CN115591593A - 检测过敏原的微流控芯片及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测过敏原的微流控芯片及方法。该微流控芯片包括芯片主体和液囊组件，芯片主体上设置有进样腔、全血分离结构、混匀腔、弧形的分液流道、多个反应单元和底物试剂腔；全血分离结构与进样腔和混匀腔连通；分液流道与混匀腔连通；多个反应单元沿旋转周向间隔分布，各个反应单元均包括免疫反应腔和与免疫反应腔连通的反应废液腔，免疫反应腔预装有过敏原冻干珠和标记抗体冻干珠，各个免疫反应腔均与分液流道；液囊组件包括第一腔、第二腔、第三腔、储存有血浆稀释液的第一液囊、储存有清洗液的第二液囊和储存有发光底物稀释液的第三液囊，第一液囊位于第一腔中，第二液囊位于第二腔中，第三液囊位于第三腔中。

Description

检测过敏原的微流控芯片及方法
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种检测过敏原的微流控芯片及方法。
背景技术
超敏反应是机体受到抗原持续刺激或再次受到相同抗原刺激后产生的以组织损伤或功能紊乱为特征的免疫应答，根据超敏反应发生的机制和临床特点，将其分为I、II、III和IV型。I型超敏反应是指由免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介导，组织中的肥大细胞和外周血中的嗜碱性粒细胞参与，通过释放生物活性介质引起局部或全身性的生理紊乱及组织损伤。I型超敏反应所致疾病主要包括：眼部的过敏性结膜炎；鼻部的过敏性鼻炎；气管、肺的过敏性哮喘、过敏性支气管肺曲霉病等；消化道的过敏性胃肠炎；皮肤的特应性皮炎、过敏性荨麻疹、过敏性血管性水肿、变应性速发型接触性反应等；以及严重全身反应的过敏症。
引起I型超敏反应的物质叫过敏原，亦称为变应原。通过呼吸道接触的过敏原称为吸入性过敏原，其主要包括植物花粉、动物毛皮屑、真菌孢子或菌丝、尘螨等。通过消化道摄入的过敏原称为食物性过敏原主要包括牛奶、鸡蛋、鱼、虾、蟹、果仁等。防治过敏性疾病的关键在于发现过敏原并避免与之接触。过敏性疾病的诊断包括询问病史、体外诊断和体内试验，其中体外诊断发挥重要的作用，而过敏原检测是重要的体外诊断项目之一。
过敏原检测并不是真正检测过敏原抗原物质，而是通过检测过敏原特异性IgE(specific IgE，sIgE)抗体间接推断待检者是否对相应物质过敏。过敏原sIgE抗体检测作为过敏性疾病的病因学诊断依据，对过敏患者的诊断、指导脱敏治疗和评价特异性脱敏治疗效果以及评估接触过敏原带来的风险具有重要价值。同时，筛查过敏原对于疑似过敏患者的预防也非常重要。目前，过敏原sIgE抗体血清学检测方法主要包括斑点－酶免疫吸附试验(dot enzyme-linked immunosorbent assay，Dot-ELISA)、ELISA、荧光酶免疫分析法(fluorescence enzyme immunoassay，FEIA)。
随着技术的进步，微流控芯片技术(Microfluidics)可以很方便的实现生物、化学、医学分析过程中的自动化，由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，其已经发展成为一个热门的研究方向，并已应用到体外诊断领域中。然而，目前基于微流控技术的微流控芯片还不能解决多种过敏原的联检问题；并且针对血液样本的微流控芯片还需要提前进行样本处理，检测过程中的个别步骤还需人为配合完成，整体的自动化程度还比较低；此外，目前的微流控芯片对保存和运输条件的要求较为苛刻，一般需要保存在2～8℃环境下，冷链运输。若这些条件得不到满足，则容易会对试剂的分析性能造成不可控的影响，甚至导致试剂失效。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够同时检测多种过敏原、自动化程度高且便于运输和保存的微流控芯片。
一种检测过敏原的微流控芯片，包括：
芯片主体，所述芯片主体具有旋转中心，所述芯片主体上设置有：
进样腔；
全血分离结构，具有血浆腔、血球腔和血液废液腔，所述血浆腔与所述进样腔连通，所述血球腔和所述血液废液腔分别与所述血浆腔连通，所述血球腔较所述血浆腔更远离所述旋转中心；
混匀腔，与所述血浆腔连通；
弧形的分液流道，所述分液流道包括主流道和多个分杯腔，所述主流道具有入口端和出口端，所述入口端与所述混匀腔连通；所述主流道呈弧状，多个所述分杯腔在所述主流道的周向上间隔排布并与所述主流道连通，所述主流道到所述旋转中心的距离自所述入口端到所述出口端逐渐增大；
多个反应单元，多个所述反应单元沿旋转周向间隔分布，所述反应单元包括免疫反应腔和与所述免疫反应腔连通的反应废液腔，所述免疫反应腔与所述分杯腔对应连通，所述分杯腔、所述免疫反应腔和所述反应废液腔在所述主流道的径向上沿远离所述旋转中心的方向依次排布；部分所述免疫反应腔内预装有过敏原冻干珠和标记抗体冻干珠，所述过敏原冻干珠包括过敏原和载体，各所述免疫反应腔内的过敏原不同；
预装有发光底物冻干珠的底物试剂腔，所述底物试剂腔与所述混匀腔连通；
液囊组件，所述液囊组件包括储存有血浆稀释液的第一液囊、储存有清洗液的第二液囊和储存有发光底物稀释液的第三液囊，所述第一液囊中的血浆稀释液能够进入所述混匀腔，所述第二液囊中的清洗液能够进入所述混匀腔，所述第三液囊中的发光底物稀释液能够经所述底物试剂腔进入所述混匀腔。
上述检测过敏原的微流控芯片通过在芯片主体上设置进样腔、全血分离结构、混匀腔、分液流道、多个反应单元和底物试剂腔，并搭配液囊组件，使得上述微流控芯片一次加样就可测试多种过敏原，且不需要单独对全血液样本进行前处理，检测过程中不需要人为配合完成，全部试剂集成到微流控芯片上，无需借助芯片外部的加液系统、通用试剂以及清洗液等就能完成完整的检测流程，操作简捷，耗时少，自动化程度高；并且由于多个反应单元共用进样腔、全血分离结构、混匀腔和分液流道，这节省了空间而使得上述微流控芯片在有限的面积内可以排布12个以上的反应单元，从而可以能够同时检测12种以上过敏原，进而使得过敏原的检测集成化；此外，过敏原、标记抗体和发光底物采用冻干珠的形式，这使得上述微流控芯片能够在常温下保存，也便于运输。
在其中一个实施例中，所述反应单元至少12个；各所述过敏原分别独立地来源于如下的一组：屋尘螨；粉尘螨；屋尘；猫毛；狗毛；蟑螂；霉菌；花粉；葎草；艾蒿；豚草；鸡蛋白；蛋黄；牛奶；花生；大豆；牛肉；羊肉；虾；蟹；海鲜；易致敏水果；坚果；CCD。
在其中一个实施例中，所述易致敏水果包括桃、苹果、芒果、荔枝和草莓中的至少一种；和/或，所述花粉包括柳树花粉、杨树花粉和榆树花粉中的至少一种；和/或，所述海鲜包括鳕鱼、龙虾和扇贝中的至少一种；和/或，所述坚果包括腰果、开心果、榛子、杏仁和核桃中的至少一种；和/或，所述霉菌包括青霉、烟曲霉、交链孢霉和分枝孢霉中的至少一种。
在其中一个实施例中，部分所述免疫反应腔内预装有背景质控冻干珠，部分所述免疫反应腔中预装有试剂降解质控冻干珠。
在其中一个实施例中，所述载体与所述过敏原能够通过亲和素与生物素偶联。
在其中一个实施例中，所述载体为连接有链霉亲和素的磁珠，所述过敏原上偶联有生物素。
