CN115461088A - 细菌和噬菌体的生物医学成像 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细菌的非侵入性成像方法。一个实施方案包括用放射性同位素标记细菌，然后将其输送到人或动物的肠道。另一个实施方案是标记噬菌体，然后将它们施用至人或动物，以使得它们感染人或动物中已经定居的细菌(并因此与其共定位)。然后可以对噬菌体进行成像，显示出感兴趣的定居细菌的位置。在另一个实施方案中，本发明更一般地涉及用放射性金属或放射性同位素标记细菌或噬菌体以使标记的肠道细菌和体内的细菌对由功能/结构MRI和/或CT成像引导的核医学PET和SPECT成像可见。在另一个实施方案中，本发明更一般地涉及用放射性金属或放射性同位素标记细菌或噬菌体(两种或仅一种)以使肠道细菌和体内的细菌对由功能/结构MRI和/或CT成像引导的核医学PET和SPECT成像可见，或通过单独的MRI或者其与PET或SPECT的组合可见。
Description
技术领域
本发明涉及细菌的非侵入性成像方法。一个实施方案包括用放射性同位素标记细菌，然后将其输送到人或动物的肠道。另一个实施方案是标记噬菌体，然后将它们施用至人或动物，以使得它们感染人或动物中已经定居的细菌(并因此与其共定位)。然后可以对噬菌体和/或感染的细菌进行成像，显示出感兴趣的定居细菌的位置。在另一个实施方案中，本发明更一般地涉及用放射性同位素(包括但不限于放射性金属)标记细菌或噬菌体，以使标记的细菌和体内的细菌对由功能/结构MRI和/或CT成像引导的核医学PET和SPECT成像可见。在另一个实施方案中，通过MRI信号的变化来检测依赖于锰的细菌。如果这些依赖于锰的细菌也用放射性同位素标记，则可以将PET/SPECT和MRI信号组合以量化受试者内存在的细菌的数量。
背景技术
已知肠道的细菌在人和动物的健康和疾病方面具有重要作用(Swank&Deitch,1996)。对此作用程度的理解受到不能对细菌进行非侵入性且定量的体内成像并且确定其位置、跨过肠屏障的透过性和向身体其他部分的迁移的限制。
活生物体中的细胞或亚细胞事件的非侵入性绘图或分子成像是一个逐步发展且不发达的领域。目前已知的体内成像方法具有多种缺点。
一种这样的成像方法是用报道基因追踪细胞。这一般使用光学平台(比如生物发光、荧光)(Mezzanotte等人，2017)，通过核医学(比如通过追踪胸苷激酶活性)(Boerman等人，2012)或通过磁共振成像(MRI)(比如利用磁小体状纳米粒子)(Goldhawk等人，2009)来进行。
对细菌的体内光学成像一般涉及插入到肠道中的侵入性光检测器和/或代谢底物比如萤光素的施用，其可能不会均匀地分布到转化的细菌中。
还已知核医学成像方法(例如，正电子发射断层扫描，PET；单光子发射计算机断层扫描，SPECT)。然而，目前的核医学成像方法需要放射性示踪剂(例如，有放射性的代谢底物)，并且通常在肠道中产生强的背景信号，其可能遮蔽来自标记细胞的目标信号，并且独立于细菌物种而被细菌吸收(Ordonez等人，2021)。
最近的使用MRI的工作(Donnelly等人，2019)表明，许多共生和泌尿致病性细菌的T2驰豫时间固有地非常短；因此使用产生铁纳米粒子的MRI报道基因(无论它们是内源性的还是外源性的)的进一步缩短可能不导致有效的MRI对比度。在具有非常短T2时间的一些细菌中，存在较大浓度的Mn，其是强顺磁性MRI造影剂。如果将52Mn(5.6天半衰期)加载到这些细菌中，这使得能够通过MRI以及也通过PET检测这些细菌。
因此，以提供对细菌的定量或准确定位(包括物种鉴定)的方式用报道基因对细菌进行成像仍是一个挑战。
另一种已知的体内成像方法是利用静脉内注射的放射性配体对特异性细菌细胞表面标志物进行成像。这种方法对于检测在特定组织中的细菌感染显示出一些希望(Ordonez等人，2017，Hess等人，2018)。然而，这些方法可能不适合于检测肠道中的细菌，因为吞下的放射性配体可能导致高的肠背景放射信号，这会遮蔽来自细菌的信号。
另一种已知的体内成像方法是在摄入之前直接标记细菌，这可以使得能够追踪细菌。通过MRI使用氧化铁粒子(例如超顺磁性氧化铁(SPIO)粒子)(Shan，2011)的示踪可以成功地追踪注射的哺乳动物细胞；然而，追踪细菌是更有挑战性的，因为标记更有挑战性，并且即使能够标记细菌，考虑到基线细菌R2驰豫率通常已经较高，标记可能不会充分地改变R2驰豫性。
铁标记对于哺乳动物细胞示踪一直是有效的，但是对于许多细菌物种可能不是有效的。这是因为被称为T2的铁敏感MRI量度在许多细菌中固有地较短，不同于大部分哺乳动物细胞中的T2(Sengupta等人，2014)。注意，横向驰豫率R2是驰豫时间T2的倒数。因此，较短的T2导致较大的R2。
因此，仍需要对肠道微生物区系进行非侵入性、选择性且定量的成像。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种对受试者中的微生物区系进行成像的方法，所述方法包括：用放射性同位素标记细菌或噬菌体；将放射性同位素标记的细菌或噬菌体引入到所述受试者中；以及对所述受试者进行功能和/或结构成像。
在一些实施方案中，所述标记是对细菌、例如肠道细菌的标记。
在一些实施方案中，所述方法还包括在标记之前从所述受试者的粪便物中分离所述肠道细菌。
在一些实施方案中，其中标记肠道细菌，并且所述肠道细菌包括卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ATCC33820。
在一些实施方案中，所述方法还包括在将放射性同位素标记的肠道细菌引入到所述受试者中之前将其混入粪便物中。
在一些实施方案中，引入所述放射性同位素标记的细菌包括：所述受试者对所述放射性同位素标记的细菌的摄入，或通过静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、皮下或腔内施用将所述放射性同位素标记的细菌施用到所述受试者中。
在一些实施方案中，引入所述放射性同位素标记的肠道细菌包括将所述放射性同位素标记的肠道细菌放入所述受试者的十二指肠中。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是89Zr、64Cu或52Mn。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是89Zr，并且用包含89Zr-去铁敏(desferrioxamine)-NCS(89Zr-DBN)的标记试剂标记所述细菌。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是52Mn。
在一些实施方案中，所述成像包括同时的正电子发射断层扫描(PET)成像和磁共振成像(MRI)。
在一些实施方案中，所述成像包括依次的正电子发射断层扫描(PET)成像和磁共振成像(MRI)。
在一些实施方案中，所述成像包括正电子发射断层扫描(PET)成像和计算机断层扫描(CT)成像。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是111In、177Lu或225Ac。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是111In，并且用包含111In-DOTA-NHS的标记试剂标记所述细菌。
在一些实施方案中，所述成像包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和磁共振成像(MRI)，任选地同时包括。
在一些实施方案中，所述成像包括依次的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和磁共振成像(MRI)。
在一些实施方案中，所述成像包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和计算机断层扫描(CT)成像。
在一些实施方案中，所述成像包括在施用标记物后的前12小时，每2小时对受试者进行成像。
在一些实施方案中，所述成像包括每2小时对所述受试者进行成像30分钟。
在一些实施方案中，所述成像还包括在最初的12小时后，大约每个放射性同位素物理(或生物)半衰期对所述受试者进行一次成像，直到在所述受试者中不再检测到所述放射性同位素。
在一些实施方案中，所述标记是对噬菌体的标记。
在一些实施方案中，所述噬菌体由于其感染待成像的细菌的能力而被选择。
在一些实施方案中，所述噬菌体由于其对待成像的细菌的特异性而被选择。
在一些实施方案中，所述噬菌体选自LH01-肌尾噬菌体科(Myoviridae)、LL5-长尾噬菌体科(Siphoviridae)、T4D-肌尾噬菌体科(Myoviridae)和LL12-肌尾噬菌体科(Myoviridae)，并且待成像的细菌是大肠杆菌(E.Coli)。
在一些实施方案中，所述噬菌体是肠道噬菌体。
在一些实施方案中，所述方法包括在标记之前从所述受试者的粪便物中分离所述肠道噬菌体。
在一些实施方案中，所述方法还包括在将所述放射性同位素标记的噬菌体或细菌引入到所述受试者中之前将其混入粪便物中。
在一些实施方案中，引入所述放射性同位素标记的噬菌体包括所述受试者对所述放射性同位素标记的噬菌体的摄入，或将所述放射性同位素标记的噬菌体移植到所述受试者中。
在一些实施方案中，将放射性同位素标记的噬菌体静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、皮下或腔内施用到所述受试者中。
在一些实施方案中，引入所述放射性同位素标记的肠道噬菌体包括将所述放射性同位素标记的肠道噬菌体放入所述受试者的十二指肠中。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是89Zr、64Cu或52Mn。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是89Zr，并且用包含89Zr-去铁敏-NCS(89Zr-DBN)的标记试剂标记所述噬菌体。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是52Mn。
在一些实施方案中，所述成像包括同时的正电子发射断层扫描(PET)成像和磁共振成像(MRI)。
在一些实施方案中，所述成像包括依次的正电子发射断层扫描(PET)成像和磁共振成像(MRI)。
在一些实施方案中，所述成像包括正电子发射断层扫描(PET)成像和计算机断层扫描(CT)成像。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是111In、177Lu或225Ac。
在一些实施方案中，所述放射性同位素是111In，并且用包含111In-DOTA-NHS的标记试剂标记所述噬菌体。
在一些实施方案中，所述成像包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和磁共振成像(MRI)，任选地同时包括。
在一些实施方案中，所述成像包括依次的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和磁共振成像(MRI)。
在一些实施方案中，所述成像包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和计算机断层扫描(CT)成像。
在一些实施方案中，所述成像包括在施用标记物后的前12小时，每2小时对受试者进行成像。
在一些实施方案中，所述成像包括每2小时对所述受试者进行成像30分钟。
在一些实施方案中，所述成像还包括在最初的12小时后，大约每个放射性同位素物理(或生物)半衰期对所述受试者进行一次成像，直到在所述受试者中不再检测到所述放射性同位素。
根据本发明的另一个方面，提供了一种对受试者中的微生物区系进行定量3D成像的方法，所述方法包括：用放射性同位素标记细菌、病毒、噬菌体或其他微生物；将放射性同位素标记的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物引入到所述受试者中；对所述受试者进行功能和/或结构成像；确定来自所述受试者的生物样品的放射性；以及将所述生物样品的放射性与图像进行映射以产生细菌、病毒、噬菌体或其他微生物分布的定量3D图像。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入所述放射性同位素标记的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物之前从所述受试者收集生物样品。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入所述放射性同位素标记的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物之后，确定所述生物样品的放射性和每个细菌细胞、病毒、噬菌体或其他微生物的放射性同位素标记物的平均数。
在一些实施方案中，使用经校准的放射性计数检测器来确定所述生物样品的放射性。
在一些实施方案中，所述方法还包括将由所述成像得到的一个或多个图像与每个细菌细胞、病毒、噬菌体或其他微生物的放射性组合以产生每体素的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物的数量的3D图像。
在一些实施方案中，所述生物样品是粪便样品，并且成像的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物分别是肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物。
在一些实施方案中，所述方法还包括分割所产生的3D图像以鉴定所述受试者的肠道，并且确定在所述受试者肠道中的放射性同位素标记的肠道微生物区系的数量和位置。
在一些实施方案中，所述生物样品是尿液样品、血液样品和唾液样品中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述方法还包括分割所产生的3D图像以鉴定所述受试者的肠道外部的感兴趣区，并且确定在所述感兴趣区中的放射性同位素标记的微生物区系的数量和位置。
在一些实施方案中，使用以下各项分析所述生物样品以确定存在的细菌的种类和/或数量：a)新一代测序，和/或b)NMR驰豫法，其中将所述生物样品置于慢速水交换中。
在一些实施方案中，所述方法还包括将细菌的数量和种类与由所述成像得到的一个或多个图像组合以确定所述生物样品中的所述细菌、病毒、噬菌体或其他微生物的放射性和每个细菌的放射性。
根据本发明的另一个方面，提供了一种对受试者的肠道中的微生物区系进行成像的方法，所述方法包括：用放射性同位素标记肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物；将放射性同位素标记的肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物引入到所述受试者中；以及对所述受试者进行功能和/或结构成像。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述受试者或其他受试者的粪便物中分离所述肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物。
在一些实施方案中，所述方法还包括在引入到所述受试者中之前将所述放射性同位素标记的肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物混入粪便物中。
在一些实施方案中，所述标记是对细菌的标记，并且其中对所述受试者进行功能和/或结构成像提供第一图像，在对所述受试者进行功能和/或结构成像之后，所述方法还包括：选择对标记的细菌具有特异性的噬菌体，并且将所述噬菌体施用至所述受试者；第二次对所述受试者进行功能和/或结构成像以提供第二图像；比较所述第一图像和所述第二图像，其中所述第一图像和所述第二图像之间的区别指示所述细菌的位置。
在一些实施方案中，所述标记是对噬菌体的标记，并且其中对所述受试者进行功能和/或结构成像提供第二图像，在用所述同位素标记所述噬菌体之前，所述方法还包括：将细菌引入到所述受试者中；其中所述噬菌体由于其对所述细菌的特异性而被选择。
根据本发明的另一个方面，提供了一种对受试者中的微生物区系进行成像的方法，所述方法包括：对所述受试者进行功能和/或结构成像以得到第一图像；将依赖于锰的细菌引入到所述受试者中；以及再次对所述受试者进行功能和/或结构成像以得到第二图像；比较所述第一图像和所述第二图像，其中成像的变化指明所述细菌的位置。
在一些实施方案中，在引入到所述受试者中之前，将所述依赖于锰的细菌与粪便物混合。
在一些实施方案中，所述功能和/或结构成像通过MRI进行，并且所述第一图像和所述第二图像是R2/R2*图像。
