CN115491375A - 一种用于抑制alk表达的rna、基因线路及递送系统 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种用于抑制ALK表达的RNA、基因线路及递送系统。其中，所述用于抑制ALK表达的RNA包括以下任意一种或几种的组合：如SEQ ID NO：1所示的siRNA、如SEQ ID NO：2所示的siRNA、如SEQ ID NO：3所示的siRNA、如SEQ ID NO：4所示的siRNA、与上述siRNA序列同源性大于80％的RNA。这些RNA特定的序列结构决定了其可以精准的对ALK基因产生强效抑制作用，通过抑制ALK基因的表达，进而达到抑制肺癌肿瘤发生与发展的目的。

Description

一种用于抑制ALK表达的RNA、基因线路及递送系统
技术领域
本申请涉及生物医学技术领域，特别涉及一种用于抑制ALK表达的RNA、基因线路及递送系统。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率最高、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌约占肺癌的80％-85％，是全球男性和女性癌症相关死亡的主要原因，ALK是一种跨膜酪氨酸激酶受体，它具有胞外结构域、跨膜段和胞质受体激酶段。ALK基因重排是非小细胞肺癌发展的驱动突变，ALK突变在非小细胞肺癌患者中约占5％-6％，是一个非常有应用前景的肺癌治疗靶点。
目前临床针对ALK突变型肺癌的治疗药物都是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，其作用方式以蛋白为靶点，在临床治疗中常常伴随着继发性耐药问题，无法彻底治愈ALK突变型肺癌。
根据肺癌的基因型选择分子靶向药物的“个性化治疗”已成为临床上常用的治疗手段。而如何提高针对突变基因的疗效、减少毒副作用也已经是肺癌治疗研究的主要方向。Crizotinib是第一个进入临床实验的ALK抑制剂，报告反应率超过60％，疾病控制率高达90％，ALK重排NSCLC的中位无进展生存期(PFS)超过9个月，但几乎所有接受Crizotinib治疗的患者都出现了肿瘤进展和耐药性，因此，需要有效的ALK抑制剂来克服对Crizotinib的耐药性，这成为目前亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本申请实施例提供了一种用于抑制ALK表达的RNA、基因线路及递送系统，以解决现有技术中存在的技术缺陷。
本申请提供了一种用于抑制ALK表达的RNA，所述用于抑制ALK表达的RNA包括以下任意一种或几种的组合：如SEQ ID NO：1所示的siRNA、如SEQ ID NO：2所示的siRNA、如SEQID NO：3所示的siRNA、如SEQ ID NO：4所示的siRNA、与上述siRNA序列同源性大于80％的RNA。
进一步地，所述用于抑制ALK表达的RNA还包括具有抑制ALK基因表达作用的编码siRNA；
所述编码siRNA的正义链核苷酸序列包括：如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ IDNO：6所示的序列、如SEQ ID NO：7所示的序列、如SEQ ID NO：8所示的序列、与上述序列同源性大于80％的RNA；
所述编码siRNA的反义链核苷酸序列包括：如SEQ ID NO：9所示的序列、如SEQ IDNO：10所示的序列、如SEQ ID NO：11所示的序列、如SEQ ID NO：12所示的序列、与上述序列同源性大于80％的RNA。
本申请还提供一种基因线路，所述基因线路包括至少一个如上所述的用于抑制ALK基因表达的RNA和/或至少一个具有靶向功能的靶向标签，所述基因线路为能够在宿主的器官组织中富集并自组装形成复合结构的序列，该基因线路通过所述RNA抑制ALK基因的表达实现对疾病的治疗。
进一步地，所述具有靶向功能的靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白，优选为iRGD-Lamp2b靶向肽；
更为优选地，能够表达iRGD-Lamp2b靶向肽的正义链核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示的序列，或与SEQ ID NO：13所示的序列同源性大于80％的序列。
进一步地，所述基因线路还包括启动子，所述基因线路的种类包括：启动子-RNA、启动子-靶向标签、启动子-靶向标签-RNA；
位于同一个载体上的基因线路包括至少一个能够抑制ALK基因表达的RNA和至少一个具有靶向功能的靶向标签，该RNA和靶向标签位于相同的基因线路中或位于不同的基因线路中。
进一步地，所述基因线路还包括能够侧翼序列、loop序列和补偿序列，其中，侧翼序列、loop序列和补偿序列是能够使基因线路折叠成正确结构并表达的序列，补偿序列在目标受体中不能被表达。
所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列。