在其中一个实施例中，所述过敏原冻干珠、所述标记抗体冻干珠和所述发光底物冻干珠分别独立地含有冻干后的冻干稀释剂，所述冻干稀释剂冻干之前包括缓冲液、质量百分含量为3％～20％的助剂、质量百分含量为0.01％～1％的表面活性剂和质量百分含量为0.01％～0.5％的防腐剂；所述助剂包括甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、右旋糖酐、PEG、PVP、BSA和明胶中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述表面活性剂包括吐温20、吐温80、司盘80、曲拉通X-45、曲拉通X-100中的至少一种；
和/或，所述缓冲液为TBS缓冲液；
进一步地，所述过敏原冻干珠中还含有蛋白保护剂和抗氧化剂中的至少一种；和/或，所述标记抗体冻干珠中含有蛋白保护剂和抗氧化剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述液囊组件具有第一腔、第二腔和第三腔，所述第一腔和所述第二腔分别与所述混匀腔连通，所述第三腔经所述底物试剂腔与所述混匀腔连通，所述第一液囊位于所述第一腔中，所述第二液囊位于所述第二腔中，所述第三液囊位于所述第三腔中。
一种过敏原的检测方法，采用上述的微流控芯片进行检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1为一是实施例的微流控芯片；
图2为图1所示的微流控芯片的爆炸图；
图3为图1所示的微流控芯片的芯片主体的立体图；
图4为图1所示的微流控芯片的芯片主体的俯视图。
附图标记：
10、微流控芯片；110、芯片主体；110a、盖合面；111、进样腔；112、全血分离结构；112a、血浆腔；112b、血球腔；112c、血液废液腔；112d、平台部；112e、收集部；112f、血样足量检测腔；113、混匀腔；114、分液流道；114a、主流道；114b、分杯腔；114c、分流废液腔；114d、牺牲腔；115、反应单元；115a、免疫反应腔；115b、反应废液腔；115c、第一微流道；115d、第二微流道；116、底物试剂腔；117、沉降池；118、第一虹吸流道；119、第二虹吸流道；120、液囊组件；121、第一液囊；122、第二液囊；123、第三液囊；130、盖板；140、粘合层。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
需要说明的是，当元件被表述“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。
当使用术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”、“上”、“下”、“内”、“外”、“底部”等指示方位或位置关系时，是为基于附图所示的方位或位置关系，仅为了便于描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本文中，“可选地”表示举例说明。术语“多个”是指至少两个；术语“多种”是指至少两种。
需要说明的是，在本文中，腔室的容量是指腔室能够承装液体的最大量；芯片主体上的部件的深度均是指部件对应的底到盖合面的距离，例如，收集部的深度是指收集部的底部到盖合面的距离。另外，在本文中，如未特殊说明，各个部件的底面均是平整面，也即是部件底面上的各个位置到盖合面的距离相等。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
请参阅图1和图2，本申请一实施方式提供了一种检测过敏原的微流控芯片10，该微流控芯片10包括芯片主体110和液囊组件120；芯片主体110具有旋转中心，芯片主体110上设置有进样腔111、全血分离结构112、混匀腔113、弧形的分液流道114、多个反应单元115和底物试剂腔116；全血分离结构112具有血浆腔112a、血球腔112b和血液废液腔112c，血浆腔112a与进样腔111连通，血浆腔112a与血球腔112b连通，血液废液腔112c与血浆腔112a连通，血球腔112b较血浆腔112a更远离旋转中心；混匀腔113与血浆腔112a连通；分液流道114包括主流道114a和多个分杯腔114b，主流道114a具有入口端和出口端，入口端与混匀腔113连通；主流道114a呈弧状，多个分杯腔114b在主流道114a的周向上间隔排布并与主流道114a连通，主流道114a到旋转中心的距离自入口端到出口端逐渐增大；多个反应单元115沿旋转周向间隔分布，各个反应单元115均包括免疫反应腔115a和与免疫反应腔115a连通的反应废液腔115b，免疫反应腔115a与分杯腔114b对应连通，分杯腔114b、免疫反应腔115a和反应废液腔115b在主流道114a的径向上沿远离旋转中心的方向依次排布，一部分免疫反应腔115a预装有过敏原冻干珠和标记抗体冻干珠，各免疫反应腔115a内的过敏原不同；预装有发光底物冻干珠的底物试剂腔116与混匀腔113连通；液囊组件120包括储存有血浆稀释液的第一液囊121、储存有清洗液的第二液囊122和储存有发光底物稀释液的第三液囊123，第一液囊121中的血浆稀释液能够进入混匀腔113，第二液囊122中的清洗液能够进入混匀腔113，第三液囊123中的发光底物稀释液能够经底物试剂腔116进入混匀腔113。
上述微流控芯片10通过在芯片主体110上设置进样腔111、全血分离结构112、混匀腔113、分液流道114、多个反应单元115和底物试剂腔116，并搭配液囊组件120。在检测时，待测血样经进样腔111进入芯片主体110，经全血分离机构分离出血清或血浆之后进入混匀腔113后，与血浆稀释液混合后经分流流道进入多个反应单元115，在待测血样中含有sIgE时，sIgE与免疫反应腔115a中的过敏原和标记抗体形成复合物，经清洗液清洗后与发光底物反应并通过检测发光信号而能够确定待测血样中sIgE的量(定性或定量)。因此，上述微流控芯片10一次加样就可测试多种过敏原，且不需要单独对全血液样本进行前处理，检测过程中不需要人为配合完成，全部试剂集成到微流控芯片上，无需借助芯片外部的加液系统、通用试剂以及清洗液等耗材就能完成完整的检测流程，操作简捷，耗时少，自动化程度高。并且由于多个反应单元115共用进样腔111、全血分离结构112、混匀腔113和分液流道114，以及分液流道114的结构设计，这节省了空间而使得上述微流控芯片10能够在有限的面积内可以排布12个以上的反应单元115，从而可以同时检测12种以上过敏原，进而使得过敏原的检测集成化；此外，过敏原、标记抗体和发光底物均采用冻干珠的形式，这使得上述微流控芯片10能够在常温下保存，也便于运输。另外，由于血浆稀释液、清洗液和发光底物稀释液等均是分灌到液囊组件120中并集成于微流控芯片10之上，无需另行配备外部通用试剂及耗材，配套检测设备仪器无需配备液路机构，也无需对其进行液路保养，所以配套检测设备维护成本更低。
