CN115561296A - 一种用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法,属于纳米孔传感技术领域。该方法采用方波电压多次循环推出堵塞孔道并粘附在孔壁的蛋白质,将通孔后的氮化硅纳米孔进行膜片钳测试，电流基线恢复到堵孔之前的数值且基线平稳，表明纳米孔恢复原始正常测试状态。解决了氮化硅纳米孔在检测蛋白质过程中蛋白质粘附孔壁后无法继续使用的难题，进行通孔后的纳米孔能继续进行检测实验，不仅提高了实验效率，还降低了纳米孔实验成本。本发明提供的方波电压通孔的方法操作简单，且可重复性好，同时可适用于其他固态纳米孔，具有较高的应用价值和经济价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米孔传感技术领域，尤其涉及一种脉冲电压对被蛋白质堵塞的氮化硅纳米孔进行通孔再利用的方法。
背景技术
纳米孔检测技术作为一种新型孔传感分析技术，具有低成本、高通量、无需标记等优点，其工作原理是基于电阻脉冲传感，两个充满电解质的储层被一层薄的、不透水的膜隔开，并通过一个纳米孔连接。在纳米孔两端施加一个外加电场，通过监测电解液流经纳米孔时的微弱电流(皮安级)信号变化，包括电流阻塞的幅值和停留时间、变化频率和指纹性信号等来判断穿过纳米孔的离子或分子的浓度、带电情况和结构特征等。
纳米孔是单分子分辨率传感器，在基因组学、糖组学、脂质组学、和病毒学等领域的应用越来越广泛。最近，蛋白质已成为纳米孔研究的焦点。某些蛋白质和酶的调节异常通常被认为是许多病理的指标，并且这些与疾病相关的蛋白质可以用作诊断疾病发作和进展的生物标志物。氮化硅纳米孔在蛋白质检测方面特别有优势，因为它们不仅机械强度高，而且对孔的大小、结构和表面性质进行改造的更易实现。但是蛋白质在固态表面上的非特异性吸附是检测过程中的一个障碍。尽管对液-固界面处的蛋白质吸附进行了许多实验研究，但这种现象仍未得到全面了解。
氮化硅纳米孔在检测蛋白质中的过程不可避免的会出现蛋白质吸附到孔壁的现象，此时一般会选择施加一个比测试电压稍大的电压或者比测试电压稍大的反向电压把蛋白推出孔，当这两种方式都无法将蛋白推出，氮化硅纳米孔将无法继续使用，面对这种影响测试效率并且增加测试成本的情况，我们需要一种方法使堵孔后的氮化硅纳米孔恢复原始正常测试状态。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供了一种用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，使被蛋白质堵塞的氮化硅纳米孔恢复到原始正常测试状态，使其能够进行后续实验。
技术方案：本发明所述的用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，包括以下步骤：
(1)制备氮化硅纳米孔检测平台并进行蛋白质检测；
(2)蛋白质堵塞孔壁后采用施加比步骤(1)检测电压稍大的偏置电压推出部分蛋白质；
(2)采用方波电压多次循环推出堵塞孔道并粘附在孔壁的蛋白质；
(3)将通孔后的氮化硅纳米孔进行膜片钳测试，电流基线恢复到堵孔之前的数值且基线平稳，表明纳米孔恢复原始正常测试状态。
进一步的，所述氮化硅纳米孔使用的氮化硅纳米芯片(NBPT001Z-HR)从加拿大Norcada公司订购，氮化硅膜的厚度为12±2nm。将所述氮化硅纳米孔芯片用氧等离子体正反面各清洗1分钟后，采用介电击穿法(CBD)形成纳米孔。
具体的，介电击穿法为施加6.5V电压经数千秒达到阈值电流300nA，代表着纳米孔的形成。
进一步的，所述步骤(1)中氮化硅纳米孔检测平台通过以下方法构建：采用聚四氟乙烯检测池，将带有纳米尺度孔洞的氮化硅纳米孔芯片安装在检测池中，并将电解质溶液加入到两侧液池直至液面超过氮化硅纳米孔芯片窗口，形成氮化硅纳米孔检测平台。蛋白质检测时将蛋白质溶液加到接地的Cis室中，施加正跨膜电位以驱动BSA穿过孔。
进一步的，步骤(2)中所述施加稍大的偏置电压是检测蛋白质使纳米孔堵塞时跨膜电位的1.5-2倍的正/负跨膜电位。
进一步的，步骤(2)中所述方波电压为正负脉冲电，例如0.5V持续数秒，-0.5V持续数秒以此多次循环往复直至将堵塞在孔壁的蛋白质推出。
进一步的，步骤(3)中膜片钳测试是通孔后施加一定正/负跨膜电位时的电流回到了纳米孔堵塞之前的电流值，且基线平稳。
有益效果：与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下显著优点：本发明采用方波电压进行通孔，能有效避免氮化硅纳米孔被蛋白质堵塞后无法继续使用的问题，而且根据方波电压的高低可以控制通孔后纳米孔的孔径大小，当使用较小的电压进行通孔后纳米孔孔径几乎不发生变化，当电压较大时可能造成纳米孔孔径变大。本发明方法能在蛋白质堵孔后有效提高氮化硅纳米孔的使用时间，不仅提高了测试效率也降低了实验成本，本发明提供的方波电压通孔的方法操作简单，且可重复性好，同时可适用于其他固态纳米孔，具有较高的应用价值和经济价值。
附图说明
图1是介电击穿打孔的装置和纳米孔形成过程图；
图2是本发明实施例1检测BSA过程中堵孔后通孔电流轨迹图，其中图2a是施加反向电压依然处于堵孔状态的电流轨迹图，图2b是通孔时施加的方波电压示意图及在此方波电压下电流随时间的变化，图2c是通孔后不同电压下膜片钳测试的电流轨迹图；