所述基因线路的种类包括：5’-启动子-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签、5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
进一步地，所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
所述补偿序列为所述RNA序列的删除其中任意1-5位碱基的反向互补序列，以使补偿序列不表达。
优选地，所述补偿序列为所述RNA序列的反向互补序列，并删除其中任意1-3位碱基。
更为优选地，所述补偿序列为所述RNA序列的反向互补序列，并删除其中任意1-3位连续排列的碱基。
最为优选地，所述补偿序列为所述RNA序列的反向互补序列，并删除其中的第9位和/或第10位碱基。
进一步地，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
本申请还提供一种RNA递送系统，该系统包括如上所述的基因线路以及能够将所述基因线路递送至宿主的器官组织中富集的递送载体。
可选地，所述递送载体携带一个、两个或多个所述基因线路，其所携带的所有所述基因线路中，至少包括一个用于抑制ALK表达的RNA和一个靶向标签；
含有所述基因线路的递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在宿主的器官组织中自组装形成复合结构，所述靶向标签位于所述复合结构的表面，所述复合结构通过所述靶向标签寻找并结合目标组织，将所述用于抑制ALK表达的RNA送入目标组织。
进一步地，在所述递送载体携带两个或多个所述基因线路的情况下，相邻的所述基因线路之间通过序列1-3组成的序列(序列1-序列2-序列3)相连；
其中，序列1为CAGATC，序列2是由5-80个碱基组成的序列，序列3为TGGATC。优选地，序列2是由10-50个碱基组成的序列，更为优选地，序列2是由20-40个碱基组成的序列。
可选地，在所述递送载体携带两个或多个所述基因线路的情况下，相邻的所述基因线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；
其中，序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC，或CAGATCTGGATGCACCTGAGGGTGAAGTCAGACCTAGTGGATC。
可选地，所述递送载体为病毒载体或非病毒载体；
其中，所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，所述非病毒载体包括质粒载体、脂质体载体、阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、多功能信封式纳米载体。
优选采用质粒载体或腺病毒载体。其中，所述腺相关病毒载体优选为腺相关病毒载体5型(AAV5)、腺相关病毒载体8型(AAV8)或腺相关病毒载体9型(AAV9)。
上述递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统，即该递送系统可用于包括人在内的哺乳动物。
本申请还提供一种如上所述的RNA递送系统在制备抗癌产品中的应用。
可选地，所述抗癌产品包括抑制癌细胞或阻止ALK基因表达的试剂、对癌症肿瘤具有预防和/或治疗作用的药物，特别是肺癌肿瘤。
药物的给药方式包括口服、吸入、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。即所述药物可以通过口服、吸入、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式进入体内后，通过如上任意一段所述的RNA递送系统递送至目标组织，发挥治疗作用。
所述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
本申请的技术效果为：
本申请提供的用于抑制ALK表达的RNA，其特定的序列结构决定了这些RNA可以精准的对ALK基因产生强效抑制作用，通过抑制ALK基因的表达，进而达到抑制肺癌肿瘤发生与发展的目的。
本申请提供的基因线路，包括用于抑制ALK表达的RNA和/或具有靶向功能的靶向标签。用于抑制ALK表达的RNA，其进入体内可以显著抑制ALK基因的表达，从而抑制肺癌的形成与发展；靶向标签具有极好的靶向功能，可以促使RNA快速到达靶器官和靶组织发挥作用，效率高，效果好，适于大规模推广与应用。
本申请提供的RNA递送系统，能够将靶向标签与用于抑制ALK表达的RNA组合表达。将携带RNA与靶向标签的递送载体注入宿主体内后，该携带RNA、靶向标签的递送载体能够在肝脏细胞中自组装成复合结构，再递送至肺癌肿瘤细胞，将这些肺癌肿瘤细胞中的ALK表达水平敲低，从而进行治疗。
