CN115494241A - 脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用 - Google Patents

脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用，涉及生物技术领域。本发明提供的脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用，其中蛋白标志物包括SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5中的至少一种。经发明人研究发现，以上19种蛋白具有作为轻度认知功能损害诊断标志物的潜力，将以上19种蛋白共同作为标志物，能够很好地鉴别出多种类型的神经退行性疾病。

Description

脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用。
背景技术
随着社会人口老龄化的不断加剧，阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)的高患病率已成为一个严重的公共健康问题。AD目前早期诊断困难，缺乏有效的治疗药物。学界认为目前众多AD药物开发失败的一个重要原因是没有在早期阶段进行识别和干预，因此早期诊断AD极其重要。轻度认知功能损害(Mild cognitive impairment，MCI)是AD病程进展中的早期阶段，如能在这一阶段就识别出并进行干预将有助于阻止或延缓MCI进一步发展为AD。现有的AD脑脊液诊断标记物主要依赖β-淀粉样蛋白(Aβ)，磷酸化tau蛋白(p-tau)，神经丝轻链蛋白(NFL)等指标，但是上述分子仅代表了AD复杂病理生理变化的一小部分。在临床实践过程中，上述指标在其他类型的痴呆如额颞叶痴呆(Frontotemporal dementia，FTD)，亨廷顿舞蹈病(Huntington's disease，HD)和肌萎缩侧索硬化(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)中也可以共同病理的方式出现和AD一样的变化，影响临床医生对疾病诊断的判断。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用，以解决上述问题中的至少一种。
本发明的第二目的在于提供一种用于诊断轻度认知功能损害的产品。
本发明的第三目的在于提供一种脑脊液中蛋白标志物在制备诊断神经退行性疾病的产品中的应用。
第一方面，本发明提供了一种脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用；
所述蛋白标志物包括SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5中的至少一种。
作为进一步技术方案，所述蛋白标志物为SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5。
作为进一步技术方案，与非轻度认知功能损害患者相比，所述蛋白标志物在轻度认知功能损害患者的样本中差异表达。
作为进一步技术方案，与非轻度认知功能损害患者相比，所述SCRG1在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
B3GALNT1在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
IGHM在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
SHBG在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
MGP在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
GM2A在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
COL18A1在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
MAN2A2在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PLTP在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
MGAT2在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
ART3在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
C16orf89在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
GALNT7在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
FRZB在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
CXCL16在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
CHRD在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
MAN1C1在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PCSK1N在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PCDHGC5在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高。
作为进一步技术方案，所述非轻度认知功能损害患者包括正常老年人、亨廷顿舞蹈病患者、额颞叶痴呆患者和肌萎缩侧索硬化患者中的至少一种。
作为进一步技术方案，所述样本包括脑脊液。
第二方面，本发明提供了一种用于诊断轻度认知功能损害的产品，所述产品用于所述蛋白标志物表达水平的检测。
作为进一步技术方案，所述产品包括识别所述蛋白标志物的标记物。
优选地，所述标记物包括结合所述蛋白标志物的抗体。