图3是本发明实施例2检测IgG(免疫球蛋白G)过程中堵孔后通孔电流轨迹图，其中图3a是施加反向电压依然处于堵孔状态的电流轨迹图；图3b是通孔时施加的方波电压示意图及在此方波电压下电流随时间的变化，图3c是通孔后不同电压下膜片钳测试的电流轨迹图；
图4是发明实施例3检测Papain(木瓜蛋白酶)过程中堵孔后通孔电流轨迹图，其中图4a是施加反向电压依然处于Papain堵孔状态的电流轨迹图，图4b是通孔时施加的方波电压示意图及在此方波电压下电流随时间的变化，图4c是通孔后不同电压下膜片钳测试的电流轨迹图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明，但有必要指出以下实施例只用于对发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。此外，对本领域的研究人员来说熟知的公知结构及其说明进行了部分省略。
实施例1
制备氮化硅纳米孔进行BSA检测
(1)制备氮化硅纳米孔检测平台
①取厚度为12±2nm的氮化硅(SiNx)纳米芯片，将其用氧等离子体正反面各清洗一分钟。
②把处理好的芯片安装到检测池中，将pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl溶液加入到检测装置的液池直至液面超过氮化硅窗口处，两个液池中分别插入Ag/AgCl电极。施加6.5V电压经数千秒达到阈值电流300nA，代表着纳米孔的形成。如图1所示。
(2)利用氮化硅纳米孔进行BSA检测
①将打孔完成的实验装置放在屏蔽笼中，此时插入液池中的两Ag/AgCl电极分别和膜片钳放大器(Axon 200B)正负极连接。膜片钳放大器的正极插入液池的Trans端，负极插入Cis端。
②将BSA溶液加入pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl的溶液中至BSA终浓度为135nM。已知BSA等电点约为4.5，在配制好的测试溶液中BSA整体带负电荷。将此混合溶液加入检测装置的Cis端，Trans端溶液为pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl，施加正偏置电压可以观察到BSA过孔信号。
③如图2a所示当BSA堵在孔中，施加负偏置电压(-200mV)，再次施加100mV电流没有回到正常值基线噪音也变得很大，这说明施加负偏置电压已经不能把BSA从纳米孔中推出，此时将液池中的BSA溶液吸出并冲洗干净后，换成pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl溶液再放置到Keithley 6487电表施加如图2c所示的方波电压，即0.5V持续3s再-0.5V持续3s依次循环，可以看到随着施加电压的变化电流也逐渐变大。
④将通孔后的装置放入屏蔽笼中用膜片钳进行电流测试，不同电压下电流轨迹图显示回到堵塞前的电流水平，且基线平稳，表明氮化硅纳米孔已经从堵塞状态恢复原始正常测试状态，证明此方波压通孔方法对于氮化硅检测BSA可行。
实施例2
制备氮化硅纳米孔进行IgG(免疫球蛋白G)检测
(1)制备氮化硅纳米孔检测平台
①取厚度为12±2nm的氮化硅(SiNx)纳米芯片，将其用氧等离子体正反面各清洗一分钟。
②把处理好的芯片安装到检测池中，将pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl溶液加入到检测装置的液池直至液面超过氮化硅窗口处，两个液池中分别插入Ag/AgCl电极。施加6.5V电压经数千秒达到阈值电流300nA，代表着纳米孔的形成。如图1所示。
(2)利用氮化硅纳米孔进行IgG(免疫球蛋白G)检测
①将IgG溶液加入pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl的溶液中至IgG终浓度为440nm。已知IgG等电点约为8.5，在配制好的测试溶液中IgG整体带正电荷，将此混合溶液加入检测装置的Cis端，Trans端溶液为pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl，施加负偏置电压可以观察到IgG过孔信号。
②如图3a所示若实验过程中出现电流减小且不能回到正常基线电流值即为IgG堵在孔中，这时施加正偏置电压(200mV)，可以看到基线噪音变大纳米孔仍处于堵塞状态。
③这说明施加正偏置电压已经不能把IgG从纳米孔中推出，此时我们将液池中的IgG溶液吸出并冲洗干净后，换成pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl溶液再放置到Keithley6487电表施加如图3b中所示的方波电压，即0.5V持续3s再-0.5V持续3s依次循环，可以看到随着施加电压的变化电流也逐渐变大，表明氮化硅纳米孔已经从堵塞状态恢复原始正常测试状态。
④将通孔后的装置放入屏蔽笼中进行电流测试，不同电压下电流轨迹图显示回到堵塞前的电流水平，且基线平稳，表明氮化硅纳米孔已经从堵塞状态表明纳米孔恢复原始正常测试状态，证明此方波压通孔方法对于氮化硅检测IgG可行。
实施例3
制备氮化硅纳米孔进行Papain(木瓜蛋白酶)检测
(1)制备氮化硅纳米孔检测平台
①取厚度为12±2nm的氮化硅(SiNx)纳米芯片，将其用氧等离子体正反面各清洗一分钟。
