CN115606596B - 一种网状抗菌材料、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种网状抗菌材料、其制备方法及应用，属于有机材料制备技术领域。本发明的网状抗菌材料由如下方法制备而成：将多酚水溶液与抗菌肽水溶液混合均匀，静置反应，形成多酚‑抗菌肽聚集体；将多酚‑抗菌肽聚集体离心，洗涤，冻干，获得网状抗菌材料。本发明所述网状抗菌材料，具有网状结构，结构稳定，且具有较好的抗菌作用，将其制备成抗菌涂层后，可有效附着在基体表面，抗水洗，抑菌效果持久。
Description
技术领域
本发明属于有机材料制备技术领域，具体涉及一种网状抗菌材料、其制备方法及应用。
背景技术
暴露在空气中的食品，容易滋生细菌，危害人体健康。一般的抗菌剂极易发生水解，不耐水洗，从而使抗菌包装材料失去其作用价值。近年来，一些长效抗菌活性材料被开发出来，例如，将pH响应的聚甲基丙烯酸外层引入杀菌背景层，作为调节分层表面行为的致动器；将天然AMP共价固定在分层表面的内层，形成分层聚合物刷结构；利用季铵化反应和乳液聚合工艺合成一系列具有不同烷基链长的抗菌聚合季铵单体，与含氟和其他丙烯酸单体共聚，生成阳离子含氟聚合物乳液；利用静电纺丝技术将二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵(QAS)引入聚己内酯(PCL)/明胶杂化物中制造QAS功能化的PCL-明胶混合纳米纤维；利用微波辐射合成聚乙烯亚胺(PEI)改性和纳米银修饰GO纳米复合材料(GO-PEI-Ag)等，但这些方法通常需要更复杂的合成方法或能源成本等技术条件，特别是化学接枝法，其对底物的选择性高，从而限制了其应用。因此，开发一种不易水解、生产工艺较为简单、安全性能高且对人体无毒的长效抗菌材料，具有重要意义。
发明内容
本发明利用静电、氢键以及疏水等非共价相互作用，将多酚与抗菌肽共组装形成聚集体，该聚集体具有网状结构，不溶于水，稳定性好，且具有优异的抗菌作用，可用于抗菌涂液或涂层的制备。
本发明提出如下技术方案：
一种网状抗菌材料的制备方法，步骤如下：
将多酚水溶液与抗菌肽水溶液混合均匀，静置反应，形成多酚-抗菌肽聚集体；将多酚-抗菌肽聚集体离心，洗涤，冻干，获得网状抗菌材料。
多酚水溶液选自如下方法制备：将多酚类化合物溶于水中，搅拌均匀，调节pH，得到外观呈透明的多酚水溶液。多酚类化合物可选自没食子酸、单宁酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、鞣花酸、原儿茶酸以及茶多酚等，多酚水溶液的pH值可选自7～10，多酚水溶液的浓度可选自0.01～20mM。
抗菌肽水溶液选自如下方法制备：将抗菌肽溶于水中，搅拌均匀，得到外观呈无色透明的抗菌肽水溶液。抗菌肽可选自少于30个氨基酸残基的阳离子型抗菌肽，如G(IIKK)3I-NH2、C12-GIIKKIIKKI-NH2、C16-RRRVVV-NH2。抗菌肽溶液的浓度可选自0.01～2mM。
在上述网状抗菌材料的制备方法中，多酚水溶液与抗菌肽水溶液的体积比可选自1:1。
在上述网状抗菌材料的制备方法中，静置反应的条件选自：反应温度可选自0～60℃，静置时间可选自10s～5min；离心速率可选自10000～13000rpm，离心时间可选自13～20min；可采用水洗涤；冻干时间可选自1～2d。
上述多酚-抗菌肽聚集体的形成，有赖于多酚水溶液与抗菌肽水溶液在混合后，混合溶液中多酚与抗菌肽的浓度比。具体地，本发明提供了一系列可稳定形成多酚-抗菌肽聚集体的底物浓度组合，如下所示：
当制备GA-G3聚集体时，G3肽浓度≤0.05mM，GA浓度≥1.25mM；或G3肽浓度≤0.075mM，GA浓度≥1.875mM；或G3肽浓度≤0.1mM，GA浓度≥2.0mM；或G3肽浓度≤0.3mM，GA浓度≥2.25mM；或G3肽浓度≤0.5mM，GA浓度≥2.5mM；或G3肽浓度≤1.1mM，GA浓度≥3.0mM；或G3肽浓度≤2.0mM，GA浓度≥3.0mM；
当制备GA-C12聚集体时，C12肽浓度≤0.02mM，GA浓度≥0.6mM；或C12肽浓度≤0.04mM，GA浓度≥0.64mM；或C12肽浓度≤0.1mM，GA浓度≥1.2mM；或C12肽浓度≤1.0mM，GA浓度≥1.8mM；或C12肽浓度≤1.5mM，GA浓度≥2.0mM；或C12肽浓度≤1.8mM，GA浓度≥2.5mM；或C12肽浓度≤2.0mM，GA浓度≥3.0mM；或C16肽浓度≥0.02mM，GA浓度≥20.0mM；
当制备GA-C16聚集体时，C16肽浓度≥0.02mM，GA浓度≥20.0mM；或C16肽浓度≥0.03mM，GA浓度≥6.0mM；或C16肽浓度≥0.05mM，GA浓度≥3.0mM；或C16肽浓度≥0.08mM，GA浓度≥2.0mM；或C16肽浓度≥1.0mM，GA浓度≥1.5mM；或C16肽浓度≥1.5mM，GA浓度≥1.0mM；或C16肽浓度≥2.0mM，GA浓度≥0.8mM。
本发明提供了由上述方法制备的网状抗菌材料。
本发明提供了一种抗菌涂液，是将上述网状抗菌材料溶于乙醇水溶液中制备而成。其中，乙醇水溶液可选自体积分数为75％的乙醇水溶液；抗菌涂液中网状抗菌材料的浓度可选自10～50μg/mL。
本发明提供了一种抗菌涂层，是将上述抗菌涂液涂覆于基体表面制备而成。其中，基体可选自任意具有抗菌需求的材料，例如塑料及其制品等；抗菌涂液在基体表面的涂覆容积可选自25～125mL/cm2。
本发明提供了上述网状抗菌材料、抗菌涂液以及抗菌涂层在制备具有抑菌功能的食品包装中的应用。其中，抑菌对象可选自任意对人体构成健康威胁的细菌，例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
本发明的有益效果为：