作为进一步技术方案，所述产品包括试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供了一种脑脊液中蛋白标志物在制备诊断神经退行性疾病的产品中的应用；
所述蛋白标志物为SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5；
所述神经退行性疾病包括亨廷顿舞蹈病、额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
经发明人研究发现，相较于非轻度认知功能损害患者(正常老年人、亨廷顿舞蹈病患者、额颞叶痴呆患者和肌萎缩侧索硬化患者)，SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5在轻度认知功能损害患者的脑脊液中存在差异表达，具有作为轻度认知功能损害诊断标志物的潜力。经发明人进一步研究发现，以上19种蛋白组成的标志物可高效地区分轻度认知功能损害和正常老年对照(AUC＝0.984)，除此之外，还能很好地鉴别出其他类型的神经退行性疾病如亨廷顿舞蹈病、额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1提供的蛋白质组学分析流程；
图2为实施例2提供的靶向蛋白质组学分析流程；
图3为实施例3提供的蛋白标志物及测试结果；
图4为实施例4提供的UMAP图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供了一种脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用；
所述蛋白标志物包括SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5中的至少一种。
经发明人研究发现，与非轻度认知功能损害患者(正常老年人、亨廷顿舞蹈病患者、额颞叶痴呆患者和肌萎缩侧索硬化患者)相比，所述蛋白标志物在轻度认知功能损害患者的脑脊液样本中差异表达。
具体地，与非轻度认知功能损害患者相比，所述SCRG1在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
B3GALNT1在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
IGHM在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
SHBG在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
MGP在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
GM2A在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
COL18A1在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
MAN2A2在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PLTP在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
MGAT2在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
ART3在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
C16orf89在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
GALNT7在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
FRZB在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
CXCL16在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
CHRD在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
MAN1C1在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PCSK1N在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PCDHGC5在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高。
因此，本发明提供的19种蛋白标志物具有作为轻度认知功能损害诊断标志物的潜力。
进一步地，所述蛋白标志物为SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5。
经发明人进一步研究发现，以上19种蛋白组成的标志物可高效地区分轻度认知功能损害和正常老年对照(AUC＝0.984)。
第二方面，本发明提供了一种用于诊断轻度认知功能损害的产品，所述产品用于所述蛋白标志物表达水平的检测。
本发明提供的产品通过检测样本中蛋白标志物(SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5)的表达水平实现对轻度认知功能损害的诊断。
在一些优选的实施方式中，所述产品包括识别所述蛋白标志物的标记物。
通过标志物实现对蛋白标志物的识别以及定量。
在一些优选的实施方式中，所述标记物包括结合所述蛋白标志物的抗体。
在一些优选的实施方式中，所述产品包括试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供了一种脑脊液中蛋白标志物在制备诊断神经退行性疾病的产品中的应用；
所述蛋白标志物为SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5；
所述神经退行性疾病包括亨廷顿舞蹈病、额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化。
