CN115639356A - 十二烷二酸或其盐在诊断或治疗老年衰弱相关疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了十二烷二酸或其盐在诊断或治疗老年衰弱相关疾病中的应用。本发明的标志物从代谢物角度评估老年衰弱的发病风险，结果精确客观可靠，能够在衰弱前期即做出老年人发生衰弱的风险预测，并仅需提供血样、粪便样本即可，极大提高了临床应用的可能性与可行性，为早期诊断和干预老年衰弱发生提供依据。

Description

十二烷二酸或其盐在诊断或治疗老年衰弱相关疾病中的应用

技术领域

本发明属于代谢组学领域和医学领域，具体涉及十二烷二酸或其盐在诊断或治疗老年衰弱相关疾病中的应用。

背景技术

老年衰弱是一种老年性多维临床综合征，其特征是随着年龄增加和一系列的衰老过程，机体退行性改变导致个体生理储备减少和对内源性、外源性应激的易感性增加，抗打击能力显著下降。研究显示，老年衰弱的发生率通常在10％至20％之间，其中65岁以上老年人发生率为7-15％，80岁以上老年人衰弱比例高于20％，90岁以上老年人的比例则高达30-40％。而且，由于全球预期寿命的逐步延长以及老年人的数量的逐渐增加，其总体负担将成倍增加。据估计，到2050年，全球将有2.94亿衰弱病例，高于预期癌症病例数10倍以上。衰弱是老年人失能的前兆，是介于生活自理和死亡前的中间阶段，极易发生跌倒、失能、急性病、住院、医源性问题以及死亡等临床事件。与非衰弱的老年人比较，衰弱老年人平均死亡风险增加15-50％，给医疗保健和社会系统带来了沉重的负担。

临床目前仅能通过评估工具来识别衰弱，其中老年衰弱表型评估(PhysicalFrailty Phenotype，PFP)是最常用的评估量表之一，包括以下五个方面：1)一年内体重减轻＞3kg或5％(非有意识减重)；2)自觉疲惫，上一周内超过3天；3)肌力下降：握力＜28kg(男性)，＜18kg(女性)；4)躯体功能下降：步速减慢(4米行走时间，男性≥5秒，女性≥6.7秒)；5)活动量减少(男性＜383kcal/周，女性＜270kcal/周)。老年人在上述五项中的一项或两项被认为衰弱前期，具备三项及以上被认为存在老年衰弱。然而，衰弱是一个由生理型向临床表型转变的连续动态过程，衰弱表型的异质性、个体严重程度的波动性以及其病理生理涉及到的多系统性成为了临床上全面评价该状态最主要的障碍。无论选择哪种特定的评估工具，现有的衰弱临床诊断都依赖于二分类判断(即：是否存在缺陷，是否有能力执行任务等)，因而无法发现衰弱早期、细微的病理改变。若能在衰弱早期尽早识别并加强干预就可有效逆转衰弱。因此，我们迫切需要确定新的更有用的生物标志物，以帮助衰弱的早期诊断、精确治疗以及预后评估。

衰弱也被称为“加速衰老”，具有复杂的病理生理学基础，例如DNA损伤、基因和非编码RNA表达的改变、蛋白稳态丧失、氧化应激和染色质破坏等。在这种情况下，多组学平台(例如基因组学，转录组学，蛋白质组学，代谢组学)已经开发出功能强大的工具来分析衰弱。越来越多的证据表明，衰老的所有病理基础都会导致不良的代谢反应，并且存在控制衰老的“代谢时钟”(metabolic clock)。因此，为了更好地理解衰弱过程的多维性，考虑到衰弱与代谢紊乱之间的紧密联系，代谢组学作为一种能够无创地识别和量化生物基质(细胞，组织和生物体液)中所有小分子代谢物的组学技术引起了人们极大的兴趣。代谢组学是一种强大的表型分析工具，为在环境影响下探索基因型-表型相互作用提供了机会。此外，作为其他组学技术的下游，代谢组学可以比基因组学或蛋白质组学更全面地动态评估机体功能的变化。代谢组学技术还具有以下优势：1)有利于获得受疾病和/或治疗影响的通路的代谢标记；2)提供复杂过程的直接输入和输出，而不是基于单个代谢物的测定；3)支持识别用于患者分层的相关代谢变化。Masahiro Kameda等基于代谢组学分析，已经确定了乙酰肌肽、UDP-葡萄糖醛酸等15个衰弱相关代谢物。因此，代谢组学已被证明是寻找代谢改变的生物标志物的有力工具。代谢组学分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向代谢组学主要是无偏向地检测样本中所有能检测到的代谢物分子，并通过生物信息学方法进行差异分析和通路分析，寻找生物标志物，初步建立模型的组学方法。靶向代谢组学则是针对特定的代谢物进行检测，由于其使用了标准品，因此可以实现代谢物的绝对定量。两者联合可应用于差异代谢物的发现和精准定量，为筛选并确定代谢物作为疾病生物标志物的研究提供方法及奠定基础。