可选地，芯片主体110的材料包括但不限于玻璃、ABS、PDMS、PMMA、PP、PET或PC。在一些实施例中，芯片主体110的材料为不透明材料。不透明材料作为芯片主体110的材料更利于后续检测。可选地，芯片主体110的材料为带颜色的不透明材料。在一些实施例中，芯片主体110的直径为100mm～140mm。可选地，芯片主体110的直径为100mm、120mm、130mm或140mm。
请参阅图3和图4，具体地，进样腔111用于承装添加的样品。在本实施方式中，进样腔111的容量在400μL以上。按照上述设置可以满足至少20个反应单元115的用量。进一步地，进样腔111的容量在450μL以上。更进一步地，进样腔111的容量为400μL～600μL。可选地，进样腔111呈扇环状，进样腔111自旋转中心向芯片主体110的边缘凸出。在图示的实施例中，进样腔111的宽度沿顺时针方向逐渐增大。按照如此设置便于样品经离心进入下游，减少离心时间，提高检测效率。
具体地，全血分离结构112用于对血液样本进行处理，以从全血中分离出血清或血浆用于下游检测。全血分离结构112包括血浆腔112a、血球腔112b和血液废液腔112c。在离心时，全血被分离成血清或血浆和血细胞，血清或血浆停留在血浆腔112a中而血细胞留在血球腔112b中，从而实现分离。在血浆腔112a中的血液超过其容量时，进入血液废液腔112c，从而实现对血液的定量。进一步地，芯片主体110具有盖合面110a；血浆腔112a具有助流面，助流面到盖合面110a的距离沿血浆腔112a的入口到血浆腔112a的出口方向逐渐减小。通过助流面的设置，使得在离心时血浆腔112a中的血细胞更容易进入血球腔112b而使得全血分离更彻底，利于后续检测。可选地，血浆腔112a大致呈漏斗状，血浆腔112a的侧壁之间的距离在沿血浆腔112a的入口至血浆腔112a的出口反向上逐渐收窄。可以理解的是，血浆腔112a的形状不限于上述，血球腔112b的形状也不限。
在本实施方式中，血浆腔112a与血球腔112b的容量之比为1：(1～5)。将血浆腔112a与血球腔112b的容量之比设置为1：(1～5)，将血浆与血细胞充分分离，使得血浆中无血红蛋白等其他干扰物。进一步地，血浆腔112a与血球腔112b的容量之比为1：(2～5)。将血浆腔112a与血球腔112b的容量之比设置为1：(2～5)可以使得全血分离结构112能够兼容几乎所有年龄段及性别的正常全血样本。在一个可选地具体示例中，血浆腔112a与血球腔112b的容量之比为1：2、1：3、1：4或1：5。
具体地，血液废液腔112c用于承装超过血浆腔112a承载量的全血，即用于承装多余的全血。在使用过程中，多余的全血会溢出而进入血液废液腔112c。在图示的实施例中，血液废液腔112c的入口靠近血浆腔112a的入口。可以理解的是，在其他实施例中，血浆腔112a的入口不限于此，还可以是其他位置，只要能接收从血浆腔112a溢出的全血即可。进一步地，血液废液腔112c包括平台部112d和收集部112e，平台部112d与血浆腔112a连通，收集部112e与平台部112d连通，平台部112d的深度小于收集部112e的深度。在使用时，从血浆腔112a溢出的全血经平台部112d流入收集部112e。通过设计平台部112d和收集部112e，可使得进入血液废液腔112c的全血不容易逆行回血浆腔112a。更进一步地，芯片主体110还具有用于反应全血的量是否足够用于后续检测的血样足量检测腔112f，血样足量检测腔112f与血液废液腔112c连通且较血液废液腔112c更远离旋转中心。在图示的实施例中，血样足量检测腔112f与平台部112d连通，血样足量检测腔112f与收集部112e间隔地位于平台部112d远离旋转中心的一端，血样足量检测腔112f更靠近血球腔112b。
在一些实施例中，血液废液腔112c上还设置有透气孔。通过透气孔的设置便于废弃血液进入血液废液腔112c中。
在一些实施例中，芯片主体110还设置有沉降池117。具体地，沉降池117用于沉降一部分全血样本中的自然产生的结块以及加样时带入的纤维或颗粒物。例如血样中的可能凝块，包括凝血块、较大脂肪团等，以防止堵塞芯片中流道。沉降池117位于进样腔111和血浆腔112a之间，进样腔111与血浆腔112a通过沉降池117连通。
具体地，混匀腔113是血清或浆与稀释液混合均匀的场所，也是清洗液进入分液流道114的必经之路，还是发光底物与发光底物稀释液混合均匀的场所。混匀腔113与血浆腔112a连通。更具体地，混匀腔113与血浆腔112a通过第一虹吸流道118连通。在本实施方式中，第一虹吸流道118的宽度为0.2mm～1.5mm，第一虹吸流道118的深度为0.1mm～1mm。第一虹吸流道118的尺寸按照上述设置并联动其他关联结构可以使得精确定量的血浆在结束全血分离步骤后可以从血浆腔112a中完全引流到下游混匀腔113中，而在全血分离步骤期间血球腔112b中的血细胞不会引流到混匀腔113中，确保全血不通过而分离得出的血浆通过，从而使得血细胞不会干扰后续试剂测试结果的准确性。在图示的实施例中，混匀腔113绕旋转中心大致呈月牙形。可以理解的是，在其他实施例中，混匀腔113的形状不限于上述，还可以是其他形状。
在一些实施例中，第一虹吸流道118的靠近混匀腔113的三分之一的区域涂布有疏水试剂，第一虹吸流道118的靠近主流道114a的三分之二的区域涂布有亲水试剂。上述涂层处理可以有效增强第一虹吸流道118的虹吸效果。涂布方式可以选择超声喷涂、微量点样器点样等。在一个可选地具体示例中，选择的是超声喷涂方案。将不需要喷涂的位置做成掩膜，覆盖在芯片主体110之上，置于超声喷涂仪器中，仪器将试剂以微粒的形式喷涂到未被掩膜覆盖的芯片表面，试剂附着微流道的表面。在一个可选地具体示例中，第一虹吸流道118的宽度为0.1～1.0mm，第一虹吸流道118的深度为0.1～1.0mm。
具体地，弧形的分液流道114用于将混匀腔113中的液体定量地输送至反应单元115。分液流道114包括主流道114a和多个间隔设置的分杯腔114b。在使用时，随着离心，从混匀腔113中流出的液体顺着离心方向进入主流道114a并逐步填满每个分杯腔114b。主流道114a呈弧状，主流道114a自旋转中心向芯片主体110的边缘凸起，多个分杯腔114b在主流道114a的远离旋转中心的一侧沿主流道114a的周向间隔分布。在本实施方式中，主流道114a的宽度为0.5mm～3mm，主流道114a的深度为1.5mm～3mm。在一个可选地具体示例中，主流道114a的宽度为1mm～2mm，主流道114a的深度为0.5mm～3.5mm。
在一些实施例中，主流道114a以旋转中心为中心呈外螺旋线状，多个分杯腔114b在主流道114a的外周上、以旋转中心为中心等角度并联式间隔排布并与主流道114a直接连通。在自主流道114a的入口端到出口端的方向上，第一个分杯腔114b到旋转中心的距离与最后一个分杯腔114b到旋转中心的距离之比为1：(1.05～1.2)。按照如此设置，可以使得在有较多分杯腔114b(例如分杯腔114b的数量为25个以上)时，也能在较低的转速下，每个分杯腔114b都被充满来自混匀腔113的液体。在图示的实施例中，第一个分杯腔114b到旋转中心的距离与最后一个分杯腔114b到旋转中心的距离之比为1:1.12。