②把处理好的芯片安装到检测池中，将pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl溶液加入到检测装置的液池直至液面超过氮化硅窗口处，两个液池中分别插入Ag/AgCl电极。施加6.5V电压经数千秒达到阈值电流300nA，代表着纳米孔的形成。如图1所示。
(2)利用氮化硅纳米孔进行Papain(木瓜蛋白酶)检测
①将Papain溶液加入pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl的溶液中至Papain终浓度为640nm。已知Papain等电点约为8.75，在配制好的测试溶液中整体带正电荷，所以将此混合溶液加入检测装置的Cis端，Trans端溶液为pH＝8,1M KCl,10mM Tris-HCl，施加负偏置电压可以观察到Papain过孔信号。
②如图4a所示当施加-50mV的偏置电压时出现少量穿孔信号(局部放大图位于图4a中右上角)，后Papain粘附在纳米孔孔壁上造成电流稍有减小后没有了穿孔信号，不断施加100mV、200mV的偏置电压再切换到-100mV，可以看到基线噪音变大纳米孔仍处于堵塞状态。
③这说明施加正偏置电压已经不能把Papain从纳米孔中推出，此时我们将液池中Papain的溶液吸出并冲洗干净后，换成1M KCl溶液再放置到Keithley 6487电表施加如图4c中所示的方波电压，即0.2V持续3s再-0.2V持续3s依次循环，可以看到随着施加电压的变化电流也逐渐变大，表明氮化硅纳米孔已经从堵塞状态恢复原始正常测试状态。
④将通孔后的装置放入屏蔽笼中进行电流测试，不同电压下电流轨迹图显示回到堵塞前的电流水平，且基线平稳，表明氮化硅纳米孔已经从堵塞状态恢复原始正常测试状态。，证明此方波电压通孔方法对于氮化硅检测Papain可行。
综上所述，本发明提供了氮化硅纳米孔在蛋白质检测过程中出现堵孔后的一种通孔方法。本发明旨在解决氮化硅纳米孔在检测蛋白质过程中堵孔后无法继续使用的缺点，进行通孔后的纳米孔能继续进行检测实验，不仅提高了实验效率，还降低了纳米孔实验成本。本发明提供的方波电压通孔的方法操作简单，且可重复性好，在氮化硅纳米孔检测蛋白质堵孔后进行通孔时具有很好的效果。
最后说明的是，以上优选例和实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，本说明无需也无法对所有可能的实施方案进行列举。对于相关领域研究人员来说，可以在上述说明的基础上以不同形式对本技术方案进行修改、替换或改进，但需注意的是，凡是在本技术方案的宗旨和范围内进行的修改和改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围之内。
Claims (8)
1.一种用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备氮化硅纳米孔检测平台并进行蛋白质检测；
(2)蛋白质堵塞孔壁后采用施加比步骤(1)检测电压稍大的偏置电压推出部分蛋白质；
(3)采用方波电压多次循环推出堵塞孔道并粘附在孔壁的蛋白质；
(4)将通孔后的氮化硅纳米孔用膜片钳进行电流测试，电流基线恢复到堵孔之前的数值且基线平稳，表明纳米孔恢复原始正常测试状态。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，其特征在于，所述氮化硅纳米孔芯片厚度为12±2nm。
3.根据权利要求1所述的用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，其特征在于，步骤(1)中氮化硅纳米孔检测平台通过以下方法构建：采用聚四氟乙烯检测池，将带有纳米尺度孔洞的氮化硅纳米孔芯片安装在检测池中，并将电解质溶液加入到两侧液池直至液面超过氮化硅纳米孔芯片窗口，形成氮化硅纳米孔检测平台。
4.根据权利要求3所述的用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，其特征在于，步骤(1)中氮化硅纳米孔检测平台中的氮化硅纳米孔采用介电击穿法制备得到。
5.根据权利要求4所述的用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，其特征在于，所述介电击穿法为施加6.5V电压经数千秒达到阈值电流300nA。
6.根据权利要求1所述的用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，其特征在于，步骤(2)中所述反向电压为检测蛋白质使纳米孔堵塞时跨膜电位的1.5-2倍的相反跨膜电位。
7.根据权利要求1所述的用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，其特征在于，步骤(3)中方波电压为正负脉冲电压。
8.根据权利要求1所述的用于蛋白质堵塞氮化硅纳米孔后通孔再利用的方法，其特征在于：步骤(4)中膜片钳测试是通孔后施加一定正/负跨膜电位时的电流回到了纳米孔堵塞之前的电流值，且基线平稳。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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