CN115487146B - 一种阻断cxcr4/pd-l1双信号的三药共递送纳米体系及其制备方法和应用 - Google Patents

一种阻断cxcr4/pd-l1双信号的三药共递送纳米体系及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种阻断CXCR4/PD‑L1双信号的三药共递送纳米体系及其制备方法和应用，属于肿瘤治疗领域。上述制备方法包括以下步骤：(1)将酸响应性嵌段共聚物载体与肿瘤化疗药物、CXCR4拮抗剂以及PD‑1/PD‑L1小分子抑制剂涡旋混合至溶解，构成油相；(2)将聚乙烯醇置于水中，加热至溶解构成水相；(3)将所述油相与所述水相在冰浴条件下超声乳化，得到乳液；(4)将所述乳液离心、弃沉淀，得到纳米体系。通过上述制备方法得到的三药共递送纳米体系，经实验验证发现，在治疗三阴性乳腺癌过程中能够实现避免对趋化正常细胞归巢的损害以及产生免疫系统的副作用，增强三阴性乳腺癌的免疫治疗效果。

Description

一种阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，特别是涉及一种阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系及其制备方法和应用。
背景技术
三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)属于一种临床高危乳腺癌病理亚型，多发生于年轻女性，以侵袭性强、易发生内脏转移、预后差和总生存期短为主要临床表现。目前TNBC的系统治疗仍以化疗为主，患者5年生存率不足30％。近年以程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其配体(PD-L1)为靶点的免疫治疗，为三阴性乳腺癌患者带来新希望，PD-L1阻断剂免疫治疗和化疗联合应用能够将三阴性乳腺癌患者生存期延长达十个月，死亡或癌症进展的风险降低近40％。然而，实体瘤内免疫抑制微环境仍然限制此免疫疗法的有效性，瘤内免疫抑制性细胞阻止活化的T细胞浸润至肿瘤内部。
趋化因子受体4(CXCR4)是基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的特异受体，SDF-1/CXCR4生物学轴参与造血细胞生成、白细胞迁移和归巢以及恶性肿瘤侵袭转移等生理、病理过程。研究显示，缺氧酸性微环境中三阴性乳腺癌组织高表达的CXCR4分子，可招募包括调节性T细胞在内的免疫抑制相关细胞至肿瘤内。目前，通过阻断CXCR4或PD-1/PD-L1信号通路减少肿瘤的免疫逃逸已经取得一定效果，但是仍然存在难以精准靶向、三阴性乳腺癌治疗效果受限等问题。
纳米递药体系在肿瘤精准化治疗中占据重要地位，其不仅可以同时递送多种药物联合治疗恶性肿瘤，而且能够依据肿瘤微环境特征在不同作用部位有序、可控释放药物。因此，提供一种能够高效精准递送肿瘤治疗药物，提高三阴性乳腺癌治疗效果的纳米递送体系非常关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过将分子靶向治疗、免疫检查点阻断疗法与化疗整合于一体，增强了三阴性乳腺癌的治疗效果。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系的制备方法，包括以下步骤：
(1)将酸响应性嵌段共聚物载体与肿瘤化疗药物、CXCR4拮抗剂以及PD-1/PD-L1小分子抑制剂涡旋混合至溶解，构成油相；
(2)将聚乙烯醇置于水中，加热至溶解构成水相；
(3)将所述油相与所述水相在冰浴条件下超声乳化，得到乳液；
(4)将所述乳液离心、弃沉淀，得到纳米体系。
优选的是，步骤(1)中，所述酸响应性嵌段共聚物载体包括PEG-hdy-PLGA，所述肿瘤化疗药物包括紫杉醇，所述CXCR4拮抗剂包括AMD 3100，所述PD-1/PD-L1小分子抑制剂包括BMS-1。
优选的是，所述PEG-hdy-PLGA、紫杉醇、AMD 3100和BMS-1的质量比为5:1:1:1。
优选的是，步骤(2)中，所述聚乙烯醇与水的质量体积比为1g：100mL。
