CN115558028A

CN115558028A - 针对b7-h3和cd3的同源二聚体型双特异性抗体及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN115558028A
Application number: CN202110752364.5A
Authority: CN
Inventors: 高永娟; 朱康勇; 武翠; 董炤; 张玉华; 马心鲁; 贾世香; 李强
Original assignee: Anyuan Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Anyuan Pharmaceutical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2023-01-03

Abstract

提供一种同时靶向免疫效应细胞抗原CD3和肿瘤相关抗原B7‑H3的四价、同源二聚体型双特异性抗体分子，所述双特异性抗体分子从N端至C端依次包含第一和第二单链Fv和Fc片段；其中，第一单链Fv能够特异性结合B7‑H3，第二单链Fv能够特异性结合CD3，且第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连；所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP等效应子功能。所述双特异性抗体能够显著抑制或杀伤肿瘤细胞，又具有控制的可能由效应细胞过度活化所致的毒副作用；此外，这种双特异性抗体为同源二聚体型，不存在重链及轻链错配问题，纯化步骤简单高效，表达量高、且其理化和体内稳定性都显著提高。

Description

针对B7-H3和CD3的同源二聚体型双特异性抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及免疫学领域，更具体地，涉及一种介导T细胞杀伤的抗CD3双特异性抗体，以及这类抗体的用途，特别是其在治疗癌症、自身免疫中的用途。

背景技术

机体通过固有免疫和适应性免疫屏障排除异己以维持内环境稳定，而免疫屏障主要通过免疫细胞和免疫分子来执行其免疫功能，外源病原体和自身异常细胞(例如癌细胞)通常成为他们攻击的目标。T细胞是适应性免疫的主力军，在异常物质的刺激下能够迅速激活投入免疫应答。然而，T细胞的过度激活往往导致自身免疫疾病的产生，因此需要精准调控其激活程度以确保机体正常运转。表达在免疫细胞上的免疫检查点分子承担了这一职能，但是肿瘤细胞却利用相关机制逃避免疫反应。目前多个针对PD-1、PD-L1和CTLA4靶点的抗体药物的成功上市，证明靶向免疫检查点的抑制剂能够改善肿瘤患者存活。

细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)是免疫系统最有力的效应细胞，由经抗原刺激后被有效活化的初始T细胞增殖分化后产生。初始T细胞识别抗原需要通过APC的加工提呈，分别分布于两者表面的T细胞受体TCR-CD3复合物与MHC-抗原复合物的结合构成有效激活T细胞的第一信号。CD3分子是表达于所有成熟T淋巴细胞表面的蛋白，通过与TCR结合形成TCR-CD3复合物而启动对抗原刺激的体液免疫应答，因此成为介导免疫细胞(如T细胞，NK细胞等)杀伤型双特异性抗体中应用最多的效应细胞表面触发分子。CD3可以募集具有杀伤作用的CTL细胞，靶向CD3的双功能抗体通过分别结合T细胞表面CD3分子和靶细胞表面抗原，使CTL与靶细胞直接接触，进而激活T细胞并诱导其有效杀伤靶细胞。但是，第一代应用于临床的抗CD3单克隆抗体OKT3(Kung P等,Science,206:347-349,1979)，由于T细胞被过度激活而大量释放炎症因子，在临床上会引起严重的“细胞因子风暴综合症”(Hirsch R等,J.Immunol.,142:737-743,1989)。因而，开发靶向CD3的双功能抗体，如何削弱或避免过度的细胞因子风暴是首要考虑的问题。

一直以来，构建出具有正确重链和轻链组合的产物是双特异性抗体开发中最大的挑战。其中一类包含Fc结构域的双特异性抗体，因为FcRn介导的细胞内吞和再循环过程而具有更长的半衰期；同时保留了Fc介导的部分或全部效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖细胞毒性(CDC)和抗体依赖细胞吞噬(ADCP)作用；并且具有更好的溶解性，因而在双抗药物开发中得到广泛应用，包括Triomabs、knobs-into-holesIgG、Crossmab、ortho-Fab IgG、DVD IgG、IgG scFv、scFv2-Fc等。目前的IgG样抗CD3双特异性抗体设计广泛采用单价形式，主要是由于二价抗CD3双特异性抗体很容易导致过度激活而诱发T细胞凋亡和大量细胞因子瞬时释放(Kuhn C等,Immunotherapy,8:889-906,2016)，甚至可能引发非抗原依赖性激活T细胞反应而打破免疫平衡。但是，通常采用杂交瘤细胞表达此类具有非对称结构的异源二聚体时会同时产生许多密切相关却难以去除的非功能性错配副产物。尽管“knobs-into-holes”及其衍生技术的运用部分解决了异源二聚体型双抗分子的重链间错配的问题，然而“重链/轻链错配”又带来了另一个挑战。一种结合“CrossMab+knobs-into-holes”的策略可以将其错配减到最低程度，但却需要针对两个抗体序列进行大量的突变等基因工程改造，无法达到简单、通用的目的。

另外，类IgG结构的抗CD3双特异性抗体因具有FcγR结合能力，可能导致无限制的T细胞激活，且这种活化的T细胞发现于任何表达FcγR的组织内(例如在造血、淋巴和网状内皮系统内)，即使其未与靶抗原结合。这种T细胞的全身性激活，将伴随着细胞因子的大量释放，导致治疗应用过程中的严重不良反应。因此，开发这类介导T细胞杀伤的抗CD3双特异性抗体仅需要免疫效应细胞在靶细胞内的限制性激活。

B7-H3(B7homology 3protein,CD276)是B7/CD28家族重要的免疫检查点分子，以膜蛋白和可溶形式存在，广泛表达于免疫细胞和肿瘤细胞中。人类B7-H3主要常见的胞外域形式是4Ig亚型，包含两个细胞外串联IgV-IgC结构域(即，IgV-IgC-IgV-IgC)，而鼠中展示类似功能的是另一个人鼠共有亚型2Ig结构域。B7-H3在多种恶性肿瘤中均有表达，通常与恶性肿瘤的增殖、迁移、侵袭、预后不良等因素密切相关。B7-H3在不同肿瘤微环境中表现双重特性且主要发挥抑制性作用，一方面通过共刺激作用诱导T细胞免疫；另一方面通过抑制Treg细胞促使肿瘤免疫逃逸，并降低NK细胞等免疫细胞功能。此外，高表达于肿瘤微环境中的基质成纤维细胞和肿瘤相关血管，有可能允许B7-H3靶向疗法消除未表达B7-H3分子的癌细胞。研究表明，B7-H3可以和其他免疫检查点家族成员，例如PD-1或CTLA4等发挥协同作用(Lee YH等,Cell Res,27:1034-1045,2017)，帮助肿瘤逃避免疫反应，并且其联合阻断可增加疗效也已经被实验证明(Wei SC等,Cell,170:1120–1133,2017)。此外，B7-H3药物也有助于改善施用化疗药物导致的抗药性和耐药性(Flem-Karlsen K等,Pigment Cell MelanomaRes.,30:467-76,2017)。因此，开发在产品半衰期、安全性和可生产性方面具有优越性能的抗B7-H3/CD3双特异性抗体，单独以及与免疫检查点类药物或化疗药物联用，将会在许多B7-H3异常表达的疾病中具有诊断、治疗及监测价值。

发明内容

本发明目的是提供一种靶向免疫效应细胞抗原CD3和肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen,TAA)B7-H3的四价、同源二聚体型双特异性抗体分子，这种双特异性抗体在体内能够显著抑制或杀伤肿瘤细胞，但对低表达TAA的正常细胞的非特异性杀伤作用显著降低，同时具有控制的可能由效应细胞过度活化所致的毒副作用，且其理化性质显著提高。

本发明一个方面，提供一种针对B7-H3的双特异性抗体，所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链以共价键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链从N端至C端依次包含特异性结合肿瘤相关抗原B7-H3的第一单链Fv(抗-TAA scFv)、特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv(抗-CD3scFv)和Fc片段；其中，第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连，且所述Fc片段不具有效应子功能。

其中，第一单链Fv针对肿瘤相关抗原具有特异性，其所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽(L1)连接，所述VH、L1和VL以VH-L1-VL或VL-L1-VH的顺序排列，且所述连接肽L1的氨基酸序列为(GGGGX)_n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3；

示例性地，所述肿瘤相关抗原为B7-H3，包含但不限于：B7-H3的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物。

例如，本发明表1-1中例举了优选的针对B7-H3的第一单链Fv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列。

优选地，所述第一单链Fv特异性结合B7-H3，其包含的CDR1、CDR2和CDR3序列是：

VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：1、2和3所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：4、5和6所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

更优选地，所述第一单链Fv特异性结合B7-H3，其选自下组：

(i)VH结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；

(ii)VH结构域包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

其中，连接本发明所述第一单链Fv和第二单链Fv的连接肽(L2)由柔性肽和刚性肽组成。

进一步地，所述柔性肽包含2个或更多个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。更优地，所述柔性肽包含G和S残基。最优地，所述柔性肽的氨基酸组成结构通式为G_xS_y(GGGGS)_z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1。例如，在一优选实施例中，所述柔性肽的氨基酸序列为G₂(GGGGS)₃。

进一步地，所述刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列(如SEQ ID NO：17所示)或其截短的片段(以下统称为CTP)，或具有氨基酸置换的全长序列或其截短的片段(如SEQ ID NO：18所示)。优选地，所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：18N端的10个氨基酸或其突变型，例如SSSGKAPPPS(CTP¹)；或所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：17C端的14个氨基酸，即SRLPGPSDTPILPQ(CTP²)；又如，另一实施例中，所述CTP刚性肽包含SEQ ID NO：18N端的16个氨基酸或其突变型，例如SSSGKAPPPSLPSPSR(CTP³)；再如，另一些实施例中，所述CTP刚性肽包含28个氨基酸的全长序列或其突变型并开始于人绒毛膜促性腺激素β亚基的第118位，终止于第145位，例如SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(CTP⁴)。

例如，本发明表1-2中示例性的例举了一些优选的连接第一和第二单链Fv的连接肽L2的氨基酸序列。

在本发明的一优选实施例中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，其柔性肽的氨基酸组成为G₂(GGGGS)₃，和其刚性肽的氨基酸组成为SSSGKAPPPS(即CTP¹)。

其中，第二单链Fv针对免疫效应细胞抗原CD3具有特异性，其所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽(L3)连接，所述VH、L3和VL以VH-L3-VL或VL-L3-VH的顺序排列，且所述连接肽L3的氨基酸序列为(GGGGX)_n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3；

优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：9、10和11所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：12、13和14所示，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

更优选地，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

其中，本发明所述Fc片段直接或通过连接肽L4与第二单链Fv相连，且所述连接肽L4包含1-20个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；较优地地，所述连接肽L4选自Gly(G)和Ser(S)；更优选地，所述连接肽L4组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3或4。本发明的一优选实施例中，所述Fc片段与第二单链Fv直接相连。

另一方面，本发明所述Fc片段包含来源于人免疫球蛋白重链恒定区的铰链区、CH2和CH3结构域，例如，在某些实施方案中，本发明所述Fc片段来源于例如选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别地选自例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别地选自人IgG1或IgG4的重链恒定区；并且，所述Fc片段与其所源自的天然序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如，至多20个、至多15个、至多10个、或至多5个置换、缺失或添加)。

在一些优选实施方案中，所述Fc片段被改变，例如被突变，以修饰本发明所述双特异性抗体分子的性质(例如改变下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、效应细胞功能或补体功能)。

例如，本发明提供的双特异性抗体包含具有改变的效应子功能(例如降低或消除)的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。抗体的Fc区介导几种重要的效应子功能，例如ADCC、ADCP、CDC等。通过替换抗体的Fc区中的氨基酸残基，以改变抗体对效应子配体(如FcγR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能的方法是本领域已知的(参见，例如EP 388,151A1；US 564,8260；US 562,4821；Natsume A等,Cancer Res.,68:3863-3872,2008；Idusogie EE等,J.Immunol.,166:2571-2575,2001；Lazar GA等,PNAS,103:4005-4010,2006；Shields RL等,JBC,276:6591-6604,2001；Stavenhagen JB等,Cancer Res.,67:8882-8890,2007；Stavenhagen JB等,Advan.Enzyme.Regul.,48:152-164,2008；Alegre ML等,J.Immunol.,148:3461-3468,1992；和Kaneko E等,Biodrugs,25:1-11,2011)。在本发明一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸L235(EU编号)进行修饰以改变Fc受体相互作用，例如L235E或L235A。在另一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸234和235同时进行修饰，例如L234A和L235A(L234A/L235A)(EU编号)。

例如，本发明提供的双特异性抗体可包含具有延长的循环半衰期的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。研究发现M252Y/S254T/T256E、M428L/N434S或者T250Q/M428L都能够延长抗体在灵长类动物中的半衰期，此外，Fc中有N434A突变能够增加FcRn在酸性pH下的结合并改善清除率。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN 201280066663.2、US 2005/0014934A1、WO 97/43316、US 5,869,046、US 5,747,03、WO 96/32478。在本发明一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸M428(EU编号)进行修饰以增强FcRn受体的结合亲和力，例如M428L。在另一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸250和428(EU编号)同时进行修饰，例如T250Q和M428L(T250Q/M428L)。

例如，本发明提供的双特异性抗体也可包含具有可以降低或消除Fc糖基化的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。例如，Fc变体包含正常存在于氨基酸位点297(EU编号)处的N-连接聚糖降低的糖基化。N297位糖基化对IgG的活性有很大影响，如果该位点糖基化被移除，则会影响IgG分子CH2上半部分的构象，从而丧失对FcγRs的结合能力，影响抗体相关的生物活性。在本发明的一些优选实施例中，对人IgG恒定区上的氨基酸N297(EU编号)进行修饰以避免抗体的糖基化，例如N297A。

