CN115443331A - 用细胞群体进行的方法和测定 - Google Patents

用细胞群体进行的方法和测定 Download PDF

Info

Publication number
CN115443331A
CN115443331A CN202180029444.6A CN202180029444A CN115443331A CN 115443331 A CN115443331 A CN 115443331A CN 202180029444 A CN202180029444 A CN 202180029444A CN 115443331 A CN115443331 A CN 115443331A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
population
target moiety
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180029444.6A
Other languages
English (en)
Inventor
特雷弗·罗杰斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
StemCell Technologies Inc
Original Assignee
StemCell Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by StemCell Technologies Inc filed Critical StemCell Technologies Inc
Publication of CN115443331A publication Critical patent/CN115443331A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0081—Purging biological preparations of unwanted cells
    • C12N5/0087—Purging against subsets of blood cells, e.g. purging alloreactive T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G01N33/54333—Modification of conditions of immunological binding reaction, e.g. use of more than one type of particle, use of chemical agents to improve binding, choice of incubation time or application of magnetic field during binding reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1402—Data analysis by thresholding or gating operations performed on the acquired signals or stored data
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1488—Methods for deciding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70517—CD8
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G01N2333/7055—Integrin beta1-subunit-containing molecules, e.g. CD29, CD49
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7155—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids
    • G01N2446/86—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids the coating being pre-functionalised for attaching immunoreagents, e.g. aminodextran

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本公开涉及从样品中富集靶部分阳性的第一细胞群体和/或靶部分阳性的第二细胞群体的方法，其中所述第一细胞群体中靶部分的水平相对低于所述第二细胞群体中靶部分的水平。本公开的方法也可适用于确定样品中靶部分阳性的不同细胞群体的测定，以及优化富集条件的测定。最后，本公开涉及可用于实施所述方法和测定的组件的试剂盒。

Description

用细胞群体进行的方法和测定
本申请要求于2020年2月20日提交的美国临时专利申请序列号62/979,025的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及细胞的分离，更具体地说，涉及以不同水平的靶部分为特征的样品中细胞群体的优先富集。
背景技术
多细胞生物包含大量细胞和这些细胞的产物。多细胞生物的细胞可以在各种不同的基础上分类。例如，可以基于细胞的结构和/或功能来区分细胞。或者，细胞可以根据它们的来源、发育阶段或组织驻留来分类。依赖于基因表达标记或基因表达的表现，例如通过将肽或蛋白质定位于细胞表面，也可以促进细胞的分类。
鉴于多细胞生物的复杂性及其大量的细胞类型，细胞分离技术极大地帮助了对这些细胞的研究。分离细胞类型的早期模式是基于对底物的差异粘附、在特定培养条件下的优先存活/扩增、大小分级或基于差异沉降速率(例如在密度梯度介质中)来实现的。最近分离细胞类型的模式利用了如可能存在于细胞表面的靶部分的存在/不存在，以及结合配偶体对这种靶部分的识别。
STEMCELL Technologies和其他公司已经将免疫磁性细胞分离试剂商业化，这些试剂可用于进行阳性或阴性细胞分离。在阳性细胞分离中，感兴趣的细胞是在它呈现感兴趣的靶部分的基础上被分离的。在阴性细胞分离中，感兴趣的细胞是在非感兴趣的细胞呈现感兴趣的靶部分的基础上分离的。这两种方法的主要区别在于阴性细胞分离产生“未接触的细胞”，这在下游应用中可能具有特殊的用途。事实上，使用阳性方法或阴性方法或两者的连续分离通常用于产生感兴趣的细胞群体。