经发明人研究发现，本发明提供的19种蛋白组成的标志物不仅可高效地区分轻度认知功能损害和正常老年对照(AUC＝0.984)，还能很好地鉴别出其他类型的神经退行性疾病如亨廷顿舞蹈病、额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1AD患者和对照组脑脊液样本的TMT全蛋白质组学分析
对105例脑脊液样本(重度阿尔茨海默症13例、中度阿尔茨海默症12例、轻度阿尔茨海默症6例、轻度认知功能损害7例、亨廷顿舞蹈病20例、肌萎缩侧索硬化20例、正常老年对照20例、7个生物学重复(每种类型随机挑选一个样本进行重复检测))进行蛋白质组学分析(如图1所示)。
具体蛋白组学分析方法如下：
1)100μL脑脊液用100μL去除高丰度蛋白的树脂(Thermo Scientific,A36372)，按照制造商的说明书去除高丰度蛋白。后在3kDa的蛋白浓缩管中加入6M尿素/2M硫脲变性，浓缩至50μL。再加入10mM三(2-羧基乙基)膦(TCEP)和40mM碘乙酰胺(IAA)还原并烷基化蛋白裂解物，在32℃的黑暗中孵育40分钟。用100mM碳酸氢铵进一步稀释后，用2.5μg胞内蛋白酶在32℃下消化4小时，继而再加入2.5μg胰蛋白酶在32℃下消化12小时。加入终浓度为1％的三氟乙酸(TFA)停止反应。这些经胰酶消化后的肽段使用除盐柱进行清洗除盐后，使用TMTpro 16plex按照供应商说明书对多肽进行标记。
2)纳升液相-高分辨率质谱分析
重新溶解的脑脊液多肽通过LC-MS/MS进行分析。我们的实验进行了批次设计，将不同疾病的样本随机分配至不同的批次实验，以尽量减少批次效应对我们的蛋白质组学数据的影响。我们将105个样品随机分为7批次进行TMTpro 16plex标记，每个批次样品数量相同(如图1所示)。对于每个批次的TMT样品，采用DIONEX UltiMate 3000RSLCnano系统(Thermo Fisher Scientific,San Jose,USA)和XBridge Peptide BEH C18色谱柱(
Figure BDA0003871951770000081
5μm×4.6mm×250mm)(Waters,Milford,MA,USA)进行分离。样品采用5％至35％乙腈(ACN)(即乙腈的占比从5％逐渐增大至35％)在10mM氨水(pH＝10.0)中梯度分离，流速为1mL/min。TMT标记的肽经该系统被分离为60个馏分，这些馏分再进一步合并为30个馏分。这30个馏分经旋干后，用2％ACN/0.1％甲酸(FA)重新溶解，重新溶解的多肽通过LC-MS/MS进行分析。使用nanoflow DIONEX UltiMate 3000RSLCnano系统(Thermo FisherScientific,San Jose,USA)，并联合QE-HF高分辨率质谱(Thermo Fisher Scientific,SanJose,USA)，采用数据依赖采集(DDA)模式，对每个馏分进行数据采集。分析时，样本首先以6μL/min的速度装填到预柱(3μm,
Figure BDA0003871951770000082
20mm*75μm i.d.)上，然后以300nL/min的流速，将装填在预柱上的样品，冲洗至分析柱(1.9μm,120a,150mm*75μm)中进行进一步的分离，分离时间为60分钟，LC梯度为从5％逐渐增大到28％的缓冲液B(缓冲液B为98％ACN(含0.1％FA)，缓冲液A为2％ACN,98％H2O(含0.1％FA))梯度洗脱。所有试剂均为MS级。质谱参数方面MS1的m/z范围为350～1800，分辨率为60,000(200m/z)，AGC为3e6，最大离子注入时间(max IT)为50ms。选取前15个前体离子进行MS/MS的二级碎裂，其分辨率为45000(200m/z)，AGC为2e5，max IT为120ms。所选前体的隔离窗口为0.7m/z。使用Proteome Discoverer(版本2.4.1.15,Thermo Fisher Scientific)和蛋白质数据库(从UniProtKB下载)对质谱数据进行分析。酶被设置为胰蛋白酶，有两个缺失的切割耐受性。静态修饰为半胱氨酸氨基甲基化(+57.021464)、赖氨酸残基及肽段N端TMTpro(+304.207145)，可变修饰为蛋氨酸氧化(+15.994915)和肽段N端乙酰化(+42.010565)。前体离子质量偏差设置为10ppm，碎裂离子质量偏差设置为0.02Da。
全蛋白组学分析结果如下：
脑脊液样本中检测出了3238种蛋白。然后对脑脊液中的蛋白进行差异分析，获得轻度认知功能损害、亨廷顿舞蹈病和肌萎缩侧索硬化较正常老年对照的差异蛋白，经过对差异蛋白的比较分析，最终在脑脊液中获得了171种轻度认知功能损害所独有的差异蛋白，表明这171个差异蛋白为潜在的轻度认知功能损害诊断标记物。
实施例2在独立验证队列中对差异蛋白进行验证
对多中心的221例脑脊液样本(阿尔茨海默症73例、正常老年对照32例、轻度认知功能损害73例、亨廷顿舞蹈病15例、肌萎缩侧索硬化25例、额颞叶痴呆3例)进行靶向蛋白质组学测试(如图2所示)。
具体蛋白组学分析方法如下：
蛋白酶解方法与全蛋白质组学制备方法与实施例1一致，除了不进行去除高丰度蛋白，TMT标记和分馏。采用nanoflow DIONEX UltiMate 3000RSLCnano系统(ThermoFisher Scientific)与QE-HF混合四极杆轨道离子阱(Thermo Fisher Scientific)进行平行反应监测(PRM)实验。每个PRM实验注射0.5μg多肽样本。以300nL/min(预柱3μm,
Figure BDA0003871951770000091
内径20mm*75μm；分析柱1.9μm,
Figure BDA0003871951770000101
内径150mm*75μm)的流速分离脑脊液肽段，有效梯度为60min(缓冲液B从10％逐渐增加至30％)，缓冲液A和B与全蛋白质组学实验一致。CSF PRM实验共纳入120条多肽，包括15条内部标准多肽(CiRT)。一级MS和PRM的分辨率分别为60000(m/z 200)和30000(m/z200)。设置AGC目标为2e5，PRM设置最大IT为80ms。使用Skyline对PRM数据进行分析。保留时间由上述CiRT肽预测，分离时间窗口设置为5min。一级MS和MS/MS质量分析仪设置为“Orbitrap”，分辨率分别为60000和30000。蛋白定量数据用ProteomeExpert进行肽定量数据转换。
靶向蛋白组学分析结果如下：