在下文中将会描述本发明的另外的特征和优点，其形成本发明的权利要求的主题。本领域技术人员应理解，本文所公开的具体实施方案可以容易地用作改进或设计用于实现本发明的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应意识到，这种等同结构不背离本发明的范围。在结合附图考虑时，根据以下描述，将更好地理解在其组织和操作方法两方面被认为是本发明的特征的新特征，连同其他目的和优点。然而，应明确地理解，附图中的每幅都仅提供用于举例说明和描述的目的，并且不打算作为对本发明的范围的限定。
附图说明
图1是列出一种用于对受试者中的细菌(例如肠道细菌)进行成像的示例性方法的步骤的流程图；
图2是列出另一种用于对受试者中的细菌(例如肠道细菌)进行成像的示例性方法的步骤的流程图；
图3是列出一种用于对受试者中的噬菌体进行成像的示例性方法的步骤的流程图；
图4是列出一种用于对受试者中的依赖于锰的细菌进行成像的示例性方法的步骤的流程图；
图5是列出一种用于对受试者中的噬菌体特异性细菌进行成像的示例性方法的步骤的流程图；
图6是列出一种用于对受试者中的噬菌体特异性细菌进行成像的示例性方法的步骤的流程图；
图7是列出一种用于对受试者中的细菌分布进行3D成像的示例性方法的步骤的流程图；
图8是列出一种用于使用粪便物对受试者中的微生物区系进行成像的示例性方法的步骤的流程图；
图9以示意图的形式示出了一种MRI明胶模体(phantom)。
图10示出了卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ATCC33820在明胶/PBS中的系列稀释后的R2和R2*。
图11示出了含有系列稀释的卷曲乳酸杆菌(L.Crispatus)ATCC33820的明胶模体的PET/MRI。
图12示出了通过对细菌(卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ATCC33820)的89Zr-DBN标记检测的细胞数量和样品中的活细胞数量之间的关系。
图13显示，在卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)ATCC33820中R2和89Zr活性强烈相关。
图14示出了不同细菌的核磁共振信号。标有*的对在统计学上显著不同。
图15提供了关于另外的物种大肠杆菌(E.coli)(益生菌，共生和泌尿致病性)的数据。
图16是示出89Zr放射性标记随着时间对细菌生存力的影响的图。
图17A和17B示出了放射性标记的大肠杆菌(E.coli)Nissle中的89Zr稳定性。(图17A：9-72小时的时间点；图17B：7-24天的时间点)
图18图像利用单独的PET最大强度投影(MIP)(在右侧)和叠合到MRI的这些(冠状T1加权同相Dixon，在左侧)示出了猪摄入的89Zr标记的细菌(大肠杆菌(E.coli)Nissle，益生菌)。
图19示出了一种用于涵盖三组动物中的细菌移动的成像时间轴。
图20示出了在89Zr标记的益生菌的摄入后第4天的猪的PET/MRI分割。
图21示出了摄入的89Zr标记的细菌对动物(猪)中的特异性位点的定位。
图22示出了一种用于噬菌体制备和放射性标记的示例性工作流程。
图23(a)示出了来自用89Zr磷酸盐静脉内注射的狗的PET成像的最大强度投影；图23(b)示出了作为在所述注射后的时间的函数的89Zr的特异性吸收值。
图24示出了在放射性标记的大肠杆菌(E.coli)Nissle的摄入后第7天，猪的肢体中的89Zr的显现。
图25示出了在放射性标记的大肠杆菌(E.coli)Nissle的摄入后第7天，89Zr-DBN在猪中的生物分布。
图26示出了卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)和膀胱细胞的混合物中的R2*和R2。将培养的细胞系列稀释；固定在明胶模体中；并且通过MRI在3T下进行分析。该图比较了R2(圆形)和R2*(三角形)。蓝色符号表示在单独的明胶中稀释的卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)ATCC33820；红色符号表示卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)和5637膀胱细胞的混合样品。各线证明了在每个样品类型和MR量度内的线性回归(对于所有皮尔逊相关系数，r2>0.91)。无论是在明胶中还是在膀胱细胞中稀释，活卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)(CFU)的分数(f)与横向驰豫性强烈正相关。在膀胱细胞混合物中，R2而不是R2*驰豫性衰减，导致显著的R2′分量(Donnelly S.(2020))。
图27示出了P4P噬菌体中的89Zr-DBN稳定性。
具体实施方式
本发明涉及用放射性同位素示踪剂(比如正电子发射断层扫描(PET)标记物89Zr-DBN)标记微生物区系(例如，细菌、酵母菌或噬菌体)，所述放射性同位素示踪剂共价结合至与细胞表面蛋白相关的胺基。具体地，本发明涉及放射性标记这些细胞用于核成像，同时将微生物(例如细菌)的内源性对比用于另外的通过MRI的细胞示踪。因此，本发明特别好地适合于利用混合型PET/MRI的成像。在另一个实施方案中，可以用52Mn标记细菌，使得能够通过依赖于锰的细菌的PET进行检测。也可以使用其他放射性标记物。
在一个实施方案中，公开了一种直接地(例如，使用89Zr-DBN或52Mn或111In)对细菌进行成像的方法，或通过以下方式间接地对细菌进行成像的方法：(例如，用89Zr-DBN)标记已知感染感兴趣的细菌的噬菌体，使那些噬菌体与感兴趣的细菌接触，并且使用PET/MRI和PET/CT对细菌进行成像，因为它们将与标记的噬菌体共定位。在一个推论实施方案中，当未标记的噬菌体发现并且感染并且溶解放射性标记的细菌时，它们可以用于衰减放射性信号。
89Zr的半衰期为3.3天；现有技术已经表明，如果具有良好的89Zr从背景的清除，则将89Zr磷酸盐静脉内注射到狗中已经显示出20天的可接受的骨可视化(参见图20，来自Thiessen等人，2017)。52Mn同位素的半衰期为5.6天，并且被预测为检测细菌甚至更长时间，并且可能在依赖于锰的细菌中甚至更有效。
如Thiessen等人中所述，图20示出了狗中的通过PET/MRI对89Zr磷酸盐的纵向成像。图像a)示出了从第0天到第16天的最大强度投影(MIP)的冠状图(上部)和矢状图(下部)。PET/MRI提供了额外的解剖学信息。为了参考，用箭头标出肾。图像b)示出了不同区域中的平均标准摄取值(SUV)在第8天相对稳定，当在第8-16天内进行平均时，肝、肺和肾中的SUV为～3，而骨中的SUV为～10。
在目前的方法中，优选地，在引入到宿主中之前标记细菌或噬菌体。标记(以及洗涤和分离标记的细菌/噬菌体)导致可忽略的背景放射。每个细菌的活度的校准可以通过分析在摄入标记的细菌后排出的粪便物来确定，因为信号即每个细菌细胞的89Zr浓度将随着细菌增殖而稀释。图18示出了在6小时、4天和7天的标记的细菌(大肠杆菌(E.coli)Nissle)在肠道中的3-D分布。
已经发现，许多细菌的自旋-自旋驰豫率(也被称为横向驰豫率且表示为R2)远大于哺乳动物软组织的自旋-自旋驰豫率，这在因为在选择的细菌细胞中的锰的高浓度。哺乳动物软组织中的典型R2值在20s-1的量级，而不同细菌物种的R2可以高达300s-1。考虑到细菌占粪便干质量的多达60％，可以使用具有高R2值的细菌来产生肠道的MRI图像，具有足够的信噪比以使得能够对位于肠道中的细菌进行3D辨别。由气穴造成的磁敏感伪影通过将MRI与放射性标记的细菌的PET图像叠合来区分。
已经发现，确定具有高R2的特定细菌物种由于具有较低R2值的细菌(其提高了背景信号)的存在有时可能是困难的，并且肠道中的细菌和含水流体一般可能处于快速水交换中，特别是对于具有较短的R2/R2*值的细菌。
已经发现，当具有高R2值(300s-1的量级)的细菌占感兴趣区中的细菌种群的至少约25％时，则即使处于快速交换中，也可以通过R2成像容易地且选择性地检测和识别这些细菌。如以下更详细讨论的图7所示，当“高R2”细菌的贡献稀释1/4时，所得R2值为大约80s-1；已经发现这对于通过R2成像选择性检测和识别细菌来说绰绰有余。
粪便样品或其他生物试样比如唾液、尿液或血液中的细菌的识别可以使用以下各项来确定和定量：a)标准细菌学方法，比如新一代测序，和/或b)当可以处理粪便物(或其他生物样品)以使各细菌菌株处于慢速水交换中时，通过NMR驰豫法。因此，如果具有不同R2值的不同细菌处于快速交换中时，则仅可以测量R2的加权平均值，即仅可以测量一个不同的R2值。然而，如果具有不同R2值的细菌处于慢速交换中时，则可以测量各个R2值。例如，图11中的数据显示，格氏乳酸菌(Lactobacillus gasseri)ATCC33323与金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Newman由于它们的R2值不同而可以相当容易地区分。
本发明还涉及对噬菌体的标记。例如，此成像可以用于理解噬菌体对于治疗毒性细菌的作用(Hampton等人，2020；Cisek等人，2017)。另外，可以将标记的噬菌体施用到生物体中以确定特异于标记且引入的噬菌体物种的细菌物种的存在。
根据另一个方面，本发明涉及确定在用活细菌处理后的移植的程度和持久性。
图1至6示出了用于使用89Zr和111In-DBN作为放射性同位素对受试者中的微生物区系(例如，肠道细菌)进行成像，并且特别地对在小动物、大动物和人类的整个体内的细菌浓度进行成像(直接地使用放射性同位素标记的细菌，间接地使用放射性同位素标记的噬菌体与放射性标记的细菌或与未放射性标记的细菌，使用未放射性标记的噬菌体与放射性标记的细菌或对放射性标记和未放射性标记的依赖于锰的细菌的MRI检测)的示例性方法100、200、300、400、500和600。图1至7以实线矩形示出了必要步骤，并且以虚线矩形示出了任选的(尽管通常优选的)步骤。
在图1中，在102处，可以从粪便物或非粪便物中分离细菌。例如，这样的细菌可以是肠道细菌，或者可以是可商购获得的细菌，比如益生菌补品。这样的细菌的一个实例是卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)，比如菌株ATCC33820。应理解，可以使用好氧细菌和厌氧细菌的其他菌株。尽管示出了从粪便物中分离，但是此方法同样可以应用于来自其他来源的可以分离和标记的细菌菌株，比如用于益生菌、食品、动物或环境用途的那些。
细菌物种的实例包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)、普氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、阿克曼菌属(Akkermansia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、埃希菌属(Escherichia)、毛螺菌属(Lachnospiracae)、布劳特氏菌属(Blautia)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、多尔氏菌属(Dorea)、罗氏菌属(Roseburia)和粪杆菌属(Faecalibacterium)的其他成员。例如，可用于本发明方法中的标记的细菌的实例包括卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)(比如卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)ATCC33820)、大肠杆菌(E.coli)(比如大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)MG1655、大肠杆菌(E.coli)Nissle、大肠杆菌(E.coli)25922、大肠杆菌(E.coli)67、大肠杆菌(E.coli)AD110、大肠杆菌(E.coli)GR-12、大肠杆菌(E.coli)536、大肠杆菌(E.coli)J96)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(比如粪肠球菌(E.faecalis)ATCC33186)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(比如肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)280)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)(比如奇异变形杆菌(P.mirabilis)296)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(比如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PA01)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(比如金黄色葡萄球菌(S.aureus)Neuman和金黄色葡萄球菌(S.aureus)USA300)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(比如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)ATCC35984)、格氏乳杆菌(L.gasseri)(比如格氏乳杆菌(L.gasseri)ATCC33323)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)(比如罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)RC14)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)(比如鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GR-1)。
在104处，用可以使用PET或SPECT成像的放射性同位素标记分离出的细菌。在一个示例性实施方案中，在106处，可以通过调整公布的程序(Bansal等人，2015)，使用标记试剂89Zr-去铁敏-NCS(89Zr-DBN)，用放射性同位素89Zr标记卷曲乳酸杆菌(Lactobacilluscrispatus)ATCC33820细菌。
首先在溶液比如磷酸氢锆溶液89Zr(HPO4)2中分离放射性同位素比如89Zr。然后使用DFO-Bz-NCS螯合放射性同位素以形成标记试剂，比如89Zr-DBN。89Zr-DBN是第一代原型标记试剂。89Zr与DBN的螯合改编自Bansal等人。DFO部分是DBN的螯合端。异硫氰酸酯基-苄基是共价结合在细胞表面找到的蛋白质上的伯胺的缀合部分。然后可以使用去铁敏(DFO)或改进的螯合剂(Bhatt等人，2018；Berg等人，2020)作为用于锆原子的螯合剂。DFO与对异硫氰酸酯基-苄基或改进的缀合剂(Berg等人，2020)缀合以得到生成的89Zr-去铁敏-NCS，或89Zr-DBN。
备选地，并不制备89Zr-DBN或其前体89Zr(HPO4)2，而是它们可以简单地由第三方购得，包括选择回旋加速器和放射化学设施，在那里它们可以容易地商购获得。
然后将分离出的细菌与89Zr标记试剂(例如，89Zr-DBN)组合并且温育。在温育期间，89Zr-DFO-标记的试剂与分离出的细菌的细胞表面蛋白的伯胺共价结合，因此，随机地用放射性同位素标记细菌的外部细胞表面。
然后，在108处，将放射性同位素标记的细菌与未结合89Zr分离。例如，可以通过离心“洗涤”样品以从放射性标记的细菌沉淀中去除保留在上清液中的未结合放射性示踪剂。
在哺乳动物细胞中，已经证明高达0.5Bq/细胞的放射性是安全的。因为细菌远小于哺乳动物细胞，在表面积方面大约为其100分之一，所以可以将每个细菌细胞的目标放射性水平降低至大约0.005Bq/细胞。随着细菌尺寸变化，当已知尺寸时，更好的计算会是0.5Bg/细胞乘以细菌表面积与10微米球体面积的比率。
任选地，在109处，在施用被称为粪便微生物群移植(FMT)的已知微生物疗法中，在将经洗涤的放射性同位素标记的细菌引入到受试者中之前，可以将其混入到受体粪便物中。这可以使得能够对FMT细菌进行成像，例如，有助于确定移植和疗法的有效性。
在110处，将放射性同位素标记的细菌引入到受试者中。在一些应用中，使用饲管将放射性标记的细菌细胞或粪便微生物群移植到受试者的十二指肠中。放射性标记的细菌细胞可以是在食用的益生菌产品(图18)或发酵食品中的细菌。在其他应用中，放射性标记的细菌细胞被受试者简单吞下或以其他方式摄入。