然而，当感兴趣的细胞群体与不感兴趣的细胞对于相同的靶部分呈阳性时，这些方法可能会失败。因此，需要基于靶部分的不同水平分开和/或分离细胞的改进方法。
发明内容
本公开涉及基于靶部分的存在水平分离样品中靶部分阳性细胞群体的方法，以及基于靶部分的存在水平鉴定样品中不同的靶部分阳性细胞群体的测定。
在本公开的一个主要方面，提供了从样品中富集(或分离)靶部分阳性的第一细胞群体和/或靶部分阳性的第二细胞群体的方法，包括用颗粒标记第一细胞群体和第二细胞群体以形成细胞:颗粒复合物；将细胞:颗粒复合物与富集试剂接触，以基本上脱去第一群体的颗粒标记；和从样品中分离第一群体，其中第一细胞群体中靶部分的水平相对低于第二细胞群体中靶部分的水平。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括将样品中的残余细胞:颗粒复合物与分离试剂接触，以基本上将所述第二群体与颗粒分离。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括从样品中分离所述第二群体。
在一个实施方案中，所述靶部分是细胞表面标志物。在一个实施方案中，所述标志物是人CD271、人CD25、人CD49d、小鼠CD138、人CD8或人CD56。
在一个实施方案中，所述颗粒包被有聚合物。在一个实施方案中，所述颗粒响应于磁场。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括在步骤a)之后和步骤c)之前从样品中分离细胞:颗粒复合物。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括提供相对于靶部分水平的至少饱和量的颗粒。
在一个实施方案中，用颗粒标记第一细胞群体或第二细胞群体是由抗体或抗体片段介导的。在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含颗粒特异性成员和靶部分特异性成员。在一个实施方案中，颗粒特异性成员直接或间接连接到靶部分特异性成员。在一个实施方案中，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员形成双特异性复合物。
在一个实施方案中，富集试剂的配制不同于分离试剂。在一个实施方案中，富集试剂和分离试剂各自包括聚合物。在一个实施方案中，与分离试剂相比，富集试剂中聚合物的浓度相对较低。在一个实施方案中，聚合物是PEG(聚乙二醇)、基于PEG的或PEG样的。在一个实施方案中，聚合物是葡聚糖、基于葡聚糖的或葡聚糖样的。
在一个实施方案中，该方法可以进一步包括在步骤a)之后和步骤b)之前从样品中富集细胞:标记复合物。
在本公开的另一个主要方面，提供了用于鉴定样品中靶部分阳性的不同细胞群体的测定，包括用颗粒标记靶部分以形成细胞:颗粒复合物；和通过流式细胞术获得细胞:颗粒复合物的读数，其中所述第一细胞群体中靶部分的水平(相对)低于所述第二细胞群体中靶部分的水平。
在一个实施方案中，所述第一群体的细胞:颗粒复合物的读数不同于所述第二群体的细胞:颗粒复合物的读数。在一个实施方案中，所述第一群体的细胞:颗粒复合物和所述第二群体的细胞:颗粒复合物两者的读数不同于未复合的靶部分阳性细胞的读数。在一个实施方案中，读数是侧向散射分布。
在一个实施方案中，所述靶部分是细胞表面标志物。在一个实施方案中，所述标志物是人CD271、人CD25、人CD49d、小鼠CD138、人CD8或人CD56。
在一个实施方案中，所述颗粒响应于磁场。
在一个实施方案中，所述测定可进一步包括提供相对于第一群体和第二群体的靶部分水平的至少饱和量的颗粒。
在一个实施方案中，用颗粒标记第一细胞群体或第二细胞群体是由抗体或抗体片段介导的。在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含颗粒特异性成员和靶部分特异性成员。在一个实施方案中，颗粒特异性成员直接或间接连接到靶部分特异性成员。在一个实施方案中，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员形成双特异性复合物。
在一个实施方案中，所述测定还可以包括以靶部分上的侧向散射分布进行门控。
在一个实施方案中，所述测定还可以包括在获取读数之前从样品中分离细胞:颗粒复合物。
在一个实施方案中，所述测定还可以包括将细胞:颗粒复合物与富集试剂接触，并通过流式细胞术重新获取读数，以评估读数的偏移。因此，在本公开的另一个主要方面，提供了用于测量细胞:颗粒复合物对富集试剂的剂量反应性的测定。
在本公开的另一个主要方面，提供了用于从样品中富集靶部分呈阳性的第一细胞群体和/或靶部分呈阳性的第二细胞群体的试剂盒，其包括含有聚合物包被的颗粒的管；含有抗体组合物的管，所述抗体组合物包括与靶部分特异性成员连接的颗粒特异性成员；含有富集试剂的管；和任选的含有分离试剂的管。
在一个实施方案中，富集试剂是含有PEG或含有葡聚糖的。
在一个实施方案中，分离试剂是含有PEG或含有葡聚糖的。
在一个实施方案中，PEG或葡聚糖在富集试剂中的浓度相对低于在分离试剂中的浓度。
从下面的详细描述中，本发明的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅仅是以说明的方式给出的，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
为了更好地理解本文描述的各种实施方案，并且为了更清楚地示出这些各种实施方案可以如何实现，将通过实施例的方式参考附图，附图示出了至少一个示例性实施方案，并且现在对其进行描述。附图不旨在限制本文描述的教导的范围。
图1显示了多种人ES和人iPS细胞系的神经嵴细胞分化的结果。在mTeSRTM 1或TeSRTM-E8TM中维持各种ES和iPS细胞系，然后使用STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒(STEMCELLTechnologies)进行分化。A)人胚胎干细胞(“ES”)和诱导多能干细胞(“iPS”)有效分化成SOX10+神经嵴细胞(85.5±1.6％；平均值±SEM；n＝9)。B)A)的培养物中PAX6+神经外胚层细胞的水平以细胞系依赖的方式变化(5.6±0.7％；平均值±SEM；n＝9)。数字为平铺图像中DAPI总量的阳性百分比。圆点表示单个实验的结果。
图2显示了在mTeSRTM 1(STEMCELL Technologies)中维持的未分化H9细胞和使用STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒分化为神经嵴细胞的H9细胞中CD271水平的流式细胞术图。在第6天，使用ACCUTASETM(STEMCELL Technologies)将细胞分解成单细胞悬浮液。细胞以DAPI-活细胞进行门控。虽然未分化的H9细胞和分化为神经嵴细胞的H9细胞表现出相对一致的表面抗原CD57表达，但未分化的H9细胞的特征在于表面CD271水平(A)相对于分化的神经嵴细胞的表面CD271水平(B)较低。