本发明制备的多酚-抗菌肽聚集体，具有网状结构，结构稳定，且具有较好的抗菌作用，将其制备成抗菌涂层后，可有效附着在基体表面，抗水洗，抑菌效果持久。
附图说明
图1为没食子酸和G3抗菌肽浓度配比相图；其中，I区域表示无法形成不溶性的多酚-抗菌肽聚集体；II区域表示可以形成不溶性的多酚-抗菌肽聚集体；
图2为没食子酸和C12抗菌肽浓度配比相图；其中，I区域表示无法形成不溶性的多酚-抗菌肽聚集体；II区域表示可以形成不溶性的多酚-抗菌肽聚集体；
图3为没食子酸和C16抗菌肽浓度配比相图；其中，I区域表示无法形成不溶性的多酚-抗菌肽聚集体；II区域表示可以形成不溶性的多酚-抗菌肽聚集体；
图4为PET塑料薄膜表面的AFM图；
图5为涂覆有GA-C12肽涂液的PET塑料薄膜表面的AFM图；
图6为涂覆有GA-C12肽涂液的PET塑料薄膜在水中浸泡两天后的AFM图；
图7为涂覆有GA-C12肽涂液的PET塑料薄膜在水中浸泡两天后的XPS图；
图8为GA-C12肽的大肠杆菌抑菌图；
图9为GA-C12肽的金黄色葡萄球菌抑菌图；
图10为人肝癌细胞HepG2和成纤维细胞CHO细胞的细胞存活率图。
具体实施方式
多酚是苯环上连接一个或多个羟基的小分子物质，具有抗氧化、抗炎、光谱粘附性等特点。本发明提供的多酚有：没食子酸(GA)、单宁酸(TA)、表没食子儿茶素没食子酸酯、鞣花酸、原儿茶酸以及茶多酚等。
抗菌肽是一类广泛存在于自然界的小分子的蛋白质，其广谱抗菌性能优良，生物相容性好。本发明提供了几种阳离子型抗菌肽，其结构式如下所示：
C16-RRRVVV-NH2(简称C16肽)：
C16肽的合成与提纯，可采用现有技术中的方法：Chen,C.et al.High cellselectivity and low-level antibacterial resistance of designed amphiphilicpeptide G(IIKK)(3)I-NH(2).ACS Appl Mater Interfaces 6,16529-16536.doi:10.1021/am504973d(2014)。
C12-GIIKKIIKKI-NH2(简称C12肽)：
C12肽的合成与提纯，可采用现有技术中的方法：Chen,C.et al.High cellselectivity and low-level antibacterial resistance of designed amphiphilicpeptide G(IIKK)(3)I-NH(2).ACS Appl Mater Interfaces 6,16529-16536.doi:10.1021/am504973d(2014)。
G(IIKK)3I-NH2(简称G3肽)：
G3肽的合成与提纯，可采用现有技术中的方法：Jia,D.et al.Interfacialadsorption of lipopeptidesurfactants at the silica/water interface studied byneutron reflection.Soft Matter 7,1777-1788.doi:10.1039/c0sm00581a(2011)。
本发明利用静电、氢键以及疏水等非共价相互作用，将多酚与抗菌肽共组装形成多酚-抗菌肽聚集体，该聚集体具有网状结构，不溶于水，且稳定性好。
多酚与抗菌肽的结合机理，如下所示：
在试验过程中，我们发现，并非将任意浓度的多酚水溶液与抗菌肽水溶液混合，都能形成多酚-抗菌肽聚集体，在某些浓度比例下，将多酚水溶液与抗菌肽水溶液混合后，反应体系中并无多酚-抗菌肽聚集体的形成，这使我们意识到，多酚-抗菌肽聚集体的形成依赖于多酚水溶液与抗菌肽水溶液在混合后，混合溶液中多酚与抗菌肽的浓度比。基于此，我们配置了大量的不同浓度的底物溶液，经过不断测试，找到多酚-抗菌肽聚集体能形成沉淀的底物临界浓度，如表1所示：
表1
相应的曲线图，如图1～图3所示，I区域为不能形成沉淀的浓度区域，在透射电子显微镜下扫描溶液发现多酚和抗菌肽聚集到一起但彼此没有交联，所以外观上没有聚集体沉淀的生成；II区域为能够形成聚集体沉淀的区域，在透射电子显微镜下扫描下发现多酚和抗菌肽形成了类似网状的结构，彼此互相交联，从而在溶液外观上呈现聚集体沉淀。
下述表2记载了可形成聚集体的底物浓度，以GA-G3聚集体为例，当G3肽浓度≤0.05mM时，只要GA浓度≥1.25mM，即可形成GA-G3聚集体，其它情形在理解上亦如此。
表2
结合上述内容可知，当G3肽浓度≤2mM时，只要保证GA浓度≥3mM时，可稳定形成GA-G3聚集体；当C12肽浓度≤2mM时，只要保证GA浓度≥3mM时，可稳定形成GA-C12聚集体；当C16肽浓度≥0.05mM，只要保证GA浓度≥3mM时，可稳定形成GA-C16聚集体。但在实际应用过程中，可依据表2控制抗菌肽与多酚的浓度来制备多酚-抗菌肽聚集体，以达到节约底物材料的目的。
本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
将0.085g没食子酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成5mM、pH为8的没食子酸溶液。将8.15mg G3肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.5mM G3肽溶液。
在室温条件下，将500μL没食子酸溶液和500μL G3肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的没食子酸-G3肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将没食子酸-G3肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于50mL75％乙醇水溶液中，得到10μg/mL的没食子酸-G3肽溶液。取300μL没食子酸-G3肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例2