例如，本发明提供的双特异性抗体也可包含具有消除电荷异质性的氨基酸置换、缺失或添加的Fc变体。在工程细胞表达过程中发生的多种翻译后修饰会都会引起单克隆抗体的电荷异质性，而IgG抗体C末端赖氨酸的不均一性是其中的一个主要原因，另外导致产生碱性物质的蛋白修饰也是其中一个原因。重链C端的赖氨酸K可能在抗体生产过程中出现一定比例的确失，而抗体重链C端序列为脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸(PGK)时，末位赖氨酸被切除后导致脯氨酸酰胺化会造成碱性物质的产生，两者均会造成电荷异质性，从而影响抗体的稳定性、有效性、免疫原性或药代动力学。在本发明的一些优选实施例中，进行P445G/G446E/K447C的氨基酸置换，或将IgG抗体C末端的K447(EU编号)去除或缺失，以消除抗体的电荷异质性，提高表达产物的均一性。

本发明表1-3中示例性的例举了一些优选的Fc片段的氨基酸序列。与包含野生型人IgG Fc区的双特异性抗体相比，本发明提供的双特异性抗体所包含的Fc片段对人FcγRs(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)和C1q的至少一种显示出降低的亲和力，具有减少的效应细胞功能或补体功能。例如，在本发明的一优选实施例中，双特异性抗体包含的Fc片段来自人IgG1，且具有L234A和L235A取代(L234A/L235A)，显示出对FcγRI降低的结合能力；此外，本发明提供的双特异性抗体包含的所述Fc片段还可以包含具有使其它一种或几种特性(例如，与FcRn受体结合能力、抗体糖基化或抗体电荷异质性等)改变的氨基酸取代。例如，

在本发明的一优选实施例中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示，它与其所源自的天然序列相比具有L234A/L235A/N297A/P331S/T250Q/M428L/P445G/G446E/K447C的氨基酸置换或取代。

在本发明的一优选实施例中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示，它与其所源自的天然序列相比具有L234A/L235A/P331S/T250Q/M428L/N434A的氨基酸置换或取代，且K447被缺失或删除。

在本发明的一优选实施例中，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，它与其所源自的天然序列相比具有L234A/L235A/P331S/T250Q/M428L的氨基酸置换或取代，且K447被缺失或删除。

本发明一优选实施例中，所述双特异性抗体结合人B7-H3和CD3，其氨基酸序列如下：

(i)SEQ ID NO：26所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：26所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：26所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。

本发明另一个优选实施例中，所述双特异性抗体其氨基酸序列如下：

(i)SEQ ID NO：28所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：28所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：28所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。

(i)SEQ ID NO：30所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO：30所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NO：30所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些优选的实施方案中，(ii)中所述的置换是保守置换。

本发明另一方面，提供了编码上述双特异性抗体的DNA分子。

本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列。

本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列。

本发明的优选实施例中，编码上述双特异性抗体的DNA分子如SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列。

本发明另一方面，提供了包含上述DNA分子的载体。

本发明另一方面，提供了包含上述载体的宿主细胞；所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞或其它哺乳动物细胞，优选为CHO细胞。

本发明另一方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含上述双特异性抗体以及可药用赋形剂、载体或稀释剂。

优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂。

优选地，另外的药学活性剂是用于治疗免疫相关疾病的药物。

优选地，另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物。

优选地，另外的药学活性剂是用于治疗自身免疫性疾病的药物。

优选地，上述双特异性抗体与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。

优选地，向受试者施用上述药物组合物之前、之后或同时施用药学活性剂，其中所述药学活性剂选自抗体、抗原结合片段、药物、酶、细胞毒性剂、毒素、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子和放射性同位素。

优选地，上述药物组合物中药学活性剂的抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：PD-1、PD-L1、PD-L2、PD-L3、TIM-3、LAG-3、TIGIT、VISTA、CTLA-4、OX40、4-1BB、B7-H4、B7-H6、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD96、CD160、ICOS、GITR、CD3、LAIR1、2B4、HVEM、NKG2A、IL-18BP、ST2及其任意组合。

本发明另一方面，提供了一种用于重新激活被B7-H3免疫检查点抑制的T细胞、NK细胞、树突细胞、抗原提呈细胞活性的方法，其包含对所述个体施用治疗有效量的所述双特异性抗体或所述药物组合物。

本发明另一方面，提供了一种用于预防/治疗疾病、延迟其进展、降低/抑制其复发的方法，所述疾病包含免疫相关疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等疾病或病症，其包括将有效量的所述双特异性抗体或所述药物组合物给予或施用至所述患有以上疾病或病症的个体。

本发明另一方面，还提供了制备本发明所述双特异性抗体的方法，其包括：(a)获得双特异性抗体的融合基因，构建双特异性抗体的表达载体；(b)通过基因工程方法将上述表达载体转染到宿主细胞中；(c)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养上述宿主细胞；(d)分离、纯化产生的所述抗体。

其中，步骤(a)中所述表达载体选自质粒、细菌和病毒中的一种或多种，优选地，所述表达载体为PCDNA3.1。

其中，步骤(b)通过基因工程方法将所构建的载体转染入宿主细胞中，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞或其它哺乳动物细胞，优选为CHO细胞。

其中，步骤(d)通过常规的免疫球蛋白纯化方法，包含蛋白质A亲和层析和离子交换、疏水层析或分子筛方法分离、纯化所述双特异性抗体。

本发明另一方面，提供了所述双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的用途；所述癌症的实例包括但不限于：肺癌(例如，非小细胞肺癌)、鳞状细胞癌、头颈癌、表皮癌、口腔癌、黑色素瘤、食道癌、胃癌、胃腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌(例如，肾透明细胞癌)、胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、甲状腺癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、血液系统恶性疾病(例如，髓系白血病和B淋巴癌)以及所述癌症的难治性、复发性和转移性病灶。

本发明另一方面，提供了一种检测哺乳动物中癌症存在的方法，其包括：(a)将包含一个或多个源自哺乳动物的细胞的样品与所述双特异性抗体接触，从而形成复合物，和；

(b)检测所述复合物，其中复合物的检测表明哺乳动物中癌症的存在。

本发明另一方面，提供了一种试剂盒，其含有本发明所述的双特异性抗体。

本发明公开的技术方案，取得了有益的技术效果，概况如下：

1、本发明提供的双特异性抗体包含的抗-TAA scFv位于双抗的N端，空间构像发生变化，与TAA的结合能力在某些条件下可能减弱，尤其不易结合弱表达或低表达TAA的正常细胞，减少了非特异性杀伤，但对过表达或高表达TAA的细胞的结合特异性没有显著下降，表现出良好的体内杀伤效果。由此亦知，当靶抗原仅表达于肿瘤细胞上或本发明所述双特异性抗体仅与过表达靶抗原的肿瘤细胞特异性结合时，使得免疫效应细胞限制性仅在靶细胞组织内被激活，这使得所述双特异性抗体对正常细胞的非特异性杀伤以及细胞因子的伴随释放能够被降至最低，减小其在临床治疗中的毒副作用。

2、本发明提供的双特异性抗体选择的抗-CD3scFv以微弱的结合亲和力与效应细胞特异性结合，此外因被包埋在抗-TAA scFv和Fc之间，且位于其N端的连接肽L3包含的CTP刚性肽和位于其C端的Fc片段，都部分“遮盖”或“屏蔽”了抗-CD3scFv的抗原结合域，这种位阻效应使其以更微弱的结合亲和力(例如以大于1μM)与CD3结合，这使其对T细胞的活化刺激能力减弱，因而限制了细胞因子的过度释放，因而具有更高的安全性；另外，本发明采用的抗-CD3scFv可同时结合人和食蟹猴和/或恒河猴的CD3天然抗原，使其临床前毒理学评价不需要再构建替代分子，且获得的有效剂量、毒性剂量和毒副反应更客观、准确，可以直接进行临床剂量的转换，降低临床研究的风险。再者，本发明提供的双特异性抗体创造性地采用了二价抗-CD3scFv，这使得所述双特异性抗体在构型设计上规避了现有技术普遍所采用的异源二聚体型(所包含的抗-CD3scFv为单价)的非对称结构，因而也不存在重链间错配的问题，简化了下游纯化步骤；并且出人意料地，在体外细胞结合试验中未观察到抗-CD3scFv与T细胞的非特异性结合，且细胞激活程度(IL-2等细胞因子的释放)控制在安全、有效的范围内，即本发明采用的二价抗-CD3scFv结构并未引起非抗原依赖地诱导T细胞的过度活化，而对其他包含二价抗-CD3结构域的双特异性抗体而言，T细胞被不可控地过度激活是普遍存在的，因而抗-CD3双特异性抗体在设计时一般避免引入二价抗-CD3结构。

3、本发明提供的双特异性抗体所包含的经修饰的Fc片段不具有FcγR结合能力，避免了由FcγR所介导的T细胞全身性激活，因而允许免疫效应细胞限制性地仅在靶细胞组织内被激活。

4、本发明提供的双特异性抗体为同源二聚体型，不存在重链及轻链错配的问题，下游生产工艺稳定，纯化步骤简单高效，表达产物均一，且其理化性质显著提高。

5、本发明提供的双特异性抗体因包含修饰的Fc片段，而具有较长的体内循环半衰期。

发明详述

缩写和定义

BiAb 双特异性抗体(bispecific antibody)

CDR 用Kabat编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区

EC₅₀ 产生50％功效或结合的浓度

ELISA 酶联免疫吸附测定

FR 抗体构架区：将CDR区排除在外的免疫球蛋白可变区

HRP 辣根过氧化物酶

IL-2 白细胞介素2

IFN 干扰素

IC₅₀ 产生50％抑制的浓度

IgG 免疫球蛋白G

Kabat 由Elvin A Kabat倡导的免疫球蛋白比对及编号系统

mAb 单克隆抗体

PCR 聚合酶链式反应

V区在不同抗体之间序列可变的IgG链区段。其延伸到轻链的109位Kabat残基和重链的第113位残基。

VH 免疫球蛋白重链可变区

VK 免疫球蛋白κ轻链可变区

K_D 平衡解离常数

k_a 结合速率常数

k_d 解离速率常数

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。本发明使用的抗体或其片段可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

CD3分子是T细胞膜上的重要分化抗原，是成熟T细胞的特征性标志，由6条肽链组成，以非共价键与T细胞抗原受体(TCR)组成TCR-CD3复合体，不仅参与TCR-CD3复合体的胞浆内组装，而且通过各多肽链胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(ImmunoreceptorTyrosine-based Activation Motif,ITAM)传递抗原刺激信号。CD3分子的主要功能为：稳定TCR结构，传递T细胞活化信号，当TCR特异性识别并结合抗原后，CD3参与将信号转导到T细胞胞浆内，作为诱导T细胞活化的第一信号，在T细胞抗原识别和免疫应答产生过程中具有极其重要的作用。

“CD3”指的是作为T细胞受体复合物的一部分，由三个不同的链CD3ε，CD3δ和CD3γ组成。CD3在T细胞上通过例如抗CD3抗体对其的固定作用而产生的集中(clustering)，导致T细胞的活化，与T细胞受体介导的活化类似，但是不依赖于TCR克隆的特异性。绝大多数抗CD3抗体识别CD3ε链。本发明的特异性识别T细胞表面受体CD3的第二功能域不受具体的限制，只要其能够特异性地识别CD3，例如但不限于在下列专利中提到的CD3抗体：US 7,994,289；US 6,750,325；US 6,706,265；US 5,968,509；US 8,076,459；US 7,728,114；US20100183615。该术语还包括任何CD3变体、同工型、衍生物和物种同源物，其由细胞天然地表达，或在以编码前述的链的基因或cDNA转染的细胞上表达。

术语“抗体”通常指具有免疫球蛋白-类功能的蛋白质性结合分子。抗体的典型实例是免疫球蛋白，以及其衍生物或功能片段，只要其显示所需的结合特异性即可。用于制备抗体的技术是本领域熟知的。“抗体”包括不同类的天然免疫球蛋白(例如IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(如IgG1、lgG2、IgA1、IgA2等)。“抗体”还包括非天然免疫球蛋白，包括例如单链抗体，嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)和异源偶联抗体(例如，双特异性抗体)，以及其抗原结合片段(例如，Fab’，F(ab’)，Fab，Fv和rIgG)。还参见，例如，Pierce Catalog andHandbook,1994-1995,Pierce Chemical Co.,Rockford,IL；Kuby,J.,Immunology,3rdEd.,1998,NY；W.H.Freeman&Co.。

抗体“单价地”结合至某特定蛋白质，即一分子的抗体仅结合至一分子的蛋白质，但是该抗体也可以结合到不同的蛋白质。当抗体仅结合至一分子的两种不同的蛋白质，该抗体为“单价地”结合至每一种蛋白质，并且该抗体是“双特异性的”且“单价地”结合至两种不同蛋白质的每一种。抗体可以是“单体的”，即其包含单个多肽链。抗体可包含多个多肽链(“多聚体的”)或可包含两个(“二聚体的”)、三个(“三聚体的”)或四个(“四聚体的”)多肽链。若抗体为多聚体的，则该抗体可以是同源多聚体(homomulitmer)，即抗体包含多于一分子的仅一种多肽链，包括同源二聚体、同源三聚体或同源四聚体。可选的，多聚体抗体可以是异源多聚体，即抗体包含多于一种不同的多肽链，包括异源二聚体、异源三聚体或异源四聚体。

术语“超变区”或“CDR区”或“互补决定区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基，是非连续的氨基酸序列。CDR区序列可以由IMGT、Kabat、Chothia和AbM方法来定义或本领域熟知的任何CDR区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。例如，超变区包含以下氨基酸残基：来自序列比对所界定的“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基，例如，轻链可变结构域的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)位残基和重链可变结构域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)位残基，参见Kabat等，1991，Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫目的物的蛋白质序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.；和/或来自根据结构来界定的“超变环”(HVL)的残基，例如，轻链可变结构域的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)位残基和重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)位残基，参见Chothia和Leskl,J.Mol.Biol.,196:901-917,1987。“构架”残基或“FR”残基为除本文定义的超变区残基之外的可变结构域残基。在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确定。本领域技术人员可以明确地将每种系统赋予任何可变结构域序列，而不依赖于超出序列本身之外的任何实验数据。例如，给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与每种“标准”编号序列对比同源区来确定。基于本文提供的序列的编号，确定序列表中任何可变区序列的编号方案完全在本领域技术人员的常规技术范围内。