优选的是，步骤(3)中，所述油相和水相的体积比为1:9。
超声乳化条件为：超声强度65％(即功率550W)，超声时间8min。
本发明还提供一种阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系，利用所述的制备方法制备得到。
本发明还提供所述的纳米体系在制备抑制三阴性乳腺癌生长与转移的药物中的应用。
本发明还提供所述的纳米体系在制备增强三阴性乳腺癌治疗效果的药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明制备了一种三药共递送纳米体系，该体系采用肿瘤酸性微环境响应性双亲性嵌段共聚物载体，将化疗药物紫杉醇(PTX)、CXCR4拮抗剂(AMD 3100)与PD-1/PD-L1小分子抑制剂(BMS-1)包载其中，三药联合应用于三阴性乳腺癌治疗。通过实验验证发现，该纳米体系在治疗三阴性乳腺癌过程中，可实现避免对趋化正常细胞归巢的损害以及产生免疫系统的副作用，并且该纳米体系将分子靶向治疗、免疫检查点阻断疗法与化疗整合于一体，阻断CXCR4/PD-L1双信号，并释放肿瘤相关抗原，协同调控肿瘤免疫抑制微环境，提高肿瘤浸润性T细胞免疫应答，增强三阴性乳腺癌的治疗效果。因此，本发明为三阴性乳腺癌的治疗效果的提高提供了新的思路和方向。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系的形态(a)、尺寸和粒径(b)、与PTX(c)、AMD3100(d)和BMS-1(e)酸响应性释放情况。
图2为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系随时间在荷瘤小鼠各器官与肿瘤组织的分布情况，其中a与b为三药共递送荧光纳米体系((Cy5)P/A/B@NM)与游离荧光染料Cy5经尾静脉注射48h内在荷瘤小鼠各器官与肿瘤组织的分布情况以及相对荧光强度c与d为(Cy5)P/A/B@NM与Cy5注射48h后各器官组织与肿瘤组织的蓄积情况以及相对荧光强度/>
图3为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠原位瘤生长的影响，其中，a为三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠原位瘤体积的影响b为三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠原位瘤重的影响/>c为三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠原位瘤病理学分析与Ki-67蛋白表达的影响/>
图4为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠肿瘤肺/肝转移的影响，其中，a为三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠肺转移影响的代表性照片；b为三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠肺转移肿瘤结节影响统计图c为三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠肺/肝转移肿瘤病灶病理学分析；
图5为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对肿瘤组织内CD8+T细胞标志物表达的影响
图6为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对肿瘤组织内CD4+T细胞标志物表达的影响
图7为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对肿瘤组织内相关免疫抑制细胞Tregs细胞标志物表达的影响
图8为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对肿瘤组织内相关免疫抑制细胞MDSCs细胞标志物表达的影响