图3显示了使用STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒分化的H9细胞或B004细胞中CD49d表面水平的流式细胞术图。细胞以DAPI-活细胞进行门控。在测定的H9细胞中，CD49d高(A)和CD271高(B)的表达分别为90％和87％。在测定的B004细胞中，CD49d高(C)和CD271高(D)的表达分别为34％和33％。
图4显示了单一表面抗原CD271可以区分PAX6+神经细胞和SOX10+神经嵴细胞。测定在STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒中分化的F016细胞的表面CD271水平(A)和细胞内SOX10和PAX6水平(B)。测定在STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒中分化的R038细胞的表面CD271水平(C)和细胞内SOX10和PAX6水平(D)。测定在STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒中分化的H1细胞的表面CD271水平(E)和细胞内SOX10和PAX6水平(F)。在固定和透化之前，使用GloCellTMFixable Viability Dye Violet 450(STEMCELL Technologies)标记细胞。通过排除GloCellTM Fixable Viability Dye 450信号来对活细胞进行门控。使用荧光染料和同种型匹配的对照抗体来确定基线荧光信号。对每个流式细胞术图进行门控，以显示CD271低细胞(灰点)或CD271高神经嵴细胞(黑点)。对于测试的所有三种细胞系，SOX10表达与CD271高细胞重叠，而PAX6表达与CD271低细胞重叠。
图5显示了CD271在流式细胞术图中的差异表达。使用STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒从1C和H9细胞中分化出神经嵴细胞。培养6天后，收集细胞，合并，并用PE缀合的抗人CD271抗体标记。显示了通过流式细胞术对合并的细胞群体(A)、在基于CD271抗原表达的分离之后(B)和通过用富集试剂处理(B)中的细胞来优先分离CD271高细胞之后(C)进行的测定。该群体以活性单态CD271高细胞进行门控。
图6显示了用于标记细胞的颗粒增加了流式细胞术检测到的侧向散射(SSC)信号。(A)H9、1C和M001细胞在STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒中分化，产生的CD271+细胞通过阳性选择分离(如图5B所示)。将富集的CD271+细胞在STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒中进一步培养6天，然后与针对用于分离CD271+细胞的抗体组合物或颗粒的PE缀合抗体一起孵育。A)中的每个点代表阳性选择前的起始群体(开始)或为优化细胞分离程序而测试的不同条件(实验1、2和3)，其中相同的填充颜色代表头对头实验。在B)至D)中，以DAPI-活细胞为门控的流式细胞术图显示了未用颗粒标记的H9和1C细胞的合并群体((B)和(D))，或使用抗体组合物和颗粒从合并群体中分离的CD271+细胞((C)和(E))。评估CD271表达，显示为CD271低(灰点)或CD271高(黑点)。未标记的细胞显示CD271低和CD271高细胞之间的SSC+信号没有差异(D)。当细胞用颗粒标记时，与CD271低细胞相比，相对较大的SSC+信号与CD271高细胞相关(E)。(F)来自H9和1C细胞的合并群体的CD271高和CD271低细胞显示出依赖于富集试剂浓度的不同分离效率(n＝1神经嵴细胞培养物的数据)。
图7显示了不同浓度的富集试剂对CD271高神经嵴细胞的纯度和回收率的影响。1C或H9细胞的分化如图5所示。(A)将分离的CD271+细胞与不同浓度的含PEG的富集试剂(“第一富集试剂”)一起孵育，并将CD271高神经嵴细胞的纯度和回收率与在常规的基于PBS的洗涤试剂(“0％”)中孵育的细胞进行比较。显示了n＝6的不同CD271高神经嵴细胞分离的结果。平均纯度或回收率在箱线图中用“+”号表示。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.05*，p<0.01**，p<0.001***)。(B)将分离的CD271+细胞与不同浓度的含葡聚糖的富集试剂(“第二富集试剂”)一起孵育，并将CD271高神经嵴细胞的纯度和回收率与在常规的基于PBS的洗涤试剂(“0％”)中孵育的细胞进行比较。显示的是CD271高神经嵴细胞分离的结果，其中n＝5(0％)，n＝4(0.05％)或n＝1(0.01％和0.5％)。平均纯度或回收率在箱线图中用“+”号表示。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.01**)。(C)开发了一种快速和准确地确定阳性选择的靶部分阳性细胞对不同浓度/制剂的富集试剂的反应性的测定，所述阳性选择的靶部分阳性细胞基于靶部分的水平在至少两个群体中分层。通过流式细胞术分析来确定用颗粒标记的细胞的侧向散射信号的几何平均值。通过使用可变斜率拟合(四个参数)绘制log[抑制剂]与反应的关系，生成剂量-反应曲线。剂量-反应曲线上的垂直虚线代表计算的IC50值。
图8显示了富集试剂可以在CD 271高神经嵴细胞分离期间的不同时间加入。(A)在CD271+细胞的免疫磁性阳性选择期间，改变抗体组合物(“C”)、颗粒(“P”)和富集试剂(“E”)的添加顺序，并评估CD271高神经嵴细胞的％纯度和％回收率。显示了n＝4的不同神经嵴细胞培养物的结果。(B)在CD271+细胞的免疫磁性阳性选择期间，改变富集试剂的添加时机(无论是在用抗体组合物孵育细胞之前，在用抗体组合物和颗粒孵育细胞之后(“第一次加满之后”)，还是在磁性分离之后(“第一次倒出之后”))，并且评估了CD271高神经嵴细胞的％纯度和％回收率。显示了来自n＝19(在抗体组合物之前添加富集试剂)、n＝6(在第一次加满之后添加富集试剂)或n＝10(在第一次倒出之后添加富集试剂)的不同神经嵴细胞培养物的结果。平均纯度或回收率在箱线图中用“+”号表示。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.01**，p<0.001***)。