在一些实施例中，以旋转中心为顶点，旋转中心与入口端和出口端所形成的夹角的大小为0°～359°。可以理解的是，旋转中心与入口端和出口端所形成的夹角的不限于0°～359°，如果芯片主体110的盘面尺寸合适，还可以超过359°，例如400°、480°等。
在本实施方式中，混匀腔113与分液流道114通过第二虹吸流道119连通，第二虹吸流道119的宽度为0.2mm～1.5mm，第二虹吸流道119的深度为0.1mm～1mm。将第二虹吸流道119的尺寸按照上述设置可以使得充分稀释后的样本可以充分并均匀地引流到主流道114a中。在一个可选地具体示例中，第二虹吸流道119的宽度为0.5mm，第二虹吸流道119的深度为0.3mm。在图示的实施例中，第一虹吸流道118和第二虹吸流道119均位于混匀腔113靠近血浆腔112a的一端。
在一些实施例中，第二虹吸流道119在靠近混匀腔113的部分涂布有亲水试剂，第二虹吸流道119的中部涂布有疏水试剂，第二虹吸流道119在靠近分液流道114的部分涂布有亲水试剂，涂层处理可以有效增强第二虹吸流道119的虹吸效果。涂布方式可以选择超声喷涂、微量点样器点样等。在一个可选地具体示例中，选择的是超声喷涂方案。将不需要喷涂的位置做成掩膜，覆盖在芯片主体110之上，置于超声喷涂仪器中，仪器将试剂以微粒的形式喷涂到未被掩膜覆盖的芯片表面，试剂附着微流道的表面。在一个可选地具体示例中，第二虹吸流道119的宽度为0.1mm～1.0mm，第二虹吸流道119的深度为0.1mm～1.0mm。
在图示的实施例中，分液流道114还包括位于主流道114a的出液端的分流废液腔114c。分流废液腔114c用于承装多余的从主流道114a流出的液体。
在图示的实施例中，分液流道114还包括牺牲腔114d。牺牲腔114d与主流道114a连通并与分杯腔114b间隔，牺牲腔114d较分杯腔114b更靠近入口端。通过牺牲腔114d的设置使得从入口端数的第一个分杯腔114b，不容易出现实际填充的液体少于预设体积，而影响下一步反应；同时牺牲腔114d还可以有效减轻第一个分杯腔114b承受的液体冲击力，从而提高第一个免疫反应腔115a的准确性。
具体地，多个反应单元115沿旋转周向间隔分布，反应单元115包括免疫反应腔115a和与免疫反应腔115a连通的反应废液腔115b，各个免疫反应腔115a均与分液流道114连通。分杯腔114b、免疫反应腔115a和反应废液腔115b在主流道114a的径向上沿远离旋转中心的方向依次排布。
进一步地，分杯腔114b与免疫反应腔115a通过第一微流道115c连通，免疫反应腔115a与反应废液腔115b通过第二微流道115d连通。第一微流道115c一方面用于在液体逐步进入分杯腔114b的过程中阻碍液体进入免疫反应腔115a，另一方面在液体填满所有分杯腔114b后引导分杯腔114b中的液体进入免疫反应腔115a。第二微流道115d一方面用于阻挡在免疫反应过程中免疫反应腔115a中的物质进入反应废液腔115b，另一方面在需要将免疫反应腔115a中的液体丢弃时引导其进入反应废液腔115b。
在本实施方式中，第一微流道115c和第二微流道115d的宽度分别独立地为0.2mm～0.7mm，第一微流道115c和第二微流道115d的深度分别独立地为0.02mm～0.07mm；第一微流道115c的长度为1.5mm～2.5mm，第二微流道115d的长度为3.5mm～5.5mm。按照上述设置，更利于在较低的转速下可以使得分杯腔114b中的液体进入免疫反应腔115a而不从第二微流道115d流出，在需要将免疫反应腔115a中的液体离心入反应废液腔115b时，液体也能顺利进入反应废液腔115b。在一些实施例中，第一微流道115c和第二微流道115d均为经过疏水处理的微流道。进一步地，第一微流道115c和第二微流道115d分别涂布疏水试剂，可以有效的增加阻碍作用，从而使得多次清洗能够顺利完成。涂布方式可以选择超声喷涂、微量点样器点样等。在一个可选地具体示例中，选择的是超声喷涂方案。将不需要喷涂的位置做成掩膜，覆盖在芯片主体110之上，置于超声喷涂仪器中，仪器将试剂以微粒的形式喷涂到未被掩膜覆盖的芯片表面，试剂附着微流道的表面。本实施例中，经过对第一微流道115c和第二微流道115d的疏水处理，更利于转速差实现第一微流道115c和第二微流道115d的阻碍及液体引导作用，满足芯片的多次清洗排液流程。
在一些实施例中，免疫反应腔115a的腔底与芯片主体110的下表面的距离不小于0.3mm。
在图示的实施例中，免疫反应腔115a呈圆柱状，反应废液腔115b在盖合面110a上的正投影呈等腰梯形。可以理解的是，在其他实施例中，免疫反应腔115a和反应废液腔115b的形状不限与上述，还可以是其他形状。
在一些实施例中，一部分免疫反应腔115a内预装有标记抗体和过敏原冻干珠，另一部分免疫反应腔115a内预装有质控冻干珠。可以理解的是，标记抗体的标记物没有特别限制。过敏原冻干珠包括过敏原和载体。可选地，各免疫反应腔115a中的过敏原分别独立地来源于如下的一组：屋尘螨；粉尘螨；屋尘；猫毛；狗毛；蟑螂；霉菌；花粉；葎草；艾蒿；豚草；鸡蛋白；蛋黄；牛奶；花生；大豆；牛肉；羊肉；虾；蟹；海鲜；易致敏水果；坚果；CCD(交叉反应性碳水化合物决定簇)。进一步地，霉菌包括青霉、烟曲霉、交链孢霉和分枝孢霉中的至少一种；和/或，花粉包括柳树花粉、杨树花粉和榆树花粉中的至少一种；和/或，海鲜包括鳕鱼、龙虾和扇贝中的至少一种；和/或，易致敏水果包括桃、苹果、芒果、荔枝和草莓中的至少一种；和/或，坚果包括腰果、开心果、榛子、杏仁和核桃中的至少一种。可以理解的是，过敏原不限于上述，还可以是其他物质。
可选地，过敏原与载体在未使用之前以相互独立的冻干珠的形式存在。当然，在未使用之前，过敏原与载体还可以已经连接。可选地，载体与过敏原能够通过亲和素与生物素偶联。在本实施方式中，载体为连接有链霉亲和素的磁珠，过敏原上偶联有生物素。通过生物素和链霉亲和素的作用，过敏原连接到载体上。可以理解的是，在其他实施例中，过敏原与载体之间的连接方式不限于商户的亲和素与生物素，还可以是其他连接方式。
可选地，质控冻干珠包括背景质控冻干珠和试剂降解质控冻干珠中的至少一种。在其中一个实施例中，其中一个免疫反应腔115a内预装有背景质控冻干珠，另一个免疫反应腔115a中预装有试剂降解质控冻干珠。在本实施方式中，背景质控冻干珠包括连接有链霉亲和素磁珠冻干珠和碱性磷酸酶冻干珠；试剂降解质控冻干珠包括链霉亲和素磁珠冻干珠和碱性磷酸酶生物素偶联物冻干珠。可以理解的是，在其他实施例中，质控冻干珠可以省略。对应地，用于承装质控冻干珠的反应单元115也可以省略或将其用于承装过敏原冻干珠和标记抗体。
在图示的实施例中，反应单元115的数量为27个，其中25个反应单元115用于待测样品经全血分离处理并稀释后的血清或血浆与标记抗体和不同的过敏原冻干珠反应，其中一个反应单元115用于待测样品经全血分离处理并稀释后的血清或血浆与背景质控冻干珠反应，其中一个反应单元115用于待测样品经全血分离处理并稀释后的血清或血浆与试剂降解质控冻干珠反应。
具体地，底物试剂腔116用于预装发光底物冻干珠。在图示的实施例中，底物试剂腔116位于血液废液腔112c远离血浆腔112a的一侧，并靠近进样腔111，底物试剂腔116通过微流道与混匀腔113连通。