术语“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，是通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相交联以形成抗原结合位点，接头序列一般由柔性肽组成，例如但不限于G₂(GGGGS)₃。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一个核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。对于scFv综述，可参见Pluckthun(1994)The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学),第113卷,Rosenburg和Moore主编,Springer-Verlag,New York,第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利第4,946,778号和第5,260,203号。

术语“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab抗体”的大小是完整抗体的1/3，其只包含一个抗原结合位点。

术语“Fab’片段”含有一条轻链和一条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分。

术语“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链的VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab’片段组成。

术语“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区，是包含完整抗原识别和结合位点的最小片段。

术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是指保留与抗原(如，B7-H3)特异性结合能力的抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(ParentalAntibody)的抗原结合区或可变区。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当用摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段包括但不限于：Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、互补决定区(CDR)片段、二硫键稳定性蛋白(dsFv)等；线性抗体(Linear Antibody)、单链抗体(例如scFv单抗体)(技术来自Genmab)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、单域抗体(Single Domain Antibody)(例如VH结构域抗体)、结构域抗体(技术来自AbIynx)；由抗体片段形成的多特异性抗体(例如三链抗体、四链抗体等)；和工程改造抗体如嵌合抗体(Chimeric Antibody)(例如人源化鼠抗体)、异缀合抗体(Heteroconjugate Antibody)等。这些抗体片段用本领域技术人员已知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

术语“连接肽”是指连接两个多肽的肽，其中所述连接肽可以是两个免疫球蛋白可变区或一个可变区。连接肽的长度可以是0-30个氨基酸或0-40个氨基酸。在一些实施方案中，连接肽可以是0-25、0-20或0-18个氨基酸长度。在一些实施方案中，连接肽可以是不多于14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸长的肽。在其它实施方案中，连接肽可以是0-25、5-15、10-20、15-20、20-30或30-40个氨基酸长。在其它实施方案中，连接肽可以是约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长。连接肽是本领域技术人员已知的。连接肽的制备可以采用本领域任何方法。例如，连接肽可以是合成来源的。

术语“重链恒定区”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链恒定区的多肽至少包含以下一种：CH1结构域，铰链(例如，上部铰链区、中间铰链区，和/或下部铰链区)结构域，CH2结构域，CH3结构域，或其变体或片段。例如，本申请中使用的抗原结合多肽可包含具有CH1结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分的铰链结构域和CH2结构域的多肽；具有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；具有CH1结构域、至少一部分铰链结构域和CH3结构域的多肽链，或者具有CH1结构域，至少一部分铰链结构，CH2结构域，和CH3结构域的多肽链。在另一个实施例中，本申请的多肽包括具有CH3结构域的多肽链。另外，在本申请中使用的抗体可能缺少至少一部分CH2结构域(例如，所有的或一部分的CH2结构域)。如上文所述，但本技术领域的普通技术人员应理解，重链恒定区可能会被修改，使得它们在氨基酸序列上与天然存在的免疫球蛋白分子不同。

术语“轻链恒定区”包括来自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定kappa结构域和恒定lambda结构域中的至少一个。

术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(多数为氨基末端)恒定区。CH1结构域邻近VH结构域并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。

术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域连接至CH2结构域的那一部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，从而使两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可分为三个不同的结构域：上部、中部、和下部铰链结构域(Roux KH等,J.Immunol.,161:4083,1998)。

术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸含有巯基，该巯基可以与第二个巯基形成二硫键或桥连。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CK区由二硫键连接并且两个重链由两个二硫键连接，在对应于使用Kabat编号系统的239和242处(位置226或229，EU编号系统)连接。

术语“Fc区”或“Fc片段”是指免疫球蛋白重链的C端区，其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(C1q)结合，包括天然序列Fc区和变异Fc区。

通常，人IgG重链Fc区为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，但其边界可能有变化。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以存在或可以不存在。Fc还可以指隔离的这一区域，或在包含Fc的蛋白多肽的情况下，例如“包含Fc区的结合蛋白”，还称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列Fc区包括哺乳动物(例如人)IgG1、IgG2(IgG2A，IgG2B)、IgG3和IgG4。在人IgG1Fc区中，至少两个等位基因类型是已知的。在某些实施方案中，相对于哺乳动物Fc多肽氨基酸序列的序列，两条Fc多肽链的氨基酸序列中每100个氨基酸中具有10个左右氨基酸的单一氨基酸的置换、插入和/或缺失。在一些实施方案中，上述不同可以是延长半衰期的Fc改变、增加FcRn结合的改变、抑制Fcγ受体(FcγR)结合的改变和/或降低或去除ADCC和CDC的改变。

在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含抗体的两条重链的每一条的CH2和CH3恒定结构域；IgM和IgE Fc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。

术语“Fc受体”或“FcR”指结合免疫球蛋白Fc区的受体。FcR可以是天然序列人FcR，也可以是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，以及这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγR家族由三种活化受体(小鼠中的FcγRI，FcγRIII和FcγRIV；人类中的FcγRIA，FcγRIIA和FcγRIIIA)和一种抑制性受体(FcγRIIb或等同的FcγRIIB)组成。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列。FcγRIIA的胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。FcγRIIB的胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见M.Annu.Rev.Immunol.,15:203-234,1997)。大多数天然效应细胞类型共表达一种或多种活化FcγR和抑制性FcγRIIb，而NK细胞选择性表达一种活化性Fc受体(小鼠中的FcγRIII和人中的FcγRIIIA)，但小鼠和人中不表达抑制性FcγRIIb。人类IgG1与大多数人类Fc受体结合，在其结合的活化性Fc受体的类型方面被认为等同于鼠类IgG2a。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie V等,Immunol.Today,18:592-8,1997；Ghetie V等,Nature Biotechnol.,15:637-40,1997)。可测定人FcRn高亲和力结合多肽与FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中。术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(GuyerRL等,J.Immunol.,117:587,1976；Kim YJ等,J.Immunol.,24:249,1994)。

术语“效应细胞”是指免疫系统的一种细胞，其表达一种或多种FcR并介导一种或多种效应器功能。优选地，该细胞表达至少一种类型的激活性Fc受体，例如人FcγRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。效应细胞也包括例如T细胞。他们可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。

术语“效应子功能”是指，那些可归因于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性，且其随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括但不限于：Fc受体结合亲和性、ADCC、ADCP、CDC、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调、B细胞活化、细胞因子分泌、抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率等。改变抗体的效应子功能的方法是本领域已知的，例如通过在Fc区引入突变来完成。

术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是指一种细胞毒性形式，Ig通过与细胞毒性细胞(例如NK细胞、中性粒细胞或巨噬细胞)上存在的FcR结合，使这些细胞毒性效应细胞特异性结合到抗原附着的靶细胞上，然后通过分泌细胞毒素杀死靶细胞。检测抗体的ADCC活性的方法是本领域已知的，例如可通过测定待测抗体与FcR(例如CD16a)之间的结合活性来评价。

术语“抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP)”指一种细胞介导的反应，在该反应中，表达FcγR的非特异性细胞毒活性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起该靶细胞的吞噬。

术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”是指通过使补体成分C1q与抗体Fc结合来激活补体级联的细胞毒性形式。检测抗体的CDC活性的方法是本领域已知的，例如可通过测定待测抗体与Fc受体(例如C1q)之间的结合活性来评价。

术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂和/或稳定剂”，是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂/或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。

术语“T细胞受体(TCR)”是存在于T细胞即T淋巴细胞表面上的特殊受体。体内T细胞受体以几个蛋白质的复合物存在。T细胞受体通常具有两个单独的肽链，通常是T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)链，在一些T细胞上是T细胞受体γ和δ(TCRγ和TCRδ)。复合物中其他蛋白质是CD3蛋白质：CD3εγ和CD3εδ异源二聚体，最重要的是，有六个ITAM基序的CD3ζ同源二聚体。CD3ζ上的ITAM基序可以被Lck磷酸化，反过来募集ZAP-70。Lck和/或ZAP-70也可以在许多其他分子上磷酸化酪氨酸，尤其是CD28、LAT和SLP-76，这允许围绕这些蛋白质的信号传导复合物聚集。

术语“双特异性抗体”指本发明的双特异性抗体，例如抗B7-H3抗体或其抗原结合片段可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种肽或蛋白质(例如TAA、细胞因子和细胞表面受体)以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。为创建本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)至一种或多种其它结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模仿物，从而产生双特异性分子。例如，“双特异性抗体”是指包含两个可变结构域或scFv单位使得所得抗体识别两种不同抗原。本领域已知双特异性抗体的许多不同的形式和用途(Chames P等,Curr.Opin.Drug Disc.Dev.,12:276,2009；Spiess C等,Mol.Immunol.,67:95-106,2015)。

术语“hCG-β羧基末端肽(CTP)”是一段来自人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β-亚基羧基末端的短肽。四种与生殖相关的多肽类激素促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促甲状腺素(TSH)和绒毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亚基和各自特异的β-亚基。与其它三种激素相比，hCG体内半衰期明显延长，这主要来源于其β-亚基上特有的羧基末端肽(CTP)。CTP含有37个氨基酸残基，它具有4个O-糖基化位点，糖侧链终端是唾液酸残基。带负电、高度唾液酸化的CTP能够抵抗肾脏对其的清除作用，从而延长蛋白在体内的半衰期(Fares FA等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4304-4308,1992)。

术语“糖基化”意思是低聚糖(含有连接在一起的两个或更多个单糖、例如连接在一起的2个到约12个单糖的碳水化合物)附着形成糖蛋白。低聚糖侧链通常通过N-或O-连接连接到糖蛋白的骨架上。本文公开的抗体的低聚糖通常是连接到Fc区的CH2结构域，作为N-连接的低聚糖。“N-连接的糖基化”是指碳水化合物类部分连接到糖蛋白链的天冬酰胺残基上。例如，技术人员可以识别鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgD的CH2结构域中的每一个在残基297处有用于N-连接的糖基化的单一位点。

在又一方面，本发明抗体包含的重链和轻链可变区所包含的氨基酸序列与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源，且其中所述抗体保留了本发明所述，例如B7-H3×CD3双特异性抗体的期望的功能特性。

具有保守修饰的抗体

术语“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体CDR区中的一个或多个氨基酸残基。

与新生儿受体(FcRn)结合亲和力改变的Fc变体

这里使用的“FcRn”指结合IgG抗体Fc区的至少部分由FcRn基因编码的蛋白。FcRn可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。功能性FcRn蛋白包含经常被称为重链和轻链的两条多肽，轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。

本发明涉及对FcRn的结合被调节的抗体(调节包括增加以及降低结合)。例如：在有些情况下，增加的结合会导致细胞再循环抗体，并由此延长，例如治疗抗体的半衰期。有时，降低FcRn结合是合乎需要的，例如用作包含放射标记的诊断抗体或治疗抗体。另外，对FcRn的结合显示出增加，同时对其他Fc受体，例如FcγRs的结合被改变的抗体可以用于本发明。

本申请涉及包含调节对FcRn的结合力的氨基酸修饰的抗体。具有特殊意义的是在较低的pH时，对FcRn的结合亲和力显示出增加，而在更高的pH时，结合基本上不显示出改变的最低限度地包含Fc区的抗体或其功能性变体。

与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体

IgG的血浆半衰期取决于它与FcRn的结合，一般在pH 6.0时结合，在pH 7.4(血浆pH)时解离。通过对两者结合位点的研究，改造IgG上与FcRn结合的位点，使之在pH 6.0时结合能力增加。已经证明对于结合FcRn重要的人Fcγ结构域的一些残基的突变可增加血清半衰期。已报道T250、M252、S254、T256、V308、E380、M428和N434(EU编号)中的突变可增加或降低FcRn结合亲和力(Roopenian DC等,Nat.Rev.Immunol.,7:715-725,2007)。韩国专利号KR10-1027427公开了具有增加的FcRn结合亲和力的曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)变体，并且这些变体包含选自257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F和308Y的一个或更多个氨基酸修饰。韩国专利公开号KR 2010-0099179提供了贝伐单抗(阿瓦斯汀，Genentech)变体并且这些变体通过包含在N434S、M252Y/M428L、M252Y/N434S和M428L/N434S的氨基酸修饰显示增加的体内半衰期。此外，Hinton等也发现T250Q和M428L2个突变体分别使与FcRn的结合增加3和7倍。同时突变2个位点，则结合增加28倍。在恒河猴体内，M428L或T250QM/428L突变体显示血浆半衰期增加2倍(Hinton PR等,J.Immunol.,176:346-356,2006)。更多的与新生儿受体(FcRn)结合亲和力增强的Fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利CN201280066663.2。此外，有研究对五种人源化抗体的Fc段进行T250Q/M428L突变不仅改善了Fc与FcRn的相互作用，且在随后的体内药代动力学试验中，发现以皮下注射给药，Fc突变抗体与野生型抗体相比药代动力学参数有所改善，如体内暴露量增加、清除率降低、皮下生物利用度提高(Datta-Mannan A等,MAbs.Taylor&Francis,4:267-273,2012)。

其他可引起本发明抗体与FcRn亲和力增强的突变点包括但不限于以下氨基酸修饰：226,227,230,233,239,241,243,246,259,264,265,267,269,270,276,284,285,288,289,290,291,292,294,298,299,301,302,303,305,307,309,311,315,317,320,322,325,327,330,332,334,335,338,340,342,343,345,347,350,352,354,355,356,359,360,361,362,369,370,371,375,378,382,383,384,385,386,387,389,390,392,393,394,395,396,397,398,399,400,401,403,404,408,411,412,414,415,416,418,419,420,421,422,424,426,433,438,439,440,443,444,445,446，其中Fc区中氨基酸的编号是Kabat中的EU索引的编号。

