CN115531382A - 喹啉噻唑啉酮衍生物Ro-3306在治疗β-冠状病毒感染中的应用 - Google Patents
喹啉噻唑啉酮衍生物Ro-3306在治疗β-冠状病毒感染中的应用 Download PDFInfo
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本发明涉及喹啉噻唑啉酮衍生物Ro‑3306在治疗β‑冠状病毒感染中的应用。本发明提供了Ro‑3306(式I)在制备药物中的用途，所述药物用于治疗β‑冠状病毒感染。Ro‑3306可以直接作用于TFEB蛋白液态凝聚体，在细胞间期提高TFEB的转录活性，促进溶酶体酸化，抑制β‑冠状病毒对溶酶体的碱化，进而抑制β‑冠状病毒的分泌，用于治疗β‑冠状病毒感染。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别地涉及喹啉噻唑啉酮衍生物Ro-3306在治疗β-冠状病毒感染中的应用。
背景技术
β-冠状病毒是一类具有囊膜的正链RNA病毒，可以感染人和其他哺乳动物，引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统等疾病。与人类重大公共流行病相关的β-冠状病毒包括新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)、严重急性呼吸道综合征冠状病毒 (severe acute respiratory syndromes coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)，分别引起新冠肺炎、非典型性肺炎和中东呼吸综合征等流行病。β-冠状病毒感染目前仍然缺乏临床有效的治疗药物；另外由于RNA病毒极易突变，利用接种疫苗等群体免疫手段，无法彻底根除β-冠状病毒感染，只能在一定程度上抑制相关流行病的爆发，因此β-冠状病毒已经成为严重威胁全世界公共卫生安全的感染源。
β-冠状病毒对宿主细胞的感染过程包括入侵、复制、包装、分泌四个步骤，理论上阻断其中任意一个过程都可以抑制病毒的感染效率。β-冠状病毒的复制和分泌与溶酶体通路密切相关，一些复制关键蛋白需要通过溶酶体中的蛋白酶进行剪切，以转化为活性状态，进而催化下游的复制过程；组装好的β-冠状病毒则劫持并碱化溶酶体，利用溶酶体的分泌途径进行细胞外分泌，从而可以开始下一轮的感染过程(参考文献1，β-coronaviruses uselysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell,183:1520-1535.(2020))。溶酶体的酸化程度对于溶酶体的降解活性和分泌途径至关重要。降解溶酶体中通常是酸性的环境(内部pH值可以低至 5以下)，其中的各种水解酶(如蛋白酶、酯酶、糖苷酶等)在酸性环境下处于活性状态，在碱性条件下活性被抑制，因此溶酶体酸化有利于提高其降解活性。而溶酶体碱化(去酸化)，则被认为是其进行分泌途径的先决条件。碱化的分泌溶酶体会向细胞膜附近移动，并最终与细胞膜融合，将其中包裹的物质分泌至细胞外。β-冠状病毒感染宿主后，先利用酸性的降解溶酶体激活其关键蛋白，进行病毒复制和组装的过程；当宿主细胞中的病毒复制达到一定程度时，多种病毒蛋白会碱化溶酶体，以促进其携带病毒颗粒进行分泌。
在病毒感染宿主细胞后，宿主细胞同样会利用溶酶体等通路抵御病原物入侵，并激活免疫系统。首先，入侵的病毒会被细胞自噬通路识别，并尝试将其运输至溶酶体进行降解。其次，通过各种方式进入溶酶体的病毒，其蛋白会被溶酶体切割成病毒来源的抗原小肽，宿主细胞会利用溶酶体的分泌功能将这些抗原小肽呈递至细胞膜上的MHC复合物，以激活免疫系统对感染宿主细胞的识别。但与此同时，病毒通过碱化溶酶体令其丧失降解活性，又可以抑制溶酶体对病毒蛋白的过度剪切，以产生病毒来源的抗原小肽，最终抑制病毒抗原在宿主细胞表面的展示和免疫系统对感染细胞的识别。因此，β-冠状病毒对宿主细胞的感染过程，是一个竞争性的互作过程，互作的失衡，最终只有宿主清除病毒，或β-冠状病毒的大量感染扩散两种结果。