将0.085g没食子酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成5mM、pH为8的没食子酸溶液。将6.6mg C12肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.5mM C12肽溶液。
在室温条件下，将500μL没食子酸溶液和500μL C12肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的没食子酸-C12肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将没食子酸-C12肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于50mL 75％乙醇水溶液中，得到10μg/mL的没食子酸-C12肽溶液。取300μL没食子酸-C12肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例3
将0.085g没食子酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成5mM、pH为8的没食子酸溶液。将5.04mg C16肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.5mM C16肽溶液。
在室温条件下，将500μL没食子酸溶液和500μL C16肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的没食子酸-C16肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将没食子酸-C16肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于50mL 75％乙醇水溶液中，得到10μg/mL的没食子酸-C16肽溶液。取300μL没食子酸-C16肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例4
将0.068g没食子酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成4mM、pH为8的没食子酸溶液。将3.26mg G3肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.2mM G3肽溶液。
在室温条件下，将500μL没食子酸溶液和500μL G3肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的没食子酸-G3肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将没食子酸-G3肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于50mL 75％乙醇水溶液中，得到10μg/mL的没食子酸-G3肽溶液。取300μL没食子酸-G3肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例5
将0.068g没食子酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成4mM、pH为8的没食子酸溶液。将2.64mg C12肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.2mM C12肽溶液。
在室温条件下，将500μL没食子酸溶液和500μL C12肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的没食子酸-C12肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将没食子酸-C12肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于50mL 75％乙醇水溶液中，得到10μg/mL的没食子酸-C12肽溶液。取300μL没食子酸-C12肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例6
将0.068g没食子酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成4mM、pH为8的没食子酸溶液。将2.02mg C16肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.2mM C16肽溶液。
在室温条件下，将500μL没食子酸溶液和500μL C16肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的没食子酸-C16肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将没食子酸-C16肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于25mL 75％乙醇水溶液中，得到20μg/mL的没食子酸-C16肽溶液。取300μL没食子酸-C16肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例7