图9显示了CD271在流式细胞术图中的差异表达。使用STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒分化1C或H9细胞。培养6天后，收集细胞，合并，并用PE缀合的抗人CD271抗体标记。通过流式细胞术分析合并的细胞群体中的CD271低细胞群体(A)和在阳性选择CD271细胞与富集试剂孵育后通过倾倒分离的CD271低细胞(B)。该群体以活性单态CD271低细胞进行门控。(C)分离分化的CD271+细胞后，将细胞与不同浓度的含PEG的富集试剂一起孵育，并将分离的CD271低细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示了用n＝3的不同的神经嵴细胞培养物进行的CD271阳性选择实验的阴性流出级分。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.05*，p<0.01**)。(D)使用葡聚糖包被的颗粒进行与(C)所示相同的程序。在分化的CD271+细胞的分离过程中，将细胞与不同浓度的含葡聚糖的富集试剂一起孵育，并将分离的CD271低细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示的是用n＝1的神经嵴细胞培养物进行的CD271阳性选择实验的阴性流出级分。
图10显示了富集的CD271高神经嵴细胞是有功能的。(A)分化和富集的CD271高细胞在培养中扩增，但CD271低神经细胞在相同培养条件下不显著扩增。H9细胞使用STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒进行分化。培养6天后，收集细胞，合并，并通过CD271细胞的免疫磁性阳性选择分离细胞，然后在富集试剂中孵育。将富集的CD271高群体铺在STEMdiffTM神经嵴分化培养基中，并再培养7天。活的CD271高细胞从3.81×105个细胞扩增至6.43±0.97×105个细胞(平均值±SEM；4个重复的孔)。在相同条件下，仅观察到阴性CD271低级分的有限扩增，从1.91×104至2.89±1.18×104个活细胞(平均值±SEM；4个重复的孔)。(B)用于进一步培养的CD271高细胞的接种密度可以变化。白色箭头表示PAX6+细胞，如在非富集的起始培养孔中观察到的。富集CD271高细胞的分离群体形成了SOX10+细胞的汇合层，表明建立了具有最少PAX6+污染物的神经嵴细胞的富集培养物。(C)重铺的、富集的CD271高神经嵴细胞可以分化为外周神经元。采用B)的接种密度，通过在第6天将神经嵴细胞传代至Lee G等人(2010)Natprotocol5(4):688–701中公开的条件下，诱导外周神经元分化。白色箭头指向表达Brn3A的细胞体，Brn3A是一种在发育中的外周神经元的细胞核中发现的转录因子。通过外周蛋白表达来评估外周神经元细胞体之间轴突连接的存在，外周蛋白是一种在外周神经系统的神经元中表达的III型中间丝蛋白。
图11显示了CD25高细胞可以优先从白细胞分离样品中富集。通过流式细胞术分析白细胞分离样品中的CD25细胞(A)、通过免疫磁性阳性选择分离的CD25+细胞(B)以及使用富集试剂从群体(B)中富集CD25高细胞(C)。在(A)到(C)的每一个中，群体以活性单态CD45+CD25高细胞进行门控。(D)通过不同浓度的富集试剂对富集的CD25+细胞进行去标记。通过流式细胞术分析来确定用聚合物包被颗粒标记的细胞的侧向散射信号的几何平均值。通过使用可变斜率拟合(四个参数)绘制log[抑制剂]与反应的关系，生成剂量-反应曲线。(E)将通过免疫磁性阳性选择分离的CD25+细胞与不同浓度的含PEG的富集试剂或对照孵育，并且将CD25高细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示的是来自n＝3的白细胞分离供体的结果，其中相同的填充颜色代表头对头的实验。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.05*，p<0.01**)。(F)将(E)中富集的CD25高细胞进一步与抗CD127去除试剂一起孵育。将去标记的FOXP3+CD25高调节性T细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示的是来自n＝4的白细胞分离供体的结果。平均纯度或回收率在箱线图中用“+”号表示。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.05*，p<0.01**)。
图12显示了CD56高细胞可以优先从白细胞分离样品中富集。通过流式细胞术分析白细胞分离样品中的CD56细胞(A)、通过免疫磁性阳性选择分离的CD56+细胞(B)以及使用富集试剂从群体(B)中富集CD56高细胞(C)。在(A)到(C)的每一个中，群体以活性单态CD45+CD56高细胞进行门控。(D)通过不同浓度的富集试剂对富集的CD56+细胞进行去标记。通过流式细胞术分析来确定用聚合物包被颗粒标记的细胞的侧向散射信号的几何平均值。通过使用可变斜率拟合(四个参数)绘制log[抑制剂]与反应的关系，生成剂量-反应曲线。(E)将通过免疫磁性阳性选择分离的CD56+细胞与不同浓度的含PEG的富集试剂或对照孵育，并将CD56高细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示的是来自n＝4的白细胞分离供体的结果。平均纯度或回收率在箱线图中用“+”号表示。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.05*，p<0.01**)。
图13显示了CD8高细胞可以优先从白细胞分离样品中富集。通过流式细胞术分析白细胞分离样品中的CD8细胞(A)、通过免疫磁性阳性选择分离的CD8+细胞(B)以及使用富集试剂从群体(B)中富集CD8高细胞(C)。在(A)到(C)的每一个中，群体以活性单态CD45+CD8高细胞进行门控。(D)通过不同浓度的富集试剂对富集的CD8+细胞进行去标记。通过流式细胞术分析来确定用聚合物包被颗粒标记的细胞的侧向散射信号的几何平均值。通过使用可变斜率拟合(四个参数)绘制log[抑制剂]与反应的关系，生成剂量-反应曲线。(E)将通过免疫磁性阳性选择分离的CD8+细胞与不同浓度的含PEG的富集试剂或对照孵育，并将CD8高细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示的是来自n＝1的白细胞分离供体的结果。