与FcRn结合亲和力增强的Fc变体还包括其他一切公知的氨基酸修饰位点以及尚未被发现的氨基酸修饰位点。

在可选择的实施方式中，可以优化IgG变体使其具有增加或降低的FcRn亲和力，以及增加或降低的人FcγR，包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa和包括他们的等位基因变异的FcγRIIIb亲和力。

优先地，IgG变体的Fc配体特异性将决定它的治疗应用。给定IgG变体用于治疗目的将取决于靶抗原的表位或形式，以及待治疗的疾病或适应症。对大多数靶和适应症来说，增强的FcRn结合可是更优选的，因为增强的FcRn结合可以导致血清半衰期延长。较长的血清半衰期允许治疗时以较低的频率和剂量给药。为了使需要重复给药的适应症作出反应而施用该治疗剂时，这种特性可是特别优选的。对一些靶和适应症来说，当需要变体Fc具有增加的清除或降低的血清半衰期时，例如当Fc多肽用作显象剂或放射治疗剂时，降低的FcRn亲和力可是特别优选的。

可以通过现有技术的公知方法来评价该多肽对FcRn的亲和力。

FcRn可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物。

抑制FcγR结合的改变

本文所述“抑制FcγR结合的改变”是指Fc多肽链中抑制FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合的一个或多个插入、缺失或置换，所述结合如通过例如基于的竞争结合实验(PerkinElmer,Waltham,MA)测定。这些改变可包含在作为双特异性抗体一部分的Fc多肽链中。更具体地，抑制Fcγ受体(FcγR)结合的改变包括L234A、L235A或抑制N297位糖基化的任意改变，包括在N297的任意置换。此外，连同抑制N297位糖基化的改变一起，通过建立另外的二硫桥来稳定二聚体Fc区的另外的改变也被预期。抑制FcγR结合的改变的进一步实例包括在一条Fc多肽链中的D265A改变和在另一条Fc多肽链中的A327Q改变。上述一些突变描述于，如Xu D等,Cellular Immunol.,200:16-26,2000中，其中描述上述突变及其活性评估的部分以引用的方式并入本文。以上是根据EU编号。

例如，本发明提供的双特异性抗体抑制FcγR结合的改变所包含的Fc片段对人FcγRs(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)和C1q的至少一种显示出降低的亲和力，具有减少的效应细胞功能或补体功能。

其他抑制FcγR结合的改变包含公知技术及未来可能被发现的位点及其修饰。

FcγR可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物。

延长半衰期的Fc改变

本文所述“延长半衰期的Fc改变”是指与包含相同Fc多肽、但其不包含改变的相似Fc蛋白质的半衰期相比，Fc多肽链中延长包含改变的Fc多肽链的蛋白质的体内半衰期的改变。所述改变可包含在作为双特异性抗体一部分的Fc多肽链中。改变T250Q、M252Y、S254T和T256E(第250位的苏氨酸变为谷氨酰胺；第252位的甲硫氨酸变为酪氨酸；第254位的丝氨酸变为苏氨酸；和第256位的苏氨酸变为谷氨酸；根据EU编号进行编号)为延长半衰期的Fc改变并能联合、单独或任意组合使用。这些改变及其它一些改变详细描述于美国专利7,083,784中。美国专利7,083,784中描述这种改变的部分以引用的方式并入本文。

同样地，M428L和N434S为延长半衰期的Fc改变并能联合、单独或任意组合使用。这些改变及其它一些改变详细描述于美国专利申请公开文本2010/0234575和美国专利7,670,600中。美国专利申请公开文本2010/0234575和美国专利7,670,600中描述这种改变的部分以引用的方式并入本文。

此外，按照本文含义，在以下位点之一处的任何置换都可被认为是延长半衰期的Fc改变：250、251、252、259、307、308、332、378、380、428、430、434、436。这些改变中的每一个或者这些改变的组合可用于延长本文所述双特异性抗体的半衰期。其它可用于延长半衰期的改变详细描述于2012年12月17日提交的国际申请PCT/US2012/070146(公开号:WO 2013/096221)中。这一申请中描述上述改变的部分以引用的形式并入本文。

延长半衰期的Fc改变还包括包含公知技术及未来可能被发现的位点及其修饰。

Fc可以来自包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴的任意生物。

编码双抗的核酸

使用本文描述的治疗剂和抗体或抗体片段，本领域技术人员可容易地构建含有功能等价核酸(例如序列不同、但编码相同的效应部分或抗体序列的核酸)的多个克隆。因此，本发明提供了双特异性抗体、编码抗体、抗体片段及其融合蛋白的核酸、核酸变体、衍生物和物种同源物。

本领域已知许多编码包含VH、VL、铰链、CH1、CH2、CH3和CH4区的免疫球蛋白区的核酸序列。参见，如，Kabat等.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Public Health Service N.I.H.,Bethesda,MD,1991。根据本文提供的教导，本领域技术人员可将所述核酸序列和/或本领域已知的其它核酸序列结合，以构建编码本发明双特异性抗体的核酸序列。编码本发明双特异性抗体的示例性核苷酸包括(1)SEQ ID NO：27，(2)SEQID NO：29，和(3)SEQ ID NO：31。

此外，基于本文和其它地方提供的氨基酸序列及本领域常识，本领域技术人员可以确定编码本发明双特异性抗体的核酸序列。除较传统的生产编码特定氨基酸序列的克隆DNA片段的方法外，现今如DNA 2.0(Menlo Park,CA,USA)和Blue Heron(Bothell,WA,USA)等公司通常采用化学合成来生产任意期望顺序排序的基因大小的DNA，从而简化生产所述DNA的过程。

制备双特异性抗体的方法

可采用本领域任何已知的方法制备本发明双特异性抗体。早期构建双特异性抗体的方法有化学交联法或杂合杂交瘤或四价体瘤法(例如，Staerz UD等,Nature,314:628-31,1985；Milstein C等,Nature,305:537-540,1983；Karpovsky B等,J.Exp.Med.,160:1686-1701,1984)。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连接在一起，制备出双特异性单克隆抗体。例如两种不同单克隆抗体的化学结合，或例如两个抗体片段如两个Fab片段的化学结合。杂合—杂交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋巴细胞融合而得到的。虽然这些技术用于制造BiAb，但各种产生问题使得此类复合物难以使用，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、蛋白质表现方面的困难、需要纯化目标BiAb、低产率、生产费用高等。

最近的方法利用经过基因工程改造的构建体，其能够产生单一BiAb的均质产物而无需彻底纯化以去除不需要的副产物。此类构建体包括串联scFv、二抗体、串联二抗体、双可变结构域抗体和使用诸如Ch1/Ck结构域或DNLTM的基元的异源二聚(Chames&Baty,C9urr.Opin.Drug.Discov.Devel.,12:276-83,2009；Chames&Baty,mAbs,1:539-47)。相关纯化技术是公知的。

靶细胞和在靶细胞上表达的靶细胞蛋白

如上文所述，双特异性抗体可结合至效应细胞蛋白和靶细胞蛋白。例如，所述靶细胞蛋白可以在癌细胞、病原体感染的细胞或介导疾病(例如，自身免疫性疾病)的细胞表面表达。在一些实施方案中，该靶细胞蛋白能在靶细胞表面高度表达，尽管高水平的表达不是必需的。在一些实施方案中，该靶细胞蛋白在靶细胞表面不表达或低表达。

当靶细胞为癌细胞时，如本文所述的同源二聚体的双特异性抗体可结合至如上文所述的癌细胞抗原。癌细胞抗原可以是人蛋白或源自其它物种的蛋白。

在一些实施例中，所述靶细胞蛋白可以是介导淋巴系统相关疾病的细胞表面的蛋白。

在一些实施例中，所述靶细胞蛋白可以是在肿瘤细胞表面选择性表达或过表达或不表达的蛋白。

在其他方面，靶细胞可以是介导自身免疫性疾病的细胞。例如，哮喘中的人嗜酸性粒细胞可以是靶细胞，在这种情况下，如含EGF样模体粘液样激素受体(EMR1)可作为靶细胞蛋白。可选地，在全身性红斑狼疮患者中过量人B细胞可作为靶细胞，在这种情况下，如B7-H3可作为靶细胞蛋白。同样地，靶细胞可以是介导如动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝硬化、硬皮病、肾移植纤维化、肾同种异体移植肾病或肺纤维化(包括特发性肺纤维化和/或独特型肺动脉高压)的纤维化细胞。对于所述纤维化病症，如成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)可以是靶细胞蛋白。

癌症

术语“癌症”是指以体内异常细胞的不受控生长为特征的一大类疾病。“癌症”包括良性和恶性癌症以及休眠肿瘤或微转移。癌症包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移产生的肿瘤，转移为恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。癌症也包括血液学恶性肿瘤。“血液学恶性肿瘤”包括淋巴瘤，白血病，骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤，以及脾癌和淋巴结肿瘤。

在优选的实施方案中，本发明双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或药物组合物或组合疗法对癌症的治疗、预防或缓解是有用的。癌症的实例包括但不限于肺癌(例如，非小细胞肺癌)、鳞状细胞癌、头颈癌、表皮癌、口腔癌、黑色素瘤、食道癌、胃癌、胃腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌(例如，肾透明细胞癌)、胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、甲状腺癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、血液系统恶性疾病(例如，髓系白血病和B淋巴癌)以及所述癌症的难治性、复发性和转移性病灶。

本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或药物组合物或组合疗法可用于治疗恶性或恶变前病状以及用于预防发展成赘生性或恶性状态，包括但不限于上文所述的那些病症。指示此类用途在已知的或怀疑先前进展至瘤形成或癌症的病状中，具体来说，其中非瘤性细胞生长由过度增生、化生组成，或最具体来说，出现发育异常(针对此类异常生长病状的综述，参见Robbins和Angell,Basic Pathology.,第2版,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,第68-79页,1976)。

药物组合物

本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸(例如B7-H3xCD3)可以应用于制备药物组合物或无菌组合物，例如，将双特异性抗体与药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合。药物组合物可包括一种或组合的(如两种或更多不同的)本发明的双特异性抗体。例如，本发明的药物组合物可包含与靶抗原上的不同表位结合的具有互补活性的抗体或抗原结合片段的组合。治疗和诊断剂的制剂可通过以例如冻干粉末、浆液、水性溶液或悬浮液的形式与药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备。

术语“药学上可接受的”指当分子本体、分子片段或组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其他不良反应。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体示例包括糖类(如乳糖)、淀粉、纤维素及其衍生物、植物油、明胶、多元醇(如丙二醇)、海藻酸等。

在一些优选实施方案中，本发明药物组合物用于治疗、预防或缓解的疾病包括但不限于：免疫相关疾病、癌症、自身免疫性相关疾病或病症。

本发明的组合物可以是多种形式。其包括例如，液体，半固体和固体的剂量形式，例如液体溶液(例如，可注射的和不熔化的溶液)分散剂或悬浮剂片剂，丸剂，粉剂，脂质体和栓剂。优选的方式依赖于施用方式和治疗用途。典型的优选组合物是可注射的或不熔化的溶液，例如那些类似于用其他抗体对人进行被动免疫的组合物。施用路径可以有多种形式，包括经口、直肠、经粘膜、经肠、肠胃外；肌肉内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。优选的施用形式是非肠道的(例如静脉内，皮下，腹膜内，肌内)。在优选的实施方案中，所述的抗体通过静脉内注入或注射施用。在另一优选的实施方案中，所述的抗体通过肌内或皮下注射。

以上组合方法、治疗方法及施用方法是公知的，也包括未来可能发展的组合、治疗及施用方法。

适当剂量的测定通过临床医师，例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗的参数或因素进行。通常，剂量以略小于最佳剂量的量开始，且其随后以较小增量增加，直至相对于任何负面的副作用实现所要或最佳作用。重要的诊断量度包括例如炎症的症状或所产生炎性细胞因子的水平的量度。

本发明提供容器(例如塑料或玻璃小瓶，例如具有盖或色谱柱、中空孔针或注射器圆筒)，其包含任一本发明的抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸及说明书。本发明还提供注射装置，其包含任一本发明的抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸。

本发明的药物组合物可以是两种药物的组合，可以是与已上市的类似功能相同产品或者增加治疗效果的产品的组合。

组合疗法

本发明涵盖双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或药物组合物可与一或多种活性治疗剂(例如化学治疗剂)或其他预防或治疗模式(例如，辐射)组合的用途。在此类组合疗法中，各种活性剂经常具有不同的互补作用机制，组合疗法可能导致协同效应。组合疗法包含影响免疫反应(例如增强或活化反应)之治疗剂及影响(例如抑制或杀死)肿瘤/癌细胞之治疗剂。组合疗法可降低抗药性癌细胞发生的可能性。组合疗法可允许试剂中的一或多种试剂剂量减少，以减少或消除与试剂中之一或多种相关的不良作用。此类组合疗法可对潜在疾病、病症或病状具有协同的治疗或预防作用。

“组合”包括可以分开施用的疗法，例如针对单独投药分开调配(例如，可以在套组中提供)，及可以按单一调配物(亦即，“共调配物”)一起投与的疗法。在某些实施例中，本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或药物组合物可依次序施用。在其他实施例中，双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或药物组合物可同时施用。本发明的双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或药物组合物可以与至少一种其他(活性)药剂以任何方式组合使用。

用本发明双特异性抗体或编码本申请抗体的核酸或多核苷酸或药物组合物治疗可以与可有效针对待治疗病症的其他治疗组合，其他治疗组合的非限制性实例包括手术、化疗、放疗、免疫疗法、基因疗法、DNA疗法、RNA疗法、纳米疗法、病毒疗法、辅助疗法。