图9为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对肿瘤组织内相关免疫抑制细胞M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)标志物表达的影响
图10为阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对肿瘤组织内免疫相关因子INF-γ、IL-2、TGF-β1和IL-10表达的影响
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、实验材料
(1)实验细胞培养
4T1细胞购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，并于宁夏医科大学工程技术研究中心药效学研究室液氮罐中保存。将复苏的4T1细胞加入新鲜培养基吹打为细胞悬液并接种于100mm3培养皿中，于37℃、5％CO2的培养箱中常规培养，按照实验所需密度进行接种，每周更换新鲜培养基2～3次。
(2)实验动物
购买80只4～6周龄BALB/C雌性小鼠，体重16～18g，所有动物于宁夏医科大学动物中心SPF级屏障中饲养(伦理号：IACUC-NYLAC-2019-154)。
2、实验方法
2.1阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系的制备、表征与体外释药
2.1.1载药纳米体系的制备与表征
本实验采用O/W型超声乳化-溶剂蒸发法制备含有紫杉醇PTX、CXCR4抑制剂AMD3100和PD-L1抑制剂BMS-1三种药物的纳米体系。通过单因素筛选超声强度、表面活性剂浓度、有机相/水相体积比、超声时间和嵌段共聚物载体与药物质量比；方法如下：
首先将一定量的PEG-hdy-PLGA聚合物、PD-1抑制剂、CXCR4抑制剂和紫杉醇置于二氯甲烷中，涡旋混合至溶解构成油相。另外将聚乙烯醇置于水中，加热使溶解构成水相。将油相慢慢加入水相中，在冰浴条件下用探头式超声仪进行超声乳化形成均一的牛奶状乳液，用磁力搅拌器搅拌4h除去有机溶剂。将乳液置于离心管，用低速离心机离心，弃沉淀，除掉游离的PEG-hdy-PLGA聚合物、PD-1抑制剂、CXCR4抑制剂和紫杉醇，得到纳米乳。
2.1.1.1超声强度对纳米体系的选择
制备此聚合物纳米体系的过程中，需通过探头超声仪来分散纳米体系使之成型，但是超声强度过大容易导致纳米体系破坏，且随着超声频率的上升，有机相与水相乳化时间缩短，乳化不均匀，制备的纳米体系粒径大小不一。超声强度太小则纳米体系粒径较大且不均匀。因此，适当的超声强度对纳米体系的质量具有重要影响。结果见表1实验数据，实验选择超声强度65％即超声功率为550W。
表1超声强度对纳米体系的影响
2.1.1.2表面活性剂浓度对纳米体系制备的影响
聚乙烯醇(PVA)作为表面活性剂广泛应用于聚合物纳米制剂的制备。聚乙烯醇的种类和浓度对纳米体系的药剂学性质有一定的影响。聚乙烯醇加快有机相在水相中的分散度，而且在纳米体系表面形成一层亲水性膜，阻止了粒子间的团聚，增强体系的稳定性，形成的纳米体系粒径较小。但是表面活性剂浓度继续增大，常会造成外相过于劲稠，增强溶液的粘滞性，导致有机相进入水相速度减慢，不易扩散，从而聚集成球，形成的纳米体系粒径较大且不均匀。故本实验将使用的体积量固定(5mL)，制备载药纳米体系，考察0.5％、1％、2％、3％的聚乙烯醇水溶液作为乳化剂，对纳米体系粒径和稳定性的影响。通过表2，结果发现1％PVA所得纳米体系具有更小的粒径和更好的稳定性。
表2聚乙烯醇溶液浓度对纳米体系粒径和稳定性的影响
2.1.1.3有机相水相体积比的选择
有机相与水相体积比可以影响纳米体系的粒径，实验控制有机相/水相体积比分别为1：3，1：5，1：7，1：9，测定纳米体系的粒径考察有机相/水相体积比对纳米体系的影响。由表3可得有机相和水相比例对纳米体系粒径影响较大，水相液面高度适宜，这样有机相可以很好的扩散到水相以减小有机相进入水相，由于空间不足造成粒径变大的影响。结合表3，综合实验数据，实验中选择有机相水相体积比为1：9。
表3有机相/水相体积比对纳米体系的影响