图14显示了CD138高细胞可以优先从幼稚小鼠脾细胞样品中富集。通过流式细胞术分析小鼠脾细胞样品中的CD138细胞(A)、通过免疫磁性阳性选择分离的CD138+细胞(B)以及使用富集试剂从群体(B)中富集CD138高细胞。在(A)到(C)的每一个中，群体以活性单态CD45+CD267(TACI)+CD138高浆细胞/原幼细胞(blast)进行门控。(D)通过不同浓度的富集试剂对富集的CD138+细胞进行去标记。通过流式细胞术分析来确定用聚合物包被颗粒标记的细胞的侧向散射信号的几何平均值。通过使用可变斜率拟合(四个参数)绘制log[抑制剂]与反应的关系，生成剂量-反应曲线。(E)将通过免疫磁性阳性选择分离的CD138+细胞与不同浓度的含PEG的富集试剂或对照孵育，并将CD138高细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示了n＝6的不同小鼠脾细胞样品的结果。平均纯度或回收率在箱线图中用“+”号表示。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.05*，p<0.01**，p<0.001***)。(F)将通过免疫磁性阳性选择分离的CD138+细胞与不同浓度的含葡聚糖的富集试剂或对照孵育，并将CD138高细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示了n＝2(0％和0.04％)和n＝1(0.08％和0.16％)的不同小鼠脾细胞样品的结果。
图15显示了CD138高细胞可以优先从幼稚C57BL/6小鼠骨髓样品中富集。通过流式细胞术分析小鼠骨髓样品(A)、通过免疫磁性阳性选择分离的CD138+细胞(B)以及使用富集试剂从群体(B)中富集CD138高细胞(C)。在(A)到(C)的每一个中，群体以活性单态CD45+CD267(TACI)+CD138高浆细胞/原幼细胞进行门控。(D)将通过免疫磁性阳性选择分离的CD138+细胞与不同浓度的含PEG的富集试剂或对照孵育，并将CD138高细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示了n＝6的不同小鼠骨髓细胞样品的结果。平均纯度或回收率在箱线图中用“+”号表示。对logit转换的数据进行配对双尾t检验(p≥0.05ns，p<0.05*，p<0.01**，p<0.001***)。(E)将通过免疫磁性阳性选择分离的CD138+细胞与不同浓度的含葡聚糖的富集试剂或对照孵育，并将CD138高细胞的纯度和回收率与对照的常规基于PBS的洗涤试剂(“0％”)进行比较。显示了n＝2(0％和0.04％)和n＝1(0.08％和0.16％)的不同小鼠骨髓细胞样品的结果。
具体实施方式
本公开涉及关于样品中不同的靶部分阳性细胞群体的方法、测定和试剂盒。更具体地，靶部分阳性的不同细胞群体包括靶部分阳性的第一细胞群体和靶部分阳性的第二细胞群体。在一个实施方案中，靶部分阳性的第一细胞群体的靶部分水平(相对)低于靶部分阳性的第二细胞群体的靶部分水平。
本文所用术语“靶部分”指细胞相关基序，其存在、不存在或数量(即水平)可用于帮助对特定类型的细胞或细胞群体进行鉴定或分类。在一个实施方案中，靶部分是细胞表面标志物。在一些情况下，靶部分可以唯一地鉴定特定的细胞群体(即细胞类型)。例如，CD45唯一地与正常人造血细胞相关。在一些情况下，靶部分不能唯一地鉴定特定的细胞群体(即细胞类型)。例如，CD8至少与正常人NK细胞和正常人T细胞相关。在这种情况下，为了区分细胞类型，可能有必要进一步确定不同靶部分的存在与否。例如，CD8至少与正常人NK细胞和正常T细胞相关，但是进一步查询CD56可以区分这些群体。在一些情况下，靶部分的水平也可用于区分两种或多种靶部分阳性细胞群体。例如，人CD271表达与神经嵴细胞谱系的细胞(CD271高)以及神经外胚层和非神经外胚层细胞谱系的细胞(CD271低)相关。同样，不同的人类细胞群体也可以基于CD25、CD49d、CD8或CD56的水平进行分级。在小鼠中，可以查询CD138的水平以对样品中不同的靶部分阳性细胞群体进行分层。
本文所用术语“样品”是指细胞制备物，例如细胞悬浮液。细胞制备物可以是任何物种、任何发育阶段、任何组织类型或任何疾病状态的。细胞样品将包括靶部分呈阳性的第一细胞群体、靶部分也呈阳性的第二细胞群体，并可包括靶部分呈阴性的细胞群体。在一些实施方案中，细胞是脊椎动物细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人类细胞。细胞制备物可以通过处理器官或组织来获得，例如通过生命科学领域中的常规方法。或者，细胞制备物可以从溶液如血液中获得，该溶液可以被预处理以除去某些污染物，如红细胞或血浆成分。细胞制备物也可以从细胞的体外或离体培养物中获得。细胞的体外或离体培养物可以是维持或扩增培养物，或者细胞的体外或离体培养物可以是细胞的分化培养物。在一些情况下，细胞制备物可以是非贴壁(例如悬浮)细胞培养物，在这种情况下，这种细胞制备物可以随时用于本文公开的方法或测定，或者这种细胞可以在准备使用前经过一个或多个预处理步骤，例如除去污染物。在一些情况下，细胞制备物可以是贴壁细胞，在这种情况下，在准备用于本文公开的方法或测定之前，可能需要使用常规技术从细胞培养基质中释放这种细胞。
本文所用的术语“颗粒”是指可用于标记、标示或结合细胞(例如靶部分阳性细胞)的物体。在一些实施方案中，可以在下游检测或分离测定中利用颗粒的特性。因此，颗粒的特性可以决定一种或多种分离方法(例如响应于磁场或基于密度(例如比重/相对密度))。下游测定的非限制性实例可包括分离已被颗粒标记/标示的细胞或对其进行成像。在一些实施方案中，颗粒可以是磁性的、顺磁性的或超顺磁性的，因此可以被采用到利用磁场的工作流程中，以促进用颗粒标记的细胞的分离。在一些情况下，颗粒可以被功能化，以便于下游测定，例如分离或检测测定。例如，颗粒通常与抗靶部分抗体或抗体片段缀合。或者，颗粒可以用不同类型的涂层功能化，该涂层能够被抗体或抗体片段或抗体组合物结合，所述抗体或抗体片段或抗体组合物将颗粒连接到靶部分阳性细胞。例如，颗粒可以用亲和素或链霉亲和素功能化，并且这种颗粒可以与生物素或生物素化的实体(例如生物素化的抗靶部分抗体或抗体片段)复合。或者，其它涂层可以使颗粒功能化，并且在一个具体实施方案中，涂层可以是聚合物。聚合物涂层的例子包括PEG、基于PEG的或PEG样的涂层。或者，聚合物涂层的例子包括葡聚糖、基于葡聚糖的或葡聚糖样的涂层。
方法
在本公开的一个方面，该方法包括基于样品中靶部分阳性细胞的靶部分水平来富集靶部分阳性细胞群体的那些步骤。更具体地，样品中的靶部分阳性细胞至少包括靶部分阳性的第一细胞群体和靶部分阳性的第二细胞群体，其中所述第一细胞群体的靶部分水平相对(或平均)低于所述第二细胞群体的靶部分水平。
该方法可以从提供细胞样品开始。细胞样品可以来自任何来源，但是在优选的实施方案中，样品是细胞的单细胞悬浮液。在一些实施方案中，细胞样品可以包括相对小的细胞簇或细胞块或由其组成，或者细胞样品可以包括相对大的细胞聚集体或由其组成。