该递送系统以合成生物学元件为基础，利用哺乳动物肝脏细胞作为生物反应器，将靶向标签与能够抑制ALK基因表达的RNA在哺乳动物体内自组装为能够靶向治疗ALK突变型疾病的复合结构，并分泌至循环系统，并且该复合结构在靶向标签的作用下将RNA定向运输到肿瘤细胞等待治疗的细胞中，发挥治疗效果，治疗效果好，效率高。
本申请提供的RNA递送系统借助了天然存在的分泌机制，因此能够避免采用其他载体造成的毒性。靶向标签能够高效的将RNA递送到需要治疗的组织，递送效率高，副反应小。
将本申请提供的靶向抑制ALK的递送系统应用于抗肿瘤产品中，无毒无副作用，起效快，疗效好，适于大规模推广和使用，并且提供了一个新的抗癌产品递送平台，可以通过该平台形成更多RNA类抗癌产品的研发基础，对RNA类抗癌产品研发和使用具有极大的推动作用。
附图说明
图1是本申请一实施例提供的质粒骨架示意图；
图2是本申请一实施例提供的ALK mRNA结合位点示意图；
图3是本申请一实施例提供的相关EGFR mRNA表达水平对比图；
图4是本申请一实施例提供的EGFR蛋白表达水平western blot图；
图5是本申请一实施例提供的细胞增殖速度对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式进行描述。
首先，对本发明涉及到的专业名词、试验方法等进行解释说明。
Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测.对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的试剂、材料和操作步骤均为相应领域内广泛使用的试剂、材料和常规步骤。
实施例1
本实施例提供一种用于抑制ALK表达的RNA，所述用于抑制ALK表达的RNA包括以下任意一种或几种的组合：如SEQ ID NO：1所示的siRNA(简称siRNA1)、如SEQ ID NO：2所示的siRNA(简称siRNA2)、如SEQ ID NO：3所示的siRNA(简称siRNA3)、如SEQ ID NO：4所示的siRNA(简称siRNA4)、与上述siRNA序列同源性大于80％的RNA。
优选地，所述用于抑制ALK表达的RNA为siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4中任意两种或多种的组合。
参见图2，图2展示了siRNA1-siRNA4对于ALK mRNA的结合位点。其中，siRNA1能够靶向ALK mRNA的33-57bp处，siRNA2能够靶向ALK mRNA的232-250bp处，siRNA3能够靶向ALKmRNA的27-45bp处，siRNA4能够靶向ALK mRNA的173-1917bp处。
由此可见，本实施例提供的四条siRNA并不是随意选择的，这四条siRNA虽然均可抑制ALK基因的表达，但四者的作用位点却并不相同，其中的任意两者、三者甚至是四者可以随意结合使用，提高作用发挥的灵活性，全方位多角度的对ALK基因的表达进行抑制，提高对ALK基因的抑制程度和抑制效率，从而进一步促进对肺癌及其相关疾病的治疗。
比如，siRNA1可以与siRNA2二者联合使用，也可以与siRNA2、siRNA3三者联合使用，还可以与siRNA2、siRNA3、siRNA4四者联合使用，以增强抑制效果，其他情况可依次类推，不再赘述。
更为优选地，所述用于抑制ALK表达的RNA为siRNA1与siRNA2的组合、siRNA3与siRNA4的组合、siRNA1与siRNA4的组合、siRNA3与siRNA2的组合、或siRNA1与siRNA2、siRNA3、siRNA4的组合。
此外，所述用于抑制ALK表达的RNA还包括具有抑制ALK基因表达作用的编码siRNA；
所述编码siRNA的正义链核苷酸序列包括：如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ IDNO：6所示的序列、如SEQ ID NO：7所示的序列、如SEQ ID NO：8所示的序列、与上述序列同源性大于80％的RNA；
所述编码siRNA的反义链核苷酸序列包括：如SEQ ID NO：9所示的序列、如SEQ IDNO：10所示的序列、如SEQ ID NO：11所示的序列、如SEQ ID NO：12所示的序列、与上述序列同源性大于80％的RNA。
在本实施例中所述的“同源性大于80％”意为两个序列的相似度大于80％，比如85％、90％、95％、98％、99％等均可。
本实施例提供的用于抑制ALK表达的RNA，其特定的序列结构决定了这些RNA可以精准的对ALK基因产生强效抑制作用，通过抑制ALK基因的表达，进而达到抑制肺癌肿瘤发生与发展的目的。
实施例2
在实施例1的基础上，本实施例提供一种基因线路(genetic circuit)，所述基因线路包括至少一个如上所述的用于抑制ALK基因表达的RNA和/或至少一个具有靶向功能的靶向标签，所述基因线路为能够在宿主的器官组织中富集并自组装形成复合结构的序列，该基因线路通过所述RNA抑制ALK基因的表达实现对疾病的治疗。
进一步地，所述具有靶向功能的靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白，优选为iRGD-Lamp2b靶向肽；