组合疗法还包括其他一切公知技术中已有的以及未来可能发展的部分。

附图说明

图1-1、双特异性抗体AB12E7纯化样品的SEC-HPLC检测结果。

图1-2、双特异性抗体AB12E7纯化样品的SDS-PAGE电泳结果。

图2-1、FACS检测双特异性抗体AB12E7与肿瘤细胞HT-55、H1975、A431、HGC-27的结合能力。

图2-2、FACS检测双特异性抗体AB12E8与肿瘤细胞A498、THP-1、THP-1-Luc的结合能力。

图2-3、FACS检测双特异性抗体AB12E7与效应细胞CD3AK的结合能力。

图2-4、ELISA检测双特异性抗体AB12E7、AB12E8或AB12E9与CD3和B7-H3分子结合的能力。

图2-5、肿瘤细胞HT55、H1975、A431、HGC-27存在下，酶标仪检测双特异性抗体AB12E7活化报告基因细胞株Jurkat T细胞的能力。

图2-6、肿瘤细胞THP-1存在下酶标仪检测双特异性抗体AB12E8活化报告基因细胞株Jurkat T细胞的能力。

图2-7、肿瘤细胞A498存在下，酶标仪检测双特异性抗体AB12E8或AB12E9活化报告基因细胞株Jurkat T细胞的能力。

图2-8、肿瘤细胞HT55、H1975、A431、HGC-27存在下，酶标仪检测双特异性抗体AB12E7介导效应细胞CD3AK杀伤肿瘤细胞的能力。

图2-9、肿瘤细胞THP-1存在下，酶标仪检测双特异性抗体AB12E7或AB12E8介导效应细胞CD3AK杀伤肿瘤细胞的能力。

图2-10、肿瘤细胞A498存在下，酶标仪检测双特异性抗体AB12E8或AB12E9介导效应细胞CD3AK杀伤肿瘤细胞的能力。

图2-11、酶标仪检测双特异性抗体AB12E7介导效应细胞PBMC杀伤肿瘤细胞的能力。

图2-12、酶标仪检测双特异性抗体AB12E7或AB12E8介导效应细胞PBMC杀伤肿瘤细胞的能力。

图2-13、酶标仪检测双特异性抗体AB12E9介导效应细胞PBMC杀伤肿瘤细胞的能力。

图3-1、双特异性抗体AB12E7在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和H1975细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

图3-2、双特异性抗体AB12E8在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和H1975细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

图3-3、双特异性抗体AB12E9在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和A431细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

图3-4、双特异性抗体AB12E8在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和A431细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

图3-5、双特异性抗体AB12E8在NPG小鼠皮下共接种人CIK细胞和A498细胞的移植瘤模型中的体内抑瘤效果。

具体实施方式

通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。

实施例一、Anti-B7-H3×CD3双特异性抗体的设计和制备

1.1、双特异性抗体的设计

本发明构建的双特异性抗体分子由两条相同的多肽链通过Fc片段铰链区的链间二硫键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链自N端至C端依次由抗-B7-H3scFv、连接肽L2、抗-CD3scFv和Fc片段依次串联组成，抗-B7-H3scFv和抗-CD3scFv内部VH和VL之间分别由连接肽L1和L3连接。表1-1列举了不同双特异性抗体的抗B7-H3-scFv的VH结构域及其互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的氨基酸序列，和VL结构域及其互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列，其CDR区所含氨基酸残基根据Kabat规则定义。其中，抗B7-H3-scFv的VH和VL之间的连接肽L1氨基酸组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3，4或5。

表1-1：双特异性抗体包含的抗B7-H3-scFv的氨基酸序列及其CDR区氨基酸序列

在一个优选实施例中，上述双特异性抗体包含的抗CD3-scFv的VH和VL氨基酸序列分别如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示，且VH和VL之间由(GGGGS)₃连接，该单克隆抗体(命名为AB614)特异性结合人类CD3抗原，且与CD3具有微弱的结合亲和力。

其中，连接抗-B7-H3scFv和抗-CD3scFv的连接肽由柔性肽和刚性肽组成；优选地，柔性肽的氨基酸组成结构通式为G_xS_y(GGGGS)_z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1。而刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列(如SEQ ID NO：17所示)或其截短的片段，或具有氨基酸置换的全长序列或其截短的片段(如SEQ ID NO：18所示)；优选地，所述CTP刚性肽组成为SSSGKAPPPS(CTP¹)。表1-2中例举了一些优选的连接肽L2的氨基酸序列。

表1-2：连接抗-TAA scFv和抗-CD3scFv的连接肽的氨基酸序列

SEQ ID NO：19	G<sub>2</sub>(GGGGS)<sub>3</sub>CTP<sup>1</sup>	GGGGGGSGGGGSGGGGSSSSGKAPPPS
			SEQ ID NO：20	(GGGGS)<sub>3</sub>CTP<sup>1</sup>	GGGGSGGGGSGGGGSSSSGKAPPPS
SEQ ID NO：21	GS(GGGGS)<sub>2</sub>CTP<sup>1</sup>	GSGGGGSGGGGSSSSGKAPPPS
			SEQ ID NO：22	(GGGGS)<sub>1</sub>CTP<sup>4</sup>	GGGGSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

其中，Fc片段直接或通过连接肽与抗-CD3scFv相连，连接肽包含1-20个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)，更优地自Gly(G)和Ser(S)，最优选地，所述连接肽组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3或4。

Fc片段优选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区，更特别地选自人IgG1或IgG4的重链恒定区；并且Fc是突变的，以修饰双特异性抗体分子的性质，例如，对人FcγRs(FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)和C1q的至少一种显示出降低的亲和力，具有减少的效应细胞功能或补体功能。此外，Fc片段还可以包含具有使其它一种或几种特性(例如，与FcRn受体结合能力、抗体糖基化或抗体电荷异质性等)改变的氨基酸取代。表1-3中例举了一些优选的具有一个或多个氨基酸突变的Fc片段的氨基酸序列。

表1-3：人IgG Fc氨基酸序列

1.2、双特异性抗体分子表达载体的构建

按常规分子生物学方法合成上述双特异性抗体的编码基因，并将获得的融合基因的编码cDNA分别插入到经PCDNA3.1改造后的真核表达质粒pCMAB2M的相应酶切位点间，该质粒含巨细胞病毒早期启动子，它是哺乳动物细胞高水平表达外源基因所需的增强子。质粒pCMAB2M还含有选择性标记物，从而在细菌中可以具有卡那霉素抗性，而在哺乳动物细胞中可以具有G418抗性。另外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，pCMAB2M表达载体含有小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，从而在存在氨甲蝶呤(MTX)时能共扩增目的基因和DHFR基因(参见美国专利US 4,399,216)。

1.3、双特异性抗体分子的表达

将上述构建的表达质粒转染哺乳动物宿主细胞系，以表达双特异性抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是DHFR酶缺陷型CHO-细胞(参见美国专利US 4,818,679)，本实施例中宿主细胞选取CHO衍生细胞株DXB11。一种优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸钙共沉降、脂转染。在电穿孔中，用设置为300V电场和1500μFd电容的Gene Pulser电穿孔仪(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在比色杯内的5×10⁷个细胞中加入50μg表达载体质粒DNA。在转染两天后，将培养基改成含0.6mg/mL G418的生长培养基。用极限稀释亚克隆转染子，并用ELISA方法测定各细胞系的分泌率。筛选出高水平表达双特异性抗体的细胞株。

为了实现融合蛋白较高水平的表达，宜用受MTX药物抑制的DHFR基因进行共扩增。在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的融合蛋白基因。极限稀释DHFR表达阳性的亚克隆，逐步加压并筛选出能在高达6μM MTX培养基中生长的转染子，测定其分泌率，筛选出高表达外源蛋白的细胞系。将分泌率超过约5(较佳地约15)μg/10⁶(即百万)个细胞/24h的细胞系使用无血清培养基的进行适应性悬浮培养。然后，收集细胞上清并分离纯化双特异性抗体。

1.4、双特异性抗体的纯化工艺

抗体纯化一般采用三步纯化策略：粗纯(样品捕获)、中间纯化和精细纯化。在粗纯阶段，通常利用亲和层析对目的抗体进行捕获，可有效去除样品中的大量杂质，如杂蛋白和核酸、内毒素和病毒。中间纯化步骤较多地采用疏水层析或CHT羟基磷灰石层析以去除大部分的残留的杂质蛋白以及聚合体。精细纯化多采用离子交换层析或凝胶过滤层析(分子筛)以去除与目的抗体性质相近的残留的少量或微量的杂质蛋白，并进一步去除HCP、DNA等污染物。

本发明可以利用Protein A/G亲和层析柱(例如GE公司的MabSelect Sure等)对包含Fc的双特异性抗体进行粗纯。上述粗纯产物再经过中间纯化及精细纯化步骤，最终获得高纯度、高质量的纯化目的抗体，然后利用脱盐柱(例如GE公司的HiTrap desaulting等)将上述双特异性抗体保存缓冲液置换为PBS或其它合适的缓冲液。

a)双链四价双特异性抗体的纯化

鉴于本文中双特异性抗体采用的纯化工艺相同，在此仅以AB12E7为例，阐明该类四价同源二聚体构型双特异性抗体的具体纯化步骤和方案。

我们采用三步层析法对双特异性抗体AB12E7进行纯化。分别为亲和层析、复合模式CHT羟基磷灰石层析和脱盐柱换液层析(本实施例采用的蛋白纯化仪为美国GE公司的AKTA pure 25M；本实施例中采用的试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析级)。

第一步，亲和层析：采用GE公司的MabSelect Sure亲和层析介质或其它市售的亲和介质(例如博格隆公司的Protein A Diamond等)进行样品捕获、浓缩以及部分污染物的去除。首先使用平衡buffer(20mM PB，150mM NaCl，pH 7.4)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；将经过澄清后的发酵液以100-200cm/h的线性流速上样，载量不高于20mg/mL填料；上样完毕后，使用平衡buffer(20mM PB，150mM NaCl，pH 7.4)以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)，冲洗未结合的组份；使用去污buffer 1(50mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积，去除部分污染物；使用去污buffer 2(50mM NaAc-HAc，pH 5.0)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；之后使用洗脱buffer(50mM NaAc-HAc，pH 3.5)，以不高于100cm/h的线性流速洗脱目标产物，收集目标峰。

第二步，复合模式CHT羟基磷灰石层析：使用Bio-rad公司的CHT或其它市售的复合模式层析介质(例如TOSOH的Ca²⁺pure-HA等)进行中间纯化，用于降低聚合体含量。目标蛋白聚合以后，聚合体和单体之间存在性质上的差异，包括电荷特性以及疏水性，我们使用电荷特性和疏水性的差异对二者进行分离。首先，使用平衡buffer(20mM PB，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速平衡层析柱3-5个柱体积(CV)；第一步亲和层析分离得到的目标蛋白用1M Tris溶液调pH至7.0，然后上样，载量控制在<15mg/ml；上样完毕后，使用平衡buffer(20mM PB，pH 7.0)，以100-200cm/h的线性流速冲洗层析柱3-5个柱体积(CV)；最后进行目标蛋白洗脱，使用洗脱buffer(20mM PB，1M NaCl，pH 7.0)，以不高于100cm/h的线性流速进行0-50％梯度洗脱5个柱体积(CV)，对洗脱组分进行分段收集，分别送样进行蛋白含量、SEC-HPLC和电泳检测。将单体百分比大于90％的目标组分合并进行下一步层析。

第三步，凝胶过滤层析：使用GE公司的G25或其它市售的凝胶过滤层析介质(例如博格隆的Bestdex G-25M)进行缓冲液置换使样品保存更稳定。首先使用平衡buffer(20mMCitrate，8％Sucrose，0.02％Tween80，pH 5.5)，以不超过300cm/h的线性流速冲洗层析柱1-2个柱体积(CV)；经第二步复合模式CHT羟基磷灰石层析分离得到的目标蛋白上样，收集流穿，上样完毕，使用平衡buffer(20mM Citrate，8％Sucrose，0.02％Tween 80，pH 5.5)，以不超过300cm/h的线性流速冲洗层析柱1-2个柱体积(CV)；对流穿组分进行收集，分别送样进行蛋白含量、SEC-HPLC和电泳检测。

样品的SEC-HPLC纯度结果及SDS-PAGE电泳结果分见图1-1和图1-2，其中SEC-HPLC结果显示，三步层析后双特异性抗体的主峰纯度达95％以上，SDS-PAGE电泳带型符合预期，非还原电泳(180KDa)，还原后可得清晰的(90KDa)单链条带。

实施例二、Anti-B7-H3×CD3双特异性抗体的体外生物学功能评价

2.1、双特异性抗体与效应细胞和靶细胞结合活性的测定(FACS)

a)利用流式分析法(FACS)检测双特异性抗体与B7-H3较高表达肿瘤细胞的结合活性

选取B7-H3较高表达的肿瘤细胞HT55，A498，THP-1-Luc(以上购自南京科佰生物科技有限公司)和H1975，A431，HGC-27，THP-1(以上购自上海中国科学院细胞库)分析双特异性抗体与靶细胞的结合活性。

培养肿瘤细胞HT55，H1975，A431，HGC-27和A498，用0.25％胰酶消化，离心收集细胞；悬浮细胞THP-1和THP-1-Luc直接离心收集细胞。将收集的细胞用1％PBSB重悬，调整细胞密度为2×10⁶个/ml，置于96孔板中，每孔100μl(2×10⁵个细胞)，4℃封闭0.5h。封闭后的细胞离心弃上清，分别加入稀释好的一系列浓度的双特异性抗体AB12E7和AB12E8，4℃孵育1h；离心去上清，用1％BSA的PBS溶液(PBSB)洗3遍，加入稀释好的AF647标记的山羊抗人IgG抗体(购自Jackson)，4℃避光孵育1h；离心去上清，1％PBSB洗两遍，每孔再用100μl 1％多聚甲醛(PF)重悬，流式细胞仪检测信号强度。以平均荧光强度(MFI)作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算双特异性抗体与各肿瘤细胞结合的Kd值。