然后，在112处，对受试者进行成像。成像可以包括正电子发射断层扫描(PET)成像、磁共振成像(MRI)或X射线计算机断层扫描(CT)成像。利用PET、MRI和CT的成像可以同时进行(参见图11)或依次进行，并且方法100可以包括一轮或多轮成像。同样，可以对肠道、肠道附近的周围区域或整个受试者进行成像。在一些示例性实施方案中，在113处，能够确定细菌通过肠道的时间通过，以及移植、肠道透过性和/或迁移。在一些示例性实施方案中，在114处，对受试者的功能和结构成像包括局部或全身SPECT成像和/或MRI/CT成像。
特别地，图11示出了含有系列稀释的卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)菌株ATCC33820的孔的明胶模体的同时PET/MRI。图像a)示出了来自在单个图像内共同叠合的3D PET和MRI数据集的片。根据各自的PET(b)和MRI(c)数据集，限定了感兴趣区(ROI)(d)。关于PET分析，确定了重复样品的ROI的平均值。样品编号对应于各系列稀释，并且包括塑料夹(11)和背景(12)。
在114处，在移植或摄入放射性同位素标记的细菌后，受试者可以在12小时内每2小时进行PET/MRI达30分钟。随后，可以进一步每4天进行成像，直到89Zr不再可检测到。可以进行重复成像直到大约4周，这取决于与个体受试者相关的肠道动力、细菌在体内的持久性和放射性同位素的半衰期。将MRI和/或CT与放射性核素成像组合使得能够将分割的3D MRI或CT图像用于分割PET图像。关于通过MRI或CT图像对PET图像的适当分割，优选的是在PET和MRI/CT数据获取之间，肠道动力较低。在动物研究中，麻醉将会降低肠道动力，而在人类中，在MRI检查期间一般使用如丁溴东莨菪碱的药物来降低肠道动力。
在备选的应用中，受试者可以进行PET/MRI成像，或者进行PET/CT成像，然后进行MRI。对受试者的成像的频率和长度也可以不同于在12小时内每2小时30分钟，并且可以不同于随后每4天进行直到89Zr不再可检测到。例如，可以每个放射性同位素物理(或生物)半衰期进行一次成像，比如对于89Zr来说每3.3天进行一次，直到89Zr不再可检测到。
用例如89Zr-DBN标记细菌然后进行PET/MRI使得能够确定引入的细菌在肠道中的移植，细菌自肠道离开的透过性，然后是细菌向体内不同位置的迁移。
尽管已经将方法100描述为用89Zr作为放射性同位素，但是可以备选地使用其他金属类正电子放射性同位素，如例如52Mn(具有5.5天的半衰期)。同样，可以使用单光子放射性同位素，例如111ln(2.8天的半衰期)。另外，可以使用重金属放射性同位素比如177Lu(β发射体和单光子发射体，6.6天的半衰期)和225Ac(α发射体和单光子发射体，10天的半衰期)来标记细菌。
图2示出了另一种用于使用111In作为放射性同位素对受试者中的微生物区系例如肠道细菌进行成像，并且特别地对在小动物、大动物和人类的整个体内的细菌浓度进行成像的示例性方法200。
在202处，可以从粪便物或非粪便物中分离细菌(比如肠道细菌)。例如，可以使用可商购获得的细菌。这样的细菌的一个实例是卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ATCC33820。
在204处，用放射性同位素或核医学示踪剂标记分离出的细菌。在一个示例性实施方案中，在206处，用与十二烷-四乙酸(DOTA)螯合并且通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)键与细胞表面蛋白共价结合的放射性同位素111In(111In-DOTA-NHS)标记卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ATCC33820细菌，并且使用SPECT对其进行成像。可以备选地使用其他已知的金属类单光子发射放射性同位素。
然后将分离出的细菌与111In-DOTA-NHS组合，并且温育。在它们的温育期间，111In标记的试剂与分离出的细菌的细胞表面蛋白的伯胺共价结合，因此，随机地用放射性同位素标记细菌。
然后，在208处，洗涤放射性同位素标记的细菌以去除未结合放射性示踪剂。任选地，在209处，在将经洗涤的放射性同位素标记的细菌引入到受试者中之前，可以将其混入受体粪便物中。
在210处，将放射性同位素标记的细菌引入到受试者中。放射性标记的细菌细胞或粪便微生物区系可以口服施用(例如，通过胶囊)，或者经由鼻饲或鼻-十二指肠管或者经由直肠灌肠或结肠镜来施用。在阴道微生物区系移植的情况下(Lev-Sagie等人，2019)，可以将放射性标记的细菌移植到阴道中。
然后，在212处，对受试者进行成像。在此实施方案中，放射性同位素成像可以包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像，而不是正电子发射断层扫描(PET)成像。确定放射性图像的解剖学位置可以涉及磁共振成像(MRI)或X射线计算机断层扫描(CT)成像。放射性同位素、MRI和/或CT成像可以同时或依次进行，并且方法200可以包括一轮或多轮成像。同样，可以对受试者的肠道和/或肠道附近的周围区域二者进行成像，或者可以对整个受试者进行成像。利用这样的成像，在一些示例性实施方案中，在213处，能够确定细菌通过肠道的时间通过，以及移植、肠道透过性和/或迁移。在一些示例性实施方案中，在214处，对受试者的功能和结构成像包括局部或全身SPECT成像和/或MRI/CT成像。
例如，在214处，在移植或摄入111In标记的肠道细菌或噬菌体后，受试者可以在12小时内每2小时进行SPECT或SPECT/MRI或SPECT/CT达30分钟。随后，可以进一步每4天进行成像，直到111In不再可检测到。将放射性同位素和解剖学成像组合允许将3D MRI图像和/或3D CT图像分割并且用于分割SPECT图像。X射线CT和MRI图像将使得能够根据解剖学位置分割SPECT图像。在成像期的期间或之间的肠道动力的校正可以是有用的或者需要的。
在备选的应用中，受试者可以进行SPECT/MRI成像，或者进行SPECT/CT成像，然后进行MRI。对受试者的成像的频率和长度也可以不同于在12小时内每2小时30分钟，并且可以不同于随后每4天进行。例如，可以每111In物理(或生物)半衰期进行一次成像，比如每2.8天进行一次，直到111In不再可检测到。
尽管已经关于使用放射性标记的细菌对细菌进行成像描述了方法100和200，但是可以使用其他微生物包括噬菌体间接地对受试者的细菌进行成像。噬菌体是在细菌和古菌内感染和复制的病毒。它们可以用于控制/杀死引起疾病的致病菌。与许多抗体不同，大部分噬菌体对于细菌宿主非常有特异性。特异性可以用于确定细菌的特定物种的存在。
图3示出了另一种用于使用噬菌体对受试者中的肠道微生物区系进行成像，并且特别地对在小动物、大动物和人类的整个体内的细菌浓度进行成像的示例性方法300。
任选地，如在302处所示，可以从粪便物中分离噬菌体，并且噬菌体可以包括对肠道细菌具有特异性的噬菌体。然而，更典型地，噬菌体是培养的或商购的。噬菌体可以基于其对要成像的特定所需形式的细菌的选择性进行选择。还可以使用噬菌体(比如基因改造的噬菌体)，并且基于其生命周期进行选择。例如，可以将具有在宿主细菌内复制而不是溶解宿主细菌的倾向的噬菌体用于特定应用。备选地，可以选择具有复制和溶解宿主细菌的倾向的噬菌体用于其他应用。在特定应用中可以采用对于感染非常窄的细菌选择具有特异性的噬菌体，而根据成像和/或研究的目标，可以采用具有更宽范围的感染的噬菌体。
这样的噬菌体的一个实例是对肠道细菌具有特异性的噬菌体。当然，备选地且通常优选地，噬菌体可以代替地从其他来源分离，或商购获得。噬菌体可以由于其对感兴趣的细菌的特异性而被选择。
噬菌体的实例包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体LH01-肌尾噬菌体(Myoviridae)、LL5-长尾噬菌体(Siphoviridae)、T4D-肌尾噬菌体(Myoviridae)和LL12-肌尾噬菌体(Myoviridae)。噬菌体是在存在细菌的任何地方找到的普遍存在的病毒。估计在这个星球上存在超过1031个噬菌体，超过地球上所有其他生物(包括细菌)的总数。
在304处，用放射性同位素、例如PET或SPECT中使用的核医学放射性示踪剂标记噬菌体。在一个示例性实施方案中，在306处，用如以上在方法100中所述的89Zr-DBN标记噬菌体。备选地，用如以上在方法200中所述的111In-DOTA-NHS标记噬菌体。
然后，在308处，洗涤/纯化放射性同位素标记的噬菌体以去除未结合放射性示踪剂。任选地，在309处，在将经洗涤的放射性同位素标记的噬菌体引入到受试者中之前，可以将其混入受体粪便物中。
在310处，将放射性同位素标记的噬菌体引入到受试者的肠道中。放射性标记的噬菌体或粪便微生物区系可以口服施用(例如，通过胶囊)，或者经由鼻饲或鼻-十二指肠管或者经由直肠灌肠或结肠镜来施用。备选地，在311处，如果不与粪便物混合，则标记的噬菌体可以静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、皮下或腔内施用。由于噬菌体的性质，放射性标记的噬菌体将自然地随着时间感染受试者内的其针对的宿主细菌，因此与该宿主细菌共定位，并且在该宿主细菌内复制。
如上所述，在哺乳动物细胞中，已经证明高达0.5Bq/细胞的放射性是安全的。因为细菌远小于哺乳动物细胞，在表面积方面大约为其100分之一，所以可以将每个细菌细胞的目标放射性水平降低至大约0.005Bq/细胞。因为噬菌体小于细菌细胞(分别为20至200nmvs 400nm以上)，所以每个噬菌体的目标放射性水平应主要与表面积线性地成比例。然而，甚至小的噬菌体(例如约20nm)也可以充分地标记，因为即使Bq/噬菌体将会以大约1×10-4进行标记，也会使用大的量。
然后，在312处，对受试者进行成像。成像可以包括正电子发射断层扫描(PET)成像、磁共振成像(MRI)或X射线计算机断层扫描(CT)成像。利用PET、MRI和CT的成像可以同时进行(参见图5)或依次进行，并且方法300可以包括一轮或多轮成像。同样，可以对肠道和/或肠道附近的周围区域和/或整个受试者进行成像。在一些示例性实施方案中，在314处，对受试者或其一部分的功能和结构成像包括局部或全身PET成像和/或MRI/CT成像。
例如，如果摄入对细菌具有特异性的89Zr-DBN标记的噬菌体，如果细菌存在于肠道中，则来自噬菌体的PET信号可以解释为指明肠道细菌的位置和存在。在另一个实施方案中，如果标记的噬菌体静脉内地沉积在体内，则来自噬菌体的PET信号可以解释为指明细菌在体内的组织或流体中的存在和位置。
在备选的应用中，例如使用111In-DOTA-NHS，受试者可以进行SPECT/MRI成像，或者进行SPECT/CT成像，然后进行MRI。对受试者的成像的频率和长度也可以不同于在12小时内每2小时30分钟，并且可以不同于随后每4天进行。例如，成像可以每个89Zr物理(或生物)半衰期进行一次。
图4示出了一个备选实施方案–一种用于对受试者中的依赖于锰的细菌进行成像的方法。
在402处，可以从粪便物或非粪便物中分离依赖于锰的细菌。例如，这样的细菌可以是肠道细菌，或者可以是可商购获得的细菌，比如益生菌补品。
与示例100-300不同，不用放射性同位素或核医学示踪剂标记分离出的细菌。代替地，利用其锰水平进行成像。
在404处，在施用被称为粪便微生物群移植(FMT)的已知微生物疗法中，在将依赖于锰的细菌引入到受试者中之前，将其混入到受体粪便物中。这可以使得能够对FMT细菌进行成像，例如，有助于确定移植的有效性。
在406处，在将依赖于锰的细菌引入到受试者的肠道中之前，进行受试者的MRI以产生R2/R2*的第一3D图像。然后，在408处，将具有依赖于锰的细菌的粪便物引入到受试者中。在一些应用中，使用饲管将细菌细胞或粪便微生物群移植到受试者的十二指肠中。依赖于锰的细菌可以是在食用的益生菌产品或发酵食品中的细菌。在其他应用中，细菌被受试者简单吞下或以其他方式摄入。
然后，在410处，再次对受试者进行成像以产生R2/R2*的第二3D图像。
在412处，比较两个图像，并且成像的区别对应于引入到受试者中的依赖于锰的细菌的位置。
另一种比较成像方法在图5中示出，并且是示例性方法500。
在502处，可以从粪便物或非粪便物中分离细菌。例如，这样的细菌可以是肠道细菌，或者可以是可商购获得的细菌，比如益生菌补品。这样的肠道细菌的一个实例是卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)，比如菌株ATCC33820。应理解，可以使用好氧细菌和厌氧细菌的其他菌株。尽管示出了从粪便物中分离，但是此方法同样可以应用于来自其他来源的可以分离和标记的细菌菌株，比如用于益生菌、食品、动物或环境用途的那些。
细菌物种的实例包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)、普氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、阿克曼菌属(Akkermansia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、埃希菌属(Escherichia)、毛螺菌属(Lachnospiracae)、布劳特氏菌属(Blautia)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、多尔氏菌属(Dorea)、罗氏菌属(Roseburia)和粪杆菌属(Faecalibacterium)的其他成员。例如，可用于本发明方法中的标记的肠道细菌的实例包括卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)(比如卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)ATCC33820)、大肠杆菌(E.coli)(比如大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)MG1655、大肠杆菌(E.coli)Nissle、大肠杆菌(E.coli)25922、大肠杆菌(E.coli)67、大肠杆菌(E.coli)AD110、大肠杆菌(E.coli)GR-12、大肠杆菌(E.coli)536、大肠杆菌(E.coli)J96)、粪肠球菌(E.faecalis)(比如粪肠球菌(E.faecalis)ATCC33186)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)(比如肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)280)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)(比如奇异变形杆菌(P.mirabilis)296)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(比如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PA01)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)(比如金黄色葡萄球菌(S.aureus)Neuman和金黄色葡萄球菌(S.aureus)USA300)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(比如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)ATCC35984)、格氏乳杆菌(L.gasseri)(比如格氏乳杆菌(L.gasseri)ATCC33323)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)(比如罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)RC14)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)(比如鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GR-1)。
在504处，用放射性同位素或核医学示踪剂标记分离出的细菌。在一个示例性实施方案中，在506处，可以通过调整公布的程序(Bansal等人，2015)，使用标记试剂89Zr-去铁敏-NCS(89Zr-DBN)，用放射性同位素89Zr标记细菌。
首先在溶液比如磷酸氢锆溶液89Zr(HPO4)2中分离放射性同位素比如89Zr。然后使用DFO-Bz-NCS螯合放射性同位素以形成标记试剂，比如89Zr-DBN。89Zr-DBN是第一代原型标记试剂。89Zr与DBN的螯合改编自Bansal等人。DFO部分是DBN的螯合端。异硫氰酸酯基-苄基是共价结合在细胞表面找到的蛋白质上的伯胺的缀合部分。然后可以使用去铁敏(DFO)或改进的螯合剂(Bhatt等人，2018；Berg等人，2020)作为用于锆原子的螯合剂。DFO与对异硫氰酸酯基-苄基或改进的缀合剂(Berg等人，2020)缀合以得到生成的89Zr-去铁敏-NCS，或89Zr-DBN。
