CN115501222B - 杜鹃素促进体细胞核移植效率的应用及方法 - Google Patents

杜鹃素促进体细胞核移植效率的应用及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种杜鹃素促进体细胞核移植效率的应用及方法。本发明中，杜鹃素用于制备提高体细胞核移植胚胎发育率和出生率的药物的应用，与当前多种小分子化合物在促进的体细胞核移植胚胎发育效率方式相比，本发明涉及的原理与以往通过调控体细胞核移植过程中表观遗传学差异的方法不同，小分子化合物杜鹃素能够有效促进体细胞核移植胚胎的基因组稳定性，并显著提高胚胎发育率和出生率，因而存在与其他药物联用达到更好效果的可能性。同时本发明所建立的筛选流程也更为有效，为探究小分子化合物靶点提供了合理的筛选方式。

Description

杜鹃素促进体细胞核移植效率的应用及方法
技术领域
本发明涉及医药领域，尤其是涉及一种杜鹃素促进体细胞核移植效率的应用及方法。
背景技术
体细胞核移植技术(SCNT)广泛应用于自体干细胞制备、基因编辑小鼠制备等方面。虽然SCNT是目前为止鲜有的一种可以使体细胞获得全能性的方式，但由于重编程中存在多种表观遗传障碍，使得体细胞重编程不完全，造成核移植胚胎发育潜能极低，与体外受精(IVF)的方式相比，SCNT技术获得的小鼠出生率较低，这也极大程度地限制了该项技术的应用前景。因此，提高核移植胚胎发育率、出生率是体细胞核移植技术这一领域亟待解决的问题。
DNA损伤会影响细胞行使正常功能，其中最严重的是DNA双链断裂。在分裂期，细胞会选择同源重组(HR)完美修复这种损伤。去泛素化酶UCHL3可通过去泛素化同源重组修复通路中的重要因子—RAD51，促进RAD51与BRCA2互作从而促进同源重组的发生。
此外，杜鹃素(Farrerol，其分子式为C17H16O5)已被证明可提高同源重组效率，但其靶点尚未明晰。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种杜鹃素促进体细胞核移植效率的应用及方法，与当前多种小分子化合物在促进的体细胞核移植胚胎发育效率方式相比，本发明涉及的原理不同于以往的调控表观遗传学差异，小分子化合物杜鹃素能够更有效促进体细胞核移植胚胎的基因组稳定性，包括胚胎发育率和出生率，可能可以和其他方法联用产生更好的效果。同时本发明所建立的筛选流程也更为有效，为探究小分子化合物靶点提供了合理的筛选方式。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的目的之一是提供一种杜鹃素的应用，所述杜鹃素用于制备提高体细胞核移植胚胎发育率和出生率的药物的应用。
进一步地，所述胚胎通过将体细胞核移植于已去除核的卵子而形成的。
进一步地，所述杜鹃素用于制备提高囊胚期H3K27三甲基化信号增加的药物的应用。
进一步地，所述杜鹃素用于促进桑葚胚及来源于囊胚的胚胎干细胞(mESCs)mESCs的染色体整倍性比例的药物的应用。
进一步地，所述杜鹃素用于促进体细胞核移植来源的小鼠胚胎干细胞的同源重组效率的药物的应用。
进一步地，所述杜鹃素用于维持体细胞核移植胚胎基因组稳定性的药物的应用。
进一步地，所述杜鹃素用于制备提高结合UCHL3蛋白以提高体细胞核移植胚胎发育率和出生率的药物的应用。
上述更进一步地，所述杜鹃素非共价结合于UCHL3，目前已经证明杜鹃素能够激活UCHL3去泛素化RAD51以提高同源重组效率。
上述更进一步地，所述杜鹃素通过其酚羟基与UCHL3的K187、R215位点产生氢键相互作用。
本发明的目的之二是提供一种提高小鼠胚胎发育效率及出生率的方法，在含有杜鹃素的培养基中培育动物胚胎。
进一步地，所述培育胚胎方法为将杜鹃素处理后的2细胞期晚期的胚胎移植入假孕动物中，将该胚胎发育成个体。
上述更进一步地，所述杜鹃素的浓度为50～200nM。
上述更进一步地，在含有杜鹃素的培养基中培育动物胚胎的时期为体细胞核移植激活后6小时至胚胎的2细胞期早期(e2-cell)。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果如下：
