CN115607568A - 二硫化铌纳米片的合成方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种二硫化铌纳米片的合成方法及其应用，具体的具有热疗的二维二硫化铌纳米片用于根除细菌和生物膜以促进感染伤口愈合的应用，属于过渡金属二硫属化物纳米片抗菌研究领域，通过高温还原反应制备了具有良好生物稳定性和高生物相容性的二维二硫化铌纳米片，其表现出优异且稳定的光热特性，能够在808nm的激光照射下5分钟杀死绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌，此外，二硫化铌纳米片在近红外激光照射下抑制生物膜的形成并迅速根除感染伤口中的金黄色葡萄球菌促进伤口愈合，该二硫化铌纳米片有良好的抗菌材料应用前景。

Description

二硫化铌纳米片的合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及抗菌生物活性领域，尤其是涉及过渡金属硫化物对金黄色葡萄球菌抑菌效果研究，具体涉及一种二硫化铌纳米片的合成方法及应用。
背景技术
细菌感染被认为是一个全球性的公共卫生问题，全世界每年约有170亿人成为此类感染的受害者。随着抗菌药物在临床上的广泛使用，使得菌株对药物出现不同程度的耐药性，导致许多种类的抗菌药物已经不能满足临床治疗需求，给治疗带来很大困扰。与此同时，相关监管机构批准的新型抗生素数量一直在下降，因此开发一种不易产生耐药性的新型抗菌药物迫在眉睫。
过渡金属硫化物(TMDs)是一组化学式为MX 2的层状化合物,其中M是周期表第4至10组(通常是Mo,W等)中的过渡金属元素,X是硫属元素(S,Se,或Te),TMDs在结构上类似于石墨烯。现有研究发现MoS2有作为抗菌剂的应用前景。MoS2纳米片特有的层状结构因具有超高比表面积及大量活性位点,在光催化及其抗菌领域中具有广阔应用潜力。如专利号为CN105948124B所记载的，一种纳米硫化钼抗菌材料及其合成方法、应用，纳米硫化钼抗菌材料在拟酶催化过氧化氢联合近红外光热协同抗菌中的应用。
但是目前研究中对其他过渡金属硫化物材料的抗菌活性并没有深入研究。
因此本发明的目的在于，寻找一种新的具有优异抗菌活性的过渡金属硫化物纳米材料，拓展作为抗菌药物的过渡金属硫化物纳米材料的种类，以解决现有技术中抗菌药物耐药性的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种二硫化铌纳米片的新用途以及其合成方法，还提供一种基于二硫化铌纳米片的抗菌组合体系。
为实现上述发明目的，
本发明提供一种二硫化铌纳米片在制备抗菌药物的应用。
进一步地，所述二硫化铌纳米片为单层或者少层的二维纳米片，所述少层为2-10层片层状二维纳米片。
进一步地，所述二硫化铌纳米片联合NIR光热组合体系在制备抗菌药物中的应用。
进一步地，所述抗菌药物为抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌生长的药物。
进一步地，所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的药物。
进一步地，所述二硫化铌纳米片在制备细菌生物膜抑制剂的用途。
进一步地，所述二硫化铌纳米片在制备治疗金黄色葡萄球菌感染脓肿药物的用途。
本发明具体提供一种二硫化铌纳米片联合近红外光热的协同纳米抗菌组合体系，包括二硫化铌纳米片及近红外激光器。
进一步地，所述二硫化铌纳米片为单层或者少层的二维纳米片，所述少层为2-10层片层状二维纳米片。