备选地，并不制备89Zr-DBN或其前体89Zr(HPO4)2，而是它们可以简单地由第三方购得，包括选择回旋加速器和放射化学设施，在那里它们可以容易地商购获得。
然后将分离出的细菌与89Zr标记试剂(例如，89Zr-DBN)组合并且温育。在温育期间，89Zr-DFO-标记的试剂与分离出的细菌(或噬菌体)的细胞表面蛋白的伯胺共价结合，因此，随机地用放射性同位素标记细菌的外部细胞表面。
然后，在508处，将放射性同位素标记的细菌与未结合89Zr分离。例如，可以通过离心“洗涤”样品以从放射性标记的细菌沉淀中去除保留在上清液中的未结合放射性示踪剂。
在哺乳动物细胞中，已经证明高达0.5Bq/细胞的放射性是安全的。因为细菌远小于哺乳动物细胞，在表面积方面大约为其100分之一，所以可以将每个细菌细胞的目标放射性水平降低至大约0.005Bq/细胞。
任选地，在509处，在施用被称为粪便微生物群移植(FMT)的已知微生物疗法中，在将经洗涤的放射性同位素标记的细菌引入到受试者中之前，可以将其混入到受体粪便物中。这可以使得能够对FMT细菌进行成像，例如，有助于确定移植的有效性。
在510处，将放射性同位素标记的细菌引入到受试者中。在一些应用中，使用饲管将放射性标记的细菌细胞或粪便微生物群移植到受试者的十二指肠中。放射性标记的细菌细胞可以是在食用的益生菌产品或发酵食品中的细菌。在其他应用中，放射性标记的细菌细胞被受试者简单吞下或以其他方式摄入。
尽管已经将方法500描述为用89Zr作为放射性同位素，但是可以备选地使用其他金属类正电子放射性同位素，如例如52Mn(具有5.5天的半衰期)。同样，可以使用单光子放射性同位素，例如111ln(2.8天的半衰期)。另外，可以使用重金属放射性同位素比如177Lu(β发射体和单光子发射体，6.6天的半衰期)和225Ac(α发射体和单光子发射体，10天的半衰期)来标记细菌。
在一个备选实施方案(未示出)中，代替分离并且用放射性同位素标记细菌，如在Ordonez(2021)中所述，可以使用细菌特异性的成像方式，比如用2-脱氧-2[18F]氟-D-山梨糖醇(18F-FDS)进行标记。已经发现18F-FDS在肠杆菌目(Enterobacterales)中聚集，但是不在健康哺乳动物细胞或癌细胞中聚集，并且已经发现在鼠模型中18F-FDS PET特异性地检测肠杆菌目(Enterobacterales)感染(Ordonez(2021))。因此，18F-FDS可以向受试者全身施用，并且将会特异性地标记细菌。
然后，在512处，对受试者进行成像。成像可以包括正电子发射断层扫描(PET)成像、磁共振成像(MRI)或X射线计算机断层扫描(CT)成像。利用PET、MRI和CT的成像可以同时进行(参见图11)或依次进行，并且方法500可以包括一轮或多轮成像。同样，可以对受试者的肠道和/或肠道附近的周围区域二者进行成像。在一些示例性实施方案中，能够确定细菌通过肠道的时间通过，以及移植、肠道透过性和/或迁移。在一些示例性实施方案中，对受试者的功能和结构成像包括局部或全身SPECT成像和/或MRI/CT成像。
在512处，在移植或摄入放射性同位素标记的细菌后，受试者可以在12小时内每2小时进行PET/MRI达30分钟。随后，可以进一步每4天进行成像，直到89Zr不再可检测到。可以进行重复成像直到大约4周，这取决于与个体受试者相关的肠道动力、细菌在体内的持久性和放射性同位素的半衰期。将MRI和/或CT与放射性核素成像组合使得能够将分割的3D MRI或CT图像用于分割PET图像。关于通过MRI或CT图像对PET图像的适当分割，优选的是在PET和MRI/CT数据获取之间，肠道动力可忽略。在动物研究中，麻醉将会消除大部分肠道动力，而在人类中，在MRI检查期间一般使用如丁溴东莨菪碱的药物来消除肠道动力。
在备选的应用中，受试者可以进行PET/MRI成像，或者进行PET/CT成像，然后进行MRI。对受试者的成像的频率和长度也可以不同于在12小时内每2小时30分钟，并且可以不同于随后每4天进行直到89Zr不再可检测到。例如，可以每个放射性同位素物理(或生物)半衰期进行一次成像，比如对于89Zr来说每3.3天进行一次，直到89Zr不再可检测到。
用例如89Zr-DBN标记细菌然后进行PET/MRI成像使得能够确定引入的细菌在肠道中的移植，细菌自肠道离开的透过性，然后是细菌向体内不同位置的迁移。
在此第一成像之后，在514处，选择对先前引入到受试者的肠道中的分离出的细菌具有特异性的噬菌体。分离噬菌体，并且基于其对先前引入到受试者的肠道中的分离出的细菌的特异性进行选择。它们还基于其溶解和杀死所述细菌的能力进行选择。
在515处，将噬菌体引入到受试者的肠道中。噬菌体可以口服施用(例如，通过胶囊)，或者经由鼻饲或鼻-十二指肠管或者经由直肠灌肠或结肠镜来施用。备选地，噬菌体可以静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、皮下或腔内施用。由于噬菌体的性质，噬菌体将自然地随着时间感染受试者内的针对的细菌，在该细菌中复制，并且溶解该细菌。在溶解针对的细菌后，细菌将释放出放射性同位素，然后所述放射性同位素将会零散地分布在生物体内，或者从生物体中消除，因为细菌将不再含有它。
然后，在516处，再次对受试者进行成像。成像应在方法上与512中使用的成像类似。
比较两个图像，并且然后可以直接将图像的区别归因于所考虑的细菌的存在。
图6中提供了另一种示例性方法。此处，引入细菌，然后引入对该细菌具有特异性的放射性标记的噬菌体，并且对其进行成像。
在602处，可以从粪便物或非粪便物中分离细菌。例如，这样的细菌可以是肠道细菌，或者可以是可商购获得的细菌，比如益生菌补品。这样的肠道细菌的一个实例是卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)，比如菌株ATCC33820。应理解，可以使用好氧细菌和厌氧细菌的其他菌株。尽管示出了从粪便物中分离，但是此方法同样可以应用于来自其他来源的可以分离和标记的细菌菌株，比如用于益生菌、食品、动物或环境用途的那些。
细菌物种的实例包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)、普氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭菌属(Clostridium)、阿克曼菌属(Akkermansia)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、埃希菌属(Escherichia)、毛螺菌属(Lachnospiracae)、布劳特氏菌属(Blautia)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、多尔氏菌属(Dorea)、罗氏菌属(Roseburia)和粪杆菌属(Faecalibacterium)的其他成员。例如，可用于本发明方法中的标记的肠道细菌的实例包括卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)(比如卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)ATCC33820)、大肠杆菌(E.coli)(比如大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)、大肠杆菌(E.coli)MG1655、大肠杆菌(E.coli)Nissle、大肠杆菌(E.coli)25922、大肠杆菌(E.coli)67、大肠杆菌(E.coli)AD110、大肠杆菌(E.coli)GR-12、大肠杆菌(E.coli)536、大肠杆菌(E.coli)J96)、粪肠球菌(E.faecalis)(比如粪肠球菌(E.faecalis)ATCC33186)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)(比如肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)280)、奇异变形杆菌(P.mirabilis)(比如奇异变形杆菌(P.mirabilis)296)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(比如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PA01)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)(比如金黄色葡萄球菌(S.aureus)Neuman和金黄色葡萄球菌(S.aureus)USA300)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)(比如表皮葡萄球菌(S.epidermidis)ATCC35984)、格氏乳杆菌(L.gasseri)(比如格氏乳杆菌(L.gasseri)ATCC33323)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)(比如罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)RC14)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)(比如鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GR-1)。
在604处，将细菌与粪便物混合，并且在606处引入到受试者的肠道中。在一些应用中，使用饲管将细菌细胞或粪便微生物群移植到受试者的十二指肠中。细菌细胞可以是在食用的益生菌产品或发酵食品中的细菌。在其他应用中，细菌被受试者简单吞下或以其他方式摄入。
在施用细菌后是将放射性同位素标记的噬菌体施用到受试者中。
在608处，分离对分离出的细菌具有特异性的噬菌体。可以从粪便物中分离它们。然而，更典型地，噬菌体培养的或商购的。噬菌体基于其对在606处引入到受试者的肠道中的细菌的选择性进行选择。还可以使用噬菌体(比如基因改造的噬菌体)，并且基于其生命周期进行选择。例如，可以使用具有在宿主细菌内复制而不是溶解宿主细菌的倾向的噬菌体。
在610处，用放射性同位素或核医学示踪剂标记分离出的噬菌体。在一个示例性实施方案中，用如以上在方法100中所述的89Zr-DBN标记噬菌体。备选地，用如以上在方法200中所述的111In-DOTA-NHS标记噬菌体。
然后，洗涤放射性同位素标记的噬菌体以去除未结合放射性示踪剂。
在612处，将放射性同位素标记的噬菌体引入到受试者的肠道中。放射性标记的噬菌体或粪便微生物区系可以口服施用(例如，通过胶囊)，或者经由鼻饲或鼻-十二指肠管或者经由直肠灌肠或结肠镜来施用。备选地，标记的噬菌体可以静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、皮下或腔内施用。由于噬菌体的性质，放射性标记的噬菌体将自然地随着时间感染受试者内的其针对的细菌，因此与该细菌共定位，并且在该细菌中复制。
如上所述，在哺乳动物细胞中，已经证明高达0.5Bq/细胞的放射性是安全的。因为细菌远小于哺乳动物细胞，在表面积方面大约为其100分之一，所以可以将每个细菌细胞的目标放射性水平降低至大约0.005Bq/细胞。因为噬菌体小于细菌细胞(分别为20至200nmvs 400nm以上)，所以每噬菌体的目标放射性水平应主要与表面积线性地成比例。然而，甚至小的噬菌体(例如约20nm)也可以充分地标记，因为即使Bq/噬菌体将会是大约1×10-4，也会使用大的量。
然后，在614处，对受试者进行成像。成像可以包括正电子发射断层扫描(PET)成像、磁共振成像(MRI)或X射线计算机断层扫描(CT)成像。利用PET、MRI和CT的成像可以同时进行或依次进行，并且方法600可以包括一轮或多轮成像。同样，可以对受试者的肠道和/或肠道附近的周围区域二者进行成像。在一些示例性实施方案中，能够确定细菌通过肠道的时间通过，以及移植、肠道透过性和/或迁移。在一些示例性实施方案中，对受试者的功能和结构成像包括局部或全身SPECT成像和/或MRI/CT成像(616)。
在614处，在移植或摄入放射性同位素标记的噬菌体后，受试者可以在12小时内每2小时进行PET/MRI达30分钟。随后，可以进一步每4天进行成像，直到89Zr不再可检测到。可以进行重复成像直到大约4周，这取决于与个体受试者相关的肠道动力、细菌在体内的持久性和放射性同位素的半衰期。将MRI和/或CT与放射性核素成像组合使得能够将分割的3DMRI或CT图像用于分割PET图像。关于通过MRI或CT图像对PET图像的适当分割，优选的是在PET和MRI/CT数据获取之间，肠道动力可忽略。在动物研究中，麻醉将会消除大部分肠道动力，而在人类中，在MRI检查期间一般使用如丁溴东莨菪碱的药物来消除肠道动力。
在备选的应用中，受试者可以进行PET/MRI成像，或者进行PET/CT成像，然后进行MRI。对受试者的成像的频率和长度也可以不同于在12小时内每2小时30分钟，并且可以不同于随后每4天进行直到89Zr不再可检测到。例如，可以每个放射性同位素物理(或生物)半衰期进行一次成像，比如对于89Zr来说每3.3天进行一次，直到89Zr不再可检测到。
用例如89Zr-DBN标记噬菌体然后进行PET/MRI成像使得能够确定引入的细菌在肠道中的移植，细菌自肠道离开的透过性，然后是细菌向体内不同位置的迁移。
尽管已经将方法600描述为用89Zr作为放射性同位素，但是可以备选地使用其他金属类正电子放射性同位素，如例如52Mn(具有5.5天的半衰期)。同样，可以使用单光子放射性同位素，例如111ln(2.8天的半衰期)。另外，可以使用重金属放射性同位素比如177Lu(β发射体和单光子发射体，6.6天的半衰期)和225Ac(α发射体和单光子发射体，10天的半衰期)来标记噬菌体。
在方法100、200、300、400、500或600之后，如图7的方法700中所示以及下文所描述，可以将获取的图像转化为受试者内的标记的细菌的定量图像或数量的映射图。同样，在图7中，虚线矩形框表示任选的(并且可能优选的)步骤。
为了将获取的图像(任选地在702处获取)转化为受试者内的标记的细菌的定量图像或数量映射图，在704处，可以从受试者收集生物样品。生物样品可以是粪便样品、尿液样品、血液样品和唾液样品中的一种或多种。然后，可以在706处确定生物样品的放射性和每个细菌细胞或噬菌体的放射性同位素的平均数。
在对受试者的肠道进行成像的情况下，可以从3D MRI或CT图像分割肠道的图像，然后将其用于分割PET肠道图像。
在这样的实施方案中，可以在整个程序中每隔一段时间收集粪便样品。可以使用新一代测序(NGS)鉴定细菌菌株，由粪便样品估算每个目标细菌的活度(ATB)。可以使用NMR驰豫法获得额外的信息。如果可以操纵质子(氢原子)分子交换驰豫机制以有效地产生慢速水交换(Morariu&Benga，1977)，则这与多分量驰豫测量(Hazlewood等人，1974，和Saab等人，2001)组合可以提供关于样品组成/结构的额外信息。例如，NMR驰豫法可以用于估算粪便样品中的细菌的种类和数量(Donnelly等人，2019)。还可以使用经校准的放射性计数检测器比如井式计数器或全身计数器(图25)来确定相同粪便样品中的89Zr的绝对活度，所述放射性计数检测器可以检测γ射线和湮没放射。因此，可以确定每个细菌的活度。
除了确定最初标记的菌株的每个细菌的特异性活度以外，706中的确定还可以包括确定在粪便样品中的其他细菌菌株上的标记程度，和在非细菌粪便物中的非特异性摄取的程度。
可以确定89Zr的非特异性摄取(NSU)，例如，其中将整个粪便样品(纤维加细菌)的标记与从粪便样品中提取的分离出的细菌(去除纤维)的标记进行比较。即使一些细菌附着至纤维，这也将会被认为是保留在肠中的标记的粪便物的一部分，并且注定要排泄而不是迁移到胃肠道之外。
在PET成像时肠道中的目标细菌(TB)的数量可以使用以下式I由3D PET活度分布图像(A)来计算：
其中：TB(x,y,z,t)是在时间t在肠道中的位置x、y、z处的细菌数量
A(x,y,z,t)是在时间t在位置x、y、z处的89Zr的活度
NSU是粪便样品中每单位体积粪便的未与细菌结合的活度和/或与注定要排泄的纤维相关的活度
ATB(t)是在时间t的与纤维不相关的每个细菌细胞的活度
在708处，已经确定受试者肠道中的放射性同位素标记的肠道微生物区系的数量和位置后，可以将这些计算结果与获取的肠道PET和MRI图像组合以产生肠道中每体素的细菌数量的3D图像。图10-12中示出了此方法背后的原理。换言之，可以校准PET和MRI图像二者，例如使用由粪便样品获得的信息，以产生受试者体内整个肠道中的细菌分布或浓度的3D图像。