(1)本发明涉及一种包括杜鹃素的用于胚胎发育的药物以及用其提高胚胎发育率及出生率的方法；
(2)通过筛选、体外结合实验、体内结合实验确定了杜鹃素的靶蛋白，并通过共结晶实验解析出杜鹃素与UCHL3结合的晶体结构，为今后的药物结构改造提供了基础；
(3)本发明提供的是基于促进同源重组修复方式一种天然小分子化合物杜鹃素，利用这一特性，将其应用于提高体细胞核移植胚胎发育率和出生率，进而为体细胞核移植技术的应用提供有效方法。
附图说明
图1为SCNT胚胎经过不同浓度杜鹃素及不同处理时间后各个阶段的发育情况，以及在每个胚胎发育阶段不同浓度杜鹃素处理对发育率的影响结果；
图2为IVF胚胎、SCNT-DMSO及SCNT-farrerol胚胎囊胚期时，免疫荧光染色结果，以及CDX2、H3K27me3阳性的细胞统计比例结果；
图3为IVF胚胎、SCNT-DMSO及SCNT-farrerol胚胎囊胚期时的染色体数目情况及染色体数目异常的细胞比例的统计图；
图4为IVF胚胎、SCNT-DMSO及SCNT-farrerol胚胎来源的mES细胞系的染色体数目情况及染色体数目异常的细胞比例的统计图；
图5为体外线性化HR报告载体检测HR效率的示意图及IVF胚胎、SCNT-DMSO及SCNT-farrerol胚胎来源的mES细胞系的HR情况；
图6为IVF胚胎、SCNT-DMSO及SCNT-farrerol胚胎2细胞期基因组稳定性的情况；
图7为IVF胚胎、SCNT-DMSO及SCNT-farrerol胚胎获得的小鼠胎盘平均质量，以及H&E染色的解剖结构图；
图8为IVF胚胎、SCNT-DMSO及SCNT-farrerol胚胎获得的小鼠出生时的平均重量；
图9为IVF胚胎、SCNT-DMSO及SCNT-farrerol胚胎获得的小鼠成年后分离尾部成纤维细胞的彗星电泳实验结果；
图10为有限蛋白水解质谱(LiP-SMap)结果的火山图；
图11为表面等离子共振(SPR)实验结果；
图12为细胞热迁移实验(CETSA)的代表性结果和统计结果；
图13为UCHL3与杜鹃素的共结晶体；
图14为UCHL3敲降条件下杜鹃素处理的不同阶段胚胎的发育情况及发育率的统计结果；
图15为不同浓度杜鹃素处理对小鼠出生率的影响，以及在最适浓度下Uchl3敲降组的小鼠出生率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
本发明中所涉及到的原理解释如下：
所述靶点UCHL3是指在真核生物中表达的基因，其作为去泛素化酶参与调控多种生化过程，其中包括DNA双链断裂修复，所述UCHL3基因的序列和位置等在本领域已知，其中，本发明中靶点UCHL3通过有限蛋白水解质谱方法初步筛选得到；
所述胚胎发育是指合子(zygote)通过细胞分裂、分化经历胚胎多个发育阶段(2细胞期、4细胞期、桑葚胚期、囊胚期)的过程，其中，2细胞期是指合子经过一次卵裂形成的存在两个相似细胞的状态，4细胞期是指2细胞期胚胎经过一次卵裂形成的存在四个相似细胞的状态，桑葚胚期是指合子经过多次卵裂后形成的致密的细胞团的状态，囊胚期是指桑葚胚经过分裂分化产生分化成胎盘的滋养外胚层(trophectoderm)和分化为胎儿的内细胞团(inner cell mass)的状态；
所述提高胚胎发育效率是指体细胞核移植产生的胚胎发育到2细胞期、4细胞期、桑葚胚期以及最终发育成囊胚的比例提高，体细胞核移植获得的胚胎由于组蛋白修饰的印记及DNA损伤修复异常等原因会出现不同程度的发育阻滞；
所述提高出生率是指体细胞核移植产生的胚胎发育到2细胞期后期转入假孕母鼠最后获得的子代小鼠比例提高，体细胞核移植获得的胚胎由于发育阻滞、胎儿发育异常等原因出现子代小鼠出生率的现象(1％以内)。
具体地，以下实施例所用细胞系如下：HEK293FT为人胚胎肾细胞，mESC为小鼠胚胎干细胞。
实施例1：杜鹃素促进体细胞核移植来源的胚胎发育率
1-1.体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)
