗4h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行第二次预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
对比例1
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，重组胶原蛋白的加入量为0.2g。
对比例2
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，未加入白杨素。
对比例3
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，pH为8。
对比例4
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，反应温度为40℃。
对比例5
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，交联剂的加入量为0.002g。
对比例6
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，反应时间为1h。
对比例7
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，溶胀时间为0h。
对比例8
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，清洗时间为2h。
对比例9
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，在溶胀时加入白杨素。
对比例10
按照实施例5的方法制备交联重组胶原蛋白海绵，不同之处在于，仅进行第一次真空冷冻干燥。
性能测试1
按照YY/T 0962-2014(胶原蛋白海绵)的液体吸收性试验，取质量约为20mg的试样，精密称量，记为m1。将试样浸入盛有20℃±1℃水的烧杯中，用手指轻揉直至完全浸湿，且所有空气被除去，注意不使破损，待吸足水分后，用小镊子轻轻夹住一角将其从水中取出，轻持镊子在水面上排水1min后，再次称量，记为m2，按下式计算其吸水倍数。共随机抽取试样5份，以平均值报告吸水倍数。
式中：A：试样吸水倍数；m1：试样浸湿前的质量，单位为克(g)；m2：试样浸湿后的质量，单位为克(g)，结果如表1所示。按照YY/T 0962-2014(胶原蛋白海绵)规定胶原蛋白海绵的液体吸收性，应不少于自身重量的20倍。由表1可知，对比例1相比于实施例，重组胶原蛋白的加入量可影响交联反应的程度，进而影响交联重组胶原蛋白海绵的液体吸收性；同理，对比例3改变交联反应的PH值、对比例4改变交联反应的温度、对比例5改变交联剂的加入量、对比例6改变交联反应的时间均影响交联反应的程度，进而影响交联重组胶原蛋白海绵的液体吸收性能；对比例9说明白杨素的加入时间点，对交联重组胶原蛋白海绵的液体吸收性无显著性影响；对比例10说明，仅进行一次真空冷冻干燥，影响交联重组胶原蛋白海绵的液体吸收性。
性能测试2
按照YY/T 0962-2014(胶原蛋白海绵)的抗拉性能试验，取交联胶原蛋白海绵剪成1cm宽的条状试样，一端固定，另一施加0.5N的拉力，维持1min，观察并报告试样是否断裂，结果如表1所示。按照YY/T 0962-2014(胶原蛋白海绵)的规定，胶原蛋白海绵应在0.5N拉力的作用下，维持1min不断裂。由表1可知，相比于实施例，对比例1重组胶原蛋白的含量影响交联反应的程度，进而影响交联重组胶原蛋白海绵的力学性能；同理，对比例3改变交联反应的PH值、对比例4改变交联反应的温度、对比例5改变交联剂的加入量、对比例6改变交联反应的时间均影响交联反应的程度，进而影响交联重组胶原蛋白海绵的力学性能。对比例2说明白杨素的加入对交联重组胶原蛋白海绵的力学性能无显著性的影响。对比例10说明仅进行第一次冷冻干燥，影响交联重组胶原蛋白海绵的力学性能。
性能测试3
按照YY/T 0962-2014(整形手术用交联透明质酸钠凝胶)附录F交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油基醚(BDDE)的残留量测定的酶标法对实施例和对比例的BDDE残留量测定，结果如表1所示。根据YY/T 0962-2014(整形手术用交联透明质酸钠凝胶)的要求，BDDE的残留量应不高于2μg/g。由表1可知，相比于实施例，对比例6说明交联反应的时间，对于BDDE的残留量有显著的影响；对比例7说明未溶胀，不利于去除BDDE残留；对比例10说明，仅进行第一次真空冷冻干燥，不利于去除BDDE残留量。
表1各样品的液体吸收性、抗拉性和交联剂残留
性能测试4
将实施例5和对比例9的交联重组胶原蛋白海绵辐照灭菌后，分别放入20ml无菌的PBS溶液中，置于37℃摇床中，设定转速为60r/min，每隔一定的时间更换缓冲液，用紫外分光光度计测定吸光度值。记录实验数据，并根据实验数据计算缓冲溶液中的药物浓度，然后计算累积释放的百分率，具体结果如图1所示。从图1可以看出，对比例9的交联重组胶原蛋白海绵中的白杨素在第6天时就已经完全释放，而实施例5的交联重组胶原蛋白海绵持续缓慢释放白杨素，在第12天才完全释放，表明相比于在交联重组胶原蛋白水凝胶溶胀时直接加入白杨素相比，实施例在交联前将白杨素与重组胶原蛋白混合，白杨素能够通过迈克尔加成反应，接枝在重组胶原蛋白上，可显著提高白杨素的缓释时间。