根据表2-1-表2-2所示，双特异性抗体与靶细胞均具有良好的结合活性。图2-1-图2-2展示了双特异性抗体与肿瘤细胞的结合曲线。

表2-1：双特异性抗体AB12E7与肿瘤细胞结合能力的测定

	HT55	H1975	A431	HGC-27
					Kd(nM)	4.262	0.849	5.359	3.983

表2-2：双特异性抗体AB12E8与肿瘤细胞结合能力的测定

	A498	THP-1	THP-1-Luc
				Kd(nM)	1.686	0.197	0.160

b)利用FACS检测双特异性抗体与人T细胞的结合活性

采用密度梯度离心法从人新鲜血液制备PBMC，用含10％热灭活FBS的1640培养基重悬，加入2μg/ml anti-CD3抗体(Thermo Fisher Scientific)活化24h后，加入250IU/mlIL-2扩增培养7天，制备得到CD3AK细胞(anti-CD3McAb activated killer cells)，经流式细胞分析仪检测细胞表面CD3表达呈阳性。待测样品制备及测定方法同实施例2.1a)。将1％PF重悬的细胞上机检测，以平均荧光强度作为Y轴，抗体浓度作为X轴，通过软件GraphPad进行分析，计算双特异性抗体AB12E7与人CD3AK细胞结合的Kd值。

结果如图2-3显示，双特异性抗体AB12E7与CD3AK细胞具有良好的结合活性，AB12E7与CD3AK细胞结合的Kd是4.767nM。

2.2、双特异性抗体与抗原的结合能力测定

通过双抗原夹心ELISA法鉴定双特异性抗体与可溶CD3和B7-H3的结合。

将B7-H3蛋白(ACRO Biosystem)以PBS稀释成1μg/ml的浓度，100μl/孔加入96孔板中，4℃包被过夜。然后用1％脱脂奶粉室温封闭1h。4倍梯度稀释待测双特异性抗体，共11个浓度梯度。然后用含有0.05％吐温-20的PBS(PBST)清洗96孔板，加入稀释好的双特异性抗体，设不加抗体的对照孔，室温孵育1h。将未结合的双特异性抗体以PBST洗去，将生物素化的CD3E&CD3D(ACRO Biosystem)以50ng/ml混合streptavdin HRP(BD)加入96孔板中，100μl/孔，室温孵育1h。其后，将96孔板以PBST清洗，加入TMB，100μl/孔，室温显色15min，然后加入0.2M H₂SO₄终止显色反应。用酶标仪检测A450-620nm的吸光值。通过软件GraphPad进行分析，计算双特异性抗体与两个抗原结合的EC₅₀值。

结果如图2-4显示，本发明的双特异性抗体均能同时特异性地结合CD3和B7-H3分子，并且随抗体浓度的变化呈现良好的剂量依赖性。双特异性抗体与可溶CD3和B7-H3的结合能力如表2-3所示。

表2-3：双特异性抗体与CD3和B7-H3分子结合能力的测定

	AB12E7	AB12E8	AB12E9
				EC<sub>50</sub>(nM)	0.517	0.413	0.306

2.3、报告基因细胞株评价双特异性抗体活化T细胞的能力

含有NFAT RE报告基因的Jurkat T细胞(BPS Bioscience)，在双特异性抗体和靶细胞同时存在的情况下可以过表达萤光素酶，通过检测萤光素酶的活性来定量Jurkat T细胞的活化程度。通过软件GraphPad进行分析，以双特异性抗体的浓度做X轴，荧光素信号作为Y轴，拟合四参数曲线。

根据图2-5至图2-7的结果表明，双特异性抗体AB12E7，AB12E8和AB12E9在有靶细胞存在时，均有较强活化Jurkat T细胞的能力。如表2-4至表2-6中所示，在靶细胞存在时，AB12E7，AB12E8或AB12E9，活化Jurkat T细胞的EC₅₀值在0.03nM～0.38nM之间。

表2-4：双特异性抗体AB12E7活化报告基因细胞株Jurkat T细胞能力的测定

	HT55	H1975	A431	HGC-27
					EC<sub>50</sub>(nM)	0.375	0.051	0.110	0.028

表2-5：双特异性抗体AB12E8活化报告基因细胞株Jurkat T细胞能力的测定

	THP-1	A498
			EC<sub>50</sub>(nM)	0.110	0.347

表2-6：双特异性抗体AB12E9活化报告基因细胞株Jurkat T细胞能力的测定

	A498
		EC<sub>50</sub>(nM)	0.265

2.4、双特异性抗体介导CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞的能力

正常培养的肿瘤细胞系HT55、THP-1-Luc、A498、H1975、A431和HGC-27作为靶细胞，用0.25％的胰酶消化，制备单细胞悬液，HT55、H1975、A431、THP-1-Luc和A498调整细胞密度2×10⁵个/ml，HGC-27调整细胞密度6×10⁵个/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，培养过夜。按实验设计稀释相应抗体，50μl/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。然后加入细胞密度6×10⁵个/ml的效应细胞CD3AK细胞，100μl/孔，设置对照孔，无需加入效应细胞的孔则用相同体积的培养基补入。培养24h后，96孔板弃上清，用PBS洗3遍，加入含10％CCK-8的完全培养基，100μl/孔，37℃孵育4h，用酶标仪检测A450-620nm的吸光值。通过软件GraphPad进行分析，计算并比较双特异性抗体介导杀伤肿瘤细胞的能力。

根据图2-8至图2-10的结果，双特异性抗体均具有介导CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞的能力，其EC₅₀值归纳在表2-7至表2-9中。结果显示双特异性抗体对B7-H3高表达的肿瘤细胞呈现非常显著的杀伤作用，并且呈剂量依赖性，其EC₅₀值在0.2-4.2pM之间。

表2-7：双特异性抗体AB12E7介导CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞的EC₅₀值

	HT-55	H1975	A431	HGC-27	THP-1-Luc
						EC<sub>50</sub>(pM)	3.972	4.166	2.231	0.975	0.863

表2-8：双特异性抗体AB12E8介导CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞的EC₅₀值

	THP-1-Luc	A498
			EC<sub>50</sub>(pM)	0.186	0.432

表2-9：双特异性抗体AB12E9介导CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞的EC₅₀值

	A498
		EC<sub>50</sub>(pM)	0.526

2.5、双特异性抗体介导PBMC细胞杀伤肿瘤细胞的能力

正常培养的肿瘤细胞系HT55、A498、H1975和A431作为靶细胞，用0.25％的胰酶消化，制备单细胞悬液，调整细胞密度2×10⁵个/ml，加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，培养过夜。按实验设计稀释相应抗体，50μl/孔，无需加入抗体的孔则用相同体积的培养基补入。然后加入5倍于靶细胞数的人PBMC细胞作效应细胞，100μl/孔，设置对照孔，无需加入效应细胞的孔则用相同体积的培养基补入。培养24h或36h后，96孔板弃上清，用PBS洗3遍，加入含10％CCK-8的完全培养基，100μl/孔，37℃孵育4h，用酶标仪检测A450-620nm的吸光值。通过软件GraphPad进行分析，计算并比较双特异性抗体介导杀伤肿瘤细胞的能力。

根据图2-11至图2-13的实验结果表明，双特异性抗体具备较强介导PBMC杀伤肿瘤细胞的能力。表2-10至表2-12中显示，针对不同来源PBMC，双特异性抗体AB12E7、AB12E8和AB12E9对B7-H3高表达的肿瘤细胞呈现非常显著的杀伤作用，并且呈剂量依赖性，其EC₅₀值范围在4.7-57.8pM之间。

表2-10：双特异性抗体AB12E7介导PBMC杀伤肿瘤细胞的EC₅₀值

	HT-55	HT-55	HT-55	H1975	A498
						EC<sub>50</sub>(pM)	12.54	12.26	10.60	7.261	57.84

表2-11：双特异性抗体AB12E8介导PBMC杀伤肿瘤细胞的EC₅₀值

	A498
		EC<sub>50</sub>(pM)	34.76

表2-12：双特异性抗体AB12E9介导PBMC杀伤肿瘤细胞的EC₅₀值

	A431
		EC<sub>50</sub>(pM)	4.706

实施例三、Anti-B7-H3×CD3双特异性抗体的体内生物学功能评价

3.1、Anti-B7-H3×CD3双特异性抗体(AB12E7)在体内皮下移植人非小细胞肺癌H1975细胞模型中的药效学研究

选取B7-H3表达阳性的人非小细胞肺癌H1975细胞小鼠移植瘤模型对抗B7-H3-CD3双功能特异性抗体进行体内抑制肿瘤生长的药效学研究。

取正常人外周血，用密度梯度离心法分离人PBMC细胞，然后用RPMI-1640培养液加入10％已灭活的FBS重悬，并且加入终浓度为1μg/ml的OKT3，以及250IU/ml人IL-2；第三天后，300g离心5min，换液，用RPMI-1640加入10％已灭活FBS重悬细胞进行培养，同时加入250IU/ml人IL-2；每2天添加新鲜的培养液，培养到第12天，收集CD3AK细胞。选取七至八周龄的雌性NPG小鼠(北京维通达生物技术有限公司)，收集处于对数生长期的H1975细胞，将5×10⁶个H1975细胞和1.7×10⁶个CD3AK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1小时后，小鼠按体重随机分为5组，每组6只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药两次，双功能抗体AB12E7给药组的剂量分别为1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm³)＝[D×d²]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。

如图3-1所示，在给药后第24天，PBS对照组平均肿瘤体积为2394.13±326.45mm³，1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg的AB12E7给药组的平均肿瘤体积分别为9.98±4.46mm³、21.77±7.10mm³和92.60±28.25mm³，与PBS对照组相比AB12E7各给药组TGI分别为99.58％、99.09％和96.13％，相对于PBS对照组和单抗组均有极显著性差异(P<0.01)。

上文所描述的结果表明，双功能特异性抗体AB12E7在动物体内通过激活人类免疫细胞来抑制肿瘤细胞的生长。

3.2、Anti-B7-H3×CD3双特异性抗体(AB12E8)在体内皮下移植人非小细胞肺癌H1975细胞模型中的药效学研究

复苏PBMC细胞离心后用RPMI-1640培养液加入10％已灭活的FBS重悬，并且加入终浓度为1μg/ml的OKT3，以及250IU/ml人IL-2；第三天后，300g离心5min，换液，用RPMI-1640加入10％已灭活FBS重悬细胞进行培养，同时加入250IU/ml人IL-2；每2天添加新鲜的培养液，培养到第9天，收集CD3AK细胞。选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的H1975细胞，将5×10⁶个H1975细胞和1.7×10⁶个CD3AK细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。待肿瘤体积长至100mm³左右，根据肿瘤体积和小鼠体重随机分为4组，每组6只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药两次，双功能抗体AB12E8给药组的剂量分别为1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm³)＝[D×d²]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。

如图3-2所示，在给药后第20天，PBS对照组平均肿瘤体积为2247.95±386.41mm³，1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg的AB12E8给药组的平均肿瘤体积分别为0.00±0.00mm³、11.75±1.67mm³和5.83±2.53mm³，与PBS对照组相比AB12E8各给药组TGI分别为100％、99.54％和99.76％，相对于PBS对照组均有极显著性差异(P<0.01)。

上文所描述的结果表明，双功能特异性抗体AB12E8在较低剂量下也能够抑制肿瘤细胞的生长，具有极显著的抑瘤作用。

3.3、Anti-B7-H3×CD3双特异性抗体(AB12E9)在体内皮下移植人表皮癌A431细胞模型中的药效学研究

选取B7-H3表达阳性的人表皮癌A431细胞小鼠移植瘤模型对抗B7-H3-CD3双功能特异性抗体进行体内抑制肿瘤生长的药效学研究。

取正常人外周血，用密度梯度离心法分离人PBMC细胞，选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的A431细胞，将2×10⁶个A431细胞和2×10⁶个PBMC细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。1小时后，小鼠按体重随机分为4组，每组5-6只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药两次，双功能抗体AB12E9给药组的剂量分别为1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm³)＝[D×d²]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。

如图3-3所示，在给药后第17天，PBS对照组平均肿瘤体积为1949.06±371.70mm³，1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg的AB12E9给药组的平均肿瘤体积分别为121.68±35.88mm³、41.98±11.26mm³和147.62±26.15mm³，与PBS对照组相比AB12E9各给药组TGI分别为93.76％、97.85％和92.43％，1mg/kg给药组相对于PBS对照组有显著性差异(P<0.01)，0.2mg/kg和0.04mg/kg给药组相对于PBS对照组均有极显著性差异(P<0.001)。

上文所描述的结果表明，双功能特异性抗体AB12E9在较低剂量下能够抑制肿瘤细胞的生长，且具有极显著的抑瘤作用。

3.4、Anti-B7-H3×CD3双特异性抗体(AB12E8)在体内皮下移植人表皮癌A431细胞模型中的药效学研究

取正常人外周血，用密度梯度离心法分离人PBMC细胞，选取七至八周龄的雌性NPG小鼠，收集处于对数生长期的A431细胞，将2×10⁶个A431细胞和2×10⁶个PBMC细胞混合，接种于NPG小鼠右侧背部皮下。待肿瘤体积生长至100mm³左右，小鼠按肿瘤体积和体重随机分为4组，每组6只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药两次，双功能抗体AB12E8给药组的剂量分别为1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm³)＝[D×d²]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。

如图3-4所示，在给药后第21天，PBS对照组平均肿瘤体积为1461.32±300.88mm³，1mg/kg、0.2mg/kg和0.04mg/kg的AB12E8给药组的平均肿瘤体积分别为58.30±41.40mm³、24.13±4.91mm³和799.78±380.42mm³，与PBS对照组相比AB12E8各给药组TGI分别为97.03％、98.46％和50.03％，1mg/kg和0.2mg/kg给药组相对于PBS对照组有显著性差异(P<0.01)，能明显抑制肿瘤体积的增长。