溶酶体通路的功能对于β-冠状病毒感染宿主，以及宿主对病毒的抵御至关重要。目前已有一些药物，如羟氯喹等，通过抑制溶酶体酸化和降解功能，在细胞系水平干扰病毒的复制和感染过程。但由于溶酶体的酸化和降解活性对于正常细胞存活是必不可少的，因此在临床使用上，羟氯喹本身具有极大的毒副作用，在宿主可耐受的药物浓度下，对新冠病毒感染的临床治疗已经宣告失败。在本发明中，发明人反其道而行，发现利用药物促进溶酶体的酸化和降解功能，可以抑制β-冠状病毒的分泌，以达到抑制β-冠状病毒感染的目的。
溶酶体的代谢过程受到转录因子TFEB(Transcription Factor EB)的调节。激活TFEB的转录活性，可以促进溶酶体相关基因的表达，从而激活溶酶体的酸化和降解功能。TFEB的转录活性与亚细胞定位存在密切关系。通常情况下，TFEB大量定位于细胞质中，极少量定位于细胞核中，以维持一个基础的转录活性。当细胞处于一些应激条件下，比如饥饿等，TFEB 大量入核并呈现升高的转录活性。TFEB的亚细胞定位受到一些信号通路的调控，如mTOR、PKC-GSK3β等通过磷酸化TFEB来抑制其入核。但是同样存在一些调节因子，以不依赖于改变TFEB入核的方式直接参与 TFEB的转录活性调节，如IPMK、ACSS2等。鉴于通过改变TFEB入核的方式间接提高其转录活性通常具有较大的副作用，获取不影响TFEB入核而是直接调节TFEB转录活性的药物是更有利的。在发明人已经发表的研究工作中，发现TFEB可以在细胞内或生化条件下发生液-液相分离，形成蛋白质液态凝聚体。TFEB形成的蛋白质液态凝聚体与其转录活性存在密切关联。因此，理论上可以通过对TFEB液态凝聚体进行人工干预，促进TFEB的转录活性和溶酶体的活化，以实现干扰β-冠状病毒感染的目的。
发明内容
发明人利用TFEB蛋白质的相分离特性开发了一个药物筛选的模型。基于该模型筛选了L4000-Bioactivity Compound Library和L6000-Natural Compound Library(TargetMol)小分子化合物库(共5770个小分子)，获得了一系列候选分子。利用进一步的细胞生物学研究，确认了一个化合物 Ro-3306，其在细胞系中不改变TFEB入核，而是利用TFEB蛋白质凝聚体促进TFEB的转录活性，促进溶酶体数量增加和酸化，抑制β-冠状病毒对溶酶体的碱化及β-冠状病毒的分泌，从而达到治疗β-冠状病毒感染的目的。
Ro-3306是具有式I结构的喹啉噻唑啉酮衍生物，分子式为 C18H13N3OS2，分子量为351.45：
在一个方面，本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于使细胞中的TFEB蛋白液态凝聚体的物理性质发生改变。
在另一个方面，本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期提高TFEB的转录活性。
在另一个方面，本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期增加溶酶体数量和酸化程度。
在另一个方面，本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制β-冠状病毒对溶酶体的碱化及β-冠状病毒的分泌。
在一些实施方案中，β-冠状病毒可以是鼠肝炎病毒(MHV，Mouse hepatitisvirus)。
在一些实施方案中，β-冠状病毒可以是新冠病毒(SARS-CoV-2)。
在一些实施方案中，β-冠状病毒是严重急性呼吸道综合征冠状病毒或中东呼吸综合征冠状病毒。
在另一个方面，本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗β-冠状病毒感染。
在一些实施方案中，β-冠状病毒感染可以选自新冠肺炎、非典肺炎和中东呼吸综合征等。