2.1.1.4超声乳化时间对纳米体系制备的影响
超声乳化是制备纳米体系的关键步骤，超声时间太短，有机相和水相乳化不完全，制备的纳米体系粒径大小不一，但是超声时间太长容易导致纳米体系破坏。因此，适当的超声时间对纳米体系的质量具有重要影响。结果见表4，实验选择超声时间8min。
表4超声乳化时间对纳米体系的影响
2.1.1.5载体与药物质量比对纳米体系制备的影响
酸响应性嵌段共聚物载体与药物质量比的变化对纳米体系粒径、稳定性、载药量及包封率的影响是很明显的，随着载体与药物质量比增加，溶液中药物浓度升高，纳米体系中包载的药物逐渐增多，载药量和包封率也随之升高；但当药物浓度过高时，溶液的粘度也随之增大，导致有机相在水相的分散度降低，出现乳滴团聚现象，不易形成纳米体系，造成药物损失，致使药物的包封率降低，且所制备的纳米体系粒径较大。由表5可知，载体与药物质量比为5:1，纳米体系具有较好的稳定性和较小的粒径。
表5载体与药物质量比对纳米体系的影响
根据上述结果建立了以下最优处方制备载药纳米体系：
首先，将酸响应性嵌段共聚物载体PEG-hdy-PLGA(5mg)与药物PTX(1mg)、AMD3100(1mg)和BMS-1(1mg)置于1mL二氯甲烷中，涡旋混合至溶解构成油相；另外，将1g聚乙烯醇置于100mL水中构成1％聚乙烯醇水溶液，95℃加热使溶解构成水相。将油相慢慢按照体积比1:9加入水相中，在冰浴条件下用探头式超声仪进行超声乳化(超声强度：65％(550W)，关3s，开3s；超声时间：8min)形成均一的牛奶状乳液，用磁力搅拌器搅拌4h除去有机溶剂。将乳液置于离心管，用低速离心机以3000rpm转速离心10min，弃沉淀，除掉游离的PEG-hdy-PLGA聚合物、PTX、AMD3100和BMS-1，得到纳米体系。
按最优处方制备载PTX、BMS-1、AMD3100纳米体系，并对其理化性质进行考察。本实验主要从粒径及粒径分布、Zeta电位、载药量及包封率、纳米体系表面形态这四个方面对纳米体系的理化性质进行评价。
(1)纳米体系的粒径大小及分布、Zeta电位的测定
分别吸取1mL纳米体系溶液(四批)，在室温下采用激光粒度分析仪分别测定纳米体系的粒径，Zeta电位和分散指数PDI。
(2)PTX、BMS-1和AMD3100包封率及载药量的测定
取离心后的沉淀，加入10倍的甲醇，混匀，沉淀聚合物，0.22μm有机系微孔滤膜过滤样品取其滤液为游离药物，用HPLC分别测定其中药物含量和包封率。
HPLC测定BMS-1含量的条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)；
流动相：CH3CN(流动相A)：H2O(流动相B)，见表6；
流速：1.0mL/min；
柱温：柱温；
检测波长：280nm；
进样量：10μL。
表6
HPLC测定AMD3100含量的条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)；
流动相：0.1％TFACH3CN(流动相A)：0.1％TFA H2O(流动相B)，见表7；流速：1.0mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：230nm；
进样量：10μL。
表7
HPLC测定PTX含量的条件：
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×250mm，5μm)；
流动相：CH3CN(流动相A)：H2O(流动相B)，见表8；
流速：1.0mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：280nm；
进样量：10μL。
表8
包封率和载药量的计算公式：
其中，C总为药物的总浓度；C游离为游离药物的浓度。
2.1.2pH响应载药纳米体系体外释药性能考察
采用小杯法测定纳米制剂组(每组三个样品)在不同条件下(pH7.4、pH6.5和pH5.0的磷酸缓冲盐溶液(30％乙醇)为溶出介质)的体外释放情况。具体操作步骤为：