上文所描述的结果表明，双功能特异性抗体AB12E8在肿瘤体积生长至100mm³左右条件下开始治疗给药，于1mg/kg和0.2mg/kg剂量下都能够抑制肿瘤细胞的生长。

3.5、Anti-B7-H3×CD3双特异性抗体(AB12E8)在体内皮下移植人肾癌A498细胞模型中的药效学研究

选取B7-H3表达阳性的人肾癌A498细胞小鼠移植瘤模型对抗B7-H3-CD3双功能特异性抗体进行体内抑制肿瘤生长的药效学研究。

选取七至八周龄的雌性NOG小鼠(购自北京维通利华生物技术有限公司)，收集处于对数生长期的A498细胞，将5×10⁶个A498细胞和等体积的Matrigel混合，接种于NOG小鼠右侧背部皮下。待肿瘤体积生长至100-200mm³和200-300mm³左右，取正常人外周血，用密度梯度离心法分离人PBMC细胞，腹腔注射荷瘤后的小鼠(5×10⁶/只)，一小时后小鼠按肿瘤体积和体重随机分为5组，每组5只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药两次，双功能抗体AB12E8给药组的剂量分别为1mg/kg和0.1mg/kg。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(D)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm³)＝[D×d²]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-给药组体积/对照组体积)×100％。

如图3-5所示，在给药后第17天，PBS对照组平均肿瘤体积为1844.23±158.08mm³，1mg/kg和0.1mg/kg的AB12E8(100-200mm³)给药组的平均肿瘤体积分别为9.25±9.25mm³和15.38±5.13mm³，与PBS对照组相比AB12E8(100-200mm³)各给药组TGI分别为99.42％和99.13％，相对于PBS对照组均有极显著性差异(P<0.001)；1mg/kg和0.1mg/kg的AB12E8(200-300mm³)给药组的平均肿瘤体积分别为29.82±14.03mm³和10.15±2.54mm³，与PBS对照组相比AB12E8(200-300mm³)各给药组TGI分别为98.82％和99.63％，相对于PBS对照组均有极显著性差异(P<0.001)，且各给药组之间组间对比无差异(P>0.05)。

上文所描述的结果表明，双功能特异性抗体AB12E8在肿瘤体积生长至100-200mm³和200-300mm³左右条件下开始治疗给药，于1mg/kg和0.1mg/kg剂量下都能够显著抑制肿瘤细胞的生长，且和对照组相比有极显著性差异((P<0.001)，且在该实验条件下未表现出剂量依赖关系。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 安源医药科技（上海）有限公司

<120> 针对B7-H3和CD3的同源二聚体型双特异性抗体及其制备方法和用途

<130> 202105

<160> 33

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 抗B7-H3抗体_HCDR1()

<400> 1

Ala Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 抗B7-H3抗体_HCDR2()

<400> 2

Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Asn Phe Arg

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Asp

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<212> PRT

<213> 抗B7-H3抗体_HCDR3()

<400> 3

Gly Val Arg Ile Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 抗B7-H3抗体_LCDR1()

<400> 4

Arg Thr Ser Glu Asn Ile Asp Tyr Thr Leu Ala

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<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 抗B7-H3抗体_LCDR2()

<400> 5

Asn Ala Asn Thr Leu Glu Glu

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 抗B7-H3抗体_LCDR3()

<400> 6

Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Arg Thr

1 5

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 抗B7-H3抗体_VH()

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Arg Asp Lys Ala Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Arg Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 抗B7-H3抗体_VL()

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Asp Tyr Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Asn Thr Leu Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> AB614_HCDR1

<400> 9

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 10

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<212> PRT

<213> AB614_HCDR2

<400> 10

Arg Ile Arg Ser Lys Ile Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Asp

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> AB614_HCDR3

<400> 11

His Asp Asn Phe Tyr Gly Ser Thr Tyr Ser Trp Phe Ala Asp

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<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> AB614_LCDR1

<400> 12

Arg Ser Ser Thr Gly Val Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

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<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> AB614_LCDR2

<400> 13

Ala Thr Asn Tyr Arg Ala Pro

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> AB614_LCDR3

<400> 14

Val Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val

1 5

<210> 15

<211> 125

<212> PRT

<213> AB614_VH

<400> 15

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ile Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Asp Asn Phe Tyr Gly Ser Thr Tyr Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 16

<211> 109

<212> PRT

<213> AB614_VL

<400> 16

Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Val Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 17

<211> 28

<212> PRT

<213> CTP: hCG β(118-145氨基酸序列)

<400> 17

Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20 25

<210> 18

<211> 28

<212> PRT

<213> CTP: hCG β(118-145突变型氨基酸序列)

<400> 18

Ser Ser Ser Gly Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg

1 5 10 15

Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln

20 25

<210> 19

<211> 27

<212> PRT

<213> G2(GGGGS)3CTP1

<400> 19

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Gly Lys Ala Pro Pro Pro Ser

20 25

<210> 20

<211> 25

<212> PRT

<213> (GGGGS)3CTP1

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

1 5 10 15

Ser Ser Gly Lys Ala Pro Pro Pro Ser

20 25

<210> 21

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<212> PRT

<213> GS(GGGGS)2CTP1

<400> 21

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

Lys Ala Pro Pro Pro Ser

20

<210> 22

<211> 33

<212> PRT

<213> (GGGGS)1CTP4

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu

1 5 10 15

Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro

20 25 30

Gln

<210> 23

<211> 227

<212> PRT

<213> IgG1 Fc(L234A，L235A，N297A，P331S，T250Q，M428L，P445G，G446E，K447C突变体恒定区氨基酸序列)

<400> 23

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Gly Glu Cys

225

<210> 24

<211> 226

<212> PRT

<213> IgG1(L234A，L235A，P331S，T250Q，M428L，N434A，K447-突变体恒定区氨基酸序列)

<400> 24

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

195 200 205

His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 25

<211> 226

<212> PRT

<213> IgG1(L234A，L235A，P331S，T250Q，M428L，K447-突变体恒定区氨基酸序列)

<400> 25

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 26

<211> 741

<212> PRT

<213> AB12E7氨基酸序列()

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Arg Asp Lys Ala Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Arg Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile

145 150 155 160

Asp Tyr Thr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys

165 170 175

Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Thr Leu Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg

180 185 190

Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp

210 215 220

Val Pro Arg Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

245 250 255

Ser Ser Gly Lys Ala Pro Pro Pro Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

275 280 285

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln

290 295 300

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ile

305 310 315 320

Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr

325 330 335

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn

340 345 350

Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Asp Asn

355 360 365

Phe Tyr Gly Ser Thr Tyr Ser Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr

405 410 415

Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly

420 425 430

Val Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp

435 440 445

His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Ala Pro Gly

450 455 460

Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu

465 470 475 480

Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val

485 490 495

Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

500 505 510

Val Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

515 520 525

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln

530 535 540

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

545 550 555 560

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

565 570 575

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser

580 585 590

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

595 600 605

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

610 615 620

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

625 630 635 640

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

645 650 655

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

660 665 670

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

675 680 685

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

690 695 700

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

705 710 715 720

Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

725 730 735

Leu Ser Gly Glu Cys

740

<210> 27

<211> 2223

<212> DNA

<213> AB12E7核苷酸序列()

<400> 27

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ctggctccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cttctggcta caccttcaca gcctattgga tgaactgggt gaagcagagg 120

ccaggacagt gtctggagtg gatcggcagg atcgatcctt acgacagcga gacccggtat 180

aaccagaact tcagggacaa ggctaggctg acagtggata agtcttccag caccgcttac 240

atggagctgt cttccctgcg gtctgaggac acagccgtgt actattgcgc caggggcgtg 300

cggatcttcg attattgggg ccagggcacc acagtgaccg tgagctctgg aggaggagga 360

tctggaggag gaggctccgg aggaggagga agcgatatcc agatgacaca gtctccatcc 420

agcctgagcg cctctgtggg cgacagggtg accatcacat gtcggacctc cgagaatatc 480

gattacacac tggcttggta tcagcagaag cccggcaaga gccctaagct gctgatctac 540

aacgccaata ccctggagga gggcgtgcct tctagattcc gcggttccgg aagcggaaca 600

cacttcaccc tgacaatctc ttccctgcag ccagaggact tcgctaccta cttttgcaag 660

caggcctatg atgtgcccag aacctttggc tgcggcacaa aggtggagat caagggtggc 720

ggcggtggag gatccggcgg tggaggtagc ggcggaggcg gtagctccag ctctggtaaa 780

gctccccctc cttccgaggt gcagctgctg gagtccggag gaggactggt gcagccagga 840

ggctccctga agctgagctg tgctgcctct ggctttacct tcaacacata cgccatgaat 900

tgggtgcggc aggctccagg caagggactg gagtgggtgg gcaggatcag gtctaagatc 960

aacaattatg ccacctacta tgctgattcc gtgaaggaca ggttcaccat ctcccgcgac 1020

gatagcaaga acacagccta cctgcagatg aacaatctga agaccgagga taccgccatg 1080

tactactgcg tgagacatga caacttttac ggcagcacat actcctggtt cgctgactgg 1140

ggacagggca ccctggtcac agtgagctct ggaggaggag gatctggagg aggaggctcc 1200

ggaggaggag gaagcgagct ggtggtgacc caggagccat ctctgacagt gtcccccggc 1260

ggcacagtga ccctgacatg tagatccagc accggcgtgg tgaccacatc caactacgct 1320

aattgggtgc aggagaagcc agatcacctg ttcacaggac tgatcggagc taccaactac 1380

agggctcctg gaacaccagc tcggtttagc ggatctctgc tgggaggcaa ggctgccctg 1440

accctgtccg gagtgcagcc agaggatgag gccatctact tctgcgtgct gtggtatagc 1500

aatcattggg tgttcggagg aggaaccaag ctgacagtgc tggacaagac ccatacatgc 1560

ccaccatgcc ctgcccctga agccgccgga ggaccttccg tgttcctgtt ccctcccaag 1620

ccaaaagatc agctgatgat ctctagaacc cccgaagtca cctgcgtggt cgtcgacgtg 1680

tcccatgagg accctgaagt caagttcaac tggtacgtgg acggtgtcga agtccacaac 1740

gccaagacca agcctaggga ggagcagtat gccagcacat accgggtggt gtctgtgctg 1800

accgtgctgc atcaggattg gctgaatggc aaggaatata aatgtaaggt gagcaataag 1860

gctctgccgg ctagcattga aaaaaccatt tccaaggcta agggccagcc cagggagcct 1920

caggtctaca ccctgcctcc atctagagat gaactgacca aaaaccaggt gagcctgact 1980

tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac attgccgtgg agtgggagtc taatggccag 2040

cctgaaaata actacaaaac tacccctcct gtgctggact ctgatggctc cttctttctg 2100

tactctaaac tgaccgtgga caagtctcgc tggcagcagg gtaacgtgtt ttcttgctcc 2160

gtgctgcacg aggctctgca taaccattac acccagaaga gcctgtctct gtctggcgag 2220

tgt 2223

<210> 28

<211> 740

<212> PRT

<213> AB12E8氨基酸序列()

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Arg Asp Lys Ala Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Arg Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile

145 150 155 160

Asp Tyr Thr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys

165 170 175

Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Thr Leu Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg

180 185 190

Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp

210 215 220

Val Pro Arg Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

245 250 255

Ser Ser Gly Lys Ala Pro Pro Pro Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

275 280 285

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln

290 295 300

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ile

305 310 315 320

Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr

325 330 335

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn

340 345 350

Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Asp Asn

355 360 365

Phe Tyr Gly Ser Thr Tyr Ser Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr

405 410 415

Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly

420 425 430

Val Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp

435 440 445

His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Ala Pro Gly

450 455 460

Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu

465 470 475 480

Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val

485 490 495

Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

500 505 510

Val Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

515 520 525

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln

530 535 540

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

545 550 555 560

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

565 570 575

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

580 585 590

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

595 600 605

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

610 615 620

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

625 630 635 640

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

645 650 655

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

660 665 670

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

675 680 685

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

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Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

725 730 735

Leu Ser Pro Gly

740

<210> 29

<211> 2220

<212> DNA

<213> AB12E8核苷酸序列()