在测量肠道细菌在肠道之外的透过性和迁移的程度的情况下，可以进一步分割非肠道图像以确定要研究的关于89Zr标记的细菌的透过性和迁移的体积。
在这样的实施方案中，可以在每次PET成像之后以及在其他时间收集粪便样品、血液样品、尿液样品和/或唾液样品。每个目标细菌的放射性活度和每个样品体积的非特异性摄取可以由如上所述的粪便、血液、尿液和/或唾液样品确定。然后可以根据式I计算在成像时肠道中的目标细菌(TB)的数量。
在时间t时已经透过肠道的细菌的数量(TBP)可以使用以下式II计算：
其中：
其中：TBP(x,y,z,t)是在时间t在肠道外部的位置x、y、z处的细菌数量
AP(x,y,z,t)是在时间t在位置x、y、z处的89Zr的活度
ATBE(t)是每个已透过肠道细菌的活度
NSUE是在肠道外部的未与细菌结合的活度，并且可以由血液、唾液或尿液样品估算
已经迁移到较远组织的细菌的数量(TBR)可以使用以下式III计算：
其中TBR(x,y,z,t)是在较远位置处的细菌数量，并且在感兴趣的体积上进行求和
注意
其中ABR(t)是由血液样品确定的除了膀胱和唾液腺以外的全身的每个细菌的放射性活度。膀胱的放射性活度由尿液样品确定。唾液腺的放射性活度由唾液确定。
AR(x,y,z,t)是在感兴趣区内在时间t在位置x、y、z处的89Zr的活度。
已经确定在肠道外部的感兴趣区中的放射性同位素标记的肠道微生物区系的数量和位置后，可以将这些计算结果与获取的肠道外部的感兴趣区的PET和MRI图像组合以产生感兴趣区中每体素的细菌数量的3D图像。换言之，可以校准PET和MRI图像二者，例如使用由生物样品获得的信息，以产生受试者体内整个感兴趣区中的细菌分布或浓度的3D图像。
尽管本文中讨论了细菌分布的3D映射，但是方法700也可以用于对其他微生物区系比如病毒、噬菌体或其他微生物进行定量3D成像。
尽管方法100、200、300、400、500和600被描述为用于对受试者中的细菌和噬菌体进行成像，但是也可以使用图8的方法800中所示的方法对其他微生物区系比如病毒进行成像。在802处，可以从受试者的粪便物中分离肠道病毒或其他肠道微生物。在804处，可以如上所述用放射性同位素标记肠道病毒或其他肠道微生物。在506处，可以将放射性同位素标记的肠道病毒或其他肠道微生物与受试者的粪便物混合，并且在808处引入回受试者中。然后，可以如上所述对受试者进行功能功能和/或结构成像。
提供以下实施例来说明上述方法的非限制性实施方案。
实施例1：利用89Zr标记对细菌进行体外成像
此实施例展示了如何在体外用89Zr(3.3天的半衰期)标记细菌用于细菌检测，对细菌生存力的影响，以及标记物稳定性。
用89Zr放射性标记细菌：将细菌在其优选培养基中培养过夜。然后，将细菌离心并且用PBS洗涤以去除培养基组分(例如蛋白质)。随后在摇动下将细菌与89Zr-DBN一起在室温温育1小时。细菌的放射性标记被设计为实现大约0.005Bq/细胞(以菌落形成单位CFU确定)。通过离心和洗涤去除过量的标记物，直到无细胞上清液含有微不足道的量的放射性活度。
89Zr标记的细菌的体外PET/MRI：样品由培养的放射性标记的细菌制备，固定在明胶模体中，并且同时使用PET/MR(在3T下)进行成像。将89Zr标记的细胞在明胶/PBS中系列稀释，装载到Ultem孔中，然后固定在球形明胶模体(9cm直径)中。图9示出了MRI细胞模体。将细胞通过以4500×g离心装载到Ultem孔中，然后固定在明胶模体中。
图10示出了卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)ATCC33820在明胶/PBS中的系列稀释后的R2和R2*。卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)在明胶/PBS中的稀释后表现出高的横向驰豫率。图10示出了平均值+/-SEM。考虑到仅有一个可辨认的R2*和R2，细菌细胞被确定为处于与明胶/PBS的快速交换中。总的横向驰豫性R2*(以红色显示)主要由不可逆的R2分量(以蓝色显示)组成。
图11和12示出了通过对细菌(卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ATCC33820)的89Zr-DBN标记检测的细胞数量和接种的活细胞数量之间的关系。在图12中，89Zr以每秒衰变数的绝对单位示出，并且活细胞数量对应于菌落形成单位(CFU)。可以使用每个细胞的89Zr标记物的初始数量作为校准因子。在放射性标记的细菌的摄入、在肠道中的增殖和由于细菌死亡的损失之后，可以由对排泄的粪便的分析来确定改进的校准因子。如预期的，图13显示，在卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)中R2和89Zr活性强烈相关。
图14示出了固定在明胶模体中的不同细菌的在3T下的MRI的核磁共振(NMR)信号。不同细菌物种的MR测量结果差异很大。尽管在细菌物种之间有自旋-自旋驰豫信号(R2)的重叠，但是校准通过对粪便样品的高分辨NMR驰豫法将会是可能的，允许通过驰豫率鉴定不同的细菌并且通过在各驰豫率下的信号幅度鉴定这些活细胞的数量。对于此技术，将会通过用顺磁性盐如Mn或Gd掺杂粪便细菌，或通过缓慢降低含有细菌和噬菌体的浆液的水合来处理粪便样品以使不同的细菌处于慢速交换模式中。
在所有情况下，横向驰豫性的R2分量(蓝色柱)在总R2*信号(红色柱)中占支配地位。发现来自卷曲乳酸杆菌(L.gasseri)ATCC33323的突出信号(参见图11)显著高于所测试的任何其他物种(p<0.05)。大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GR-1与奇异变形杆菌(P.mirabilis)296和金黄色葡萄球菌(S.aureus)Newman相比均显示出更高的驰豫性(分别为黑色线和灰色线)。使用在此数据集中使用的MRI脉冲序列无法得到(未稀释的)卷曲乳酸杆菌(L.gasseri)ATCC33820的测量结果(图8样品)以覆盖由各种细菌表现出的R2的范围。柱状图示出了平均值+/-SEM(*p<0.05，n＝3-5)。
图15提供了关于另外的物种大肠杆菌(E.coli)(益生菌，共生和泌尿致病性)的数据。大肠杆菌(Escherichia coli)可通过MRI检测。柱状图将大肠杆菌(E.coli)的BL21(DE3)实验室菌株的MR信号与选择的益生菌(Nissle)、共生体(MG1655,25922)和泌尿致病性菌株(67,AD110,GR-12,536,J96)的MR信号进行比较。所有大肠杆菌(E.coli)都表现出较高的横向驰豫率，其R2*几乎完全由R2分量组成，并且几乎没有或没有R2′贡献(R2*＝R2+R2′)。单因素方差分析(one-way ANOVA)表明Nissle(浅灰色线)、25922(深灰色线)和AD110(黑色线)的R2/R2*显著低于大部分其他测试的菌株(*p<0.05)。数据为平均值+/-SEM(n＝3–5)。
89Zr对细菌生存力的影响：平板接种细菌来对放射性标记前后的CFU进行计数，以理解其对细菌生存力的急性影响。在四周内在各个点处对未标记的细菌和放射性标记的细菌进行定量，以考察细菌的放射性标记对生存力的长期影响。
图16示出了89Zr放射性标记随着时间对细菌生存力的影响。将大肠杆菌(Escherichia coli)Nissle用89Zr-DBN标记，并且平板接种以定量随着时间的与未标记细胞相比的活细胞(CFU)。将各细菌储备物的样品在无菌dH2O中系列稀释，并且一式三份平板接种在胰酶大豆琼脂板上。将它们在室温温育24–36小时，之后对CFU进行计数。然后基于以在20–60菌落/重复之间的稀释因子平板接种的量估算样品中的总活细胞。标记的细胞(蓝色点)和未标记的细胞(红色点)的细菌生存力均随时间而降低，作为CFU的下降看到。放射性标记的细菌的细胞更新以与未标记的对应物相同的速率进行。当此实验中的标记的和未标记的细菌储备物在室温储存并保持不流动时，预期由于营养物耗尽而发生许多细胞死亡。
未标记的样品和放射性标记的样品中的活细胞与死细胞的比率也可以使用活/死生存力染色(分别为SYTO 9和碘化丙啶)用荧光显微法来定量。
测量标记物稳定性：将未标记的细菌和放射性标记的细菌接种到共同培养装置的由0.2μm过滤器分隔开的不同室中。样品在不同时间点从各室中获取，并且以10,000×g离心1分钟。取出上清液用于使用井式计数器进行放射性活度定量，同时将沉淀物在定量放射性活度之前用PBS洗涤3次。所有测量都进行衰减校正以用于将最初标记的样品中的89Zr含量的比较以确定(a)释放到培养基中的89Zr(例如从螯合中释放或通过细胞更新释放)和(b)未标记的细菌与游离的89Zr之间的可能相互作用。
图17(17A关于9-72小时的时间点；17B关于7-24天的时间点)显示，如果放射性同位素比如89Zr由螯合物或死亡细胞释放，则其不标记细菌。将大肠杆菌(Escherichia coli)Nissle用89Zr-DBN标记，并且接种到2室培养系统(共同培养装置)的一个室中。用相同量的未标记的大肠杆菌(E.coli)Nissle接种另一个室。所述室由0.2μm过滤器分隔开，防止完整的细菌在所述室之间穿越，但是允许培养基、小分子、一些蛋白质(<200kDa)和小细胞片段扩散穿过。在多个时间点，从各室取出等分样品，并且将其离心以分离细菌和上清液。洗涤细菌的沉淀物以去除未结合的89Zr，并且使用井式计数器对上清液(不包括洗涤液；实心柱)和细胞沉淀物(条纹柱)二者中的89Zr进行定量。随着放射性标记的细胞沉淀物(蓝色条纹柱)随时间减少，释放到培养基(蓝色柱)中的89Zr的比例增大，反映了细胞更新和可能的螯合损失。尽管如此，在所述室之间穿过的任何89Zr保留在上清液培养基(红色柱)中，并且不放射性标记未标记的细菌(红色条纹柱)。
还可以在用如以上关于检查细菌生存力所描述的相同方式制备的细菌板上评估标记物稳定性。对于稳定性测量，必须在平板接种之前彻底洗涤细菌以确保在培养皿上仅存在细菌结合的89Zr。使用全身计数器对板上的总放射性活度进行定量并且进行衰减校正以检查细菌结合的89Zr水平随时间的变化。还可以通过放射自显影法来评估各个菌落中的放射性活度。
实施例2：利用111In对肠道细菌进行成像
此实施例展示了如何可以在体外用111In(2.8天的半衰期)标记细菌用于细菌检测，对细菌生存力的影响，以及标记物稳定性。
用111In放射性标记细菌：将细菌在其优选培养基中培养过夜。然后，将细菌离心并且用PBS洗涤以去除培养基组分(例如蛋白质)。随后在摇动下将细菌与111In-DOTA-NHS一起在室温温育1小时。基于用111In-环庚三烯酚酮标记哺乳动物细胞的先前生存力研究(Jin等人，2005)，细菌的放射性标记被设计为实现大约0.0014Bq/CFU。通过离心和洗涤去除过量的标记物，直到无细胞上清液含有微不足道的量的放射性活度。
111In标记的细菌的体外SPECT和MRI：样品由培养的放射性标记的细菌制备，固定在明胶模体中，并且使用SPECT然后是MRI或CT进行成像，或者通过SPECT/CT然后是MRI进行成像。MRI可以以各种场强进行，包括但不限于1.5T、3T或7T。将111In标记的细胞在明胶/PBS中系列稀释，装载到Ultem孔中，然后固定在如图9中的球形明胶模体中。
111In对细菌生存力的影响：平板接种细菌来对放射性标记前后的CFU进行计数，以理解其对细菌生存力的急性影响。在四周内在各个点处对未标记的细菌和放射性标记的细菌进行定量，以考察细菌的放射性标记对生存力的长期影响。
未标记的样品和放射性标记的样品中的活细胞与死细胞的比率也可以使用活/死生存力染色(分别为SYTO 9和碘化丙啶)用荧光显微法来定量。
测量标记物稳定性：将未标记的细菌和放射性标记的细菌接种到共同培养装置的由0.2μm过滤器分隔开的不同室中。样品在不同时间点从各室中获取，并且以10,000×g离心1分钟。取出上清液用于使用井式计数器进行放射性活度定量，同时将沉淀物在定量放射性活度之前用PBS洗涤3次。所有测量都进行衰减校正以用于最初标记的样品中的111In含量的比较，从而(a)确定释放到培养基中的111In(例如从螯合中释放或通过细胞更新释放)和(b)研究未标记的细菌与游离的111In之间的可能相互作用。
还可以在用如以上关于检查细菌生存力所描述的相同方式制备的细菌板上评估标记物稳定性。对于稳定性测量，应在平板接种之前彻底洗涤细菌以确保在培养皿上仅存在细菌结合的111In。使用全身计数器对板上的总放射性活度进行定量并且进行衰减校正以检查细菌结合的111In水平随时间的变化。还可以通过放射自显影法来评估各个菌落中的放射性活度。
实施例3和4：利用89Zr和111In标记对细菌进行体内成像
此实施例包括用89Zr(半衰期3.3天)标记细菌，其使得能够使用PET/MRI成像分析生物样品中的每个细菌细胞的89Zr含量。健康猪的样品数据提供了原理证明，并且证明了益生菌在摄入后在胃肠道内至少4天的持久性。尽管以上描述了89Zr标记，但是在将111In标记或其他已知标记方法用于SPECT/MRI成像时所述方法同样适用。
方法：将放射性标记的益生菌在胶囊中递送到健康猪中。然后，使用PET/MRI来描述细菌从胃直到下胃肠道的易位以及穿过长上皮细胞到目标组织的可能迁移的时间表。还对89Zr在粪便、尿液和血液中的显现进行了量化。猪样品验证了本文中例示的放射性标记和成像方法。
将不含未结合89Zr的放射性标记的细菌包封并且使用饲管直接引入到猪的胃中。使用PET/MRI(Siemens Biograph mMR)对麻醉的动物进行成像以用于与解剖学信息(MRI)结合的89Zr-DBN标记的细菌(PET)的同时监测。建立合适的成像参数以确定细菌易位的重要时间轴和ROI。在成像期的期间或之间监测血液、尿液和粪便；可以对其进行计数以追踪放射性标记的材料；并且通过NGS和PCR分析其细菌组分。可以在终点收集组织用于组织学和放射自显影法。
猪模型：大约6-8周龄(～30kg)的动物由本地农场获得，并且成对圈养以允许社会互动来减少压力和GI干扰。采用动物使用协议(AUP,2019-119)，其被认证为符合由加拿大动物保护委员会(the Canadian Council on Animal Care)设定的标准。在插入鼻胃管用于移植含有89Zr标记的益生菌的胶囊之前麻醉动物。在摄入后的1-6小时的成像证实了胶囊在胃中的合适定位(参见图18)。在处于麻醉状态的同时，连续地收集尿液。在成像期之间，使用代谢笼(metabolic cage)监测尿液和粪便。在整个实验中，分析粪便的89Zr标记的益生菌。在各成像期收集血液样品，并且使用高纯度锗(HPGe)井式计数器对其进行监测。
如图18所示，单独(在右侧)和叠合到MRI(冠状T1加权的同相Dixon，在左侧)的最大强度投影(MIP)表明了在摄入后的3个时间的大肠杆菌(E.coli)Nissle的位置。最初的成像显示出益生菌胶囊在胃和食管中的合适定位。在此样品数据(n＝1)中，注意到在气管导管和鼻子中的一些回流。在摄入后4天时，剩余的放射性示踪剂大部分被包含在肠室内。气管导管的再次使用在PET/MRI上显示出残留的89Zr，并且被排除在进一步分析之外。到摄入后7天时，剩余的放射性示踪剂扩散并且接近背景。
成像时间轴：为了全面覆盖细菌移动，使用了三组动物(参见图19)。通过每3天重复PET/MRI直到摄入后6-8天的终点来追踪89Zr标记的细菌的易位。另外的成像期的目标是统计比较和组织收集的中间时间点。在终点时，在适合于下游细菌分析的无菌条件下手术取出组织。由这些成像时间轴限定3维(3D)感兴趣区(ROI)(参见图20)，以确定特定器官的时间活度曲线并且使得能够计算在肠道内部和外部两者的89Zr积聚部位的放射剂量。图21和25示出了在摄入后的89Zr的生物分布。
如图19所示，进行PET/MRI以提供细胞示踪和麻醉之间的间隔。第0天表示摄入后的6-12小时。
成像顺序：PET/MRI采集由猪的全身覆盖的四个床位置组成。在各床位置，PET采集15-45分钟(根据摄入后的时间)，同时采集MRI。MRI由用于基于MR的衰减校正(MRAC)的2点Dixon采集、轴向且冠状的T2加权的半傅里叶采集单次激发快速自旋回波(HASTE)图像、T2加权的光谱衰减反转恢复(SPAIR)图像和3D T1加权的容积插值屏气检查(VIBE)图像组成。肠活动由于麻醉而最小，但是如果需要的话，可以施用东莨菪碱以进一步减少蠕动。PET利用3D有序子集最大期望值(OSEM)算法重建，该算法考虑了PET系统的点扩散函数以改善空间分辨率。全身PET和MRI数据集在成像期后自动构成。由于在各床位置中的同时采集，PET和MRI数据固有地叠合。总采集时间为1.5至3小时，随着摄入后的经过时间而增加，以考虑89Zr标记的细菌的由于放射性衰变和排泄造成的活度降低。一旦PET/MRI信号变得分散，就使用加拿大卫生部(Health-Canada)批准的全身计数器(WBC，图25)来监测残留的89Zr。
摄入的活细菌的数量(CFU)由1个胶囊的内容物确定，并且用于预计益生菌传播的规模。使用WBC，表1估算了在健康猪的选择器官中的908KeV 89Zr信号的验尸后(死后，post-mortem)分布。