本发明的有益效果
目前Ro-3306及其结构类似物主要被用于抑制细胞周期、诱导细胞凋亡以及尝试用于肿瘤治疗等方面，尚未报道尝试用于治疗β-冠状病毒感染的推测或实例。根据本发明，Ro-3306可以通过直接作用于TFEB的液态凝聚体，在细胞间期促进细胞溶酶体数量和酸性升高。经Ro-3306处理的细胞系中，β-冠状病毒的感染明显被抑制，因此Ro-3306可用于β-冠状病毒感染的治疗。
附图说明
图1示出了药物筛选的示意流程图。
图2示出了Ro-3306使TFEB液滴融合变大的高内涵成像图。
图3示出了Ro-3306处理不改变TFEB在HeLa细胞中的亚细胞定位。图3A和3B分别示出了对照组和Ro-3306实验组中的TFEB-GFP蛋白的亚细胞定位；图3C示出了对照组和Ro-3306实验组HeLa细胞的细胞核、细胞质和全细胞裂解液中的内源性TFEB蛋白水平。
图4示出了Ro-3306处理促进HeLa细胞系中的溶酶体数量和降解活性增加。图4A-C分别示出了对照组和Ro-3306实验组HeLa细胞中的 LAMP1、DQ-BSA和Magic Red点状结构成像图；图4D示出了对照组和 Ro-3306实验组的每个HeLa细胞中LAMP1、DQ-BSA和Magic Red点状结构数量的统计图。
图5示出了Ro-3306处理促进HeLa细胞系中的溶酶体数量和活性增加依赖于TFEB，而非TFE3或CDK1。图5A-E分别示出了对照组和敲低 TFEB、TFE3、CDK1实验组，及Dinaciclib实验组中，Ro-3306对HeLa 细胞中LysoTracker点状结构数量和分布的影响；图5F示出了每个细胞中 LysoTracker点状结构数量的统计图。
图6示出了Ro-3306处理提高TFEB下游调控基因的mRNA水平。
图7示出了Ro-3306促进HeLa细胞系中的溶酶体数量的效应是可逆的。图7A-D分别示出了Ro-3306处理24小时，和Ro-3306处理24小时后恢复2小时、4小时、8小时的HeLa细胞中，LysoTracker点状结构的数量和分布。
图8示出了Ro-3306促进17Cl-1细胞系中的溶酶体数量。图8A和8B 分别示出了对照组和Ro-3306实验组HeLa细胞中的LysoTracker点状结构成像图；图8C出了对照组和Ro-3306实验组的每个HeLa细胞中 LysoTracker点状结构数量的统计图。
图9示出了Ro-3306抑制MHV病毒对17Cl-1细胞系的感染。图9A 和9B分别示出了感染复数MOI＝1的MHV病毒感染17Cl-1细胞16小时后，对照组和Ro-3306实验组中17Cl-1细胞的病毒感染效率成像图。MHV 病毒基因组中携带GFP表达基因，GFP信号可以反映感染的效率，GFP 强度可用于反映病毒复制和转录的水平；图9C示出了MHV病毒对17Cl-1 细胞感染效率的统计图；图9D示出了沿图9A和9B中横线的GFP荧光强度。
图10示出了Ro-3306抑制了MHV病毒感染17Cl-1细胞后，培养基中的病毒活力。图10A示出了用感染MHV病毒16小时后的正常细胞和 Ro-3306处理细胞的培养基，再次感染17Cl-1细胞后产生的感染斑点；图 10B示出了感染MHV病毒16小时后的正常细胞和Ro-3306处理细胞的培养基中的具有感染性的病毒滴度统计图。
图11示出了Ro-3306抑制MHV病毒对17Cl-1细胞中溶酶体的去酸化。图11A-C分别示出了在MHV病毒感染的对照组和Ro-3306实验组 17Cl-1细胞中，LysoTracker和LAMP1的成像图；图11D示出了对照组和 Ro-3306实验组17Cl-1细胞中，LysoTracker+LAMP1+点状结构在全部 LAMP1点状结构中所占的比例统计图。
图12示出了Ro-3306抑制MHV病毒在17Cl-1细胞中的分泌。图 12A-C分别示出了对照组和Ro-3306实验组17Cl-1细胞中，内质网和溶酶体结构中的MHV病毒颗粒的电镜图；图12D和12E分别示出了对照组和 Ro-3306实验组17Cl-1细胞中，含有MHV病毒颗粒的内质网结构面积占细胞质总面积的比例统计图，和每个溶酶体结构中的病毒颗粒数量统计图。