<400> 29

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ctggctccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cttctggcta caccttcaca gcctattgga tgaactgggt gaagcagagg 120

ccaggacagt gtctggagtg gatcggcagg atcgatcctt acgacagcga gacccggtat 180

aaccagaact tcagggacaa ggctaggctg acagtggata agtcttccag caccgcttac 240

atggagctgt cttccctgcg gtctgaggac acagccgtgt actattgcgc caggggcgtg 300

cggatcttcg attattgggg ccagggcacc acagtgaccg tgagctctgg aggaggagga 360

tctggaggag gaggctccgg aggaggagga agcgatatcc agatgacaca gtctccatcc 420

agcctgagcg cctctgtggg cgacagggtg accatcacat gtcggacctc cgagaatatc 480

gattacacac tggcttggta tcagcagaag cccggcaaga gccctaagct gctgatctac 540

aacgccaata ccctggagga gggcgtgcct tctagattcc gcggttccgg aagcggaaca 600

cacttcaccc tgacaatctc ttccctgcag ccagaggact tcgctaccta cttttgcaag 660

caggcctatg atgtgcccag aacctttggc tgcggcacaa aggtggagat caagggtggc 720

ggcggtggag gatccggcgg tggaggtagc ggcggaggcg gtagctccag ctctggtaaa 780

gctccccctc cttccgaggt gcagctgctg gagtccggag gaggactggt gcagccagga 840

ggctccctga agctgagctg tgctgcctct ggctttacct tcaacacata cgccatgaat 900

tgggtgcggc aggctccagg caagggactg gagtgggtgg gcaggatcag gtctaagatc 960

aacaattatg ccacctacta tgctgattcc gtgaaggaca ggttcaccat ctcccgcgac 1020

gatagcaaga acacagccta cctgcagatg aacaatctga agaccgagga taccgccatg 1080

tactactgcg tgagacatga caacttttac ggcagcacat actcctggtt cgctgactgg 1140

ggacagggca ccctggtcac agtgagctct ggaggaggag gatctggagg aggaggctcc 1200

ggaggaggag gaagcgagct ggtggtgacc caggagccat ctctgacagt gtcccccggc 1260

ggcacagtga ccctgacatg tagatccagc accggcgtgg tgaccacatc caactacgct 1320

aattgggtgc aggagaagcc agatcacctg ttcacaggac tgatcggagc taccaactac 1380

agggctcctg gaacaccagc tcggtttagc ggatctctgc tgggaggcaa ggctgccctg 1440

accctgtccg gagtgcagcc agaggatgag gccatctact tctgcgtgct gtggtatagc 1500

aatcattggg tgttcggagg aggaaccaag ctgacagtgc tggacaagac ccatacatgc 1560

ccaccatgcc ctgcccctga agccgccgga ggaccttccg tgttcctgtt ccctcccaag 1620

ccaaaagatc agctgatgat ctctagaacc cccgaagtca cctgcgtggt cgtcgacgtg 1680

tcccatgagg accctgaagt caagttcaac tggtacgtgg acggtgtcga agtccacaac 1740

gccaagacca agcctaggga ggagcagtat aatagcacat accgggtggt gtctgtgctg 1800

accgtgctgc atcaggattg gctgaatggc aaggaatata aatgtaaggt gagcaataag 1860

gctctgccgg ctagcattga aaaaaccatt tccaaggcta agggccagcc cagggagcct 1920

caggtctaca ccctgcctcc atctagagat gaactgacca aaaaccaggt gagcctgact 1980

tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac attgccgtgg agtgggagtc taatggccag 2040

cctgaaaata actacaaaac tacccctcct gtgctggact ctgatggctc cttctttctg 2100

tactctaaac tgaccgtgga caagtctcgc tggcagcagg gtaacgtgtt ttcttgctcc 2160

gtgctgcacg aggctctgca tgctcattac acccagaaga gcctgtctct gtctccagga 2220

<210> 30

<211> 740

<212> PRT

<213> AB12E9氨基酸序列()

<400> 30

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Arg Asp Lys Ala Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

130 135 140

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile

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Asp Tyr Thr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys

165 170 175

Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Asn Thr Leu Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg

180 185 190

Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

195 200 205

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp

210 215 220

Val Pro Arg Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

245 250 255

Ser Ser Gly Lys Ala Pro Pro Pro Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala

275 280 285

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln

290 295 300

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ile

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Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr

325 330 335

Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn

340 345 350

Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg His Asp Asn

355 360 365

Phe Tyr Gly Ser Thr Tyr Ser Trp Phe Ala Asp Trp Gly Gln Gly Thr

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Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr

405 410 415

Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly

420 425 430

Val Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp

435 440 445

His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Ala Pro Gly

450 455 460

Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu

465 470 475 480

Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Val

485 490 495

Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

500 505 510

Val Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

515 520 525

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln

530 535 540

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

545 550 555 560

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

565 570 575

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

580 585 590

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

595 600 605

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

610 615 620

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

625 630 635 640

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

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660 665 670

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

675 680 685

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

690 695 700

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

705 710 715 720

Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

725 730 735

Leu Ser Pro Gly

740

<210> 31

<211> 2220

<212> DNA

<213> AB12E9核苷酸序列()

<400> 31

gaggtgcagc tggtgcagag cggcgctgag gtgaagaagc ctggctccag cgtgaaggtg 60

agctgcaagg cttctggcta caccttcaca gcctattgga tgaactgggt gaagcagagg 120

ccaggacagt gtctggagtg gatcggcagg atcgatcctt acgacagcga gacccggtat 180

aaccagaact tcagggacaa ggctaggctg acagtggata agtcttccag caccgcttac 240

atggagctgt cttccctgcg gtctgaggac acagccgtgt actattgcgc caggggcgtg 300

cggatcttcg attattgggg ccagggcacc acagtgaccg tgagctctgg aggaggagga 360

tctggaggag gaggctccgg aggaggagga agcgatatcc agatgacaca gtctccatcc 420

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tactactgcg tgagacatga caacttttac ggcagcacat actcctggtt cgctgactgg 1140

ggacagggca ccctggtcac agtgagctct ggaggaggag gatctggagg aggaggctcc 1200

ggaggaggag gaagcgagct ggtggtgacc caggagccat ctctgacagt gtcccccggc 1260

ggcacagtga ccctgacatg tagatccagc accggcgtgg tgaccacatc caactacgct 1320

aattgggtgc aggagaagcc agatcacctg ttcacaggac tgatcggagc taccaactac 1380

agggctcctg gaacaccagc tcggtttagc ggatctctgc tgggaggcaa ggctgccctg 1440

accctgtccg gagtgcagcc agaggatgag gccatctact tctgcgtgct gtggtatagc 1500

aatcattggg tgttcggagg aggaaccaag ctgacagtgc tggacaagac ccatacatgc 1560

ccaccatgcc ctgcccctga agccgccgga ggaccttccg tgttcctgtt ccctcccaag 1620

ccaaaagatc agctgatgat ctctagaacc cccgaagtca cctgcgtggt cgtcgacgtg 1680

tcccatgagg accctgaagt caagttcaac tggtacgtgg acggtgtcga agtccacaac 1740

gccaagacca agcctaggga ggagcagtat aatagcacat accgggtggt gtctgtgctg 1800

accgtgctgc atcaggattg gctgaatggc aaggaatata aatgtaaggt gagcaataag 1860

gctctgccgg ctagcattga aaaaaccatt tccaaggcta agggccagcc cagggagcct 1920

caggtctaca ccctgcctcc atctagagat gaactgacca aaaaccaggt gagcctgact 1980

tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac attgccgtgg agtgggagtc taatggccag 2040

cctgaaaata actacaaaac tacccctcct gtgctggact ctgatggctc cttctttctg 2100

tactctaaac tgaccgtgga caagtctcgc tggcagcagg gtaacgtgtt ttcttgctcc 2160

gtgctgcacg aggctctgca taaccattac acccagaaga gcctgtctct gtctccagga 2220

<210> 32

<211> 116

<212> PRT

<213> VH

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr

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Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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50 55 60

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65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Val Arg Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 107

<212> PRT

<213> VL

<400> 33

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asn Ile Asp Tyr Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asn Ala Asn Thr Leu Glu Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ala Tyr Asp Val Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体分子由两条相同的多肽链以共价键结合形成四价同源二聚体，每条多肽链从N端至C端依次包含特异性结合肿瘤相关抗原B7-H3的第一单链Fv、特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv和Fc片段；其中，第一和第二单链Fv通过连接肽相连，而第二单链Fv与Fc片段直接相连或通过连接肽相连，且所述Fc片段不具有CDC、ADCC和ADCP等效应子功能。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合肿瘤相关抗原B7-H3的第一单链Fv所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽连接，且所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3；所述肿瘤相关抗原B7-H3包含但不限于：B7-H3的任何变体、同工型、衍生物和物种同源物。

3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合B7-H3，其VH结构域和VL结构域包含的CDR1、CDR2和CDR3序列如下：

4.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一单链Fv特异性结合B7-H3，其选自下组：

1)VH结构域包含如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；

2)VH结构域包含如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：33所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合效应细胞抗原CD3的第二单链Fv所包含的VH结构域和VL结构域通过连接肽连接，且所述连接肽的氨基酸序列为(GGGGX)n，X包含Ser或Ala，X优选Ser；n为1-5的自然数，n优选3；优选的，所述双特异性抗体的第二单链Fv能与人CD3结合。

6.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含的HCDR1、HCDR2和HCDR3分别如SEQ ID NO：9、10和11所示，或与上述序列至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代的序列；和其VL结构域包含的LCDR1、LCDR2和LCDR3分别如SEQ ID NO：12、13和14所示，或与上述序列至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代的序列。

7.如权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二单链Fv特异性结合CD3，其VH结构域包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列；和其VL结构域包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或与上述序列中的任何基本上相同(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高度相似的或具有一个或更多个氨基酸取代(例如保守性取代))的序列。

8.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接第一单链Fv和第二单链Fv的连接肽由柔性肽和刚性肽组成；且所述柔性肽包含2个或更多个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；更优地，所述柔性肽包含G和S残基；最优地，所述柔性肽的氨基酸组成结构通式为GxSy(GGGGS)z，其中x，y和z是大于或等于0的整数，且x+y+z≥1；所述刚性肽来自天然人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端第118至145位氨基酸组成的全长序列或其截短的片段或其具有氨基酸置换的片段；优选地，所述刚性肽包含SSSGKAPPPS。

9.如权利要求8所述的双特异性抗体，其特征在于，所述连接肽包含如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。

10.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，连接所述Fc片段与第二单链Fv的连接肽包含1-20个氨基酸，并优选自下列几种氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)；较优选自Gly(G)和Ser(S)；更优选地，所述连接肽组成为(GGGGS)n，n＝1，2，3或4。

11.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段包含来源于人免疫球蛋白重链恒定区的铰链区、CH2和CH3结构域；较优地，Fc片段选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；较优地，Fc片段选自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区；更优地，Fc片段选自人IgG1或IgG4的重链恒定区；并且，所述Fc片段与其所源自的天然序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。

12.如权利要求11所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段包含具有降低或消除的效应子功能(ADCP、ADCC和CDC效应)的氨基酸置换、缺失或添加；优选的，所述Fc片段包含根据EU编号系统确定的L234A/L235A/P331S的氨基酸置换。

13.如权利要求12所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段还包含具有以下一种或多种性质的氨基酸的置换、缺失或添加：

(i)与新生儿受体(FcRn)的结合亲和力增强；

(ii)降低或消除的糖基化；

(iii)降低或消除的电荷异质性。

14.如权利要求13所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段还包含以下一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加：

(i)根据EU编号系统确定的M428L、T250Q/M428L、M428L/N434S、M252Y/S254T/T256E的氨基酸置换；

(ii)根据EU编号系统确定的N297A的氨基酸置换；

(iii)根据EU编号系统确定的N434A的氨基酸置换；

(iv)根据EU编号系统确定的P445G/G446E/K447C的氨基酸置或K447的氨基酸缺失。

15.如权利要求11所述的双特异性抗体，其特征在于，所述Fc片段的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：23、24或25所示。

16.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体结合人B7-H3和CD3，其氨基酸序列选自下组：

(i)如SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列，或与上述序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加的序列；或与上述序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

(ii)与SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，或与上述序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加的序列；或与上述序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；

(iii)SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，或与上述序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加的序列；或与上述序列相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

17.编码如权利要求1-16任一项所述双特异性抗体的DNA分子。

18.如权利要求17所述的DNA分子，其特征在于，具有如SEQ ID NO：27、29或31所示的核苷酸序列。

19.包含如权利要求17或18所述DNA分子的载体。

20.包含如权利要求19所述载体的宿主细胞；所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，优选为CHO细胞。

21.一种药物组合物，所述组合物包含如权利要求1-16任一项所述的双特异性抗体以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂；

优选地，药物组合物还包含另外的药学活性剂；

优选地，所述另外的药学活性剂是用于治疗免疫相关疾病的药物；

优选地，所述另外的药学活性剂是具有抗肿瘤活性的药物；

优选地，所述另外的药学活性剂是用于治疗自身免疫性疾病的药物；

优选地，所述抗体与所述另外的药学活性剂作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。

22.如权利要求21所述的药物组合物还包括向受试者施用所述药物组合物之前、之后或同时施用药学活性剂，其中所述药学活性剂选自抗体、抗原结合片段、酶、细胞毒性剂、毒素、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子和放射性同位素。

23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组：PD-1、PD-L1、PD-L2、PD-L3、TIM-3、LAG-3、TIGIT、VISTA、CTLA-4、OX40、4-1BB、B7-H4、B7-H6、BTLA、CD27、CD28、CD40、CD96、CD160、ICOS、GITR、CD3、LAIR1、2B4、HVEM、NKG2A、IL-18BP、ST2及其任意组合。

24.一种用于重新激活被B7-H3免疫检查点抑制的T细胞、NK细胞、树突细胞、抗原提呈细胞活性的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的如权利要求1-16任一项所述的双特异性抗体或如权利要求21-23任一项所述的药物组合物。

25.一种用于预防/治疗疾病、延迟其进展、降低/抑制其复发的方法，所述疾病包含免疫相关疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等疾病，其包括将有效量的如权利要求1-16任一项所述的双特异性抗体或如权利要求21-23任一项所述的药物组合物给予或施用至所述患有以上疾病或病症的个体。

26.制备如权利要求1-16任一项所述双特异性抗体的方法，其包括：(a)获得双特异性抗体的融合基因，构建双特异性抗体的表达载体；(b)通过基因工程方法将上述表达载体转染到宿主细胞中；(c)在允许产生所述双特异性抗体的条件下培养上述宿主细胞；(d)分离、纯化产生的所述抗体；

其中，步骤(a)中所述表达载体选自质粒、细菌和病毒中的一种或多种；

其中，步骤(b)通过基因工程方法将所构建的载体转染入宿主细胞中，所述宿主细胞包含原核细胞、酵母或哺乳动物细胞，如CHO细胞、NS0细胞或其它哺乳动物细胞；

27.如权利要求1-16任一项所述的双特异性抗体在制备治疗、预防或缓解肿瘤的药物中的用途，其中所述癌症包括：肺癌(例如，非小细胞肺癌)、鳞状细胞癌、头颈癌、表皮癌、口腔癌、黑色素瘤、食道癌、胃癌、胃腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌(例如，肾透明细胞癌)、胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、甲状腺癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、血液系统恶性疾病(例如，髓系白血病和B淋巴癌)以及所述癌症的难治性、复发性和转移性病灶。