为8周龄至10周龄雌性C57/BL小鼠施用5IU PMSG和5IU hCG激素，在施用激素后14小时，收集小鼠排卵，并使用透明质酸酶分离卵丘细胞和卵子，收集卵丘细胞冷藏备用做体细胞核供体，并将卵子保存至KSOM培养液中培养于37℃，将卵子去核，并将卵丘细胞注入去核卵子中，1小时后在培养基中加入Sr2+激活，激活后6小时，将胚胎转移至包含杜鹃素的培养基中培养至2细胞期早期，然后将胚胎置于KSOM培养基中继续培养；
1-2.确认体细胞核移植胚胎发育率的改善
根据实施例1-1的方法，将杜鹃素0nM，50nM，100nM，200nM处理体细胞核移植的卵子，以选择合适的发育浓度。
结果如图1所示，可以看出，杜鹃素浓度为50nM时发育率最高，杜鹃素可减少阻滞于2细胞期、4细胞期、桑葚胚期以及囊胚期的胚胎。
实施例2：杜鹃素使囊胚期H3K27三甲基化信号增加
通过免疫荧光染色比较和分析在体外受精(in vitro fertilization,IVF)卵子、所述实施例1中的经过杜鹃素处理与否的体细胞核移植卵子中的H3K27me3的水平。
具体而言，取囊胚期胚胎用添加有0.1％牛血清蛋白(BSA)的PBS溶液洗涤，然后在4％多聚甲醛中固定1小时，在0.1％Triton-X的BSA-PBS溶液中渗透细胞，然后使用H3K27me3的抗体及对应的荧光标记二抗孵育细胞，并用4,6-儿脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对细胞核进行染色，在荧光显微镜下观察细胞在不同通道下的荧光情况。
结果如图2所示，可以看出，浓度为50nM的杜鹃素处理体细胞核移植囊胚中H3K27me3水平高于未经杜鹃素处理的体细胞核移植囊胚，因此杜鹃素使囊胚期H3K27三甲基化信号增加。
实施例3：杜鹃素促进桑葚胚及来源于囊胚的mESCs的染色体整倍性比例
3-1.检测桑葚胚阶段染色体数目情况
为确认SCNT来源的桑葚胚是否出现染色质异常情况，从实施例1中制备的体细胞核移植胚胎中选择发育到桑葚胚期的胚胎，使用秋水仙素将细胞阻滞于有丝分裂中期，然后破碎细胞获得染色体，用龙胆紫染色，然后计数每个细胞的染色体数目。
结果如图3所示，可以看出，经杜鹃素处理后的体细胞核移植桑葚胚中染色体整倍性比例高于未经杜鹃素处理的体细胞核移植桑葚胚，因此杜鹃素促进桑葚胚的染色体整倍性比例。
3-2.检测mESCs染色体数目情况
为确认胚胎干细胞(mESCs)中是否出现染色质异常情况，从实施例1中制备的体细胞核移植胚胎发育到囊胚期后分离mESCs并建系，取适量细胞使用秋水仙素将细胞阻滞于有丝分裂中期，然后破碎细胞获得染色体，用龙胆紫染色，然后计数每个细胞的染色体数目。
结果如图4所示，可以看出，经杜鹃素处理来源于囊胚的mESCs中染色体整倍性比例高于未经杜鹃素处理来源于囊胚的mESCs，因此杜鹃素促进来源于囊胚的mESCs的染色体整倍性比例。
实施例4：杜鹃素促进SCNT来源的小鼠胚胎干细胞的HR效率
4-1.同源重组(HR)报告载体的体外线性化处理
已报道，酶切线性化的报告载体可有效检测细胞内双链断裂修复情况。因此，使用I-SceI酶切HR报告载体，纯化获得HR报告载体断裂片段；
4-2.检测IVF及SCNT来源的小鼠胚胎干细胞的HR效率
将实施例4-1获得的线性化质粒和标定转染效率的pCAG-DsRed质粒通过电转方式转入mES细胞，培养48小时后进行FACS检测红绿光细胞比例。
结果如图5所示，可以看出，经杜鹃素处理的SCNT来源中小鼠胚胎干细胞的HR效率显著高于未经杜鹃素处理的，因此杜鹃素促进SCNT来源的小鼠胚胎干细胞的HR效率。
实施例5：杜鹃素维持SCNT胚胎基因组稳定性。
为确定体外受精(in vitro fertilization,IVF)卵子、所述实施例1中的经过杜鹃素处理与否的体细胞核移植卵子在二细胞期时基因组稳定性情况，执行了彗星电泳实验。具体而言，为了确认基因组稳定性，将每个样品消化分散成单细胞悬浮于37℃的低熔点琼脂糖中，然后将其涂布于载玻片上。将载玻片置于碱性裂解液中裂解50分钟，然后在碱性缓冲液中进行电泳30分钟。在37℃烘箱中放置，直至琼脂糖干燥。用SYBR green染色，在荧光显微镜下观察每个细胞的拖尾情况。