生物标志物是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标。可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。内源性化合物作为人体内产生和发现的一类化合物，除了可以应用于药物发现方面，也可以用做于疾病的标志物。人体内包括脂肪、糖、氨基酸等在内的各种底物以及代谢过程中生成的小分子化合物能够为了解机体健康状态提供重要信息。其中对脂肪代谢的研究多集中于长、短链脂肪酸，而对于中链脂肪酸的研究很少。例如膳食纤维的肠道微生物代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，已被证实不仅调节肠上皮功能，也作用于其他重要脏器，在糖尿病、心脑血管疾病中起重要作用。中链脂肪酸(MCFAs)是指含有6～12个碳原子的饱和脂肪酸，它是自然界中含量较少的脂肪酸，主要来源于母乳、牛奶及其制品、棕榈仁油和椰子油等。代表性的MCFAs有：己酸(6C)，辛酸(8C)，癸酸(10C)和月桂酸(12C)。由于MCFAs具有较高的水溶性，经肠道吸收后直接到达重要脏器的线粒体，被线粒体利用并快速供能，也可被线粒体所代谢，产生的部分代谢物为二羧酸。MCFAs及其代谢物的生物学功能包括降低脂肪沉积、提高胰岛素敏感性、抑菌等。

因此，代谢组学在发现生物标志物以及疾病的早期诊断方面有明显优势，然而由于技术相对复杂，并且代谢物种类繁多，筛选工作十分巨大，目前为止关于老年衰弱诊治方面的血清及粪便代谢物的发现在国内鲜有报道。

发明内容

发明目的：针对现有临床诊断上的不确定性，由于肠道在物质吸收和代谢物产生中的重要作用，本发明基于非靶向代谢组学筛查与老年衰弱相关的血清和粪便代谢物，进一步基于靶向代谢组学对代谢物进行验证，将得到的代谢物用于老年衰弱的临床诊断。本发明所要解决的技术问题是提供了十二烷二酸或其盐在在制备诊断老年衰弱及其相关疾病的试剂或试剂盒方面的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了十二烷二酸或其盐在在制备预防或治疗老年衰弱及其相关疾病的药物中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种老年衰弱及其相关疾病的诊断试剂盒。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了十二烷二酸或其盐在在制备诊断老年衰弱及其相关疾病的试剂或试剂盒方面的应用。

本发明内容还包括十二烷二酸或其盐在在制备预防或治疗老年衰弱及其相关疾病的药物中的应用。

本发明所述的十二烷二酸也可以是十二烷二酸的盐类物质，或十二烷二酸的衍生物，其只要包括该十二烷二酸的结构均在本发明的保护范围之内。

其中，所述十二烷二酸来源于血清或/和粪便代谢物。选择的血清和粪便检测均为无创、非侵入的，可准确、方便的为临床医生制定早期诊断和干预方案提供依据。

其中，所述应用包括通过非靶向代谢组学技术筛选出衰弱老年人与非衰弱老年人之间的血清或/和粪便差异代谢物，经过靶向代谢组学的进一步验证，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度筛选得到衰弱老年人与非衰弱老年人之间的血清或/和粪便差异代谢物。

其中，所述差异代谢物为血清或/和粪便中的十二烷二酸，十二烷二酸是一种二羧酸，是中链脂肪酸月桂酸的ω氧化产物。

本发明内容还包括一种老年衰弱及其相关疾病的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括十二烷二酸。

其中，所述诊断试剂盒还包括阴性对照品。

本发明内容还包括一种与老年衰弱诊断相关的血清和粪便代谢标志物的筛选方法，包括以下步骤：先通过非靶向代谢组学技术筛选出衰弱老年人与非衰弱老年人之间的血清和粪便差异代谢物，经过靶向代谢组学的进一步验证，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度筛选得到衰弱老年人与非衰弱老年人之间的血清和粪便差异代谢物。