进一步地，所述二硫化铌纳米片的溶液浓度为200-300μg·mL-1，所述近红外激光器为近红外功率密度为2W·cm-2，进行3－10分钟光照。
本发明还提供一种二硫化铌纳米片的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
五氯化铌和油胺混合在100℃的氩气气氛下保持30分钟以除去氧气，当溶液变得透明澄清时，迅速加热到300℃，然后在300℃下将二硫化碳(5mmol)缓慢注入溶液中3小时，反应结束后，加入正丁醇，离心得到黑色沉淀，用己烷和乙醇洗涤数次，然后干燥，在氩气氛下在管式炉中在200℃下退火3小时后，获得最终产品。
本发明具有如下优点：
本发明合成了一种具有生物活性的二硫化铌纳米片，该纳米片具有独特二维平面结构，有大的比表面积，良好的光学和电子性能。单层二维材料的表面原子几乎完全裸露，相比于体相材料，原子利用率大大提高。发现二硫化铌纳米片对革兰阳性菌和革兰阴性菌具有很好的抑制效果。本发明证实了二硫化铌纳米片具有良好的光热效应。利用二硫化铌纳米片的具有良好的光热效应，能联用光热治疗手段，也就是近红外光线照射条件下，通过将光能转化成热能，从而杀死细菌。并且本发明通过研究二硫化铌纳米片的光热效应，选择最优的浓度和激光强度，使得局部升温的温度不会过高，避免了现有技术部分具有光热效应的纳米材料升温过高损伤感染周围的正常组织。本发明提供的二硫化铌纳米片物理特性的治疗机制使其在治疗细菌感染时可以避免耐药性的产生。
在测试材料抗菌活性中，发现其对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌及其生物膜有显著的清除效果。本发明还通过活体实验来进一步研究了二硫化铌纳米片对金黄色葡萄球菌的灭菌活性，发现其能有效促进小鼠皮下脓肿的愈合，对细菌感染的小鼠皮下脓肿模型有很好的促进修复功能，同时具有良好的生物安全性。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1为实施例1中二硫化铌纳米片的合成模式图；
图2A为实施例2中二硫化铌纳米片微观照片图，图2B为二硫化铌纳米片选区电子衍射(SAED)图片，图2C为二硫化铌纳米片的高分辨率TEM(HRTEM)图像，图2D为二硫化铌纳米片的能量色散X射线(EDX)的元素映射图像，图2E为图2D箭头处的S和Nb元素映射结果图；图2F X射线光电子能谱图；
图3A为实施例3中不同浓度二硫化铌纳米片的吸收光谱图，3B为近红外光照射不同浓度的二硫化铌纳米片溶液溶液温度的变化结果统计图，3C为近红外光照射不同浓度的二硫化铌纳米片溶液溶液温度的变化热成像图，3D为不同能量密度的近红外光照射500μg/mL的二硫化铌纳米片溶液溶液温度的变化结果统计图，3E为500μg/mL的二硫化铌纳米片在近红外辐射(808nm，2W/cm2)下五个循环(每个循环中激光打开10分钟后关闭直至降至室温)下的温度曲线，3F为二硫化铌纳米片用808nm近红外激光照射后的UV-vis-NIR光谱图，3G为二硫化铌纳米片光热转换效率结果图，3H为冷却时间与-lnθ曲线；
图4A为实施例4中二硫化铌纳米片平板涂布对金黄色葡萄球菌的影响，4B为实施例4中二硫化铌纳米片以及二硫化铌纳米片+激光实验组平板涂布对金黄色葡萄球菌的影响统计结果，4C为实施例4中二硫化铌纳米片对金黄色葡萄球菌处理后的活/死染色测定荧光测定，4D为实施例4中二硫化铌纳米片以及二硫化铌纳米片+激光实验组平板涂布对金黄色葡萄球菌的形态学实验，图4E为实施例4中二硫化铌纳米片清除金黄色葡萄球菌生物膜实验，4F为实施例4中二硫化铌纳米片以及二硫化铌纳米片+激光实验组处理后金黄色葡萄球菌生物膜的量结果统计图；