图13示出了Ro-3306促进Vero-E6细胞系中的溶酶体数量增加。图 13A和13B分别示出了对照组和Ro-3306实验组Vero-E6细胞中的 LysoTracker点状结构成像图；图13C出了对照组和Ro-3306实验组的每个Vero-E6细胞中LysoTracker点状结构数量的统计图。
图14示出了Ro-3306抑制SARS-CoV-2病毒对Vero-E6细胞系的感染。图14A和14B分别示出了感染复数MOI＝1的SARS-CoV-2病毒感染 Vero-E6细胞24小时后，对照组和Ro-3306实验组中Vero-E6细胞的病毒感染效率成像图。用SARS-CoV-2病毒核衣壳(N)蛋白抗体免疫染色对照组和实验组细胞，以反映SARS-CoV-2病毒的感染效率，N蛋白免疫染色强度可用于反映病毒复制和转录的水平；图14C示出了SARS-CoV-2病毒对Vero-E6细胞感染效率的统计图；图14D示出了沿图14A和14B中横线的N蛋白免疫染色的荧光强度。
具体实施方案
本发明利用体外组装的生物大分子液态凝聚体的宏观物理性质，采用高内涵成像的手段筛选小分子化合物库，从中获得若干可以改变生物大分子液态凝聚体的宏观物理性质的候选分子。因而可以进一步在细胞系和动物模型中验证候选小分子化合物的生物学效应，获得了具有特定活性的化学药物(图1)。
具体地，筛选改变TFEB蛋白相分离性质的小分子化合物的方法包括以下步骤：
1)基于体外重组蛋白质液态凝聚体物理性质的改变利用高内涵成像筛选小分子化合物库；
2)利用细胞系检测候选小分子的生物学效应以筛选最优候选小分子，例如利用LysoTracker(ThermoFisher)染料筛选出可以明显增加 LysoTracker染色以及利用半定量荧光PCR技术检测筛选出可以明显增加溶酶体代谢相关基因(TFEB下游基因)的mRNA表达量的最优候选小分子。
3)利用评价体系评价最优候选小分子的效果，例如在细胞系中检测最优候选小分子对溶酶体数量和活性的影响，以及对β-冠状病毒感染的影响。
因此，本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于使细胞中的TFEB蛋白液态凝聚体发生物理性质改变。
液态凝聚体的物理性质表现为形态、融合特性、絮凝特性、浸润特性等。具体地，相关物理性质现象包括：液滴形状趋向于球形或不规则形状，液滴受挤压后发生形变的程度，液滴絮凝的促进或抑制，(絮凝的)液滴发生融合，液滴对基底介质(例如多孔板板底)的浸润的促进或降低等。
本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于提高 TFEB的转录活性。
本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于增加溶酶体数量和酸化程度。
本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制β-冠状病毒对溶酶体的碱化及β-冠状病毒的分泌。在一些实施方案中，β- 冠状病毒可以是鼠肝炎病毒(MHV，Mouse hepatitis virus)。在一些实施方案中，β-冠状病毒可以是新冠状病毒(SARS-CoV-2)。
本发明提供了式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗β-冠状病毒感染。在一些实施方案中，β-冠状病毒感染可以选自新冠肺炎、非典肺炎和中东呼吸综合征等。
实施例
实施例1