更为优选地，能够表达iRGD-Lamp2b靶向肽的正义链核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示的序列，或与SEQ ID NO：13所示的序列同源性大于80％的序列。iRGD-Lamp2b靶向肽能够精准靶向肺部组织，特别是能够精准靶向发生ALK突变或具有ALK表达的组织，以提高治疗效率。
进一步地，所述基因线路还包括启动子，所述基因线路的种类包括：启动子-RNA、启动子-靶向标签、启动子-靶向标签-RNA；
位于同一个载体上的基因线路包括至少一个能够抑制基因表达的RNA片段和至少一个具有靶向功能的靶向标签，该RNA片段和靶向标签位于相同的基因线路中或位于不同的基因线路中。
进一步地，所述基因线路还包括能够侧翼序列、loop序列和补偿序列，其中，侧翼序列、loop序列和补偿序列是能够使基因线路折叠成正确结构并表达的序列，补偿序列在目标受体中不能被表达。
所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列。
所述基因线路的种类包括：5’-启动子-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签、5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
进一步地，所述5’侧翼序列为ggatcctggaggcttgctgaaggctgtatgctgaattc或与其同源性大于80％的序列；
所述loop序列为gttttggccactgactgac或与其同源性大于80％的序列；
所述3’侧翼序列为accggtcaggacacaaggcctgttactagcactcacatggaacaaatggcccagatctggccgcactcgag或与其同源性大于80％的序列；
所述补偿序列为所述RNA序列的删除其中任意1-5位碱基的反向互补序列，以使补偿序列不表达。
优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位碱基。更为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中任意1-3位连续排列的碱基。最为优选地，所述补偿序列为所述RNA片段的反向互补序列，并删除其中的第9位和/或第10位碱基。
进一步地，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
本实施例提供的基因线路，包括用于抑制ALK表达的RNA和/或具有靶向功能的靶向标签。用于抑制ALK表达的RNA，其进入体内可以显著抑制ALK基因的表达，从而抑制肺癌的形成与发展；靶向标签具有极好的靶向功能，可以促使RNA快速到达靶器官和靶组织发挥作用，效率高，效果好，适于大规模推广与应用。
实施例3
在实施例2的基础上，本申请提供一种RNA递送系统，该系统包括如上所述的基因线路以及能够将所述基因线路递送至宿主的器官组织中富集的递送载体。
可选地，所述递送载体携带一个、两个或多个所述基因线路，其所携带的所有所述基因线路中，至少包括一个RNA和一个靶向标签；
含有所述基因线路的递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在宿主的器官组织中自组装形成复合结构，所述靶向标签位于所述复合结构的表面，所述复合结构通过所述靶向标签寻找并结合目标组织，将所述RNA送入目标组织。上述目标组织优选为发生ALK突变/具有ALK表达的癌细胞。
进一步地，在所述递送载体携带两个或多个所述基因线路的情况下，相邻的所述基因线路之间通过序列1-3组成的序列(序列1-序列2-序列3)相连；
其中，序列1为CAGATC，序列2是由5-80个碱基组成的序列，序列3为TGGATC。优选地，序列2是由10-50个碱基组成的序列，更为优选地，序列2是由20-40个碱基组成的序列。
可选地，在所述递送载体携带两个或多个所述基因线路的情况下，相邻的所述基因线路之间通过序列4或与序列4同源性大于80％的序列相连；
其中，序列4为CAGATCTGGCCGCACTCGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATC，或CAGATCTGGATGCACCTGAGGGTGAAGTCAGACCTAGTGGATC。
以在同一个递送载体上联合使用“siRNA1”和“siRNA2”为例，该递送载体的功能结构区可以表示为：(启动子-siRNA1)-连接序列-(启动子-siRNA2)-连接序列-(启动子-靶向标签)，或(启动子-靶向标签-siRNA1)-连接序列-(启动子-靶向标签-siRNA2)，或(启动子-siRNA1)-连接序列-(启动子-靶向标签-siRNA2)等。