有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明基于非靶向代谢组学技术筛选出衰弱老年人与非衰弱老年人之间的血清和粪便差异代谢物，经过靶向代谢组学的进一步验证，获得衰弱老年人与非衰弱老年人之间的差异代谢物十二烷二酸。非靶向代谢组学定性及靶向代谢组学定量的特征相结合，获得的疾病诊断差异代谢物的准确性、灵敏度和特异性大大提高。此外，血清和粪便样本的获取是微创、简便易行的。本发明的生物标志物十二烷二酸从微观代谢物角度诊断老年衰弱，结果精确客观可靠，不仅能够诊断老年衰弱，还可以很好地反映老年衰弱的程度；而且仅需提供血样、粪便样本即可进行，无需其他组织样本，操作简便，显著提高了临床应用的可能性与可行性，为临床医生早期准确诊断和提供早期干预方案提供参考依据。

附图说明

图1、非衰弱和衰弱组老年人血清代谢物正负离子模式下的PLS-DA图；

图2、非衰弱和衰弱组老年人粪便代谢物正负离子模式下的PLS-DA图；

图3、非衰弱和衰弱组老年人血清代谢物分类饼图；

图4、非衰弱和衰弱组老年人粪便代谢物分类饼图；

图5、非衰弱和衰弱组老年人血清代谢物正负离子模式下通路富集图；

图6、非衰弱和衰弱组老年人粪便代谢物正负离子模式下通路富集图；

图7、非靶向代谢组学检测血清十二烷二酸的箱线图；

图8、非靶向代谢组学检测粪便十二烷二酸的箱线图；

图9、非靶向代谢组学检测血清十二烷二酸与老年衰弱表型评估(PFP)得分之间的Spearman相关性分析图；

图10、非靶向代谢组学检测粪便十二烷二酸与老年衰弱表型评估(PFP)得分之间的Spearman相关性分析图；

图11、靶向代谢组学检测血清十二烷二酸MRM图；

图12、靶向代谢组学检测血清十二烷二酸的标准曲线图及方程；

图13、靶向代谢组学检测血清十二烷二酸的箱线图；

图14、靶向代谢组学检测血清十二烷二酸与老年衰弱表型评估(PFP)得分之间的Spearman相关性分析图；

图15、用于老年衰弱诊断的血清十二烷二酸的ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1：

1.试验材料：Waters 2D UPLC(waters，USA)串联Q Exactive高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)；AB SCIEX 6500液压质谱仪；色谱柱：ACQUITY UPLCBEH C18(1.7μm，2.1*100mm，Waters，USA)；低温高速离心机(Centrifuge 5430，Eppendorf)；涡旋仪(QL-901，其林贝尔仪器制造有限公司，中国)；纯水仪(Milli-QIntegral，Millipore Corporation，USA)；冷冻真空浓缩仪(Maxi Vacbeta，GENECOMPANY)。内标：L-亮氨酸-D3，L-苯丙氨酸，L-色氨酸-D5，孕酮-(2，3，4-13C3)。甲醇(A454-4)、乙腈(A996-4)均为LCMS级别(Thermo Fisher Scientific，USA)；甲酸氨(17843-250G，Honeywell Fluka，USA)，甲酸(50144-50ml，DIMKA，USA)，水由纯水仪提供。

2.样本收集和样本资料整理：

本发明共计使用老年人血清样本54例，粪便样本15例。在非靶向代谢组学部分中，非衰弱、衰弱前期和衰弱老年人样本各5例，包括血清和粪便，平均年龄83.2±3.9岁；靶向代谢组学部分中，非衰弱15例，衰弱前期12例，衰弱12例，平均年龄83.4±3.6岁。患者在入院后第二天行老年衰弱评估，采用老年衰弱表型评估(Physical Frailty Phenotype，PFP)量表，包括以下五个方面：1)一年内体重减轻＞3kg或5％(非有意识减重)；2)自觉疲惫，上一周内超过3天；3)肌力下降：握力＜28kg(男性)，＜18kg(女性)；4)躯体功能下降：步速减慢(4米行走时间，男性≥5秒，女性≥6.7秒)；5)活动量减少(男性＜383kcal/周，女性＜270kcal/周)。五项中的具备一项或两项(1分或2分)被认为衰弱前期；具备三项及以上(3分，4分或5分)被认为存在老年衰弱；0分为非衰弱。