结果如图6所示，可以看出，经杜鹃素处理的体细胞核移植卵子中SCNT胚胎基因组稳定性显著高于未经杜鹃素处理的体细胞核移植卵子，因此杜鹃素维持SCNT胚胎基因组稳定性。
实施例6：杜鹃素处理对获得的子代无明显影响
6-1.通过克隆小鼠的体重和胎盘体重来确认是否影响发育
已报道，体细胞核移植获得的克隆小鼠通常会出现胎盘体积过大，而且结构紊乱的情况，我们想通过分析胎盘发育状况判定杜鹃素是否影响小鼠出生前的发育。同时已报道，克隆小鼠的质量可能比正常小鼠大，所以出生时体重也可用于判断小鼠出生前的发育是否正常。
6-2.通过分离小鼠尾部成纤维细胞来确认是否影响出生后发育
为深入探索杜鹃素处理对SCNT获得的小鼠子代基因组稳定性的影响，将不同方式处理的子代小鼠的尾巴成纤维细胞进行体外分离，利用彗星电泳实验检测其基因组稳定性；
具体而言，断颈杀死小鼠，将小鼠泡入75％乙醇中进行消毒处理，剪取1cm的尾巴，将其置于含20×三抗的1mL离心管中浸泡2min，将组织在10cm培养皿中用剪刀剪碎，并转移至含转子的50mL烧杯中，置于37度磁力搅拌器混匀90min，将匀浆液转移至15mL离心管，1500rpm离心5min，弃去上清，加入6mL新鲜培养基(有无血清均可)重悬，离心5min，最后将沉淀转移至10cm培养皿中至于CO2培养箱中进行培养。取部分细胞进行实施例5中的彗星电泳实验。
结果如图7、图8和图9所示，可以看出，经杜鹃素处理的胎盘体重显著小于未经杜鹃素处理的胎盘体重，即杜鹃素可降低出生小鼠胎盘大小，促进出生小鼠胎盘结构更接近于体外受精来源的小鼠胎盘结构；经杜鹃素处理的克隆小鼠的体重接近于体外受精来源的小鼠体重；经杜鹃素处理的小鼠尾部成纤维细胞的尾距值稍低于未经杜鹃素处理的尾距值，因此杜鹃素处理对获得的子代无明显影响。
实施例7：杜鹃素靶点蛋白的筛选方法。
7-1.有限蛋白水解质谱(LiP-SMap)
已报道LiP-SMap技术能够有效筛选小分子化合物的靶点，我们利用此技术筛选杜鹃素的可能靶点；具体而言，在非变形条件下裂解细胞并去除不溶性杂质，将细胞提取液中加入杜鹃素，用蛋白酶K对样品进行有限的蛋白分解，生成结构特异的蛋白片段，然后用序列特异性胰蛋白酶消化片段，生成可用于自下而上蛋白质组学分析的肽混合物，肽通过液相色谱-串联质谱分析，并使用无标签定量质谱方法比较添加杜鹃素与否的蛋白质组，分析其中差异的肽段以确定蛋白是否可能结合小分子。
7-2.表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)实验
实时表面等离子体共振分析在Biacore T200仪器(GE Healthcare)上进行，温度为25℃，在PBS-P+缓冲液(0.02M磷酸盐缓冲液，2.7mM氯化钾，13.7mM氯化钠，0.05％表面活性剂P20和5％DMSO)中，UCHL3在10mM乙酸盐溶液(pH＝4)中稀释为10μg/mL，使用胺偶联方式连接在CM5传感器芯片(GE Healthcare)上以10000个共振单位进行共价固定化。杜鹃素的亲和实验以30μL/min的流速进行，并进行两倍的连续稀释(15.625-2000nM)。所有曲线在使用二价拟合模型进行双参考减法后进行评估(T200评估软件3.0；GE Healthcare)。
7-3.细胞热迁移实验(cellular thermal shift assay，CETSA)实验
为验证杜鹃素能进入细胞并结合UCHL3，我们进行了CETSA实验。具体而言，我们首先用20μM杜鹃素处理HEK293FT细胞24小时，然后收获细胞并计数，取一定量的细胞在热循环仪中在特定温度区间加热3分钟，然后通过液氮反复冻融裂解细胞。并在4℃下以20 000g离心20分钟。然后收集上清液，用指定的抗体进一步进行Western blotting分析，检测悬液中UCHL3蛋白的含量，以确定其热稳定性。
7-4.共结晶实验