性能测试5
各组SD大鼠麻醉后，去除背部毛发，碘伏消毒，铺巾，暴露术部位置，将其背部(术部)切取2*2cm大小的皮肤缺损，全层皮肤切除。切除后将各组相对应材料裁剪成合适缺损处大小尺寸规格，用1-0丝线将相应材料缝合于皮肤缺损处，一共8针。材料缝合完成后，使用二级敷料覆盖材料并缝合(二级敷料多出伤口边缘5-8mm)，术毕。造模后的大鼠分别于造模后的0天、3天、7天、14天和21天，使用游标卡尺测量伤口大小，同时拍照。采集到的0天、3天、7天、14天和21天实施例5和对比例2机械损伤部位的照片如图2所示。从图2可以看出，添加白杨素的交联重组胶原蛋白海绵对创面的修复速度更快。
性能测试6
分别切取0天、3天、7天、14天和21天实施例5、对比例2和对比例9的创面组织标本，按10mg/0.5ml比例加入冰生理盐水，用组织匀浆器进行匀浆15min左右，至组织液体呈均匀一致的悬浊液，置入EP管中备用，以3000r/min转速离心15min后吸出上清液备用。添加标准品：按试剂盒的说明操作。上样：依次往标准孔、待测样品孔、空白孔依次加入100μl的标准品或待测样品组。温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。洗涤：倒去孔内液体后每孔加满洗涤液，浸泡1min后倒去，如此重复5次。显色：往每孔中加入100μl显色剂，置于37℃中避光显色10-15分钟。终止：每孔加终止液50μl，终止反应。测定：15分钟内用450nm波长测量各孔的吸光度(OD值)。计算：根据待测样品OD值，由标准曲线计算出样品TNF-α、IL-6的实际浓度，结果如图3所示。从图中可以看出，相比于对比例2，加入白杨素的实施例5和对比例9的损伤部位组织的IL-6、TNF-α水平均下降，说明白杨素的加入可以减轻皮肤组织的炎症反应。其中，实施例5相比于对比例9降低更明显，说明白杨素通过迈克尔加成反应被接枝在重组胶原蛋白上，相比于物理吸附于交联重组胶原蛋白海绵内，可以更有效减轻皮肤组织的炎症反应。
Claims (11)
1.交联重组胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将重组胶原蛋白和白杨素粉末溶于碱性溶液中，得到pH值为10~13的预混液，其中重组胶原蛋白质量为碱性溶液质量的7wt%~15wt%，白杨素粉末质量为碱性溶液质量的0.1wt%~5wt%，重组胶原蛋白由保藏编号为CGMCC No.5021的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris发酵所产生；碱性溶液为氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液；
（2）将交联剂加入预混液中，混合均匀后得到混合溶液；
（3）将混合溶液在55~85℃下水浴加热，进行交联反应2~24h，得到交联重组胶原蛋白水凝胶；
（4）将交联重组胶原蛋白水凝胶置于水中溶胀0.2~24h；
（5）将溶胀的交联重组胶原蛋白水凝胶置于真空冷冻干燥机中进行预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵半成品；
（6）将第一次冷冻干燥的交联重组胶原蛋白海绵置于水中进行搅拌清洗4~48h，再将其置于真空冷冻干燥机中进行预冻和冷冻干燥，得到交联重组胶原蛋白海绵。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，氢氧化钠溶液的浓度为0.04mmol/L~100mmol/L；重组胶原蛋白质量为碱性溶液质量的9wt%~12wt%；白杨素粉末质量为碱性溶液质量的0.5wt%~4wt%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，氢氧化钠溶液的浓度为0.04mmol/L~12.5mmol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，预混液的pH值为10~12。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，交联剂选自1,4-丁二醇二环氧甘油醚、3-氯-1,2-环氧丙烷、1,3-二环氧丁烷、碳化二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，1,4-丁二醇二环氧甘油醚质量为预混液质量的0.8wt%~4wt%。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，1,4-丁二醇二环氧甘油醚质量为预混液质量的1wt%~2wt%。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，水浴加热温度为60~70℃，交联反应时间为8~16h。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，水为纯化水或注射用水，溶胀时间为0.5~8h；步骤（6）中，水为纯化水或注射用水，清洗时间为8~24h。
10.根据权利要求1至9任一所述的制备方法制得的交联重组胶原蛋白海绵。
11.根据权利要求10所述的交联重组胶原蛋白海绵在制备创面修复材料中的应用。
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