表1.使用成像来理解与微生物区系相关的临床问题
*计算结果基于摄入的CFU的数量(n＝1头猪)并且不考虑细菌的增殖、细胞死亡或可能的89Zr细胞标记物的损失。
**估算值来源于在WBC上的验尸后器官的分析。
如图20所示，在摄入89Zr标记的益生菌后，使用由T2加权的HASTE序列获得的冠状图像来分割猪组织。在此分割实例中，在摄入后第4天，大部分放射性标记物被限制在肠室中。分析中省略了图18所示的污染的气管导管。
生物分布：细菌向动物中的特定部位的传播(参见图21)通过PET/MRI确定为含有放射性示踪剂的组织区域。这些ROI将会限定要在死后切除的组织，以及要作为可能的细菌DNA污染的对照使用的相邻未标记组织。组织学和放射自显影法(BeaQuant，AI4R)将会提供在切除的组织中的细菌定位的证据以补充DNA分析。
如图21所示，时间进程显示大部分摄入的89Zr标记的细菌从放射性示踪剂摄入当天(蓝色柱)的胃和食管易位到4天之后(橙色柱)的肠室。尽管在膀肿中几乎没有或没有信号，但是到摄入后第7天(灰色柱)，肝、肾和肺中的89Zr与肢体的(发炎)关节中的积聚相比较少(图24)。
此实施例示出了在摄入后的微生物保留和/或从肠道的易位，并且描述了一种用于在大动物和人类中追中这些细胞的成像程序，而与来自不同宿主的微生物区系的变化无关。
在实验期间的猪生长通过扫描仪孔径大小和准确追踪的发育变化来调整。尽管麻醉可以减少肠道中的运动并且混淆细菌易位的时间，但是减少的蠕动有利于GI成像分析，并且可以通过短寿命麻痹剂东莨菪碱(半衰期20分钟)来促进。在需要时，可以施用葡聚糖硫酸酯以保持成像期之间的肠道动力。通过PET/MRI测量的89Zr的生物分布可以与WBC不同。为了解决该差异，可以校准系统。
实施例5：利用对噬菌体的89Zr标记对细菌进行体外成像。
此实施例展示了如何可以通过对噬菌体的89Zr标记在体外间接地放射性标记细菌。
对噬菌体的标记：将与大肠杆菌(Escherichia coli)一起繁殖的肌尾噬菌体(Myoviridae)或长尾噬菌体(Siphoviridae)的菌株分离、纯化并且与89Zr-DBN一起温育(参见图22)。标记与噬菌体表面积成比例。肌尾噬菌体(Myoviridae)具有平均直径为85nm的二十面体头部和高度为170-240nm且直径为16-20nm(通常为220nm×18nm)的圆柱形尾部。
二十面体表面积A1＝5*√3*(r1/sin72°)2，其中r1是头部的半径。
圆柱体表面积A2＝(2πr2 h2)+2π(r2)2，其中h2是尾部高度，并且r2是尾部半径。
总表面积SA＝A1+A2＝17295nm2+12950nm2＝30245nm2
在表面积为～30000nm2的情况下，大约0.1×10-4Bq/噬菌体被认为是无毒性的。通过以下方法中的一种将标记的噬菌体从未结合标记物中纯化：尺寸排阻色谱法(包括渗析)、可逆结合琼脂糖球或超速离心。
评估间接细菌标记的标记物稳定性和功效：将标记的噬菌体加入到共同培养装置的一个室中，将大肠杆菌(E.coli)加入到由过滤器分隔开的另一个室中，使得噬菌体而不是细菌能够在室之间行进。在72小时时段内的多个时间点从各室中取出样品。将这些样品以10,000×g离心1分钟以沉淀出细菌，然后将其用PBS洗涤。使用井式计数器测量沉淀物和上清液二者中的89Zr活度。还平板接种细菌和噬菌体以分别按照菌落形成单位(CFU)和噬斑形成单位(PFU)进行定量。通过使用如上所述的相同纯化方法对随着时间的游离标记物vs.噬菌体结合的标记物进行定量，来评估噬菌体的89Zr-DBN标记的稳定性。
如图22所示，将各个分离出的噬菌体菌株在其细菌宿主中繁殖，并且纯化以去除污染物，比如细菌、未结合的蛋白质和盐。将纯化的噬菌体与89Zr-DBN一起温育，以使得放射性标记物可以与构成噬菌体头部和尾部二者的细胞表面蛋白上的伯胺结合。去除未结合的放射性标记物以提供纯化的放射性标记的噬菌体用于下游的体外和体内应用。
实施例6：利用对噬菌体的89Zr标记对细菌进行体内成像。
此实施例展示了如何可以通过对噬菌体的89Zr标记在体内间接地放射性标记肠道细菌。
对噬菌体的标记：将与大肠杆菌(E.coli)一起繁殖的肌尾噬菌体(Myoviridae)或长尾噬菌体(Siphoviridae)的菌株分离、纯化并且以大约0.1×10-3Bq/噬菌体与89Zr-DBN一起温育。通过以下方法中的一种将标记的噬菌体从未结合标记物中纯化：尺寸排阻色谱法、可逆结合琼脂糖球或超速离心(图22)。
用89Zr标记的噬菌体向动物/人类的递送：将这些噬菌体装载到胶囊中，并且吞下或通过管经由食管或肛门沉积到肠道中。
动物/人类中的89Zr活度和MRI R2和/或R2*值的3-D映射图/图像的确定：将动物/人类放入混合型PET/MRI中，或依次用PET和MRI对其进行成像。首先，在递送89Zr标记的噬菌体之前获取基线MRI。将此3-D MRI数据转化为R2和R2*的3-D分布。然后，在递送89Zr标记的噬菌体后的多个时间收集PET/MRI数据，以及时跟踪在89Zr标记的噬菌体结合其宿主细菌(在此情况下为大肠杆菌(E.coli))时的移植、肠道透过性和迁移的程度。使用不同的噬菌体允许靶向肠道内的不同细菌种群，包括例如依赖于锰的乳酸杆菌。MRI主要用于使用脉冲序列的解剖学成像比如T2加权的半傅里叶采集单次激发快速自旋回波(HASTE)图像以及PET信号衰减校正。全身PET和MRI数据集在成像期后自动构成。由于在各床位置中的同时采集，所以PET和MRI数据固有地叠合。总采集时间为1.5至3小时，随着摄入后的经过时间而增加，以考虑89Zr标记的噬菌体和/或它们感染的宿主细胞的由于放射性衰变、排泄和繁殖造成的活度降低。
由PET数据产生噬菌体浓度的3-D图像(89Zr 3-D活度映射图)：将上述制剂用于89Zr在肠道中和在肠道外部的体内的非特异性摄取，即分别为NSU和NSUE。
NSU的确定：对粪便样品的以89Zr的Bq计的放射性浓度即AC(之前)进行计数。然后，去除非细胞碎片，并且对样品进行再次计数以得到AC(之后)。然后，NSU作为NSU＝AC(之前)–AC(之后)进行计算。将主要在细胞组分中发现标记的噬菌体，因为它们与其宿主细菌结合，尽管应注意在细菌宿主细胞溶解时，病毒粒子将会被释放到胞外空间中而感染更多细胞。
NSUE的确定：对血液样品和/或唾液样品和/或尿液样品的以89Zr的Bq计的放射性和浓度即ACE(之前)进行计数。然后，去除非细胞碎片，并且对样品进行再次计数以得到ACE(之后)。然后，NSUE作为NSUE＝ACE(之前)–ACE(之后)进行计算。
实施例7：利用对噬菌体的89Zr标记对细菌进行体内成像。
此实施例展示了如何可以通过对噬菌体的89Zr标记在体内间接地放射性标记在整个体内的细菌。
对噬菌体的标记：将与其细菌宿主一起繁殖的噬菌体分离、纯化并且与以大约0.1×10-3Bq/噬菌体与89Zr-DBN一起温育。通过以下方法中的一种将标记的噬菌体从未结合标记物中纯化：尺寸排阻色谱法、可逆结合琼脂糖球或超速离心(参见图22)。
用89Zr标记的噬菌体向动物/人类的递送：通过静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、肌内注射、输液或颅内施用(例如鞘内或脑室内)将这些噬菌体递送到动物/人类。噬菌体传播并且感染其宿主细菌。这些细菌可以涉及局部组织感染，矫形外科感染，在肿瘤的部分，或者可能在肠道外部扩散到其他组织中。在后一种情况下，以粪便移植物形式向动物/人类提供的细菌可能由于高肠透过性而离开胃肠道并且扩散到其他组织。此时，可以通过直接放射性标记对这些细菌进行成像，但是通过现有技术的方法，宿主中的活细胞和死细胞之间的非侵入性区分是极具挑战性的。因为噬菌体将仅感染活细胞以繁殖，所以通过噬菌体的间接细菌标记证实了活细菌在各个组织上的存在。
动物/人类中的89Zr活度和MRI R2和/或R2*值的3-D映射图/图像的确定：将动物/人类放入混合型PET/MRI中，或依次用PET和MRI对其进行成像。首先，在递送89Zr标记的噬菌体之前获取基线MRI。将此3-D MRI数据转化为R2和R2*的3-D分布。然后，在递送89Zr标记的噬菌体后的多个时间收集PET/MRI数据，以及时跟踪在它们感染其宿主细菌时的定位、移植和迁移的程度。MRI主要用于使用脉冲序列的解剖学成像比如T2加权的半傅里叶采集单次激发快速自旋回波(HASTE)图像以及PET信号衰减校正。全身PET和MRI数据集在成像期后自动构成。由于在各床位置中的同时采集，所以PET和MRI数据固有地叠合。总采集时间为1.5至3小时，随着摄入后的经过时间而增加，以考虑89Zr标记的细菌的由于放射性衰变和排泄造成的活度降低。
实施例8：通过用52Mn标记对细菌进行体外成像
此实施例展示了如何将依赖于锰的细菌负载52Mn(5.6天的半衰期)、沉积到肠道中、然后使用混合型PET/MRI进行成像。
将细菌负载52Mn：将依赖于锰的细菌物种(例如罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)RC-14)在培养基中与最佳浓度的锰(0.1-0.15mM)一起温育，并且刺激以进行增殖。在已经使细菌在此最佳培养基浓度中增殖后，每个细菌将会掺入大约100,000个Mn原子。然后，将细菌离心并且再悬浮于无锰培养基中。向此培养基中加入每个细菌10-4Bq的52Mn，持续足以用大约40个52Mn原子标记每个细菌而得到大约5.6×10-5Bq/细胞的时间。典型地，对于十亿个细菌，将大约500k Bq的52Mn(10×5×10-5×109Bq)加入到细胞培养基中并且在摇动下温育5天。
收获标记的细菌，并且未掺入到细菌细胞中的52Mn通过离心和在无52Mn培养基或PBS中再悬浮去除，直到上清液不含显著量的52Mn。
52Mn标记的细菌向动物或人类中的递送：在一个实施方案中，将52Mn标记的细菌装载到包装到胶囊中的粪便载体中，并且吞下或通过管经由食管或肛门沉积到肠道中。在其他应用中，将52Mn标记的细菌装载到含有生理浓度的锰的培养基中，并且通过摄入、静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、肌内注射或输液或颅内施用(鞘内或脑室内)递送到动物/人类。
动物/人类中的52Mn浓度的3D映射图的确定：将受试者/患者(动物/人类)放入混合型PET/MRI中，或依次用PET和MRI对其进行成像。重复成像以跟踪放射性活度的移植、肠道透过性和定位的程度的时间进程。考虑到锰是大幅提高R2和R2*的强顺磁性MRI造影剂，在递送52Mn标记的细菌之前，获取动物/人类的R2和/或R2*映射图(基线测量)。然后，在递送52Mn标记的细菌后，PET/MRI数据收集包括每个时间点的R2和/或R2*映射图。
细菌浓度的3-D图像的产生：肠道中的3-D细菌浓度使用上述等式计算。在通过PET检测到显著量的52Mn的情况下，会有在活细胞内的52Mn，以及由于来自细胞死亡的52Mn的释放和来自活细胞的52Mn的可能释放而造成的背景NSU和NSUE中的52Mn。相对于基线的R2/R2*的变化(ΔR2，ΔR2*)与来自相关成像体素中的活细菌的总和的总锰浓度线性相关。当哺乳动物组织中存在锰时，每个细胞的锰的浓度将保持相对恒定，但是由于细胞中的锰与细胞外的库之间的交换可以存在细胞中的52Mn的少量损失。因此，每个细菌的Bq(ATB(t))将会等于体素中的Bq的活度除以ΔR2(或ΔR2*)。这将会使得能够计算肠道中的TB(x,y,z,t)和肠道外部的TBP(x,y,z,t)。在其中ΔR2(或ΔR2*)足够大的一些实验中，此方式就足够了。
在不是这样的情况下，则分析粪便样品以确定NSU和ATB(t)并且分析体液以确定NSUE和ATB(t)。对于肠道，还分析粪便样品以确定每个细菌(罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)RC-14)的52Mn的活度，其考虑了由于增殖的52Mn的稀释。还分析粪便样品用于确定非特异性摄取(NSU)以考虑来自已经死亡的细菌的52Mn释放或已经由活细菌(罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)RC-14)通过与细胞外的库的交换释放的52Mn。
粪便样品的每个细胞的52Mn活度的分析和非特异性摄取(NSU)的确定：将粪便样品放入高分辨率高纯度锗检测器(HPGe)中，并且通过分析52Mn的γ射线光谱来确定每克材料的52Mn的活度(Ac(之前))，所述γ射线光谱不仅包括511KeV湮没放射，而且包括744KeV、935KeV和1434KeVγ射线中的一种或多种。然后，在去除非细胞碎片之后，对样品进行再次计数(Ac(之后))。于是：
NSU＝Ac(之前)-Ac(之后)
52Mn(活)＝Ac(之后)
然后，用以下两种程序中的一种或两种来确定用52Mn标记的活细菌的数量。在一个实施方案中，通过用顺磁性试剂掺杂粪便样品使所述样品处于慢速水交换极限中，并且确定对应于所考虑的细菌(即对于此是实施例为罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)RC-14)的R2*的幅度。在另一个实施方案中，使用新一代测序来确定每克的活细菌的数量。
为了确定体内的肠道外部的细菌浓度，如以上关于粪便所述，分析唾液、血液和/或尿液的样品以确定每个细菌的52Mn活度和NSUE。然后，还可以将52Mn的3-D活度转化为细菌(罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)RC-14)的3-D浓度。将PET和MRI图像叠合，并且MRI图像使得能够相对于在体内的位置定位3-D PET或得自PET的图像并且进行定量。
实施例9：通过用89Zr标记依赖于锰的细菌对细菌进行体内成像
此实施例展示了如何a)将依赖于锰的细菌用89Zr-DBN标记，b)引入到动物/人类中，c)用PET/MRI进行成像，和d)得到这些细菌的浓度的3-D映射图/图像。
依赖于锰的细菌在生理锰浓度下生长至大约100亿个。一旦达到目标数量，就将89Zr-DBN加入到细胞培养物中。对于100亿个细菌，目标标记是0.005Bq/细胞，并且预期的标记效率为大约80％。因此，对于10亿个细胞(一般在500μL的细胞培养物中)，将10MBq加入到经洗涤的细胞中。将其在摇床中在37℃温育60分钟。在温育后，将细胞洗涤四次以去除未与细菌外细胞膜上的蛋白质氨基共价结合的89Zr。
用89Zr标记的依赖于锰的细菌向动物/人类的递送：将这些细菌装载到包装到胶囊中的粪便载体中，并且吞下或通过管经由食管或肛门沉积到肠道中。(注意，在其他实施方案中，可以通过静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、肌内注射或输液和颅内(例如鞘内或脑室内)将89Zr标记的细菌(通过MRI检测细胞内的锰并且通过PET检测89Zr)递送到动物/人类中。)
动物/人类中的89Zr活度和MRI R2和/或R2*值的3-D映射图/图像的确定：将动物/人类放入混合型PET/MRI中，或依次用PET和MRI对其进行成像。首先，在递送89Zr标记的依赖于锰的细菌之前获取基线MRI。将此MRI 3-D数据转化为R2和R2*的3-D分布。然后，在递送89Zr标记的依赖于锰的细菌后的多个时间收集PET/MRI数据，以及时跟踪移植、肠道透过性和迁移的程度。注意，如图26所示，当依赖于锰的细菌的浓度增大时，R2和R2*值线性地增大。然而，因为细菌的R2和R2*处于与局部组织(即哺乳动物细胞)的快速水交换中，所以R2和R2*的量度将不表示单独的细菌。
由PET(89Zr 3-D活度映射图)和MRI(R2和R2*3-D映射图)数据产生依赖于锰的细菌浓度的3-D图像：为了使用以上给出的信息，必须确定以下两个值：a)肠道中和体内肠道外部的89Zr的非特异性摄取，即分别为NSU和NSUE，以及b)肠道内和肠道外部的每个细菌的89Zr活度(以Bq计)，即分别为ATB(t)和ATBE(t)。
NSU的确定：对粪便样品的以89Zr的Bq计的放射性浓度即AC(之前)进行计数。然后，去除非细胞碎片，并且对样品进行再次计数以得到AC(之后)。然后，NSU作为NSU＝AC(之前)–AC(之后)进行计算。
NSUE的确定。对血液样品和/或唾液样品和/或尿液样品的以89Zr的Bq计的放射性和浓度即ACE(之前)进行计数。然后，去除非细胞碎片，并且对样品进行再次计数以得到ACE(之后)。然后，NSUE作为NSUE＝ACE(之前)–ACE(之后)进行计算。
肠道中的每个细菌的Bq即ATB(t)的确定：当已经将依赖于锰的细菌通过暴露于生理浓度的锰而负载锰时，每个细菌的锰原子的数量将会是恒定的。因此，随着浓度(即每单位克的细菌的数量)增大，R2和R2*线性地增大。因此，ATB(t)等于89Zr活度(AC(之后))除以R2和/或R2*的变化。对于粪便样品，这需要测量在递送89Zr标记的细菌之前的粪便样品中的R2和/或R2*。
即ATB(t)＝AC(之后)/Δ(R2或R2*)
其中ΔR2＝R2(之后)–R2(之前)
并且ΔR2*＝R2*(之后)–R2*(之前)