脑脊液样本中验证了实施例1中的57个潜在的能够用于MCI诊断的差异蛋白。
实施例3对MCI和正常老年对照样本进行分类
我们在蛋白质组水平上使用机器学习的方法评估以上获得的蛋白对MCI和正常老年对照样本的区别，寻找分类的蛋白标志物。
数据挖掘过程如下：
机器学习使用R包randomForest(版本4.6.14)执行，并进行如下简要描述的修改。对cutoff值等关键随机森林参数进行了优化，包括平均降低精度、交叉验证迭代次数和树数。基于平均降低精度截断，选择输入的蛋白质特征。进行5次交叉验证。建立脑脊液模型1000株。脑脊液模型蛋白特征的最小降低平均准确度为3。脑脊液模型的mtry值设为4的平方根。
我们探索了基于失调蛋白的分子标记从正常老年样本中识别MCI的可能性。我们基于21个MCI和52个对照的CSF蛋白质组数据构建了一个随机森林机器学习模型。为了确定充分区分MCI和对照样本所需的最小蛋白质数量，通过机器学习探索了失调蛋白的优先级。一个由19个最重要的蛋白组成的小组被选为脑脊液早期诊断生物标志物(图3中的A所示)，包括：SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N、PCDHGC5。然后，我们在9个MCI和21个对照参与者中测试了该模型。当将来自19蛋白生物标志物面板的分类器模型应用于这个新队列时，它准确地区分了MCI和对照样本。该模型在测试集上的曲线下面积(AUC)为0.984(图3中的B所示)。
实施例4鉴别MCI和其他类型的神经退行性疾病包括FTD，HD和ALS。
利用上述包含19个蛋白的panel，应用主成分分析法(Principal componentanalysis，PCA)可以准确地将MCI从FTD，HD和ALS中区分出来(如图4)。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.脑脊液中蛋白标志物在制备诊断轻度认知功能损害的产品中的应用；
所述蛋白标志物包括SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白标志物为SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，与非轻度认知功能损害患者相比，所述蛋白标志物在轻度认知功能损害患者的样本中差异表达。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，与非轻度认知功能损害患者相比，所述SCRG1在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
B3GALNT1在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
IGHM在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
SHBG在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
MGP在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
GM2A在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
COL18A1在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
MAN2A2在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PLTP在轻度认知功能损害患者的样本中表达降低；
MGAT2在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
ART3在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
C16orf89在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
GALNT7在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
FRZB在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
CXCL16在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
CHRD在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
MAN1C1在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PCSK1N在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高；
PCDHGC5在轻度认知功能损害患者的样本中表达升高。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述非轻度认知功能损害患者包括正常老年人、亨廷顿舞蹈病患者、额颞叶痴呆患者和肌萎缩侧索硬化患者中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样本包括脑脊液。
7.一种用于诊断轻度认知功能损害的产品，其特征在于，所述产品用于权利要求1中所述蛋白标志物表达水平的检测。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括识别权利要求1中所述蛋白标志物的标记物；
优选地，所述标记物包括结合所述蛋白标志物的抗体。
9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
10.脑脊液中蛋白标志物在制备诊断神经退行性疾病的产品中的应用；
所述蛋白标志物为SCRG1、B3GALNT1、IGHM、SHBG、MGP、GM2A、COL18A1、MAN2A2、PLTP、MGAT2、ART3、C16orf89、GALNT7、FRZB、CXCL16、CHRD、MAN1C1、PCSK1N和PCDHGC5；
所述神经退行性疾病包括亨廷顿舞蹈病、额颞叶痴呆和肌萎缩侧索硬化。
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