更加具体地，该递送载体的功能结构区可以表示为：(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签)，或(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)，或(5’-启动子-5’侧翼序列-siRNA1-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)-连接序列-(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)、(5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-siRNA1-siRNA2-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列)等。其他情况均可以此类推，在此不再赘述。以上连接序列可以为“序列1-序列2-序列3”或“序列4”，一个括号表示一个完整的基因线路。
可选地，所述递送载体为病毒载体或非病毒载体；
其中，所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，所述非病毒载体包括质粒载体、脂质体载体、阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、多功能信封式纳米载体。
优选采用质粒载体或腺病毒载体。其中，所述腺相关病毒载体优选为腺相关病毒载体5型(AAV5)、腺相关病毒载体8型(AAV8)或腺相关病毒载体9型(AAV9)。
在实际应用中，将启动子元件与能够抑制ALK基因表达的siRNA串联，构建了siRALK并分别连入骨架载体，如图1所示，即可构建针对ALK基因的递送系统(质粒分子)。以病毒为载体的构建方法可以此类推，不再赘述。
上述递送系统为用于包括人在内的哺乳动物中的递送系统，即该递送系统可用于包括人在内的哺乳动物。
本实施例提供的RNA递送系统，能够将靶向标签与用于抑制ALK表达的RNA组合表达。将携带RNA与靶向标签的递送载体注入宿主体内后，该携带RNA、靶向标签的递送载体能够在肝脏细胞中自组装成复合结构，再递送至肺癌肿瘤细胞，将这些肺癌肿瘤细胞中的ALK表达水平敲低，从而进行治疗。
该递送系统以合成生物学元件为基础，利用哺乳动物肝脏细胞作为生物反应器，将靶向标签与能够抑制ALK基因表达的RNA在哺乳动物体内自组装为能够靶向治疗ALK突变型疾病的复合结构，并分泌至循环系统，并且该复合结构在靶向标签的作用下将RNA定向运输到肿瘤细胞等待治疗的细胞中，发挥治疗效果，治疗效果好，效率高。
本申请提供的RNA递送系统借助了天然存在的分泌机制，因此能够避免采用其他载体造成的毒性。靶向标签能够高效的将RNA递送到需要治疗的组织，递送效率高，副反应小。
实施例4
本实施例提供一种抗癌产品。该抗癌产品包括递送载体，所述递送载体携带如实施例2所述的基因线路，所述递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在所述宿主器官组织中内源性地自发形成含有用于抑制ALK表达的RNA的并具有靶向结构的复合结构，所述复合结构通过靶向结构寻找并结合目标组织，将所述RNA片段送入目标组织。
该抗癌产品可以为抑制癌细胞或阻止ALK基因表达的试剂、对癌症肿瘤具有预防和/或治疗作用的药物。
试剂或药物可以通过口服、吸入、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式进入人体后，通过实施例3所述的RNA递送系统递送至目标组织，发挥治疗作用。
本实施例的药物还可以包括药学上可以接受的载体，该载体包括但不限于稀释剂、缓冲剂、乳剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、佐剂、干燥剂、吸附载体等。
本实施例提供的药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、栓剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、洗剂、凝胶剂、糊剂等。
关于其中递送载体、基因线路、靶向标签等的解释可参见实施例1-3，在此不再赘述。
本实施例将RNA递送系统应用于抗癌产品中，即提供了一个新的抗癌产品递送平台，可以通过该平台形成更多RNA类抗癌产品的研发基础，对RNA类抗癌产品研发和使用具有极大的推动作用。
试验例1
按照图1所示方法构建不同干扰序列的质粒，将质粒分子转染人肺癌H3122细胞系中，36小时后利用qRT-PCR和Western blotting实验检测细胞中ALK基因的mRNA和蛋白质表达水平。
在此我们设置Mock对照组、Scramble siRNA对照组、siRNA seq 1-4试验组。
其中，Mock对照组为空白对照，Scramble siRNA对照组是向肺癌细胞转染不加入任何RNA的纯质粒，siRNA seq 1-4试验组是分别向肺癌细胞转染加入如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示siRNA的质粒。结果如图3-图5所示。