取三批制备的纳米混悬液于即用型纤维素透析袋中(8000D，24mm宽)，置于具塞锥形瓶中加入50mL溶出介质，将锥形瓶放置于透皮扩散仪中，37℃、120r/min，分别在0.5、1、2、4、6、8、12、24、48h平行取释放液1mL，同时补充等量的同温度溶出介质。过0.22μm滤膜，采用HPLC法测定纳米体系的体外释药，计算在三种介质下的PTX、AMD3100及BMS-1的累积释放百分率(测定一定时间点释放介质中的药物量，加上已经取走的所有药物的量，除以已知的药物的总量即为药物的累积释放率)。
2.2小鼠三阴性乳腺癌原位-自发性肺/肝转移肿瘤模型制备与给药
将生长状态良好的4T1细胞消化后调整细胞悬液浓度为5×106个/mL，取0.1mL接种于BALB/C小鼠第四对乳腺脂肪垫内进行造模。9天后所有小鼠均长出肿瘤并进行随机分组(n＝16)，并按照以下给药方案注射给药：
(1)4T1组：造模后，给予生理盐水/2d；
(2)B@NM单药组：造模后，尾静脉注射给予B@NM，1mg/kg/2d(BMS-1，20μg)；
(3)P/B@NM两药组：尾静脉注射给予P/B@NM，1mg/kg/2d(BMS-1，20μg；PTX，20μg)；
(4)A/B@NM两药组：尾静脉注射给予A/B@NM，1mg/kg/2d(BMS-1，20μg；AMD3100，20μg)；
(5)P/A/B@NM三药组：尾静脉注射给予P/A/B@NM，1mg/kg/2d(BMS-1，20μg；PTX，20μg；AMD3100，20μg)。
给药期间每天观察小鼠一般活动情况，记录小鼠体重变化并采用游标卡尺监测荷瘤小鼠瘤体积变化。给药21天后结束实验，采用颈椎脱臼法处死各组小鼠，并剥离肿瘤组织，部分用于流式细胞分析，剩余肿瘤组织拍照后进行称重，其中一部分组织保存于-80℃冰箱备用，另一部分组织置于4％多聚甲醛固定后进行后续实验；剥离小鼠肺组织，点数肺组织肿瘤转移结节数目，并置于多聚甲醛固定；剥取小鼠肝组织置于多聚甲醛中固定。
2.3小动物活体成像
将5×105个4T1细胞接种至6周龄SPF级BALB/C小鼠第四对乳腺脂肪垫上，待2周后，按照游离Cy5染料组与(Cy5)P/A/B@NM组分组，于小鼠尾静脉注射上述染料溶液(1mg/mL)与染料标记纳米体系(1mg/mL)200μL。注射后，分别于2、8、24、48h后，按0.15mL/10g剂量腹腔注射0.3％戊巴比妥钠麻醉小鼠(第一次麻醉后给小鼠脱毛，减少毛发产生的背景荧光干扰)，将小鼠固定在治疗床上，采用小动物活体成像系统分别对小鼠全身及肿瘤部位荧光扫描成像，记录动物在体发射荧光的成像图片，分析荧光探针的分布情况；成像结束后，解剖小鼠分离心、肝、脾、肺、肾等主要脏器与肿瘤组织，进行成像分析。
2.4H&E染色
将肿瘤组织、肺与肝组织浸泡于4％多聚甲醛中24h后，梯度酒精依次脱水并于二甲苯中透明，随后制备为石蜡切片。将石蜡切片置于70℃烘箱中烘片2h后，经二甲苯Ⅰ及Ⅱ各20min，无水乙醇、95％、90％乙醇各5min，80％、70％乙醇各3min，流水冲洗后于苏木素5min，流水冲洗并于盐酸酒精分化数秒，随后于伊红5min，流水冲洗后上行酒精脱水封片。
2.5免疫组织化学
肿瘤组织常规脱蜡复水后将切片置于柠檬酸钠缓冲液中煮沸10min，用免疫组化笔圈出组织。滴加试剂一，37℃孵育10min，PBS洗2min×3次。滴加山羊血清，37℃孵育20min，稍洗。一抗孵育，4℃孵育过夜，PBS洗2min×3次。滴加试剂二，37℃孵育20min，PBS洗2min×3次。滴加试剂三，37℃孵育20min，PBS洗2min×3次。DAB显色，自来水冲洗后，将苏木素染液均匀滴加于组织上，上行酒精至二甲苯，封片。
2.6流式细胞分析
给药结束后经颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，置于装有75％乙醇的平皿中，小心分离肿瘤组织，收集组织并用剪刀将其剪成2-4mm碎块。按照小鼠肿瘤解离试剂盒标准操作方法加入合适体积组织解离液制备单细胞悬液，使细胞浓度为1×107/mL，设置空白对照组、同型对照组、待测样本每管取100μL上述重悬的细胞，使每管细胞数达到1×106/管，阻断Fc受体后，按照制定好的配色方案加入不同染料标记的表面蛋白抗体4℃孵育30min，用流式细胞染色缓冲液洗涤，加入细胞活性染料染色细胞25min，使用流式细胞仪检测分析各组肿瘤组织内辅助T细胞(CD4+T)、细胞毒性T细胞(CD8+T)、调节性T细胞(Tregs)、髓源性抑制细胞(MDSCs)与M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)标志物表达情况。