首先，克隆人源转录因子TFEB基因(Gene ID：7942)，构建用于原核表达的质粒。原核表达载体为经改造的pET-32a(69015，Sigma-Aldrich) 载体，将Trx标签替换为MBP标签，thrombin蛋白酶切割位点替换为 PreScission蛋白质切割位点，并且去除S标签。该表达质粒表达MBP和 His6标签融合的TFEB蛋白，并且在His6标签和TFEB蛋白之间插入一个蛋白酶PreScission的切割位点(氨基酸序列： Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro)。利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株(69450， Sigma-Aldrich)表达系统表达并纯化MBP-TFEB蛋白，并且用Cy3-马来酰亚胺荧光染料(41380，Lumiprobe)对其进行荧光标记。将荧光标记的 MBP-TFEB蛋白最终溶解于20mM HEPES(0511-1KG，Amresco)pH7.5， 500mM NaCl(0241-5KG，Amresco)缓冲液中。小分子化合物来自 L4000-Bioactivity Compound Library和L6000-NaturalCompound Library (TargetMol.US)，用缓冲液稀释至100μM，最终缓冲液浓度为20mMHEPES pH7.5，500mM NaCl，1％DMSO(D2650，Sigma)。在96孔高内涵成像板中混合MBP-TFEB蛋白和小分子化合物，终浓度分别为10μM 和40μM，随后加入终浓度为0.2mg/ml的蛋白酶PreScission(实验室自行纯化制备)诱导TFEB相分离，所述蛋白酶体系中的最终缓冲液浓度为20 mM HEPES pH7.5，500mM NaCl，1％DMSO。室温静置2小时。每块96 孔板中设置至少两组阴性对照组，即不含小分子化合物的TFEB相分离体系。
用高内涵成像仪(Opera Phenix，PerkinElmer)对96孔成像板进行拍照，分析数据，利用TFEB液滴的融合现象筛选获取改变TFEB液滴相分离性质的小分子化合物。
筛选小分子化合物库L4000-Bioactivity Compound Library和L6000-NaturalCompound Library(TargetMol)，共5770个小分子，获得 Ro-3306等23个可以使TFEB液滴明显变大的小分子化合物(图2)。
实施例2
在HeLa细胞系中检测Ro-3306的生物学效应。用10μM Ro-3306处理HeLa细胞24小时，并不会改变TFEB在细胞中的定位，仍然只有少量 TFEB定位于细胞核中(图3A-C)。用10μM Ro-3306处理HeLa细胞24小时，用LAMP1抗体免疫荧光标记溶酶体，发现Ro-3306处理明显促进溶酶体的数量增加(图4A和4D)。用DQ-BSA和Magic Red染料检测溶酶体的降解活性，发现Ro-3306处理明显促进溶酶体的降解能力(图4B-D)。溶酶体的酸化对于其降解活性至关重要。用LysoTracker染料标记酸化的溶酶体，发现Ro-3306处理明显促进酸化溶酶体的数量增加；用RNA干扰技术敲低TFEB蛋白表达，发现Ro-3306对溶酶体的促进作用明显降低；敲低TFEB同家族蛋白TFE3的表达量，发现Ro-3306对溶酶体的促进作用不受影响，表明Ro-3306对溶酶体的促进作用是特异性依赖于TFEB而非TFE3的(图5A-C和5D)。Ro-3306存在另外一个已知的抑制靶点CDK1，敲低CDK1的表达量，或者利用另外一个CDK1的抑制剂Dinaciclib处理 HeLa细胞，不会增加溶酶体的数量，而Ro-3306处理可以进一步增加CDK1敲低细胞中的溶酶体数量，表明CDK1不是Ro-3306促进溶酶体增加的作用靶点(图5D-F)。荧光半定量PCR实验显示，经Ro-3306处理的HeLa细胞系中，TFEB下游靶点基因的表达量明显增加，说明TFEB的转录活性被Ro-3306增强(图6)。用10μM Ro-3306处理HeLa细胞24小时后去除 Ro-3306，升高的溶酶体数量在8小时内降低至处理前的水平，表明 Ro-3306的生物学效应是可逆的(图7A-D)。