图3为四组相关EGFR mRNA表达水平对比图，从图中可看出四组相关EGFR mRNA表达水平的排序为：Mock对照组＞Scramble siRNA对照组＞siRNA seq 3试验组>siRNA seq1试验组＞siRNA seq 2试验组＞siRNA seq 4试验组。
图4为能够表示四组EGFR蛋白表达水平的western blot图，从图中可看出四组EGFR蛋白表达水平的排序为：Mock对照组＞Scramble siRNA对照组＞siRNA seq 3试验组>siRNA seq 1试验组＞siRNA seq 2试验组＞siRNA seq 4试验组。
图5为细胞增殖实验，曲线代表转染后H358细胞的增殖速度，从图中可看出四组细胞的增殖速度排序为：Mock对照组＞Scramble siRNA对照组＞siRNA seq 3试验组>siRNAseq 1试验组＞siRNA seq 2试验组＞siRNA seq 4试验组。
由此可见，本申请提供的用于抑制ALK表达的RNA，其能够对ALK基因产生强效抑制作用，通过抑制ALK基因的表达，进而达到抑制肺癌肿瘤发生与发展的目的。
在本文中，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等仅用于表示相关部分之间的相对位置关系，而非限定这些相关部分的绝对位置。
在本文中，“第一”、“第二”等仅用于彼此的区分，而非表示重要程度及顺序、以及互为存在的前提等。
在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且制造或使用等允许的误差。
除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。
上面结合附图对本申请优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本申请并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请构思的前提下做出各种变化。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京大学
<120> 一种用于抑制ALK表达的RNA、基因线路及递送系统
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agactaacat gactctgccc tatat 25
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcctgtgta gtgcttcaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggaaccagac taacatgac 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaaaggttc agagctcag 19
<210> 5
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctggaggctt gctgaaggct gtatgctgag actaacatga ctctgcccta tatgttttgg 60
ccactgactg acatataggg cagagtcatg ttagtctcag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cc 142
<210> 6
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctggaggctt gctgaaggct gtatgctggg cctgtgtagt gcttcaagtt ttggccactg 60
actgacttga agcactacac aggcccagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 120
acaaatggcc 130
<210> 7
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctggaggctt gctgaaggct gtatgctggg aaccagacta acatgacgtt ttggccactg 60
actgacgtca tgttagtctg gttcccagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 120
acaaatggcc 130
<210> 8
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctggaggctt gctgaaggct gtatgctggg aaaggttcag agctcaggtt ttggccactg 60
actgacctga gctctgaacc tttcccagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 120
acaaatggcc 130
<210> 9