2.7ELISA检测
将保存在-80℃的肿瘤组织取出融化后仍然保持2-8℃的温度，加入一定量的预冷PBS(pH7.4)，用匀浆器将组织匀浆充分，于4℃、12000r/min离心10min，仔细收集上清，根据ELISA试剂盒说明书方法进行TGF-β1、IL-10、INF-γ、IL-2检测。
2.8数据分析
全部数据应用SPSS 24.0软件进行分析。计量资料结果均以±s表示，多样本间数据比较先进行正态性和方差齐性检验，均符合采用t检验或单因素方差分析。若不符合正态性或方差齐性，采用Kruskal-Wallis秩和检验，以α＝0.05为检验水准，以P＜0.05认为具有统计学差异。
3、结果与分析
3.1阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系的制备与表征
按优化处方制备纳米溶液，溶液呈半透明乳白色略带蓝色乳光。
透射电镜观察纳米体系的粒径和形态(见图1的a)，结果显示三药共递送纳米体系外形圆整、均成球形，尺寸约为152±14nm。
在室温下采用激光粒度分析仪分别测定平行制备三批纳米体系的粒径，Zeta电位和分散指数PDI(见图1的b与表9)，结果显示，取得纳米体系粒径为266.1±3.7nm，Zeta电位为-1.14±0.20mV，绝对值相对较低，但分布均匀，PDI为0.197±0.0066，粒径分布较窄。
取纳米体系离心后的沉淀，加入10倍的甲醇沉淀聚合物，0.22μm有机系微孔滤膜过滤样品取其续滤液为游离药物，用HPLC分别测定其中药物含量，结果见表10，PTX包封率＝65.90±1.47％、载药量＝3.62±0.13％；AMD3100包封率＝66.03±0.42％、载药量＝3.53±0.05％；BMS-1包封率＝67.00±1.14％、载药量＝3.67±0.03％。
表9
表10
3.2阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系pH响应性体外释放PTX、AMD3100与BMS-1情况
根据药物在释放介质中的饱和溶解度可知，本实验所用得释放基质体积满足漏槽条件的要求。用GraphPad Prism对所得的结果进行处理，以时间为横坐标，累积释放率作为纵坐标，得到相应的释药曲线图见图1c-e所示。由释药曲线可见三药共递送纳米体系中PTX释放随pH的减小释药量增加，并在pH5.0时，50h内最高释药量达47.69％；纳米体系中AMD3100释放随pH的减小释药量增加，并在pH5.0时，50h内最高释药量达89.31％；纳米体系中BMS-1释放随pH的减小释药量增加，并在pH5.0时，50h内最高释药量达90.61％。以上研究表明制备的三药共递送纳米体系具有pH响应的药物释放能力。
3.3阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系在荷瘤小鼠体内分布情况
载药纳米体系在荷瘤小鼠肿瘤内的有效蓄积决定着肿瘤治疗效果。如图2的a与c所示，游离荧光染料Cy5与Cy5标记载药纳米体系经尾静脉注射后，在监测的48h内，游离的Cy5优先积累至肝、肾组织，且在2h达到最高荧光强度，后随时间延长组织内的荧光强度逐渐降低，48h后仅血流丰富的心脏组织与肝脏组织可检测到Cy5荧光(见图2的b与d)；而Cy5标记载药纳米体系((Cy5)-P/A/B@NM)注射后2h即可在肿瘤部位检测到明显的荧光，随血循环时间延长至48h，载药纳米体系在肿瘤组织部位的蓄积愈发显著(P<0.001)，尽管在含有网状内皮系统的肺组织与肝组织也检测到明显的Cy5荧光，但其荧光强度弱于肿瘤组织。以上研究表明，阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系可在荷瘤小鼠肿瘤部位有效积累。