将0.17g单宁酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成5mM、pH为8的单宁酸溶液。将8.15mg G3肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.5mM G3肽溶液。
在室温条件下，将500μL单宁酸溶液和500μL G3肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的单宁酸-G3肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将单宁酸-G3肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于25mL 75％乙醇水溶液中，得到20μg/mL的单宁酸-G3肽溶液。取300μL单宁酸-G3肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例8
将0.17g单宁酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成5mM、pH为8的单宁酸溶液。将6.6mg C12肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.5mM C12肽溶液。
在室温条件下，将500μL单宁酸溶液和500μL C12肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的单宁酸-C12肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将单宁酸-C12肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于25mL 75％乙醇水溶液中，得到20μg/mL的单宁酸-C12肽溶液。取300μL单宁酸-C12肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例9
将0.17g单宁酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成5mM、pH为8的单宁酸溶液。将5.04mg C16肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.5mM C16肽溶液。
在室温条件下，将500μL单宁酸溶液和500μL C16肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的单宁酸-C16肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将单宁酸-C16肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于25mL 75％乙醇水溶液中，得到20μg/mL的单宁酸-C16肽溶液。取300μL单宁酸-C16肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例10
将0.136g单宁酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成4mM、pH为8的单宁酸溶液。将3.26mg G3肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.2mM G3肽溶液。
在室温条件下，将500μL单宁酸溶液和500μL G3肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的单宁酸-G3肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将单宁酸-G3肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于25mL 75％乙醇水溶液中，得到20μg/mL的单宁酸-G3肽溶液。取300μL单宁酸-G3肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例11
将0.136g单宁酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成4mM、pH为8的单宁酸溶液。将2.64mg C12肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.2mM C12肽溶液。
在室温条件下，将500μL单宁酸溶液和500μL C12肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的单宁酸-C12肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将单宁酸-C12肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于25mL 75％乙醇水溶液中，得到20μg/mL的单宁酸-C12肽溶液。取300μL单宁酸-C12肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
实施例12
将0.136g单宁酸溶于100mL超纯水中，搅拌均匀，滴加NaOH溶液配置成4mM、pH为8的单宁酸溶液。将2.02mg C16肽溶于10mL超纯水中，搅拌均匀，配置成0.2mM C16肽溶液。
在室温条件下，将500μL单宁酸溶液和500μL C16肽溶液混合均匀，静置1min，形成不溶于水的单宁酸-C16肽聚集体。置于离心机中，13000rpm离心15min，倒掉上清液，用超纯水洗涤聚集体。将上述离心和洗涤步骤重复三次。将单宁酸-C16肽聚集体置于冻干机中冻干，获得网状抗菌材料。