进一步地，过敏原冻干珠、标记抗体冻干珠和发光底物冻干珠分别独立地含有冻干后的冻干稀释剂，冻干稀释剂冻干之前包括缓冲液、质量百分含量为3％～20％的助剂、质量百分含量为0.01％～1％的表面活性剂和质量百分含量为0.01％～0.5％的防腐剂；助剂包括甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、右旋糖酐、PEG、PVP、BSA和明胶中的至少一种。冻干稀释剂可保证冻干后的冻干珠外观成型饱满光滑且具备一定强度和韧性，并使得冻干珠中的生物活性组分耐受常温环境存储。可选地，表面活性剂包括吐温20、吐温80、司盘80、曲拉通X-45、曲拉通X-100中的至少一种。可选地，过敏原冻干珠中还含有蛋白保护剂和抗氧化剂中的至少一种；和/或，标记抗体冻干珠中含有蛋白保护剂(例如甘油、氯化钙、乙二胺四乙酸二钠、甘氨酸等)和抗氧化剂(例如谷胱甘肽、抗坏血酸、硫代甘油、半胱氨酸等)中的至少一种。可选地，缓冲液为TBS缓冲液、可以理解的是，缓冲液和表面活性剂均不限于上述，防腐剂、蛋白保护剂和抗氧化剂均没有特别限制。更进一步地，冻干稀释剂冻干之前包括质量百分含量为15％～20％的助剂、质量百分含量为0.5％～1％的表面活性剂和质量百分含量为0.01％～0.5％的防腐剂。需要说明的是，过敏原冻干珠、标记抗体冻干珠和发光底物冻干珠分别独立地含有冻干后的冻干稀释剂是指过敏原冻干珠、标记抗体冻干珠和发光底物冻干珠均含有冻干后的冻干稀释剂，且各自的冻干稀释剂相互不影响。
具体地，液囊组件120位于盖合面110a上，用于向芯片主体110提供稀释液和清洗液以完成免疫反应。液囊组件120包括多个液囊。可选地，液囊包括储存有血浆稀释液的第一液囊121、储存有清洗液的第二液囊122和储存有发光底物稀释液的第三液囊123，第一液囊121中的血浆稀释液和第二液囊122中的清洗液均能够流入混匀腔113，第三液囊123中的发光底物稀释液能够经底物试剂腔116流入混匀腔113。在一些实施例中，液囊组件120具有第一腔、第二腔和第三腔，第一腔和第二腔分别与混匀腔113连通，第三腔经底物试剂腔116与混匀腔113连通；第一液囊121位于第一腔中，第二液囊122中位于第二腔中，第三液囊123位于第三腔中。可以理解的是，在一些实施例中，上述微流控芯片10中的液囊组件120的液囊可以省略，在使用时需搭配额外的液囊，即在使用时才向第一腔、第二腔和第三腔中加入对应的液囊。当然，在一些实施例中，液囊也可以省略，此时可以直接将液体加入相应的第一腔、第二腔和第三腔中，在需要对应液体时，连通相应的腔室。
在一些实施例中，液囊组件120还包括与液囊对应刺破件(图未示)。通过外力作用，刺破件能够将与其对应的液囊刺破而使得储存于该液囊中的液体可以流出。在一些实施例中，刺破件位于芯片主体110上并自芯片主体110向靠近液囊的方向延伸，刺破件包括尖刺部，尖刺部用于刺破液囊。在未使用时(不需要刺破液囊时)，刺破件与液囊之间有间隙。可以理解的是，在另一些实施例中，刺破件可以用其他能够控制液囊开启和关闭的开关替代。
在一些实施例中，微流控芯片10还包括与第一液囊121对应的第一刺破件、与第二液囊122对应的第二刺破件和第三液囊123对应的第三刺破件。第一刺破件、第二刺破件和第三刺破件均具有尖刺部，尖刺部的形状为方锥形、圆锥形和刀片形。第一刺破件、第二刺破件和第三刺破件的数量分别独立地为至少1个。具体地，第二液囊122的个数与清洗的次数相对应。例如，在清洗次数为两次时，第二液囊122的个数为两个。当然，多个第二液囊122间隔设置。需要说明的是，此处的清洗次数是指清洗捕获抗原或捕获抗体与被检测物质形成的抗原抗体复合物和带有标记的抗原抗体复合物的次数。在图示的实施例中，第一液囊121的个数为一个，第二液囊122的个数为三个，第三液囊123的个数为一个。可选地，第一液囊121的稀释液可以与第三液囊123的稀释液相同。
可选地，液囊组件120具有容纳液囊的液囊腔，液囊腔与液囊的个数对应。
具体地，第二液囊122的个数与清洗的次数向对应。例如，在清洗次数为两次时，第二液囊122的个数为两个。当然，多个第一液囊121间隔设置。需要说明的是，此处的清洗次数是指清洗过敏原或捕获抗体与被检测物质及标记抗体形成复合物的次数。在图示的实施例中，第一液囊121的个数为一个，第二液囊122的个数为三个，第三液囊123的个数为一个。可选地，第一液囊121的稀释液可以与第三液囊123的稀释液相同。在一些实施例中，第一液囊121、第二液囊122和第三液囊123的容积分别独立地为100μL～1200μL。
进一步地，微流控芯片10还包括盖板130，盖板130盖合于盖合面110a上。盖板130与芯片主体110的盖合使得芯片上的各个腔室的朝向盖合面110a的开口被封堵，进而腔室中的液体不会从该开口溢出而影响反应。第一液囊121、第二液囊122和第三液囊123均位于盖板130的远离芯片主体110的一侧，盖板130上设有与第一液囊121、第二液囊122和第三液囊123分别对应的通孔。盖板130上设置的通孔用于使得液囊中的液体能够流入混匀腔113。在本实施方式中，芯片主体110的厚度为2mm～8mm；盖板130的厚度为0.5mm～2mm。
可选地，盖板130的材料包括但不限于玻璃、PDMS、PMMA、PET或PC。
更进一步地，微流控芯片10还包括用于粘合盖板130与芯片主体110之间的粘合层140。在本实施方式中，粘合层140的厚度为0.03mm～0.2mm。
此外，本申请一实施方式还提供了一种上述微流控芯片10的制备方法，该方法包括：注塑或数控加工得到芯片主体110；将发光底物冻干珠置于底物试剂腔116、标记抗体冻干珠和不同的过敏原冻干珠置于对应的免疫反应腔115a、背景质控冻干珠置于对应的免疫反应腔115a、和试剂降解质控冻干珠置于对应的免疫反应腔115a后，将粘合层140放置与芯片主体110上；将盖板130盖合到粘合层140上后加压粘合；将第一液囊121、第二液囊122和液囊粘于盖板130的对应处，制得微流控芯片10。
可选地，盖板130与芯片主体110的连接不限于上述的粘合层140连接，还可以是超声波焊接、激光焊接等。当然，也可以同时采用粘合层140和其他封接技术。
在其中一个实施例中，发光底物冻干珠的制备步骤包括：在将发光底物与冻干稀释剂混合后，冷冻干燥，制备发光底物冻干珠。在另一个实施例中，发光底物冻干珠的制备步骤包括：在发光底物溶液中加入助剂、表面活性剂和防腐剂，然后通过液氮点样仪点样制成冷冻微球，再将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后，制得圆球状固态的发光底物冻干球。当然，助剂、表面活性剂及防腐剂的种类和用量和冻干稀释剂如上文描述，此处不再赘述。
在其中一个实施例中，标记抗体冻干珠的制备步骤包括：在将标记抗体与冻干稀释剂混合后，冷冻干燥，制备标记抗体冻干珠。
在其中一个实施例中，过敏原冻干珠的制备步骤包括：在将过敏原与载体分别与冻干稀释剂混合后，分别冷冻干燥，制备过敏原冻干珠。此时，过敏原与载体以相互独立的冻干珠的形式存在。在另一个实施例中，过敏原冻干珠的制备步骤包括：在将过敏原与载体偶联后与冻干稀释剂混合，然后冷冻干燥，制备过敏原冻干珠。此时，过敏原冻干珠的过敏原已经与载体连接。