图5A为小鼠皮下脓肿模型建立流程图，5B为实施例5中二硫化铌纳米片+激光实验组处理后小鼠脓肿处的温度，5C为实施例5中二硫化铌纳米片以及二硫化铌纳米片+激光实验组处理后小鼠皮下脓肿照片，5D为收集小鼠皮下脓肿处皮肤组织进行菌落计数，5E为收集小鼠皮下脓肿处皮肤组织进行菌落计数统计结果图，5F小鼠皮下脓肿相关感染面积统计结果，图5G为实施例5中二硫化铌纳米片以及二硫化铌纳米片+激光实验组处理后小鼠体重变化结果。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1二硫化铌纳米片的合成路线
二硫化铌纳米片的合成如图1所示的过程，首先称取五氯化铌(0.12g)和油胺(6.0g)并缓慢加入三颈烧瓶中，混合物在100℃的氩气气氛下保持30分钟以除去氧气，当溶液变得透明澄清时，迅速加热到300℃，然后在300℃下将适量二硫化碳(5mmol)缓慢注入溶液中3小时，反应结束后，将正丁醇加入离心机中，离心得到黑色沉淀，用己烷和乙醇洗涤数次，然后在60℃的真空烘箱中干燥，在氩气氛下在管式炉中在200℃下退火3小时后，获得最终产品并分散在水系统中。
实施例2二硫化铌纳米片的表征
制备的二硫化铌纳米片首先通过透射电子显微镜(TEM)进行表征。如图2A所示，发现了具有代表性的单层或少层结构，表明存在单层纳米片或多层堆叠的二硫化铌纳米片。选区电子衍射(SAED)图片的衍射环展示了二硫化铌纳米片多晶特性，可以单独分配到相应的平面(图2B)。从二硫化铌纳米片的高分辨率TEM(HRTEM)图像中可以看到连续的晶格条纹(图2C)，进一步验证了它们的高结晶度。二硫化铌纳米片的晶格距离测量为0.62nm，这对应于晶体的平面。能量色散X射线(EDX)的元素映射图像如图2D所示，相应的元素映射结果显示Nb和S原子均匀分布在二硫化铌纳米片中。由黄色箭头标记的区域被进一步分析并显示在图2E中，这进一步证明了Nb和S元素均匀分布在纳米片上。进行X射线光电子能谱(XPS)以更好地分析合成的二硫化铌纳米片的原子价态并进一步证明Nb元素的存在。研究和评估了Nb原子3d轨道的能级。如图2F所示，分级二硫化铌纳米片的Nb3d轨道的能级谱显示结合能分别为203.8eV和206.2eV，对应于Nb4+的3d5/2和3d3/2轨道。分别位于209.8eV和207.4eV的3d3/2和3d5/2峰表明存在Nb5+，因此，这些结果为制备二硫化铌纳米片提供了证据。
实施例3中二硫化铌纳米片的光热性能
使用美国CARY 5000分光光度计研究二硫化铌纳米片的紫外近红外吸收光谱，可以看到不同浓度(0、200、300、400和500μg/mL)的材料广泛近红外生物窗口的吸收峰(图3A)。使用不同功率(0.5、1.0和2.0W·cm-2)的808nm激光照射100μL 500μg/mL二硫化铌纳米片，然而，不同激光功率密度的结果表明，在0.5、1.0和2.0W·cm-2激光功率密度照射10分钟后，1.0W·cm-2和2.0W·cm-2激光功率密度照射10分钟后二硫化铌纳米片的温度升高到34.7℃和63.2℃(图3D)，该结果表明，激光的不同功率也会影响NbS2NSs的光热特性，并且两者呈正相关。测量不同浓度(0、200、300、400和500μg/mL)二硫化铌纳米片在激光(808nm，2W·cm-2)照射10分钟下的光热性能，500μg/mL二硫化铌纳米片温度达到63.2℃，而对照温度为33.2℃，这说明浓度的增加与光热特性成正比。