备选地，可以通过新一代测序确定活细菌的浓度。注意，ΔR2和/或ΔR2*可以在慢速或快速水交换下测量。
肠道外部的每个细菌的Bq即ATBE(t)的确定：当已经将依赖于锰的细菌通过暴露于生理浓度的锰而负载锰时，每个细菌的锰原子的数量将会是恒定的。因此，随着浓度(即每单位克的细菌的数量)增大，R2和R2*线性地增大。通过以关于粪便样品所进行的相同方式分析血液样品、尿液样品或唾液样品，则ATBE(t)＝ACE(之后)/Δ(R2或R2*)。
由MRI确定ΔR2和/或ΔR2*：如果锰标记的细菌在肠道中或在肠道外部的一个或多个位置处充分浓缩，则所需的ΔR2或ΔR2*的值由在递送89Zr标记的细菌之前和之后的R2和/或R2*映射图确定。然后，不必分析粪便和/或血液、尿液、唾液样品的R2和/或R2*值。
由PET图像确定NSU和NSUE值：其由PET图像中的89Zr的活度确定，其中ΔR2和ΔR2*值为零。
实施例10：使用NMR/MRI通过测量样品中的R2对细菌进行体外成像
此实施例展示了如何可以体外进行使用NMR或MRI来测量细菌样品中的固有横向驰豫率。
模体制备。样品由培养的细菌制备，固定在明胶模体中，并且在3T下进行成像。图3示出了MRI细胞模体。将细胞洗涤以去除培养基组分(例如游离的金属离子、蛋白质等)；通过以4500×g的离心装载到Ultem孔中；然后固定在球形明胶模体(9cm直径)中。对于表现出高R2和R2*(>100s-1)的细菌，将细菌洗涤并且在4％明胶/PBS中系列稀释以提供具有不同量的活细胞的样品用于MRI。将稀释的细菌装载到Ultem孔中，并且置于4℃达5分钟以允许悬浮的细胞样品在固定在明胶模体中之前凝固。
MR分析。分析每个孔内的每个样品的感兴趣区(ROI)。通过将信号衰减相对于回波时间作图来得到ROI内的平均横向驰豫性测量值(R2、R2*、R2')。还通过制备R2和R2*映射图来评价MR图像中的体素到体素驰豫性的均匀性。
图10示出了卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)ATCC33820在明胶/PBS中的系列稀释后的R2和R2*。卷曲乳酸杆菌(L.crispatus)在明胶/PBS中的稀释后表现出高的横向驰豫率。图10示出了平均值+/-SEM。考虑到仅有一个可辨认的R2*和R2，细菌细胞被确定为处于与明胶/PBS的快速交换中。总的横向驰豫性R2*(以红色显示)主要由不可逆的R2分量(以蓝色显示)组成。
图14示出了固定在明胶模体中的不同细菌的在3T下的MRI的核磁共振(NMR)信号。不同细菌物种的MR测量结果差异很大。尽管在细菌物种之间有自旋-自旋驰豫信号(R2)的重叠，但是校准通过对粪便样品的高分辨NMR驰豫法将会是可能的，允许通过驰豫率鉴定不同的细菌并且通过在各驰豫率下的信号幅度鉴定这些活细胞的数量。对于此技术，通过用顺磁性盐如Mn或Gd掺杂粪便细菌，或通过缓慢降低含有细菌和噬菌体的浆液的水合来处理粪便样品以使不同的细菌处于慢速交换模式中。
在所有情况下，横向驰豫性的R2分量(蓝色柱)在总R2*信号(红色柱)中占支配地位。发现来自卷曲乳酸杆菌(L.gasseri)ATCC33323的突出信号(参见图14)显著高于所测试的任何其他物种(p<0.05)。大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)和鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)GR-1与奇异变形杆菌(P.mirabilis)296和金黄色葡萄球菌(S.aureus)Newman相比均显示出更高的驰豫性(分别为黑色线和灰色线)。使用在此数据集中使用的MRI脉冲序列无法得到(未稀释的)卷曲乳酸杆菌(L.gasseri)ATCC33820的测量结果(图10样品)以覆盖由这些细菌表现出的R2的范围。然而，其他MRI/NMR脉冲序列比如超短回波时间(UTE)和零回波时间(ZTE)在对未稀释样品的R2*进行定量方面将会成功。柱状图示出了平均值+/-SEM(*p<0.05，n＝3-5)。
图15提供了关于另外的物种大肠杆菌(E.coli)(益生菌，共生和泌尿致病性)的数据。大肠杆菌(Escherichia coli)可通过MRI检测。柱状图将大肠杆菌(E.coli)的BL21(DE3)实验室菌株的MR信号与选择的益生菌(Nissle)、共生体(MG1655,25922)和泌尿致病性菌株(67,AD110,GR-12,536,J96)的MR信号进行比较。所有大肠杆菌(E.coli)都表现出较高的横向驰豫率，其R2*几乎完全由R2分量组成，并且几乎没有或没有R2′贡献(R2*＝R2+R2′)。单因素方差分析(one-way ANOVA)表明Nissle(浅灰色线)、25922(深灰色线)和AD110(黑色线)的R2/R2*显著低于大部分其他测试的菌株(*p<0.05)。数据为平均值+/-SEM(n＝3–5)。
细菌的定量。通过系列稀释初始培养物的样品并且一式三份平板接种在优选的琼脂培养基上，来对装载到各Ultem孔中的细菌进行定量。在对CFU进行计数之前，将板需氧地或厌氧地温育，这取决于细菌。在其中每次重复存在20–60个菌落的稀释因子下对菌落进行计数。然后计算装载到各孔中的CFU以用于活细胞与MR测量结果的比较和相关性。
实施例11：使用MRI通过测量R2对细菌进行体内成像
此实施例展示了理解细菌的横向驰豫率可以如何应用于体内MRI。
在一些应用中，将会在将细菌样品施用至宿主中之前完成细菌的R2/R2*的测量以确定由于细菌的存在而造成的R2和R2*的体内变化。
评价细菌益生菌或粪便微生物区系移植(FMT)的分散。此处，通过将微生物区系装载到胶囊中并且吞下这些胶囊或者通过管经由食管或肛门沉积到肠道中，预先评价过R2和R2*的细菌施用至动物或人类。在施用之后，在多个时间点使用MRI序列比如HASTE以基于细菌的高驰豫性或图像内的低信号区来跟踪细菌。磁共振成像可以使我们能够追踪通过肠道的细菌移动和随时间的分散。也可以获得粪便样品用于MRI评估以及16S rRNA基因测序以确认在施用的细菌离开宿主时是否存在所述细菌。
利用肿瘤靶向细菌的横向驰豫性定位肿瘤。在此情况下，首先如实施例10中那样通过MRI测量肿瘤靶向细菌的R2/R2*。然后，通过摄入、输液或注射(包括静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、肌内和颅内(鞘内或脑室内))途径将这些细菌施用至具有已知肿瘤的动物。在细菌施用之前和之后，均使用用于解剖学成像的MR序列比如HASTE和T2*和T2依赖性脉冲序列对动物进行成像以提取R2*和R2，在施用后对多个时间点进行成像，利用细菌的横向驰豫性来跟踪其体内移动并且定位肿瘤。这在小肿瘤或转移的情况下可以尤其有用，因为与肿瘤自身相比可以更容易地检测细菌。造影增强剂和/或纳米粒子可以用于在施用之前标记细菌并且改善体内检测。
膀胱癌复发率在5年时可以高达66％，并且在15年时可以高达88％。BCG最初作为皮下接种疫苗开发以预防结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)[结核病]感染，并且是一种减毒的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(牛的)菌株(卡介苗-BCG(BacillusCalmette–Guérin-BCG))。BCG目前被认为是对中等和高风险非浸润性膀胱肿瘤的最有效的治疗。典型的是经尿道膀胱肿瘤切除术，然后每周进行高剂量BCG的膀胱灌注。尽管在BCG后的复发率和进展率显著降低，但是几乎一半的患者没有反应，并且疾病甚至可能进展。BCG疫苗预防癌症复发的机制尚未完全阐明，但是BCG需要与膀胱壁相互作用。BCG利用特异性结合蛋白与纤连蛋白结合，导致诱导CD8+ T细胞和自然杀伤细胞。
考虑到BCG是一种细菌并且可能可以通过如上所述的类似方法进行标记，这将会提供此技术在膀胱癌中的多种成像应用。这样的应用可以用作临床或研究工具以更好地理解BCG功效。对BCG的标记可以使得能够对已经附着至膀胱中的癌症的细胞进行成像，这可以使得能够更清楚地了解关于疾病严重程度的临床表现。另一个应用可以使得能够评估保持在所述部位的BCG的量，其可以与BCG自身以及其他疗法的治疗效果相关。尽管通常认为BCG较安全，但是在少数情况下(～5％)，可能存在与其使用有关的严重感染或其他毒性。因此，体内BCG的标记和示踪可以有助于这些不良事件的早期检测，例如在疑似有膀胱-肾BCG回流的情况下，膀胱内容物(一般为尿液)上升/逆转到输尿管并且到肾，在那里微生物可能造成感染或脓毒症风险。使用细菌如标记的BCG的MRI和/或PET成像，可以实时检测在这些部位的感染以改善晚期膀胱癌的治疗和效果。除了膀胱癌应用以外，还可能标记任何具有微生物基体的疫苗以在施用后追踪在宿主中的微生物扩散和定位。
实施例12：对细菌的3D分布进行定量
在摄入后前七天时间跨度内的纵向PET/MRI采集中进行切割。参照猪解剖指南在3D切片器中使用MRI采其手动分割器官。同时将3D感兴趣区施加于获取的PET图像以确定各个器官中的平均和最大活度浓度以及总活度。
剂量学：使用由猪中的反复成像获得的时间活度曲线将89Zr标记的细菌的放射估算为特定器官和全身的有效剂量。
剂量也可以通过与关于与89Zr具有类似剂量学的111In报告的剂量进行比较来估算。猪中的预试验数据表明，摄入的放射性活度中的99％类似于非消化性固体的时间表(即肠道通过时间)被排泄出。当使用放射性同位素111In测量肠道通过时间时，典型的有效剂量为0.35mSv/MBq(假设与111In类似的剂量学，即28mSv/80MBq的89Zr)。考虑到小于1％的剂量从猪的胃肠道中迁移出，通过与静脉内注射111In标记的白细胞比较估算有效剂量得到0.59mSv/MBq(即来自易位到肠道外的89Zr标记的细菌(小于1MBq)的剂量会小于0.6mSv)。有效剂量由肠道中的活度决定，最大的器官剂量可能是大肠：由111In研究估算为1.9mGy/MBq。剂量学的另一个方面涉及89Zr标记的细菌。因为放射毒性将会取决于细菌的放射耐受性和来自相邻细胞的放射，允许的Bq/细胞使用功能性测定来确定。
实施例13：通过用89Zr或同时用89Zr和52Mn标记对依赖于锰的细菌进行体外和体内成像
PET成像比MRI R2/R2*成像更敏感。在高浓度的依赖于锰的细菌下，如果用89Zr标记细菌，则可以同时检测89Zr和R2/R2*的变化。因为每个细菌的89Zr随着细菌增殖而减少，所以需要每个细菌的89Zr的值以将89Zr的3D图像转换为细菌浓度的3D图像。如果依赖于锰的细菌在具有生理浓度的锰的组织培养物中生长，则当细菌在引入到哺乳动物组织中在生理条件下增殖时，R2/R2*影响将会是恒定的。在生物组织中，发明人示出了这些细菌将会处于与哺乳动物组织环境的快速水交换中，并且R2/R2*的变化(比较在施用依赖于锰的细菌前后进行的测量)与89Zr浓度线性相关(图12)。
将以(0.5Bq)×((细菌的表面积)/(10μm半径的球体的表面积))的每个细菌的目标浓度用89Zr标记依赖于锰的细菌的一个或多个选定菌株。如在先前的实施例中所述，此89Zr标记的细菌将被洗掉未结合的89Zr，可能与其他材料(例如排泄物)混合，并且引入到生物样品中(用于体外研究)或引入到生命系统中(用于体内研究)。在引入之前，将会对样品/生命系统进行成像以确定R2/R2*的基线值。然后，在引入后的多个时间，将会同时用PET和MRI对样品/生命系统进行成像以确定89Zr活度和R2/R2*值之间的关系(对于体内研究，将确定89Zr活度和R2/R2*值二者的3D分布)。如果细菌处于快速水交换模式中，则R2/R2*的变化将与细菌浓度相关。通过测量在该位置的89Zr活度，每个细菌的89Zr将作为在时间t的89Zr活度除以由在相同时间t的ΔR2/R2*确定的在时间t存在的细菌数量进行计算。将对于所考虑的每个生物系统校准ΔR2/R2*与细菌浓度的相关性。如果要由生物样品比如由粪便物或尿液材料进行每个细菌的89Zr的确定，则也可以由ΔR2/R2*进行所述确定。但是如果处理样品以使其从快速水交换模式变为慢速水交换模式，则可以进行更准确的确定。然后，可以使用在与特异性的依赖于锰的细菌对应的R2值下的样品的绝对R2/R2*代替R2和/或R2*的变化。
依赖于锰的细菌也可以用52Mn(实施例8)以及89Zr标记。尽管在89Zr和52Mn二者同时存在的情况下PET不能将它们区分开，但是可以通过γ射线光谱法将它们区分开。(89Zr可以通过对在89Zr衰变的99％的时间中释放的908KeVγ射线进行计数来定量，因为此γ射线填充了89Y中的同质异能跃迁。52Mn可以通过检测与52Cr的能级相关和与100％的52Mn衰变相关的多种不同γ射线(包括在1,434KeV下的γ射线)的数量来定量。)注意，每个细菌的52Mn浓度也会随增殖而降低。然而，会发生由于细菌和细胞外锰之间的锰交换导致的其他52Mn损失。而89Zr标记物会由于其他机制比如来自螯合配合物的损失而损失。作为时间的函数的这些不同的52Mn和89Zr的损失可以用于计算非特异性结合常数，并且因此更准确地估算每个细菌的89Zr活度和每个细菌的52Mn活度。
上述方法可以具有多种生物医学用途，包括来自粪便移植材料和其他来源的细菌的体内细胞示踪以确定移植的功效、持久性和易位，以及测量肠道细菌透过性和迁移的程度。
上述方法还可以用于筛选用于粪便微生物区系移植(FMT)的供体。关于肠道细菌的定居和通过时间的信息以及肠道细菌的透过性和迁移的程度可以提供关于供体FMT用于治疗目的的适宜性的信息。
在包括猪、狗、羊、猫和兔的大动物中的肠道细菌的非侵入性成像研究中，上述方法也可以与对报道基因进行成像一起使用。光学报道基因比如生物发光或荧光的使用可以用于校准每个细菌的89Zr标记物的数量。这将会使得能够用89Zr-DBN标记细菌细胞，以及稳定地用光学报道基因转染细菌细胞。因为光学信号不会由于细胞增殖而被稀释，并且仅在活细胞上报告，所以其可以提供粪便样品中的活细菌的数量。如果对同一样品的89Zr进行计数，则将确定出每个活细菌的89Zr的活度。这可以比人类研究中需要的粪便样品处理简单，在所述人类研究中活细菌的数量需要通过非成像方法(比如确定菌落形成单位的数量)来确定。
尽管本说明书主要涉及使用89Zr和111In作为放射性同位素，但是如上所述可以使用其他放射性同位素。例如，不是将89Zr用于标记来进行PET成像，而是可以用64Cu或52Mn替代89Zr。在另一个实例中，不是将111In用于标记来进行SPECT成像，而是可以使用其他单光子发射放射性同位素比如177Lu或225Ac替代111In。
在这样的情况下，成像顺序可以根据所使用的放射性同位素和放射性同位素的物理(或生物)半衰期进行改进。对于52Mn，可以在最初12小时之后每5.5天对受试者进行一次成像。对于177Lu，可以在最初12小时之后每6.6天对受试者进行一次成像。对于225Ac，可以在最初12小时之后每10天对受试者进行一次成像，直到受试者中不再检测到放射性同位素。
实施例14：89Zr-DBN标记的P4P噬菌体与大肠杆菌(E.coli)MG1655的共同培养。
在大肠杆菌(E.coli)MG1655的液体培养物中扩增PreForPro(P4P)噬菌体(LH01-肌尾噬菌体(Myoviridae)、LL5-长尾噬菌体(Siphoviridae)、T4D-肌尾噬菌体(Myoviridae)和LL12-肌尾噬菌体(Myoviridae))，然后在放射性标记之前，将其分离，渗析，通过0.2μm膜过滤，并且进行定量。用1.05MBq的89Zr-DBN放射性标记3.01×109噬斑形成单位(PFU)的这些噬菌体，标记效率为36％。使用Centricon过滤器(标称分子量极限(NMWL)30kDa)去除未结合的放射性标记物，并且回收7.33×106PFU的放射性标记的噬菌体。
将标记的噬菌体接种到共同培养装置的一个室中，大肠杆菌(E.coli)MG1655在由0.2μm过滤器分隔开的另一个室中。在37℃进行共同培养，并且在多个时间点获得来自各室的1mL样品以对89Zr活度进行定量。将来自细菌室的样品以10,000×g沉淀1分钟以将上清液与细菌沉淀物分离。将沉淀物用PBS洗涤三次，然后使用井式计数器测量上清液(不包括洗涤液)、沉淀物和噬菌体样品中的89Zr活度。
发现在细菌室中的放射性活度随着噬菌体移动穿过过滤器而增大时，噬菌体室中的89Zr活度随着时间降低。感染并且溶解大肠杆菌(E.coli)MG1655细胞的放射性标记的噬菌体预期在细菌室的上清液中，并且可以通过此上清液的噬斑测定来检测。尽管结合并且感染细菌但是不溶解细菌的噬菌体预期在沉淀物中，但是在此部分中存在非常少的活度。
表2概述了在上述各微生物中获得的89Zr-DBN放射性标记效率。
表2：微生物中的89Zr-DBN放射性标记效率
实施例15：对真菌和酵母菌的标记
此实施例展示了理解真菌和酵母菌的横向驰豫率可以如何应用于体内MRI。
在一些应用中，受试者中的R2/R2*的测量将在施用真菌/酵母菌之前进行，以确定通过引入真菌或酵母菌造成的R2和R2*的体内变化。