以上结果证明Ro-3306可以通过提高TFEB的转录活性，增加细胞中的溶酶体数量和活性。
实施例3
检测Ro-3306对鼠肝炎病毒(MHV)感染细胞系的影响。小鼠上皮细胞系17Cl-1可以被MHV病毒高效感染，Ro-3306处理促进17Cl-1细胞系中的酸性溶酶体数量大幅增加(图8A-C)。MHV病毒对Ro-3306处理的17Cl-1 细胞的感染效率远低于对照组细胞，表明Ro-3306处理可以抑制MHV病毒对17Cl-1细胞系的感染(图9A-C)。在Ro-3306实验组中，感染MHV病毒的细胞中，病毒的蛋白表达量更高，表明病毒的组装或分泌过程被抑制 (图9D)。利用感染斑块实验测定上述感染体系上清液中的病毒滴度，发现 Ro-3306处理体系中的病毒滴度远低于对照组，即Ro-3306处理降低了病毒的传播性(图10A和10B)。用LAMP1抗体免疫染色感染体系细胞中的总溶酶体，用LysoTracker染料标记酸性溶酶体结构，发现在对照组中大量的LAMP1标记的溶酶体已被去酸化，无法被LysoTracker染色，甚至在部分区域，被感染的细胞中完全检测不到酸性溶酶体；而在Ro-3306处理的感染体系中，LysoTracker标记溶酶体的比例明显升高，表明Ro-3306 抑制了MHV病毒对宿主细胞溶酶体的碱化过程(图11A-D)。电镜检测发现MHV病毒颗粒主要存在于溶酶体和内质网结构中，相比于对照组， Ro-3306处理的MHV病毒感染的细胞中存在大量未分泌的病毒颗粒(图 12A-E)，表明MHV病毒的分泌被抑制。
以上结果表明，Ro-3306可以通过抑制MHV病毒对宿主细胞溶酶体的碱化过程，抑制MHV病毒的分泌过程，进而抑制MHV病毒对宿主细胞的感染。
实施例4
检测Ro-3306对新冠病毒(SARS-CoV-2)感染细胞系的影响。非洲绿猴肾细胞系Vero-E6可以被SARS-CoV-2病毒高效感染，Ro-3306处理促进 Vero-E6细胞系中的酸性溶酶体数量大幅增加(图13A-C)。SARS-CoV-2病毒对Ro-3306处理的Vero-E6细胞的感染效率远低于对照组细胞，表明 Ro-3306处理可以抑制SARS-CoV-2病毒对Vero-E6细胞系的感染(图14A-C)。在Ro-3306实验组中，感染SARS-CoV-2病毒的细胞中，病毒的蛋白表达量更高，表明病毒的组装或分泌过程被抑制(图14D)。该结果表明Ro-3306对β-冠状病毒感染的抑制效果是广谱的。
Claims (7)
1.式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于使细胞中的TFEB蛋白液态凝聚体物理性质发生改变
2.式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期提高TFEB的转录活性。
3.式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于在细胞间期增加溶酶体数量和酸化程度。
4.式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于抑制β-冠状病毒对溶酶体的碱化及β-冠状病毒的分泌。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述β-冠状病毒是新冠状病毒、严重急性呼吸道综合征冠状病毒、中东呼吸综合征冠状病毒和鼠肝炎病毒。
6.式I的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗β-冠状病毒感染。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述β-冠状病毒感染选自新冠肺炎、非典肺炎和中东呼吸综合征。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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