在许多情况下，在提供细胞样品之前，可以对它们进行预处理，以将组织或器官分解成组成部分，以澄清其中含有某些污染物的细胞的溶液，或者从基质上分离细胞。
在以组织或器官为起点的实施方案中，将组织或器官解离成单细胞的方法是已知的。例如，组织或器官可以被酶促消化、机械破碎或化学分解。在一些情况下，处理组织或器官可能涉及酶促消化、机械破碎和化学分解的任何组合，以产生合适的细胞悬浮液。
在以包含细胞的溶液为起点的实施方案中，这种溶液可以被澄清以除去污染物等。澄清这种溶液的方法是已知的，包括过滤或化学处理。例如，如果要从血液样品中获得起始细胞，可能需要清除红细胞和/或其他类型的不感兴趣的细胞。在一个实施方案中，血液样品可以通过密度梯度离心来澄清。在一个实施方案中，凝集红细胞可以澄清血液样品，例如通过执行玫瑰花环(RosetteSepTM STEMCELL Technologies)方案。在一个实施方案中，可以通过用裂解缓冲液裂解红细胞来澄清血液样品。在一个实施方案中，可以通过改变红细胞内的渗透压来澄清血液样品。如果包含细胞的溶液是除血液之外的体液，例如尿液，则重要的是浓缩其中的细胞，同时也澄清非细胞成分的溶液。
在一些实施方案中，起始细胞可能先前已经在培养中。如果在悬浮液中生长(即，在非贴壁条件下)，细胞可随时用于本文公开的方法。然而，在悬浮液中生长的细胞通常浸泡在细胞培养基中，沉淀细胞并将其重新悬浮在适当的生理缓冲液如磷酸盐缓冲盐水或EasySepTM缓冲液(STEMCELL Technologies)中可能是合适的。此外，浸泡在细胞培养基中的细胞悬浮液可能不是处于最佳密度，这可以通过离心和重悬(例如在合适的缓冲液中)容易地调节。
在一些实施方案中，起始细胞可能先前已经粘附在基质上进行培养，无论是组织培养皿或培养瓶，还是微载体上。在这样的实施方案中，有必要将细胞从基质上分离，本领域技术人员将知道这可以通过机械、酶促或化学手段来完成。无论细胞是通过机械、酶促或化学方法从基质上分离，还是使用任意这些方法的组合来分离，在开始实施本文公开的方法之前，调节分离的细胞的密度也是必要的。当分离细胞时，应注意尽量减少或避免过度暴露于所述试剂，以限制细胞表面上的靶部分(和/或其它部分)的消化。
本文公开的方法包括宽范围的细胞密度。在一个实施方案中，样品中的细胞密度应该在约1×104个细胞/mL和1×1010个细胞/mL之间，或在约1×105个细胞/mL和1×109个细胞/mL之间，或在约5×105个细胞/mL和5×108个细胞/mL之间。在一个实施方案中，样品中的细胞密度应为约5×107±0.5×107个细胞/mL。
一旦细胞样品被调节到合适的密度和/或悬浮在合适的缓冲液中，样品中的靶部分阳性细胞就用颗粒标记以形成细胞:颗粒复合物。
在一个实施方案中，靶部分是细胞表面标志物。许多细胞表面标志物是已知的，因此包含在本公开中。靶部分应该可被结合成员(例如抗体或抗体片段)结合。在一个实施方案中，样品中感兴趣的细胞群体的特征在于独特的或可区分的靶部分水平。例如，第一细胞群体(靶部分呈阳性)的靶部分水平相对低于第二细胞群体(靶部分也呈阳性)的靶部分水平。
在一个实施方案中，靶部分是人CD271，其中CD271高区分神经嵴细胞，CD271低区分神经外胚层细胞和非神经外胚层细胞。
在一个实施方案中，靶部分是人CD49d，其中CD49d高区分神经嵴细胞，CD49d低区分神经外胚层细胞和非神经外胚层细胞。
在一个实施方案中，靶部分是人CD25，其中CD25高区分调节性T细胞和活化T细胞，CD25低区分非活化T细胞。
在一个实施方案中，靶部分是人CD8，其中CD8高区分T细胞，CD8低区分自然杀伤细胞的亚群。
在一个实施方案中，靶部分是人CD56，其中CD56高区分自然杀伤细胞的产生细胞因子的亚群，CD56低区分自然杀伤细胞的细胞毒性亚群。
在一个实施方案中，靶部分是小鼠CD138，其中CD138高区分终末分化的浆母细胞和浆细胞，CD138低区分前B细胞。
熟练的读者将会清楚，本文公开的方法不限于以上指定的靶部分，而是可推广到任何系统，其中可以基于靶部分的各自水平来区分样品中的不同细胞群体。
用颗粒标记靶部分呈阳性的第一细胞群体和靶部分呈阳性的第二细胞群体(以形成细胞:颗粒复合物)可以多种方式完成。在一个实施方案中，颗粒与第一细胞群体和第二细胞群体之间的连接分别由抗体或抗体片段介导。在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含颗粒特异性成员和靶部分特异性成员。
本公开的抗体或抗体片段可以对应于能够结合靶部分的任何结构。在一个实施方案中，抗体可以对应于任何同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在一个实施方案中，抗体片段是F(ab)、F(ab’)2、scFv片段或其任何适应物。在一些实施方案中，抗体或抗体片段以高度特异性结合靶部分。因此，优选抗体或抗体片段是单克隆的。
在一个实施方案中，用颗粒标记靶部分是由单个抗体或其片段介导的。在这样的实施方案中，单个抗体或其片段的一个臂结合颗粒(即颗粒特异性成员)，另一个臂结合靶部分(即靶部分特异性成员)。
在一个实施方案中，用颗粒标记靶部分是由一种以上的抗体或其片段介导的。在一个实施方案中，颗粒特异性成员直接或间接连接到靶部分特异性成员。在一个实施方案中，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员形成双特异性复合物。
在一个实施方案中，双特异性复合物包括直接结合到靶部分特异性成员的颗粒特异性成员。在这样的实施方案中，颗粒特异性成员的区域可以直接结合到靶部分特异性成员的区域。例如，颗粒特异性成员的Fc区可以直接与靶部分特异性成员的Fc区缀合。在抗体片段的情况下，颗粒特异性成员的连接部分可以直接与靶部分特异性成员的连接部分缀合。
在一个实施方案中，双特异性复合物包括与靶部分特异性成员间接连接的颗粒特异性成员。在这样的实施方案中，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员的间接连接可以以任何方式实现。例如，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员可以各自结合到共同元件上。例如，共同元件可以是能够与抗体或抗体片段缀合的聚合物。或者，共同元件可以是颗粒或珠子。或者，共同元件可以是互补的一对实体，例如生物素和亲和素/链霉亲和素，其中每个实体与颗粒特异性成员或靶部分特异性成员之一缀合。在一个实施方案中，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员可以在免疫复合物中连接，其中它们通过一种或多种抗体或抗体片段连接。在一个实施方案中，双特异性复合物包含两种抗体或其F(ab’)2片段——颗粒特异性成员和靶部分特异性成员——它们以本文所述的任何方式连接。