<211> 142
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggccatttgt tccatgtgag tgctagtaac aggccttgtg tcctgagact aacatgactc 60
tgccctatat gtcagtcagt ggccaaaaca tatagggcag agtcatgtta gtctcagcat 120
acagccttca gcaagcctcc ag 142
<210> 10
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggccatttgt tccatgtgag tgctagtaac aggccttgtg tcctgggcct gtgtagtgct 60
tcaagtcagt cagtggccaa aacttgaagc actacacagg cccagcatac agccttcagc 120
aagcctccag 130
<210> 11
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggccatttgt tccatgtgag tgctagtaac aggccttgtg tcctgggaac cagactaaca 60
tgacgtcagt cagtggccaa aacgtcatgt tagtctggtt cccagcatac agccttcagc 120
aagcctccag 130
<210> 12
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggccatttgt tccatgtgag tgctagtaac aggccttgtg tcctgggaaa ggttcagagc 60
tcaggtcagt cagtggccaa aacctgagct ctgaaccttt cccagcatac agccttcagc 120
aagcctccag 130
<210> 13
<211> 1320
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tctagagggt cgccaccatg tgcctgtccc ctgtgaaggg cgccaagctg atcctgatct 60
tcctgtttct gggcgccgtg cagtccaacg ccctgatcgt gaatctgacc gattctaagg 120
gcacatgcct gtacgcaagg tgtcgcggcg ataagggacc agactgctct ggaggagcag 180
agtgggagat gaacttcacc atcacatatg agaccacaaa ccagaccaat aagaccatca 240
caatcgccgt gcctgataag gccacacacg acggcagctc ctgtggcgac gatcggaaca 300
gcgccaagat catgatccag ttcggctttg ccgtgtcctg ggccgtgaat ttcaccaagg 360
aggcctctca ctacagcatc cacgacatcg tgctgtccta taatacctcc gactctacag 420
tgtttccagg agcagtggca aagggagtgc acaccgtgaa gaaccctgag aatttcaagg 480
tgccactgga tgtgatcttt aagtgcaact ctgtgctgac ctacaatctg acacccgtgg 540
tgcagaagta ttggggcatc cacctccagg ccttcgtgca gaacggcacc gtgagcaaga 600
atgagcaggt gtgcgaggag gaccagacac caaccacagt ggcccccatc atccacacca 660
cagccccatc taccacaacc acactgaccc ccacaagcac ccccacacct accccaacac 720
ccacccctac agtgggcaac tactccatca ggaacggcaa taccacatgc ctgctggcca 780
ccatgggcct ccagctgaac atcacagagg agaaggtgcc cttcatcttt aacatcaatc 840
ctgccaccac aaatttcacc ggctcctgtc agcctcagtc tgcccagctg cggctgaaca 900
atagccagat caagtacctg gatttcatct ttgccgtgaa gaacgagaag cggttctacc 960
tgaaggaggt gaacgtgtac atgtatctgg ccaacggcag cgccttcaat atctccaaca 1020
agaatctgtc tttttgggac gccccactgg gctctagcta catgtgcaac aaggagcagg 1080