3.样本准备

以上选择的非衰弱、筛弱前期和筛弱老年人样本中待他们空腹10小时后抽取3ml血液样本至不含抗凝剂的试管中，3000rpm，4℃离心10min，收集血清样本，至-80℃冰箱保存。使用Commode标本收集系统(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)收集粪便样本，立即在液氮中冷冻，然后在-80℃下储存。

非靶向代谢组样本准备：

1)-80℃取出血清样本(非衰弱、衰弱前期和衰弱老年人样本各5例，共15例)，在4℃条件下缓慢解冻后，取100μL置于96孔板中，加入300μL提取液(甲醇∶ACN＝2∶1，v∶v，-20℃预冷)+10μL内标[L-亮氨酸-D3，L-苯丙氨酸，L-色氨酸-D5，孕酮-(2，3，4-13C3)]，涡旋混匀1min，-20℃静置2h后，14000rpm，4℃离心20min。离心后取300μL上清，置于冷冻真空浓缩仪抽干后，加入150μL复溶液(甲醇∶H₂O＝1∶1，v∶v)进行复溶，涡旋震荡1min，14000rpm，4℃离心30min，取上清置于上样瓶中。每个样本的上清液各取10μL混合成QC质控样本，用于评估LC-MS分析过程的重复性和稳定性。

2)-80℃取出粪便样本(非衰弱、衰弱前期和衰弱老年人样本各5例，共15例)，在4℃条件下缓慢解冻后，称取25mg置于1.5mL Eppendorf管中，加入800μL提取液(甲醇∶乙腈∶水＝2∶2∶1，v∶v∶v，-20℃预冷)+10μL内标，加入两颗小钢珠，放入组织研磨仪中进行研磨(50Hz，5min)，4℃水浴超声10min后，-20℃冰箱静置1h。25000rpm，4℃离心15min。离心后取600μL上清，置于冷冻真空浓缩仪抽干后，加入600μL复溶液(甲醇∶H₂O＝1∶9，v∶v)进行复溶，涡旋震荡1min，4℃水浴超声10min后，25000rpm，4℃离心15min，取上清置于上样瓶中。每个样本的上清液各取50μL混合成QC质控样本，用于评估LC-MS分析过程的重复性和稳定性。

靶向代谢组样本准备：

1)取100μL血清样本(非衰弱15例，衰弱前期12例，衰弱12例，共39例)加入300μL预冷甲醇，涡旋5min，-20℃沉淀4h，14000rpm，4℃离心15min，取上清。

2)标准品制备：标准品十二烷二酸取1mg，加入1ml甲醇溶液溶解配制储备溶液；再通过甲醇稀释储备溶液，获得相应的工作溶液0，5，20，50，100，200ng/mL。将血清样本与标准品上机进行靶向代谢组分析。

4.非靶向代谢组条件设置：采用Waters 2D UPLC(waters，USA)串联Q Exactive高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)进行代谢物的分离和检测。

色谱条件：使用的色谱柱为BEH C18色谱柱(1.7μm 2.1*100mm，Waters，USA)。正离子模式流动相为含0.1％甲酸的水溶液(A液)和含0.1％甲酸的100％甲醇(B液)，负离子模式流动相为含10mM甲酸氨的水溶液(A液)和含10mM甲酸氨的95％甲醇(B液)。采用以下梯度进行洗脱：0～1min，2％B液；1～9min，2％～98％B液；9～12min，98％B液；12～12.1min，98％B液～2％B液；12.1～15min，2％B液。流速为0.35mL/min，柱温45℃，进样量为5μL。

质谱条件：利用Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)进行一级、二级质谱数据采集。质谱扫描质核比范围为70～1050，一级分辨率为70000，AGC为3e6，最大注入时间(IT，injection time)为100ms。按照母离子强度，选择Top3进行碎裂，采集二级信息，二级分辨率为17500，AGC为1e5，最大注入时间(IT，injection time)为50ms，碎裂能量(stepped nee)设置为：20，40，60eV。离子源(ESI)参数设置：鞘气流速(Sheath gas flowrate)为40，辅助气流速(Aux gas flow rate)为10，喷雾电压[Spray voltage(|KV|)]正离子模式为3.80，负离子模式为3.20，离子传输管温度(Capillary temp)为320℃，辅助气加热温度(Aux gas heater temp)为350℃。