该方法可进一步包括提供相对于靶部分水平(即靶部分阳性的第一细胞群体和靶部分阳性的第二细胞群体中靶部分的总和)的至少饱和量的颗粒。因此，足够量的颗粒可以增强样品中靶部分阳性细胞的回收。
在一个实施方案中，颗粒包被有聚合物。在这样的实施方案中，聚合物可以是PEG、基于PEG的或PEG样的。或者，聚合物可以是葡聚糖、基于葡聚糖的或葡聚糖样的。不管包被颗粒的聚合物的性质如何，颗粒特异性成员应该对(颗粒的)聚合物而不是颗粒本身是特异的。
颗粒可以具有便于细胞:颗粒复合物与样品中的其他细胞分离的性质，所述其他细胞的靶部分不呈阳性，或者靶部分呈阳性但是已经被去标记(如下所述)。在一个实施方案中，颗粒响应于磁场。在这样的实施方案中，样品中形成的细胞:颗粒复合物(通过抗体或抗体片段连接)可以暴露于磁场，如通常在免疫磁性分离中所做的，以从样品中靶部分不呈阳性(或靶部分呈阳性但已被去标记)的其它细胞中分离出细胞:颗粒复合物。在一个实施方案中，颗粒对细胞悬浮于其中的溶液的密度有响应。例如，颗粒的密度可能低于溶液的密度，在这种情况下，细胞:颗粒复合物将漂浮在溶液中。或者，颗粒的密度可能高于溶液和未包含在细胞:颗粒复合物中的细胞的密度，在这种情况下，细胞:颗粒复合物将沉入溶液中。因此，细胞:颗粒复合物可以从样品中靶部分不呈阳性(或靶部分呈阳性但已被去标记)的其他细胞中分离出来。本公开中考虑的颗粒可从各种供应商和/或制造商处获得，包括STEMCELL Technologies。因此，本文公开的方法的早期或初步步骤可包括在连接颗粒和靶部分阳性的细胞(通过抗体或抗体片段)后，从样品中分离细胞:颗粒复合物。
为了富集(并最终分离)以不同的靶部分水平为特征的靶部分阳性细胞群体，将形成的细胞:颗粒复合物(无论是否进行分离步骤)与富集试剂接触。细胞:颗粒复合物应与富集试剂一起孵育足够长的持续时间，以基本上去标记靶部分阳性的第一细胞群体。如本文所用，“基本上去标记”是指(通过富集试剂)使颗粒从第一细胞群体的大部分(如果不是全部的话)的靶部分去标记或去结合。尽管第一细胞群体的特征在于靶部分水平相对低于第二细胞群体，但在第一群体中，细胞间可能存在一系列靶部分水平。因此，即使不是全部，相当比例的第一细胞群体将被脱去颗粒标记，或者它们可能仅保留亚阈值水平的颗粒，使它们对分离手段无反应(如上所述)。在一个实施方案中，在富集试剂中孵育细胞:颗粒复合物后，第一细胞群体的约100％、或约95％、或约90％、或约80％、或约70％、或约60％、或约50％的靶部分可脱去颗粒标记。总的来说，富集试剂的作用是使第一细胞群体比第二细胞群体更容易去标记，从而使第一细胞群体与第二细胞群体(保留在细胞:颗粒复合物中)相比，对分离手段的敏感性不同(即无反应)。这样，第一细胞群体可以从第二细胞群体中分离或富集出来，这在以前进行细胞的免疫磁性分离时是不可能的。
在一个实施方案中，富集试剂将第一群体从第二群体中分离/富集出来，由此在富集试剂存在下孵育细胞:颗粒复合物后，第二群体可保持在磁场附近，而第一群体对磁场没有响应。
富集试剂应该对细胞温和并且对细胞无毒(例如，它不应该直接导致细胞死亡)。例如，富集试剂应该具有生理(相对于离体动物细胞，更具体地说是哺乳动物细胞)pH、同渗浓摩(osmolarity)、同渗重摩(osmolality)、温度等。此外，富集试剂可含有细胞通常遇到的盐和其他矿物质，但仅在生理水平或接近生理水平。
在一个实施方案中，富集试剂可以包括适于浸泡哺乳动物细胞的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、HEPES、MOPS或Hank’s平衡盐溶液。在一个实施方案中，富集试剂可以进一步包含胎牛血清(FBS)和/或牛血清白蛋白(BSA)和/或来自任何物种的血清衍生的或重组的白蛋白。当富集试剂中包含FBS时，FBS在基于缓冲液的富集试剂中的浓度可以为约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、约0.5％或更低。当富集试剂中包含来自另一物种的BSA或白蛋白时，白蛋白在基于缓冲液的富集试剂中的浓度可以为约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、或约0.1％或更低。
在一个实施方案中，富集试剂可以包括适合用于浸泡细胞的溶液的螯合剂，例如EDTA。当富集试剂中包含螯合剂时，螯合剂在基于缓冲液的富集试剂中的浓度可以为约10μM、约5μM至10μM、约1μM至5μM、约0.5μM至1μM、约0.1μM至0.5μM、约50mM至100mM、约10mM至50mM、约5mM至10mM、约1mM至5mM或更低。
在一个实施方案中，富集试剂包括一种或多种聚合物，并且所述一种或多种聚合物在使用的浓度下应该对细胞温和并且对细胞无毒。在一个实施方案中，聚合物是PEG、基于PEG的或PEG样的。在一个实施方案中，聚合物是葡聚糖、基于葡聚糖的或葡聚糖样的。富集试剂中包含的聚合物应该至少在单体水平上与用于包被颗粒的聚合物相同或结构等同。
在一个实施方案中，富集试剂中一种或多种聚合物的浓度应该对细胞无毒。因此，聚合物应该以相对低的浓度包含在富集试剂中(与分离试剂相比，如下所述)。在一个实施方案中，聚合物可以以实现第一靶部分阳性细胞群体与包含第二靶部分阳性细胞群体的保留的细胞:颗粒复合物分离所需的最小浓度包含在富集试剂中。在一个实施方案中，富集试剂中聚合物的浓度达到IC50，这可以通过下文公开的测定来确定。在一个实施方案中，富集试剂中聚合物的浓度小于10％(w/v)，小于5％(w/v)，小于1％(w/v)，小于0.5％(w/v)，小于0.25％(w/v)，小于0.125％(w/v)；小于0.0625％(w/v)；小于0.03125％(w/v)，小于0.015625％(w/v)；或小于0.01％(w/v)。
在一个实施方案中，富集试剂的组分可以预先配制成储备溶液，其可以由最终用户适当稀释，以实现靶部分阳性的第一细胞群体与靶部分阳性的第二细胞群体的分离。在一个实施方案中，富集试剂的组分可以单独配制，例如配制成基础溶液(例如缓冲液，其可以包含或不包含FBS和/或BSA和/或来自任何物种的血清衍生的或重组的白蛋白和/或螯合剂)和浓缩的活性成分溶液。在这样的实施方案中，活性成分溶液在基础溶液中被稀释至合适的浓度，这可以使用下文公开的测定或通过简单的滴定实验来确定。
根据细胞类型(和相关的靶部分)，可能有必要优化富集试剂浓度的剂量反应性，以提高分离/富集效率，并因此从靶部分阳性的第二细胞群体中富集靶部分阳性的第一细胞群体。例如，当样品中的第一细胞群体和第二细胞群体都呈现高水平(尽管不同)的靶部分时，可能需要较高浓度的富集试剂。另一方面，当样品中至少第一细胞群体和可能的第二细胞群体呈现低(和不同)水平的靶部分时，较低浓度的富集试剂可能就足够了。