tgctgagcgt gtcccgcgcc ttccagatca acacctttaa tctgaaggtg cagcctttca 1140
atgtgaccaa gggccagtat agcacagccc aggagtgttc cctggacgat gacaccatcc 1200
tgatcccaat catcgtggga gcaggactga gcggactgat catcgtgatc gtgatcgcct 1260
acctgatcgg ccggagaaag acctacgccg gctatcagac actgtgacac tgatactagt 1320

Claims (12)

1.一种用于抑制ALK表达的RNA，其特征在于，所述用于抑制ALK表达的RNA包括以下任意一种或几种的组合：如SEQ ID NO：1所示的siRNA、如SEQ ID NO：2所示的siRNA、如SEQ IDNO：3所示的siRNA、如SEQ ID NO：4所示的siRNA、与上述siRNA序列同源性大于80％的RNA。
2.如权利要求1所述的用于抑制ALK表达的RNA，其特征在于，所述用于抑制ALK表达的RNA还包括具有抑制ALK基因表达作用的编码siRNA；
所述编码siRNA的正义链核苷酸序列包括：如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ ID NO：6所示的序列、如SEQ ID NO：7所示的序列、如SEQ ID NO：8所示的序列、与上述序列同源性大于80％的RNA；
所述编码siRNA的反义链核苷酸序列包括：如SEQ ID NO：9所示的序列、如SEQ ID NO：10所示的序列、如SEQ ID NO：11所示的序列、如SEQ ID NO：12所示的序列、与上述序列同源性大于80％的RNA。
3.一种基因线路，其特征在于，所述基因线路包括至少一个如权利要求1或2所述的用于抑制ALK基因表达的RNA和/或至少一个具有靶向功能的靶向标签，所述基因线路为能够在宿主的器官组织中富集并自组装形成复合结构的序列，该基因线路通过所述RNA抑制ALK基因的表达实现对疾病的治疗。
4.如权利要求3所述的基因线路，其特征在于，所述具有靶向功能的靶向标签选自具有靶向功能的靶向肽或靶向蛋白，优选为iRGD-Lamp2b靶向肽；
更为优选地，能够表达iRGD-Lamp2b靶向肽的正义链核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示的序列，或与SEQ ID NO：13所示的序列同源性大于80％的序列。
5.如权利要求3所述的基因线路，其特征在于，所述基因线路还包括启动子，所述基因线路的种类包括：启动子-RNA、启动子-靶向标签、启动子-靶向标签-RNA；
位于同一个载体上的基因线路包括至少一个能够抑制ALK基因表达的RNA和至少一个具有靶向功能的靶向标签，该RNA和靶向标签位于相同的基因线路中或位于不同的基因线路中。
6.如权利要求5所述的基因线路，其特征在于，所述基因线路还包括能够使基因线路正确折叠并表达的侧翼序列、loop序列和补偿序列，所述侧翼序列包括5’侧翼序列和3’侧翼序列；
所述基因线路的种类包括：5’-启动子-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列、5’-启动子-靶向标签、5’-启动子-靶向标签-5’侧翼序列-RNA片段-loop序列-补偿序列-3’侧翼序列。
7.如权利要求3所述的基因线路，其特征在于，所述器官组织为肝脏，所述复合结构为外泌体。
8.一种RNA递送系统，其特征在于，该系统包括权利要求3-7任意一项所述的基因线路以及能够将所述基因线路递送至宿主的器官组织中富集的递送载体。
9.如权利要求8所述的RNA递送系统，其特征在于，所述递送载体携带一个、两个或多个所述基因线路，其所携带的所有所述基因线路中，至少包括一个用于抑制ALK表达的RNA和一个靶向标签；
含有所述基因线路的递送载体能够在宿主的器官组织中富集，并在宿主的器官组织中自组装形成复合结构，所述靶向标签位于所述复合结构的表面，所述复合结构通过所述靶向标签寻找并结合目标组织，将所述用于抑制ALK表达的RNA送入目标组织。
10.如权利要求8所述的递送系统，其特征在于，所述递送载体为病毒载体或非病毒载体；
其中，所述病毒载体包括腺相关病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体，所述非病毒载体包括质粒载体、脂质体载体、阳离子多聚物载体、纳米颗粒载体、多功能信封式纳米载体。
11.一种如权利要求8-10中任意一项所述的RNA递送系统在制备抗癌产品中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述抗癌产品包括抑制癌细胞或阻止ALK基因表达的试剂、对癌症肿瘤具有预防和/或治疗作用的药物。
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