我们对UCHL3蛋白尝试与杜鹃素共结晶，筛选各种结晶条件，尝试并改进各种沉淀剂、缓冲剂和添加剂，以获得高质量晶体用于X射线衍射实验。利用同步辐射光源收集X射线晶体衍射数据，利用HyPix-6000，Rigaku及Phenix等软件分析，解析出杜鹃素在UCHL3上的结合位置。具体而言，UCHL3蛋白用20mM Tris-HCl pH 7.5,100mM NaCl，按1:1.5摩尔比与杜鹃素混合纯化。4℃孵育1小时后，采用滴位法将化合物与UCHL3的配合物结晶。1周后，在1.4M柠檬酸三碱二水合钠溶液(0.1M HEPES钠pH 7.5)下得到最佳结晶。衍射数据是由清华大学的x射线晶体学设备(XtaLAB Synergy Custom FRX和混合光子计数探测器HyPix-6000，日本Rigaku)收集的。最佳的一次结晶是在100K条件下衍射到的 数据处理采用Crysalis Pro程序，空间组为P212121。通过分子置换，利用phoenix软件对结构1UCH进行了改进。初始阶段通过刚体细化来改进，然后使用phoenix套件进行几轮模拟退火和各向异性b因子细化。结构是在COOT的手工模型构建和phoenix的约束TLS细化交替循环中完成的。
参考图10至图13，通过LiP-SMap、SPR和CETSA结果得出杜鹃素靶点蛋白为UCHL3，对UCHL3蛋白与杜鹃素共结晶实验，得出杜鹃素非共价结合于UCHL3，且杜鹃素通过其酚羟基与UCHL3的K187、R215位点产生氢键相互作用。
实施例8：杜鹃素通过靶向UCHL3促进体细胞核移植效率。
8-1.敲降Uchl3后杜鹃素处理对SCNT胚胎发育的影响
在体细胞核移植前注射Uchl3的siRNA和sgRNA以及Cas9的mRNA以敲降Uchl3，然后通过实施例1-1描述的方法获得胚胎，观察各个胚胎发育阶段不同处理组获得的比例。
结果如图14所示，可以看出，杜鹃素处理可有效促进体细胞移植来源的胚胎的发育进程，但杜鹃素处理的敲降Uchl3组未能促进SCNT来源的胚胎发育进程，提示杜鹃素促进体细胞核移植来源的胚胎发育率是由UCHL3介导的。
8-2.敲降Uchl3后杜鹃素处理对SCNT子代出生率的影响
我们将实施例8-1中获得的胚胎发育至2细胞期后期，然后转移至假孕母鼠体内，统计最终每组获得的子代小鼠比例。
结果如图15所示，可以看出，浓度为100nM的杜鹃素处理后的子代小鼠比例最高，在50nM浓度条件下Uchl3敲降组的小鼠出生率显著低于未敲除组别。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素用于制备提高小鼠体细胞核移植胚胎发育率和出生率的药物的应用；
所述体细胞为卵丘细胞，
所述胚胎为2细胞期、4细胞期、桑葚胚期或囊胚期的胚胎。
2.根据权利要求1所述的一种杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素用于制备提高囊胚期H3K27三甲基化信号增加的药物。
3.根据权利要求1所述的一种杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素用于促进桑葚胚及来源于囊胚的胚胎干细胞的染色体整倍性比例的药物的应用。
4.根据权利要求1所述的一种杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素用于促进小鼠胚胎干细胞的同源重组效率。
5.根据权利要求1所述的一种杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素用于维持体细胞核移植胚胎基因组稳定性的药物的应用。
6.根据权利要求1所述的一种杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素用于制备提高结合UCHL3蛋白以提高体细胞核移植胚胎发育率和出生率的药物。
7.根据权利要求6所述的一种杜鹃素的应用，其特征在于，所述杜鹃素通过其酚羟基与UCHL3的K187、R215位点产生氢键相互作用。
8.一种提高动物胚胎发育效率及出生率的方法，其特征在于，在含有杜鹃素的培养基中培育小鼠胚胎，在含有杜鹃素的培养基中培育小鼠胚胎的时期为卵丘细胞核移植激活后6小时至胚胎的2细胞期早期，
所述杜鹃素的浓度为50~200 nM。
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