3.4阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠原位瘤生长与肺/肝转移影响
4T1细胞接种9天后，所有小鼠第四对乳腺处均可触及到直径超过5mm的肿瘤，连续给药21天后，由图3的a与b可见生理盐水组肿瘤体积呈指数增长，瘤重达3.4±0.4g，而B@NM组、P/B@NM组、A/B@NM组与P/A/B@NM组肿瘤体积增长较生理盐水组缓慢，尤以共载三药的P/A/B@NM组肿瘤体积增长最缓且出现肿瘤生长停滞甚至瘤体积减少现象(P＜0.001)，并且P/A/B@NM组瘤重相较于B@NM组具有显著性差异(P＜0.01)。小鼠原位瘤组织病理学分析发现生理盐水组肿瘤核大而圆，核分裂现象明显；而给予B@NM、P/B@NM、A/B@NM与P/A/B@NM后，肿瘤细胞出现不同程度凋亡现象，尤以P/A/B@NM组肿瘤细胞出现细胞皱缩、膜发泡、细胞核浓缩浓染等典型的凋亡特征最明显，并且该组小鼠原位瘤组织Ki-67阳性表达减低，见图3的c。以上结果表明，B@NM、P/B@NM、A/B@NM与P/A/B@NM可以抑制小鼠原位瘤生长，并促进肿瘤细胞凋亡，其中P/A/B@NM的治疗效果最为显著。
通过剥离各组荷瘤小鼠肺脏，并对其计数发现，给予B@NM、P/B@NM、A/B@NM与P/A/B@NM后，小鼠肺肿瘤结节数均减少；相较于B@NM组(15±3个)，P/A/B@NM治疗后，小鼠肺肿瘤结节显著减少，肺转移肿瘤结节数量约为3±2个(P＜0.01)，见图4的a与b。对各组荷瘤小鼠肺脏和肝脏进行病理学分析发现，生理盐水组小鼠肺/肝肿瘤转移病灶数量与面积显著较其他组多，给予B@NM、P/B@NM、A/B@NM与P/A/B@NM后，小鼠肺/肝肿瘤转移病灶减少，尤以P/A/B@NM治疗后转移病灶减少最为明显(见图4的c)，表明P/A/B@NM可以显著抑制荷瘤小鼠原位肿瘤自发性向远端器官肺与肝转移的形成。
3.5阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系对荷瘤小鼠原位肿瘤组织免疫抑制微环境的调控作用
肿瘤免疫抑制微环境是导致三阴性乳腺癌免疫治疗疗效不佳的主要限制因素。小鼠肿瘤组织流式细胞分析结果显示(见图5-图9)，P/A/B@NM组相比生理盐水组Tregs细胞降低了23.4％，MDSCs降低了13.8％，M2-TAMs降低了12.2％，CD8+T细胞增加了9.6％，CD4+T细胞增加了8.2％。相较于B@NM组，P/A/B@NM组Tregs细胞降低了11.7％，MDSCs降低了5.0％，M2-TAMs降低了5.1％，CD8+T细胞增加了5.2％，CD4+T细胞增加了4.5％，且肿瘤组织内免疫抑制因子TGF-β1与IL-10表达水平降低，而INF-γ与IL-2表达水平提高(见图10)，表明荷瘤小鼠经阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系(P/A/B@NM)治疗后，药物可响应肿瘤酸性微环境在肿瘤组织内定点释放，PTX诱导肿瘤细胞凋亡从而促进肿瘤相关抗原释放，AMD3100抑制三阴性乳腺癌组织高表达的CXCR4分子，减少了包括Tregs、MDSCs以及M2-TAMs在内的免疫抑制相关细胞招募至肿瘤内，其与BMS-1协同提高CD8+T细胞浸润与免疫应答，增强三阴性乳腺癌的治疗效果。
从上述结果来看，阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系抑制了小鼠原位肿瘤的增长及肺/肝肿瘤转移灶的形成，此抑制作用与PTX、AMD3100和BMS-1三药联合协同重编程肿瘤免疫抑制微环境提高CD8+T细胞浸润与免疫应答密切相关。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系制备抑制三阴性乳腺癌生长与转移的药物中的应用，其特征在于，所述阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系的制备方法，包括以下步骤：
（1）将酸响应性嵌段共聚物载体与肿瘤化疗药物、CXCR4拮抗剂以及PD-1/PD-L1小分子抑制剂涡旋混合至溶解，构成油相；