在其中一个实施例中，背景质控冻干珠包括连接有链霉亲和素的磁珠冻干珠和碱性磷酸酶冻干珠。此时，背景质控冻干珠的制备步骤包括：将连接有链霉亲和素的磁珠和碱性磷酸酶分别与冻干稀释剂混合，然后分别冷冻干燥，制备得到连接有链霉亲和素磁珠冻干珠和碱性磷酸酶冻干珠。试剂降解质控冻干珠包括链霉亲和素磁珠冻干珠和碱性磷酸酶生物素偶联物冻干珠。此时试剂降解质控冻干珠的制备步骤包括：将连接有链霉亲和素的磁珠和碱性磷酸酶生物素偶联物分别与冻干稀释剂混合，然后分别冷冻干燥。
此外，本申请一实施方式还提供一种过敏原的检测方法，该方法使用上述检测过敏原的微流控芯片进行、检测。具体地，包括下述步骤：
将全血样本注入进样腔后，利用全血分离结构分离全血，得到位于血浆腔的血浆；将血浆腔中的血浆转移到混匀腔；将血浆稀释液引入混匀腔，以稀释混匀腔中的血浆；将混匀腔中稀释后的血浆通过分液流道分配至各个免疫反应腔；在各个免疫反应腔中，稀释后的血浆与预装的用于免疫反应的试剂反应，以形成抗原抗体复合物；在各个免疫反应腔反应结束后，将各个免疫反应腔中的除抗原抗体复合物外的物质转移到反应废液腔；将清洗液通过混匀腔引入各个免疫反应腔，以清洗反应结束后各个免疫反应腔中形成的抗原抗体复合物；在清洗结束后，将发光底物稀释液经底物试剂腔、混匀腔、分液流道转移至各个免疫反应腔中进行反应，使抗原抗体复合物上的标记物催化底物反应产生化学发光信号；检测带标记的抗原抗体复合物所产生的化学发光信号。
进一步地，在利用全血分离结构分离全血步骤中，离心的转速为1000rpm～5000rpm，离心时间为90s～150s；在将混匀腔中稀释后的血浆通过分液流道分配至各个免疫反应腔的步骤包括：采用100rpm～1200rpm的离心转速离心1s～60s将稀释后的血浆分配至各个分杯腔中；及采用1000rpm～2000rpm的离心转速离心1s～60s将各个分杯腔中的血浆分配至各个免疫反应腔；在将各个免疫反应腔中的除抗原抗体复合物外的物质转移到反应废液腔的步骤中，离心转速为1000rpm～2000rpm，离心时间为1s～60s；在将清洗液通过混匀腔引入各个免疫反应腔的步骤中，离心转速为100rpm～1200rpm，离心时间为1s～60s；在将发光底物稀释液经底物试剂腔、混匀腔、分液流道转移至各个免疫反应腔的步骤中，离心转速为100rpm～1200rpm，离心时间为1s～60s。
更进一步地，上述检测方法包括下述步骤：
S1：将全血样本注入上述任一实施例的微流控芯片的进样腔中；
S2：以离心转速1将全血样本通过微流道转移至沉降池中；
S3：以离心转速2将沉降池中的全血样本转移至血浆腔及血球腔中，多余的全血会通过平台部进入到收集部和血样足量检测腔中。
S4：以离心转速3将血浆腔及血球腔中的全血进行离心，以将血浆与血细胞分离。
S5：以离心转速4将血浆腔中的血浆经由第一虹吸流道进入混匀腔中后，微流控芯片停止转动，外力将第一液囊顶破，第一液囊里的用于与血浆混合的稀释液A流入混匀腔。
S6：以混匀离心转速5将血浆与稀释液A充分混匀。
S7：在离心转速6的条件下，将混匀腔中的混合液经第二虹吸流道进入流道和分杯腔中。
S8：在离心转速7的条件下，分杯腔中的混合液经第一微流道进入免疫反应腔，混合液复融预装在免疫反应腔中的冻干球并充分反应后，磁铁上升吸住混合液中的磁颗粒(磁珠)。
S9：以离心转速8将免疫反应腔中的液体经第二微流道进入反应废液腔中。
S10：磁铁下降，微流控芯片停止转动，用外力将其中一个第二液囊顶破，以将第二液囊中的清洗液释放，清洗液经微流道进入混匀腔，以离心转速6将混匀腔里的液体经第二虹吸微流道进入主流道和分杯中。
S11：以离心转速7将分杯腔中的液体经第一微流道进入免疫反应腔中后，以离心转速9对磁珠颗粒进行充分清洗，然后磁铁上升吸住混合液中的磁颗粒。
S12：以离心转速8将免疫反应腔中的液体经第二微流道进入反应废液腔中。
S13：磁铁下降，微流控芯片停止转动，外力将另一个第二液囊顶破以将清洗液释放入混匀腔后，以离心转速6将混匀腔里的清洗液经第二虹吸流道进入主流道和分杯腔中。
S14：重复执行上述步骤S11～13。
S15：外力将另一个第二液囊顶破以将清洗液释放进入混匀腔后，以离心转速6将混匀腔里的清洗液经第二虹吸流道进入主流道和分杯腔中。
S16：重复执行上述步骤S11～13。
S17：外力将第三液囊顶破以将稀释液释放进入底物试剂腔，复融预装在底物试剂腔的发光底物并进入混匀腔，以离心转速6将混匀腔里的液体经第二虹吸流道进入主流道和分杯腔中。
S18：重复执行上述步骤S11～13。
S19：采集各免疫反应腔的信息，分析数据，输出结果。
在步骤S2中，离心转速1为100～1200rpm，离心时间为1s～60s。
在步骤S3中，离心转速2为100～1400rpm，离心时间为1s～60s。
在步骤S4中，离心转速3为1000～5000rpm，离心时间为90s～150s。
在步骤S5中，离心转速4为100～1200rpm，离心时间为1s～60s。
在步骤S6中，离心转速5为100～4000rpm，离心时间为1s～60s。
在步骤S7、步骤S10、步骤S13、步骤S15和步骤S17中，离心转速6为100rpm～1200rpm，离心时间为1s～60s。
在步骤S8中，离心转速7为1000～2000rpm，离心时间为1s～60s。
在步骤S9和步骤S12中，离心转速8为1000～2500rpm，离心时间为1s～60s。
在步骤S11中，离心转速9为100～1200rpm，离心时间为1s～180s。
需要说明的是，在本实施方式中，旋转半径为60mm。
在上述的步骤S19中，微型PMT依次定位各项目对应的反应腔并采集发光强度RLU与相应项目浓度后拟合浓度与发光强度的曲线。
在其中一个实施例中，该曲线为四参数拟合曲线，该曲线为非线性方程，是建立了标准曲线获得该曲线的各参数后，对各项目数据进行分析换算实现定量或半定量检测。进一步地，数据分析具体步骤包括：
1、以参考品的预期浓度X为横坐标，对应的发光强度RLU为纵坐标作图，获得各项目四参数拟合曲线及其方程式参数，即RLU＝(a-d)/[1+(X/b)^c]+d，其中a、b、c、d为方程式参数；
2、将目标全血样本待测项目对应的反应腔采集的RLU减去背景质控腔的发光强度RLU值，得出该项目的RLU净值；
3、将试剂降解质控腔采集的发光强度RLU减去背景质控腔的发光强度RLU值，得出该试剂降解质控腔的RLU净值；
4、根据试剂降解质控腔的RLU净值的改变，换算各项目的RLU净值，并将各项目换算后的RLU净值代入方程式：X＝b×[(a-d)/(RLU-d)-1]^(1/c)，计算出目标全血样本待测项目对应的浓度指标。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
本实施例制备了一种检测吸入性及食物性过敏原特异性IgE抗体的微流控芯片，该微流控芯片的结构如图1所示，该微流控芯片的具体的制备方法包括但不限于如下步骤：
1.生物素偶联物的制备