仪器检测时，为了提供更加可靠的实验结果，对样本进行随机排序，从而减少系统误差。每10个样本穿插一个QC样本。

5.非靶向代谢组数据处理分析

提取原始LC-MS数据经Proteo Wizard转换成mzXML格式。然后采用XCMS程序进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积。采用多元统计分析(偏最小二乘法-判别分析，PLS-DA)建立代谢物与样品组之间的关系模型(图1-2)。单变量方法(Wilcoxon检验和双尾t检验)用于检测显著变化的代谢物，然后通过错误发现率(FDR)进行校正，以确保可重现地检测到代谢物峰。基于来自7倍交叉验证的PLS-DA模型的投影可变重要性(VIP)阈值1，获得导致组间代谢谱扫描差异的代谢物。结合单变量和多变量统计分析，在p值＜0.05、q值＜0.05，倍数变化＜0.8或＞1.2，VIP＞1的条件下获得组间显著变化的代谢物并进行注释和分类(图3-4)。

利用KEGG数据库了解差异代谢物的功能特征，确定代谢物所涉及的主要生化代谢途径和信号转导途径。在差异代谢物的通路富集分析中，将显著不同的代谢物与总体鉴定的代谢物进行比较作为背景，并使用超几何检验来寻找显着富集的通路条目。差异代谢物显着富集了p值＜0.05的代谢途径(图5-6)。

经上述统计分析后获得的血清和粪便差异代谢物(分别是156个和462个)进行Spearman相关性分析，筛选出p＜0.05and|r|＞0.6的代谢物，再与老年衰弱表型评估(Physical FrailtyPhenotype，PFP)得分(分别为0，1，2，3，4，5分)进行Spearman相关性分析，获得血清和粪便差异代谢物十二烷二酸(图7-10)。

6.靶向代谢组条件设置

检测平台为Waters Iclass-AB Sciex 6500液质串联分析，色谱柱为ACQUITY

RBEH C18(型号：1.7μm*2.1*50mm)。流动相A为超纯水+0.1％甲酸，流动相B为乙腈+0.1％甲酸；流速：0.5mL/min；梯度设置如下：

扫描模式为MRM模式(Multi Reaction Monitoring，多反应检测扫描)。MRM是基于目标化合物已知或假定的信息设定质谱检测参数，对目标离子进行信号记录，去除大量非目标离子信号的干扰，从而得到质谱信息的一种数据获取方式。所检测十二烷二酸的MRM色谱图见图11。采用负模式采集数据，以十二烷二酸标准品的浓度为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。标曲方程：y＝6.61099e4 x+3.91643e4(r＝0.99894)(图12)。

7.靶向代谢组数据处理与分析

采用GraphPadPrism8统计软件对导出的数据进行录入及处理，采用t检验分析差异代谢物(图13)。采用Spearman相关性分析对血清十二烷二酸浓度与老年衰弱表型评估(Physical Frailty Phenotype，PFP)得分(分别为0，1，2，3，4，5分)进行相关性分析(图14)。绘制ROC曲线(Receiver Operating Curve)，计算AUC(Area Under the ROC Curve)分析血清十二烷二酸诊断老年衰弱的特异性和灵敏度。为了达到早期诊断及干预的目的，以84.2％将PFP得分为0的老年人(非衰弱)和得分≥1的老年人(衰弱前期和衰弱)分开，最佳临界点十二烷二酸浓度为18.54ng/mL，其灵敏度为93.3％，特异度为66.7％。

Claims (7)

1.十二烷二酸或其盐在制备诊断老年衰弱及其相关疾病的试剂或试剂盒方面的应用。

2.十二烷二酸或其盐在制备预防或治疗老年衰弱及其相关疾病的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述十二烷二酸来源于血清或/和粪便代谢物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括通过非靶向代谢组学技术筛选出衰弱老年人与非衰弱老年人之间的血清或/和粪便差异代谢物，经过靶向代谢组学的进一步验证，根据代谢物的特异性、灵敏度和准确度筛选得到衰弱老年人与非衰弱老年人之间的血清或/和粪便差异代谢物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述差异代谢物为血清或/和粪便中的十二烷二酸。

6.一种老年衰弱及其相关疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包括十二烷二酸。

7.根据权利要求6所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括阴性对照品。

Images