取0.5mg网状抗菌材料溶于25mL 75％乙醇水溶液中，得到20μg/mL的单宁酸-C16肽溶液。取300μL单宁酸-C16肽溶液涂覆于PET塑料表面，干燥后在PET塑料表面形成一层抗菌涂层。从而得到抗菌PET塑料。
(一)浸泡试验
在进行浸泡试验之前，先将PET塑料薄膜和实施例2制备的抗菌PET塑料薄膜置于原子力显微镜(AFM)下进行观察，观察结果分别如图4和图5所示。然后将实施例2制备的抗菌PET塑料薄膜，置于超纯水中浸泡2d，并置于原子力显微镜(AFM)下进行观察，观察结果如图6所示；同时对浸泡后的抗菌PET塑料薄膜进行X射线光电子能谱分析(XPS)，结果如图7所示。
由上述AFM图可知，将本发明制备的多酚-抗菌肽涂液涂覆于PET塑料薄膜表面后，形成了一层具有网状结构的抗菌涂层，并且，在将抗菌PET塑料薄膜浸泡两天后，抗菌涂层依然牢固地吸附在塑料表面，稳定性优异。由XPS图可知，N的残留量为2.82％，这证明了塑料薄膜在水洗后，抗菌肽依然吸附在塑料薄膜上。究其原因在于，多酚化合物含有大量的邻苯二酚或邻苯三酚基团，对材料具有较好的粘附性；此外，多酚的酚羟基能够通过静电、氢键、疏水等非共价相互作用与抗菌肽共组装形成不溶于水的聚集体，从而在涂覆后，能够在固体表面(食品塑料包装等)上形成一层稳定长效以及耐水洗的抗菌涂层材料。而网状结构则明显能够增大涂层材料的比表面积和透气性，更有利于细菌的接触和抑制。
(二)抑菌试验
本试验的操作菌种为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
1、常规试验
将菌种置于摇床中，37℃、170rpm/min培养14～16h。稀释至菌浓度为105～107CFU/mL。分别取300μL浓度为10μg/mL的GA(没食子酸)、C12肽以及GA-C12聚集体溶液，置于PET薄膜上，放在超净工作台中自然晾干；待干燥后重复上述操作步骤三次。在超净工作台中取300μL稀释菌液于空白、GA、C12肽以及GA-C12聚集体的PET薄膜中温育2h后将菌液取出待用。将菌液用LB培养基稀释105倍，取100μL涂于LB琼脂板，于37℃恒温培养箱中培养24h。
2、水洗试验
将菌种置于摇床中，37℃、170rpm/min培养14～16h。稀释至菌浓度为105～107CFU/mL。分别取300μL浓度为10μg/mL的GA(没食子酸)、C12肽以及GA-C12聚集体溶液，置于PET薄膜上，放在超净工作台中自然晾干；待干燥后重复上述操作步骤三次。将涂覆抗菌材料的PET薄膜放入5mL超纯水中浸泡两天，取出用无菌水冲洗10min。在超净工作台中取300μL稀释菌液于空白、GA、C12肽以及GA-C12聚集体的PET薄膜中温育2h后将菌液取出待用。将菌液用LB培养基稀释105倍，取100μL涂于LB琼脂板，于37℃恒温培养箱中培养24h。
试验结果如图8和图9所示：
涂覆有没食子酸-抗菌肽涂层的PET塑料薄膜，其抗菌性能较好，在经历水洗后依然表现出优异的抗菌性能，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌均表现出良好的抗菌性能。
(三)毒性试验
选用人肝癌细胞HepG2和成纤维细胞CHO细胞检测多酚-抗菌肽(GA-C12)的细胞毒性。
将细胞悬液接种到96孔板中，每个孔中加100μL细胞悬液，接种密度为1×105cells/mL。然后将96孔板置于37℃培养箱中培养24h，取出96孔板，此时细胞已经贴壁，将96孔板中的培养液吸出，再向每个孔中加入100μL新鲜的培养基和100μL GA-C12溶液，每个浓度设置5个平行，之后将96孔板置于37℃培养箱中培养48h，向每个孔中加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，并用锡箔纸包住96孔板避光，再放入培养箱中继续培养4h，将96孔板中的液体吸出，再在每个孔中加入150μL的DMSO，然后将96孔板置于摇床上混匀，10min后放在酶标仪中测定570nm处的吸光值。
试验结果如图10所示：本发明制备的多酚-抗菌肽，对细胞毒性非常低，是安全性能较高的抗菌材料。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.一种网状抗菌材料的制备方法，其特征在于，步骤如下：
将没食子酸溶于水中，搅拌均匀，调节pH为8，获得没食子酸水溶液；将没食子酸水溶液与C12肽水溶液混合均匀，静置反应，形成没食子酸-C12肽聚集体；将没食子酸-C12肽聚集体离心，洗涤，冻干，获得网状抗菌材料；
所述没食子酸水溶液与C12肽水溶液的体积比为1:1；所述静置反应的条件为：反应温度为室温，静置时间选自10s~5min；
所述C12肽即C12-GIIKKIIKKI-NH2；
所述C12肽水溶液的浓度≤2.0mM；所述没食子酸水溶液的浓度≥3.0mM。
2.权利要求1所述方法制备的网状抗菌材料。
3.一种抗菌涂液，其特征在于，是将权利要求2所述网状抗菌材料溶于乙醇水溶液中制备而成；所述乙醇水溶液选自体积分数为75%的乙醇水溶液；抗菌涂液中网状抗菌材料的浓度选自10~50μg/mL。
4.一种抗菌涂层，其特征在于，是将权利要求3所述抗菌涂液涂覆于基体表面制备而成；所述抗菌涂液在基体表面的涂覆容积选自25~125mL/cm2。
5.权利要求2所述网状抗菌材料或权利要求3所述抗菌涂液或权利要求4所述抗菌涂层在制备具有抑菌功能的食品包装中的应用；
所述菌为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。
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