将屋尘螨、粉尘螨、屋尘、猫毛、狗上皮、蟑螂、点青霉、烟曲霉、交链孢霉、分枝孢霉、柳树、杨树、榆树、葎草、艾蒿、豚草、鸡蛋白、蛋黄、牛奶、花生、大豆、牛肉、羊肉、虾、蟹、鳕鱼、龙虾、扇贝、桃、苹果、芒果、荔枝、草莓、腰果、开心果、榛子、杏仁、核桃及CCD的过敏原提取物、鼠抗人IgE抗体和碱性磷酸酶分别置于透析袋中，在PBS缓冲液中过夜透析；用PBS缓冲液配制生物素-N-羟基琥珀亚胺酯溶液Biotin-NHS，每1mg抗原(过敏原)或抗体中加入10μL Biotin-NHS溶液，混合均匀，室温反应60min；将标记好的生物素偶联物置于透析袋中，在PBS缓冲液中过夜透析。
2.碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体的制备
用PB缓冲液配制4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)溶液，每1mg碱性磷酸酶中加入0.1mL Sulfo-SMCC溶液，混合均匀，室温反应30min，在PB缓冲液中透析；用PB缓冲液配制2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(2-IT)溶液，每1mg鼠抗人IgE抗体中加入0.1mL 2-IT，混合均匀，室温反应30min，在PB缓冲液中透析；将上述透析后的碱性磷酸酶和鼠抗人IgE抗体混合均匀，室温反应120min，得到碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体。
3.冻干稀释液的制备
向TBS缓冲液中加入5％的甘露醇、0.5％的海藻糖、0.2％的蔗糖、2％的乳糖、4％的PEG、4％的PVP、0.5％的BSA、0.5％的明胶，再加入0.1％的吐温20，最后再加入0.01％的硫柳汞、0.5％的氯化钙和0.01％的硫代甘油，得到冻干稀释液。
4.链霉亲和素磁珠冻干球的制备
选择1μm～5μm粒径范围的链霉亲和素磁珠制备链霉亲和素磁珠冻干球，取10mg链霉亲和素磁珠重复“磁分离——置换稀释液(冻干稀释液)——混匀”操作步骤3次，继续加入10mL冻干稀释液适当稀释磁珠，得到链霉亲和素磁珠冻干液。链霉亲和素磁珠冻干液通过液氮点样仪点样制成冷冻微球，再将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后即得圆球状固态链霉亲和素磁珠冻干球。
5.生物素偶联物冻干球的制备
将步骤1中制备的生物素偶联物用步骤3制得的冻干稀释液以1μg/mL的浓度稀释配制成生物素偶联物冻干液。生物素偶联物冻干液通过液氮点样仪点样制成冷冻微球，再将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后，得圆球状固态的生物素偶联物冻干球。
6.碱性磷酸酶冻干球的制备
将碱性磷酸酶用冻干稀释液以0.5μg/mL的浓度稀释配制成碱性磷酸酶冻干液。将碱性磷酸酶冻干液通过液氮点样仪点样制成冷冻微球，再将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后，制得圆球状固态的碱性磷酸酶冻干球。
7.碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体冻干球的制备
将碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体用步骤3制得的冻干稀释液以0.5μg/mL的浓度稀释配制成碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体冻干液。将碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体冻干液通过液氮点样仪点样制成冷冻微球，再将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后，制得圆球状固态的碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体冻干球。
8.发光底物冻干球的制备
向发光底物溶液中加入12％的甘露醇、5％的乳糖、3％的PVP，再加入0.01％的硫柳汞，最后通过液氮点样仪点样制成冷冻微球，再将冷冻微球转入冻干机，真空冷冻干燥后，制得圆球状固态的发光底物冻干球。
9.芯片的组装：
通过注塑或者机加工的方式加工得到芯片主体110。27个免疫反应腔114a中的其中25个分别装入各项目过敏原提取物(1屋尘螨(数字“1”表示编号，下同)、2粉尘螨、3屋尘、4猫毛、5狗上皮、6蟑螂、7点青霉/烟曲霉/交链孢霉/分枝孢霉、8柳树/杨树/榆树、9葎草、10艾蒿、11豚草、12鸡蛋白、13蛋黄、14牛奶、15花生、16大豆、17牛肉、18羊肉、19虾、20蟹、21鳕鱼/龙虾/扇贝、22桃/苹果/芒果/荔枝/草莓、23腰果/开心果/榛子/杏仁/核桃、24CCD)和25鼠抗人IgE抗体的生物素偶联物冻干球、链霉亲和素磁珠冻干球和碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE抗体冻干球；余下的2个免疫反应腔114a的其中一个为背景质控腔，装入链霉亲和素磁珠冻干球和碱性磷酸酶冻干球，另外一个为试剂降解质控腔，装入链霉亲和素磁珠冻干球和碱性磷酸酶生物素偶联物冻干球。底物试剂腔116中装入发光底物冻干球。然后通过封膜设备将粘合层140覆盖在芯片主体110上，再将盖板130覆盖在粘合层140上，形成组合芯片。对组合芯片施加一定压力，使三者紧密粘接在一起。最后将带有胶的第一液囊121、第二液囊122、第三液囊123粘贴在对应位置，压紧。此时，检测吸入性及食物性过敏原特异性IgE抗体的微流控芯片10制作完成。
实施例2
采用实施例1制得的吸入性及食物性过敏原特异性IgE抗体芯片，对20份全血样本进行11项吸入组、12项食物组过敏原特异性IgE抗体及总IgE抗体进行检测。每份样本检测的具体步骤包括：
1.将500μL血样注入到微流控芯片10的进样腔111中，然后将微流控芯片10放入与该芯片配套检测机器中。
2.机器首先执行离心转速1(100rpm)，将血样通过微流道转移至沉降池117中。
3.接着执行离心转速2(150rpm)将血样转移至血浆腔112a中。多余的血液会通过平台部112d进入收集部112e和血样足量检测腔112f中。
4.机器执行高速离心转速3(1000rpm)，将血浆腔112a中的全血进行离心，达到设定时间，血浆与血细胞分离。
5.机器执行低速离心转速4(100rpm)。在转速4的情况下，血浆腔112a中的血浆经由第一虹吸流道118进入混匀腔113中；与此同时，机器的顶破机构将位于液囊入口上方的装有稀释液A的第一液囊121顶破。第一液囊121里的稀释液A经由微流道流入混匀腔113中。
6.一定时间后，机器执行混匀离心转速5(150rpm)，在此转速下，血浆与稀释液A充分混匀。
7.在离心转速6(100rpm)时，混匀腔113中的混合液经由第二虹吸流道119进入主流道114a中，并同时进入分杯腔114b中。
8.待等分完成后，机器执行离心转速7(1050rpm)，分杯腔114b中的混合液经第一微流道115c进入免疫反应腔115a中。此时混合液复溶预装在免疫反应腔115a中的冻干球。两者之间充分反应10mins。此时机器中磁铁上升，吸住混合液中的磁珠。