研究了加热/冷却曲线以进一步评估二硫化铌纳米片的光热稳定性。在五个加热和冷却循环中(图3E)，热图像变化不大，这表明二硫化铌纳米片具有良好的光热稳定性。此外，二硫化铌纳米片用808nm近红外激光照射后的UV-vis-NIR光谱观察到吸收峰几乎没有变化，这进一步证实了二硫化铌纳米片的可持续和稳定的光热能力(图3F)。二硫化铌纳米片的光热转换效率值计算为50.5％(图3G)。因此，二硫化铌纳米片在吸收近红外辐射能量并将其转化为热能方面表现出优异的性能。
实施例4中二硫化铌纳米片抑制革兰阳性菌和革兰阳性菌以及金黄色葡萄球菌生物膜的形成
将过夜培养的金黄色葡萄球菌稀释培养至对数期，将菌稀释OD为0.05备用，加入50μL 500μg/mL二硫化铌纳米片再加入50μL稀释后的菌液，其中一组加入50μL的PBS再加入50μL稀释后的菌液作为对照。抗菌过程中使用808nm近红外激光(2W·cm-2)，照射时间为0-5分钟。然后放入37℃培养箱中培养2小时后，稀释一定倍数凃板。最后用平板细菌计数法进行抗菌性能的研究。如图4A-B所示，可见3和5分钟时候，对金黄色葡萄球菌有明显抑制效果。用荧光显微镜进一步研究了二硫化铌纳米片的抗菌作用。金黄色葡萄球菌如前处理，然后研究活/死染色测定以确认杀菌效果。用STYO-9染色时，活细菌显示绿色荧光，而用碘化丙啶(PI)染色时，死细菌显示红色荧光。未经激光照射的PBS和二硫化铌纳米片处理的细菌细胞显示出高强度的绿色荧光。相比之下，在近红外照射下用二硫化铌纳米片处理5分钟的细菌细胞表现出强烈的红色荧光(图4C)。这些结果证实了平板计数法的抗菌结果。使用透射电镜分析了处理后金黄色葡萄球菌的形态。如图4D所示，在没有近红外照射的情况下，在PBS中未观察到金黄色葡萄球菌的明显形态变化，细菌细胞保持其球形光滑且完整的细胞膜。然而，用二硫化铌纳米片在激光照射5分钟处理的金黄色葡萄球菌的细胞膜显示出极度受损和塌陷，这表明光热破坏细菌细胞膜完整性，并导致蛋白质和核酸外流，随后导致细菌死亡。
同样将过夜培养的绿脓杆菌稀释培养至对数期，将菌稀释至OD为0.05备用，加入50μL 500μg/mL二硫化铌纳米片再加入50μL稀释后的菌液，其中一组加入50μL的PBS再加入50μL稀释后的菌液作为对照。抗菌过程中使用808nm近红外激光(2W·cm-2)，照射时间为0-5分钟。然后放入37℃培养箱中培养2小时后，稀释一定倍数凃板。最后用平板细菌计数法进行抗菌性能的研究。如图4A所示，可见5分钟时候，对绿脓杆菌有明显抑制效果。
以6孔板为载体，每孔中加入1mLTSB稀释过的菌液，再加入二硫化铌纳米片溶液，实验组为808nm光照5分钟，以空TSB培养基作为对照，37℃培养72h定量测定生物膜。首先缓慢移除每孔中的培养物，然后用PBS缓冲液清洗2～3次，洗去未黏附的菌体，自然干燥后加入3mL的结晶紫染液(0.1mg/mL)进行染色20分钟，再用PBS进行缓慢冲洗，直至流出无色为止，室温静置干燥，除去多余水分，随后加入3mL体积的33％乙酸进行脱色15分钟，最后用酶标仪测定OD570的值衡量生物膜的量。结果如图4E所示，对照组染色最深，生物膜完整，而随着药物浓度的增大，结晶紫颜色越来越淡，生物膜破碎程度越来越大，表明二硫化铌纳米片在激光照射条件下可以明显抑制细菌生物膜的形成。
实施例5中二硫化铌纳米片抑制细菌生长和促进小鼠伤口修复