评价来自工业成分、食品、益生菌或粪便微生物区系移植(FMT)的酵母菌的分散。酵母菌在生产多种重要物质比如乙醇(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、食品(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和益生菌(例如布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii))的工业中是重要的。酵母菌还是人类和多种物种的微生物组中的一部分。尽管该微生物组与其病毒和细菌对应物相比在物种数量和生物质方面都较小，但是真菌/酵母菌被认为对微生物区系的其余部分和其他因素比如免疫发育具有重要影响(van Tilburg Bernardes等人，2020)。
此处，通过将预先评价过R2和R2*的89Zr-DBN标记的真菌或酵母菌装载到胶囊或食物中并且摄入它们或通过管经由食管或肛门沉积到肠道中，将它们施用至受试者。在施用之后，在多个时间点使用MRI序列比如HASTE以基于它们的高驰豫性或图像内的低信号区来跟踪酵母菌或真菌。磁共振成像会使我们能够追踪真菌/酵母菌通过肠道的移动及其随时间的分散。也可以获得粪便样品用于MRI以及18S rRNA基因测序，以确认在施用的真菌或酵母菌离开宿主时是否存在所述真菌或酵母菌。
评价临床上重要的酵母菌和真菌的致病机理。真菌和酵母菌(例如白念珠菌(Candida albicans)、隐球菌(Cryptococcus))的医学重要性是巨大且不断增长的，尤其是与其他慢性免疫受损疾病比如人类免疫缺陷病毒(HIV；仅全球就有四千五百万人感染)(Rodrigues,2020)相关。真菌耐药性的再次兴起也日益增长，并且这些微生物的致病机理具有大的医学意义。
鉴于酵母菌具有可以通过本文所述的方法(例如89Zr-DBN)标记的细胞表面蛋白，可以有此技术在追踪真菌致病机理中的多种成像应用，以实时地评价不同治疗和药物的功效。可以通过摄入、输液或注射(包括静脉内、动脉内、皮下、腹腔内、肌内和颅内(鞘内或脑室内))途径将标记的真菌施用至受试者。在真菌施用之前和之后，均使用用于解剖学成像的MR序列比如HASTE以及使用T2*和T2依赖性脉冲序列对受试者进行成像以提取R2*和R2，在施用后对多个时间点进行成像，利用真菌的横向驰豫性来跟踪其体内移动。
实验16：标记来自真菌和酵母菌的病毒样颗粒用于检测医学上重要的生物体。
细菌受噬菌体折磨，而真菌和酵母菌也受它们自身的病毒类型折磨。已知例如广泛使用且工业上重要的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有与哺乳动物dsRNA病毒的部分相似的双链RNA病毒，以及在序列上与一些细菌的噬菌体最接近的单链RNA病毒。还存在作为各种染色体编码蛋白质的自繁殖的淀粉状蛋白的“病毒样”实体或朊病毒(Wickner RB)。鉴于已知这些病毒实体中的一些对非常选择性的目标宿主具有特异性，可能可以如以上关于细菌的噬菌体所述对它们进行表面标记。然后可以将这些标记的噬菌体通过摄入递送到宿主中或注射到宿主中，由此它们与其特异性真菌或酵母菌目标会合，从而以噬菌体附着至其细菌宿主的相同方式照亮它。
在一个实施方案中，公开了一种直接地(例如，使用89Zr-DBN或52Mn或111In)对真菌和酵母菌进行成像的方法，或通过以下方式间接地对真菌和酵母菌进行成像的方法：(例如，用89Zr-DBN)标记已知感染感兴趣的酵母菌的颗粒，使那些颗粒与感兴趣的真菌或酵母菌接触，并且使用PET/MRI和PET/CT对生物体进行成像，因为它们将与标记的噬菌体颗粒共定位。在一个推论实施方案中，当未标记的噬菌体颗粒发现并且感染并且溶解放射性标记的真菌或酵母菌时，它们可以用于衰减放射性信号。
尽管已经详细地描述了本发明及其优点，但是应理解，在不背离由所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，在本文中可以进行各种改变、替换和变化。此外，本申请的范围不打算限于说明书中所描述的过程、物质组成、手段、方法和步骤的具体实施方案。本文中引用的所有参考文献都通过引用结合于此。
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Claims (65)
1.一种对受试者中的微生物区系进行成像的方法，所述方法包括：
用放射性同位素标记细菌或噬菌体；
将放射性同位素标记的细菌或噬菌体引入到所述受试者中；以及
对所述受试者进行功能和/或结构成像。
2.权利要求1所述的方法，其中所述标记是对细菌的标记。
3.权利要求2所述的方法，其中所述细菌是肠道细菌。
4.权利要求3所述的方法，所述方法还包括在标记之前从所述受试者的粪便物中分离所述肠道细菌。
5.权利要求2所述的方法，其中标记肠道细菌，并且所述肠道细菌包括卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)ATCC33820。
6.权利要求2-5中任一项所述的方法，所述方法还包括在将放射性同位素标记的肠道细菌引入到所述受试者中之前将其混入粪便物中。
7.权利要求2-6中任一项所述的方法，其中引入所述放射性同位素标记的细菌包括：所述受试者对所述放射性同位素标记的细菌的摄入，或通过静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、皮下或腔内施用将所述放射性同位素标记的细菌施用到所述受试者中。
8.权利要求7所述的方法，其中引入放射性同位素标记的肠道细菌包括将所述放射性同位素标记的肠道细菌放入所述受试者的十二指肠中。
9.权利要求2-8中任一项所述的方法，其中所述放射性同位素是89Zr、64Cu或52Mn。
10.权利要求9所述的方法，其中所述放射性同位素是89Zr，并且用包含89Zr-去铁敏-NCS(89Zr-DBN)的标记试剂标记所述细菌。
11.权利要求9所述的方法，其中所述放射性同位素是52Mn。
12.权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述成像包括同时的正电子发射断层扫描(PET)成像和磁共振成像(MRI)。
13.权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述成像包括依次的正电子发射断层扫描(PET)成像和磁共振成像(MRI)。
14.权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述成像包括正电子发射断层扫描(PET)成像和计算机断层扫描(CT)成像。
15.权利要求2-8中任一项所述的方法，其中所述放射性同位素是111In、177Lu或225Ac。
16.权利要求15所述的方法，其中所述放射性同位素是111In，并且用包含111In-DOTA-NHS的标记试剂标记所述细菌。
17.权利要求15或16所述的方法，其中所述成像包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和磁共振成像(MRI)，任选地同时包括。
18.权利要求15或16所述的方法，其中所述成像包括依次的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和磁共振成像(MRI)。
19.权利要求15或16所述的方法，其中所述成像包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和计算机断层扫描(CT)成像。
20.权利要求9-19中任一项所述的方法，其中所述成像包括在施用标记物后的前12小时，每两小时对所述受试者进行成像。
21.权利要求20所述的方法，其中所述成像包括每两小时对所述受试者进行成像30分钟。
22.权利要求21所述的方法，其中所述成像还包括在最初的12小时后，大约每个放射性同位素物理(或生物)半衰期对所述受试者进行一次成像，直到在所述受试者中不再检测到所述放射性同位素。
23.权利要求1所述的方法，其中所述标记是对噬菌体的标记。
24.权利要求23所述的方法，其中所述噬菌体由于其感染待成像的细菌的能力而被选择。
25.权利要求23所述的方法，其中所述噬菌体由于对待成像的细菌的特异性而被选择。
26.权利要求23所述的方法，其中所述噬菌体选自LH01-肌尾噬菌体科(Myoviridae)、LL5-长尾噬菌体科(Siphoviridae)、T4D-肌尾噬菌体科(Myoviridae)和LL12-肌尾噬菌体科(Myoviridae)，并且待成像的细菌是大肠杆菌(E.Coli)。
27.权利要求23所述的方法，其中所述噬菌体是肠道噬菌体。
28.权利要求27所述的方法，所述方法还包括在标记之前从所述受试者的粪便物中分离所述肠道噬菌体。
29.权利要求23-28中任一项所述的方法，所述方法还包括在将放射性同位素标记的肠道细菌引入到所述受试者中之前将其混入粪便物中。
30.权利要求23-29中任一项所述的方法，其中引入所述放射性同位素标记的噬菌体包括：所述受试者对所述放射性同位素标记的噬菌体的摄入，或将所述放射性同位素标记的噬菌体移植到所述受试者中。
31.权利要求30所述的方法，其中将放射性同位素标记的噬菌体静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、皮下或腔内施用到所述受试者中。
32.权利要求30所述的方法，其中引入放射性同位素标记的肠道噬菌体包括将所述放射性同位素标记的肠道噬菌体放入所述受试者的十二指肠中。
33.权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述放射性同位素是89Zr、64Cu或52Mn。
34.权利要求33所述的方法，其中所述放射性同位素是89Zr，并且用包含89Zr-去铁敏-NCS(89Zr-DBN)的标记试剂标记所述噬菌体。
35.权利要求33所述的方法，其中所述放射性同位素是52Mn。
36.权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述成像包括同时的正电子发射断层扫描(PET)成像和磁共振成像(MRI)。
37.权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述成像包括依次的正电子发射断层扫描(PET)成像和磁共振成像(MRI)。
38.权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述成像包括正电子发射断层扫描(PET)成像和计算机断层扫描(CT)成像。
39.权利要求23至32中任一项所述的方法，其中所述放射性同位素是111In、177Lu或225Ac。
40.权利要求39所述的方法，其中所述放射性同位素是111In，并且用包含111In-DOTA-NHS的标记试剂标记所述噬菌体。
41.权利要求39或40所述的方法，其中所述成像包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和磁共振成像(MRI)，任选地同时包括。
42.权利要求39或40所述的方法，其中所述成像包括依次的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和磁共振成像(MRI)。
43.权利要求39或40所述的方法，其中所述成像包括单光子发射计算机断层扫描(SPECT)成像和计算机断层扫描(CT)成像。
44.权利要求33-43中任一项所述的方法，其中所述成像包括在施用标记物后的前12小时，每两小时对所述受试者进行成像。
45.权利要求44所述的方法，其中所述成像包括每两小时对所述受试者进行成像30分钟。
46.权利要求45所述的方法，其中所述成像还包括在最初的12小时后，大约每个放射性同位素物理(或生物)半衰期对所述受试者进行一次成像，直到在所述受试者中不再检测到所述放射性同位素。
47.一种对受试者中的微生物区系进行定量3D成像的方法，所述方法包括：
用放射性同位素标记细菌、病毒、噬菌体或其他微生物；
将放射性同位素标记的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物引入到所述受试者中；
对所述受试者进行功能和/或结构成像；
确定来自所述受试者的生物样品的放射性；以及
将所述生物样品的放射性与图像进行映射以产生细菌、病毒、噬菌体或其他微生物分布的定量3D图像。
48.权利要求47所述的方法，所述方法还包括在引入所述放射性同位素标记的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物之前从所述受试者收集生物样品。
49.权利要求48所述的方法，所述方法还包括在引入所述放射性同位素标记的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物之后，确定所述生物样品的放射性和每个细菌细胞、病毒、噬菌体或其他微生物的放射性同位素标记物的平均数。
50.权利要求49所述的方法，其中使用经校准的放射性计数检测器来确定所述生物样品的放射性。
51.权利要求50所述的方法，所述方法还包括将由所述成像得到的一个或多个图像与每个细菌细胞、病毒、噬菌体或其他微生物的放射性组合以产生每个体素的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物数量的3D图像。
52.权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述生物样品是粪便样品，并且成像的细菌、病毒、噬菌体或其他微生物分别是肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物。
53.权利要求52所述的方法，所述方法还包括分割所产生的3D图像以鉴定所述受试者的肠道，并且确定在所述受试者肠道中的放射性同位素标记的肠道微生物区系的数量和位置。
54.权利要求47-51中任一项所述的方法，其中所述生物样品是尿液样品、血液样品和唾液样品中的一种或多种。
55.权利要求54所述的方法，所述方法还包括分割所产生的3D图像以鉴定所述受试者的肠道外部的感兴趣区，并且确定在所述感兴趣区中的放射性同位素标记的微生物区系的数量和位置。
56.权利要求49所述的方法，其中使用以下各项分析所述生物样品以确定存在的细菌的种类和/或数量：a)新一代测序，和/或b)NMR驰豫法，其中将所述生物样品置于慢速水交换中。
57.权利要求56所述的方法，所述方法还包括将细菌的数量和种类与由所述成像得到的一个或多个图像组合以确定所述生物样品中的所述细菌、病毒、噬菌体或其他微生物的放射性和每个细菌的放射性。
58.一种对受试者的肠道中的微生物区系进行成像的方法，所述方法包括：
用放射性同位素标记肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物；
将放射性同位素标记的肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物引入到所述受试者中；以及
对所述受试者进行功能和/或结构成像。
59.权利要求58所述的方法，所述方法还包括：
从所述受试者或其他受试者的粪便物中分离所述肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物。
60.权利要求58或59所述的方法，所述方法还包括：
在引入到所述受试者中之前将所述放射性同位素标记的肠道细菌、肠道病毒、肠道噬菌体或其他肠道微生物混入粪便物中。
61.权利要求2-22中任一项所述的方法，其中对所述受试者进行功能和/或结构成像提供了第一图像，在对所述受试者进行功能和/或结构成像之后，所述方法还包括：
选择对标记的细菌具有特异性的噬菌体，并且将所述噬菌体施用至所述受试者；
第二次对所述受试者进行功能和/或结构成像以提供第二图像；
比较所述第一图像和所述第二图像，
其中所述第一图像和所述第二图像之间的区别指示所述细菌的位置。
62.权利要求23-46中任一项所述的方法，其中对所述受试者进行功能和/或结构成像提供第二图像，在用所述同位素标记所述噬菌体之前，所述方法还包括：
将细菌引入到所述受试者中；
其中，所述噬菌体由于其对所述细菌的特异性而被选择。
63.一种对受试者中的微生物区系进行成像的方法，所述方法包括：
对所述受试者进行功能和/或结构成像以得到第一图像；
将依赖于锰的细菌引入到所述受试者中；以及
再次对所述受试者进行功能和/或结构成像以得到第二图像；
比较所述第一图像和所述第二图像，其中成像的变化指明所述细菌的位置。
64.权利要求63所述的方法，其中在引入到所述受试者中之前，将所述依赖于锰的细菌与粪便物混合。
65.权利要求63或64所述的方法，其中所述功能和/或结构成像是通过MRI进行，并且所述第一图像和所述第二图像是R2/R2*图像。
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