9.机器执行离心转速8(1050rpm)，免疫反应腔115a中的液体经第二微流道115d进入反应废液腔115b中。此时系统完成一轮反应。
10.顶破机构将靠近第一液囊121的第二液囊122顶破，稀释液B经微流道进入混匀腔113。机器执行离心转速6。混匀腔113里的试剂经第二虹吸流道119进入主流道114a中，并同时进入分杯腔114b中。
11.待等分完成后，机器执行离心转速7，分杯腔10013中的混合液经第一微流道115c进入免疫反应腔115a中。机器执行清洗离心转速9(100rpm)，清洗液对磁珠颗粒进行充分清洗。然后机器中磁铁上升，吸住混合液中的磁颗粒。
12.机器执行离心转速8，免疫反应腔115a中的液体经第二微流道115d进入反应废液腔115b中。此时系统又完成一轮反应。
13.顶破机构将另一个第二液囊122顶破，稀释液B经微流道进入混匀腔113。机器执行离心转速6。混匀腔113里的试剂经第二虹吸流道119进入主流道114a中，并同时进入分杯腔114b中。
14.重复执行上述步骤11～13，又完成一轮反应。
15.顶破机构将剩余的一个第二液囊122顶破，稀释液B经微流道进入混匀腔113。机器执行离心转速6。混匀腔113里的试剂经第二虹吸流道119进入主流道114a中，并同时进入分杯腔114b中。
16.重复执行上述步骤11～13，又完成一轮反应。
17.顶破机构将第三液囊123顶破，稀释液A进入底物试剂腔116，机器执行混匀离心转速5，复溶预装在此处的发光底物冻干球，液体随后进入混匀腔113。机器执行离心转速6。混匀腔113里的试剂经第二虹吸流道119进入主流道114a中，并同时进入分杯腔114b中。
18.待等分完成后，机器执行离心转速7，分杯腔114b中的混合液经第一微流道115c进入免疫反应腔115a中。机器执行清洗离心转速9，并维持孵育反应1mins。
19.反应后，机器旋转盘片并将微型PMT依次定位各反应腔并采集发光强度数据，仪器后台分析数据，输出各项目浓度结果，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003879755240000221
Figure BDA0003879755240000231
从表1可知，实施例1制得的吸入性及食物性过敏原特异性IgE抗体芯片能够对全血样本进行11项吸入过敏原和12项食物性过敏原的特异性IgE抗体及总IgE抗体进行检测。通过上述检测结果，临床医生可以综合患者病史、体征及体内试验等其他临床信息作为诊断IgE介导过敏性疾病的的辅助手段。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种检测过敏原的微流控芯片，其特征在于，包括：
芯片主体，所述芯片主体具有旋转中心，所述芯片主体上设置有：
进样腔；
全血分离结构，具有血浆腔、血球腔和血液废液腔，所述血浆腔与所述进样腔连通，所述血球腔和所述血液废液腔分别与所述血浆腔连通，所述血球腔较所述血浆腔更远离所述旋转中心；
混匀腔，与所述血浆腔连通；
弧形的分液流道，所述分液流道包括主流道和多个分杯腔，所述主流道具有入口端和出口端，所述入口端与所述混匀腔连通；所述主流道呈弧状，多个所述分杯腔在所述主流道的周向上间隔排布并与所述主流道连通，所述主流道到所述旋转中心的距离自所述入口端到所述出口端逐渐增大；
多个反应单元，多个所述反应单元沿旋转周向间隔分布，所述反应单元包括免疫反应腔和与所述免疫反应腔连通的反应废液腔，所述免疫反应腔与所述分杯腔对应连通，所述分杯腔、所述免疫反应腔和所述反应废液腔在所述主流道的径向上沿远离所述旋转中心的方向依次排布；部分所述免疫反应腔内预装有过敏原冻干珠和标记抗体冻干珠，所述过敏原冻干珠包括过敏原和载体，各所述免疫反应腔内的过敏原不同；
预装有发光底物冻干珠的底物试剂腔，所述底物试剂腔与所述混匀腔连通；
液囊组件，所述液囊组件包括储存有血浆稀释液的第一液囊、储存有清洗液的第二液囊和储存有发光底物稀释液的第三液囊，所述第一液囊中的血浆稀释液能够进入所述混匀腔，所述第二液囊中的清洗液能够进入所述混匀腔，所述第三液囊中的发光底物稀释液能够经所述底物试剂腔进入所述混匀腔。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述反应单元至少12个；各所述过敏原分别独立地来源于如下的一组：屋尘螨；粉尘螨；屋尘；猫毛；狗毛；蟑螂；霉菌；花粉；葎草；艾蒿；豚草；鸡蛋白；蛋黄；牛奶；花生；大豆；牛肉；羊肉；虾；蟹；海鲜；易致敏水果；坚果；CCD。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述易致敏水果包括桃、苹果、芒果、荔枝和草莓中的至少一种；和/或，所述花粉包括柳树花粉、杨树花粉和榆树花粉中的至少一种；和/或，所述海鲜包括鳕鱼、龙虾和扇贝中的至少一种；和/或，所述坚果包括腰果、开心果、榛子、杏仁和核桃中的至少一种；和/或，所述霉菌包括青霉、烟曲霉、交链孢霉和分枝孢霉中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，部分所述免疫反应腔内预装有背景质控冻干珠，部分所述免疫反应腔中预装有试剂降解质控冻干珠。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述载体与所述过敏原能够通过亲和素与生物素偶联。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述载体为连接有链霉亲和素的磁珠，所述过敏原上偶联有生物素。
7.根据权利要求1～6任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述过敏原冻干珠、所述标记抗体冻干珠和所述发光底物冻干珠分别独立地含有冻干后的冻干稀释剂，所述冻干稀释剂冻干之前包括缓冲液、质量百分含量为3％～20％的助剂、质量百分含量为0.01％～1％的表面活性剂和质量百分含量为0.01％～0.5％的防腐剂；所述助剂包括甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、右旋糖酐、PEG、PVP、BSA和明胶中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，所述表面活性剂包括吐温20、吐温80、司盘80、曲拉通X-45、曲拉通X-100中的至少一种；
和/或，所述缓冲液为TBS缓冲液；
进一步地，所述过敏原冻干珠中还含有蛋白保护剂和抗氧化剂中的至少一种；和/或，所述标记抗体冻干珠中含有蛋白保护剂和抗氧化剂中的至少一种。
9.根据权利要求1～6和8中任一项所述的微流控芯片，其特征在于，所述液囊组件具有第一腔、第二腔和第三腔，所述第一腔和所述第二腔分别与所述混匀腔连通，所述第三腔经所述底物试剂腔与所述混匀腔连通，所述第一液囊位于所述第一腔中，所述第二液囊位于所述第二腔中，所述第三液囊位于所述第三腔中。
10.一种过敏原的检测方法，其特征在于，采用权利要求1～9任一项所述的微流控芯片进行检测。
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