（2）将聚乙烯醇置于水中，加热至溶解构成水相；
（3）将所述油相与所述水相在冰浴条件下超声乳化，得到乳液；
（4）将所述乳液离心、弃沉淀，得到纳米体系；
步骤（1）中，所述酸响应性嵌段共聚物载体包括PEG-hdy-PLGA，所述肿瘤化疗药物包括紫杉醇，所述CXCR4拮抗剂包括AMD 3100，所述PD-1/PD-L1小分子抑制剂包括BMS-1；
所述PEG-hdy-PLGA、紫杉醇、AMD 3100和BMS-1的质量比为5:1:1:1；
步骤（2）中，所述聚乙烯醇与水的质量体积比为1g：100mL；
步骤（3）中，所述油相和水相的体积比为1:9；
超声乳化条件为：超声强度65%，超声时间8min。
2.一种阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将酸响应性嵌段共聚物载体与肿瘤化疗药物、CXCR4拮抗剂以及PD-1/PD-L1小分子抑制剂涡旋混合至溶解，构成油相；
（2）将聚乙烯醇置于水中，加热至溶解构成水相；
（3）将所述油相与所述水相在冰浴条件下超声乳化，得到乳液；
（4）将所述乳液离心、弃沉淀，得到纳米体系；
步骤（1）中，所述酸响应性嵌段共聚物载体包括PEG-hdy-PLGA，所述肿瘤化疗药物包括紫杉醇，所述CXCR4拮抗剂包括AMD 3100，所述PD-1/PD-L1小分子抑制剂包括BMS-1；
所述PEG-hdy-PLGA、紫杉醇、AMD 3100和BMS-1的质量比为5:1:1:1。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述聚乙烯醇与水的质量体积比为1g：100mL。
4.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述油相和水相的体积比为1:9；
超声乳化条件为：超声强度65%，超声时间8min。
5.一种阻断CXCR4/PD-L1双信号的三药共递送纳米体系，其特征在于，利用权利要求2-4任一项所述的制备方法制备得到。
6.如权利要求5所述的纳米体系在制备增强三阴性乳腺癌免疫治疗效果的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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MX2017015811A (es) * 2015-06-12 2018-04-10 Squibb Bristol Myers Co Tratamiento de cancer por bloqueo combinado de las trayectorias de señalizacion de muerte programada 1 (pd)-1 y receptor 4 de quimiocina c-x-c(cxcr4).
US20190133998A1 (en) * 2016-04-26 2019-05-09 The General Hospital Corporation Treatment of tumors with inhibitors of cxcl12 signaling and subtherapeutic amounts of chemotherapeutic agents
CN112569206A (zh) * 2019-09-29 2021-03-30 复旦大学 一种具有抗肿瘤转移和靶向功能的白蛋白纳米递药系统及其制备方法
WO2021226762A1 (zh) * 2020-05-09 2021-11-18 王树滨 肿瘤微环境响应型纳米复合载药系统及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙海燕 ; 弓磊 ; 于振涛 ; 潘战宇 ; .髓源性抑制细胞联合免疫检查点抑制剂抗肿瘤治疗的研究进展.肿瘤防治研究.2020,(第09期), *
肿瘤微环境中CXC型趋化因子及其受体的研究进展;薛昭君 等;中国肿瘤生物治疗杂志;第27卷(07);715-724 *

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