为了研究体内的伤口愈合活性，在小鼠中建立了金黄色葡萄球菌感染模型(图5A)。脓肿形成后，将小鼠随机分为三组，然后在照射下用磷酸盐缓冲液(PBS)(阳性对照)、50μL 500μg/mL二硫化铌纳米片和50μL 500μg/mL二硫化铌纳米片加激光照处理5分钟。对小鼠进行密切监测12天。评价不同照射时间下脓肿内二硫化铌纳米片的光热特性表明，温度在5分钟内从36.4℃升高到55.9℃，足以杀死细菌(图5B)。同时，皮下脓肿周围组织的温度没有明显升高，说明光热疗法对正常组织没有造成任何损伤。每日评估伤口修复情况，直至第12天二硫化铌纳米片加光照组小鼠背部伤口几乎完全愈合，表明二硫化铌纳米片在近红外激光照射下具有出色的杀菌效果。然而，其他两组小鼠的伤口出现严重的炎症和脓肿，表明杀菌活性低，进一步影响了伤口愈合过程(图5C和5F)。此外，脓肿菌板计数结果显示，二硫化铌纳米片加光照组的细菌几乎被杀死，而其他两组没有显着变化(图5D和5E)。此外，小鼠在治疗后体重没有显着变化(图5G)，表明具有良好的生物相容性。
综上，本发明提供了一种基于二硫化铌纳米片纳米材料不仅在体外对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性，还能在体内有效地杀死金黄色葡萄球菌并促进金黄色葡萄球菌感染的动物皮肤伤口愈合；本发明提供的基于二硫化铌纳米片纳米材料是一种非抗生素材料，而且具有优良的生物相容性，其能够解决抗生素滥用带来的细菌耐药问题，在制备仿生材料和抗菌药物中具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种二硫化铌纳米片在制备抗菌药物的应用。
2.一种二硫化铌纳米片在制备抗菌药物的应用，其特征在于：所述二硫化铌纳米片为单层或者少层的二维纳米片，所述少层为2-10层片层状二维纳米片。
3.根据权利要求2所述的二硫化铌纳米片的应用，其特征在于：所述二硫化铌纳米片联合NIR光热组合体系在制备抗菌药物中的应用。
4.根据权利要求1-3任一所述的二硫化铌纳米片的应用，其特征在于：所述抗菌药物为抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌生长的药物。
5.根据权利要求4所述的二硫化铌纳米片的应用，其特征在于：所述抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的药物。
6.根据权利要求1-3任一所述的二硫化铌纳米片的应用，其特征在于：所述二硫化铌纳米片在制备细菌生物膜抑制剂的用途。
7.根据权利要求1-3任一所述的二硫化铌纳米片的应用，其特征在于：所述二硫化铌纳米片在制备治疗金黄色葡萄球菌感染脓肿药物的用途。
8.一种二硫化铌纳米片联合近红外光热的协同纳米抗菌组合体系，其特征在于，包括权要求1或2所述的二硫化铌纳米片及近红外激光器。
9.根据权利要求8所述的一种二硫化铌纳米片联合近红外光热的协同纳米抗菌组合体系，其特征在于，所述二硫化铌纳米片的溶液浓度为200-300μg·mL-1，所述近红外激光器为近红外功率密度为2W·cm-2，进行3－10分钟光照。
10.一种二硫化铌纳米片的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
五氯化铌和油胺混合在100℃的氩气气氛下保持30分钟以除去氧气，当溶液变得透明澄清时，迅速加热到300℃，然后在300℃下将二硫化碳(5mmol)缓慢注入溶液中3小时，反应结束后，加入正丁醇，离心得到黑色沉淀，用己烷和乙醇洗涤数次，然后干燥，在氩气氛下在管式炉中在200℃下退火3小时后，获得最终产品。
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