在将细胞:颗粒复合物与富集试剂接触后，可以从样品中分离出第一细胞群体。第一细胞群体的分离是可能的，因为在基本上去除了颗粒标记后，相当比例的这些细胞不再对分离手段有反应(根据颗粒的质量可适用)。然而，第二细胞群体继续存在于细胞:颗粒复合物中，因此仍然易受颗粒的影响。仅出于澄清前述内容的目的，但不旨在作为限制，在颗粒对磁场有响应的实施方案中，可在阴性级分中分离基本上去标记的第一细胞群体，而在磁场存在时保留第二细胞群体(在细胞:颗粒复合物内)。
在从样品中分离基本上去标记的第一细胞群体之前，在一些应用中，从样品中分离细胞:颗粒复合物可能是重要的。初始分离步骤可以在细胞:颗粒复合物形成后进行，优选在细胞:颗粒复合物与富集试剂接触前进行。可以如上所述进行分离，例如通过利用颗粒的质量(无论是有浮力的、致密的还是对磁场有响应的)。当基本上纯的第一细胞群体是所公开方法的期望输出时，初始分离可能特别重要，因为否则从样品中分离的基本上去标记的第一细胞群体将被包括在靶部分不呈阳性的细胞中。然而，如果第二细胞群体是所公开方法的期望输出，则可能没有必要进行这样的初始分离。
在一个具体的实施方案中，细胞:颗粒复合物可以在管中使用响应于磁场的颗粒和抗体复合物形成，包括靶部分特异性成员和颗粒特异性成员，抗体复合物不直接与颗粒缀合。任选的分离步骤可以包括将管定位在磁场附近，并且可以去掉样品中靶部分不呈阳性的细胞，同时保留细胞:颗粒复合物。细胞:颗粒复合物可以重新悬浮在缓冲液如富集试剂中，管靠近或不靠近磁场。或者，未分离的细胞:颗粒复合物可以类似地与富集试剂接触。然而，第一细胞群体将基本上脱去颗粒标记，并且可以类似地从包含第二细胞群体的保留(或残余)细胞:颗粒复合物中去掉。或者，前述方法可以使用柱而不是管来进行。根据所用容器的类型，无论是管、皿、烧瓶、柱、袋还是其他类型的容器，对这些方法的变化对本领域技术人员来说是显而易见的。
可以在分离靶部分阳性的第一细胞群体之前的任何时间加入富集试剂。更具体地，富集试剂可以在细胞:颗粒复合物形成之前或之后加入。仍然更具体地，富集试剂可以在颗粒或双特异性复合物加入样品之前或之后加入。
在分离出靶部分呈阳性的基本上去标记的第一细胞群体后，这种细胞群体从靶部分呈阳性的第二细胞群体中分离/富集出来。类似地，靶部分呈阳性的第二细胞群体已从第一细胞群体中分离出来。一方面，如果下游应用仅需要第一细胞群体，则可丢弃容器中保留的细胞:颗粒复合物(以及在基本上去除第一群体标记后的游离颗粒)。另一方面，如果残余细胞:颗粒复合物中的第二细胞群体是下游应用所需要的，它们也可以被分离。自然地，在一些情况下，可能希望在下游应用中分别使用第一细胞群体和第二细胞群体。
从样品中分离出靶部分呈阳性的基本上去标记的第一细胞群体后，残余细胞:颗粒复合物(包含第二细胞群体)可进行进一步处理。在一个实施方案中，残余细胞:颗粒复合物可通过将其从分离手段(例如磁场或其他)的影响中移除来分离。在一个实施方案中，可能需要通过将残余细胞:颗粒复合物与分离试剂接触来基本上分离第二细胞群体。本文所用的短语“基本上分离”本质上具有与短语“基本上去标记”相同的含义，除了进行必要的修饰以具体应用于分离试剂和靶部分呈阳性的第二细胞群体。
分离试剂应该对细胞温和并且对细胞无毒(例如，它不应该直接导致细胞死亡)。例如，分离试剂应该具有生理(相对于离体动物细胞，更具体地说是哺乳动物细胞)pH、同渗浓摩、同渗重摩、温度、密度等。此外，分离试剂可以包含细胞通常遇到的盐和其他矿物质。
在一个实施方案中，分离试剂可以包括适于浸泡哺乳动物细胞的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、HEPES、MOPS或Hank’s平衡盐溶液。在一个实施方案中，分离试剂可以进一步包含胎牛血清(FBS)和/或牛血清白蛋白(BSA)和/或来自任何物种的血清衍生的或重组的白蛋白。当分离试剂中包含FBS时，FBS在基于缓冲液的富集试剂中的浓度可以为约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、约0.5％或更低。当分离试剂中包含来自任何物种的BSA或白蛋白时，白蛋白在基于缓冲液的富集试剂中的浓度可以为约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、或约0.1％或更低。
在一个实施方案中，分离试剂可以包括适合用于浸泡细胞的溶液的螯合剂，例如EDTA。当分离试剂中包含螯合剂时，螯合剂在基于缓冲液的分离试剂中的浓度可以为约10μM、约5μM至10μM、约1μM至5μM、约0.5μM至1μM、约0.1μM至0.5μM、约50mM至100mM、约10mM至50mM、约5mM至10mM、约1mM至5mM或更低。
在一个实施方案中，分离试剂可以包括一种或多种聚合物，并且所述一种或多种聚合物在使用的浓度下应该对细胞温和并且对细胞无毒。在一个实施方案中，聚合物是PEG、基于PEG的或PEG样的。在一个实施方案中，聚合物是葡聚糖、基于葡聚糖的或葡聚糖样的。分离试剂中包含的聚合物应该至少在单体水平上与用于包被颗粒的聚合物相同或结构等同。
在一个实施方案中，分离试剂中一种或多种聚合物的浓度应该对细胞无毒。因此，聚合物应该以相对低的浓度包含在分离试剂中。在一个实施方案中，聚合物可以以实现颗粒和靶部分阳性的第二细胞群体分离所需的最小浓度包含在分离试剂中。在一个实施方案中，分离试剂中聚合物的浓度达到IC50，这可以通过下文公开的测定来确定。在一个实施方案中，分离试剂中聚合物的浓度小于10％(w/v)，小于5％(w/v)，小于1％(w/v)，小于0.5％(w/v)，小于0.25％(w/v)，小于0.125％(w/v)；小于0.0625％(w/v)；小于0.03125％(w/v)，小于0.015625％(w/v)；或小于0.01％(w/v)。
在一个实施方案中，分离试剂的组分可以预先配制成储备溶液，其可以由最终用户适当稀释，以实现靶部分阳性的第二细胞群体与颗粒的分离。在一个实施方案中，分离试剂的组分可以单独配制，例如配制成基础溶液(例如，缓冲液，其可以包含或不包含FBS和/或BSA和/或来自任何物种的血清衍生的或重组的白蛋白和/或螯合剂)和浓缩的活性成分溶液。在这样的实施方案中，最终用户可以将适当体积的活性成分溶液加入到适当体积的基础溶液中，以获得适当配制的分离试剂，这可以使用下文公开的测定或通过简单的滴定实验来确定。
根据细胞类型(和相关的靶部分)，可能需要测量不同浓度的分离试剂的剂量反应性，以便优化从靶部分阳性的第二细胞群体中分离标记。例如，当第二细胞群体呈现高水平的靶部分时，可能需要较高浓度的分离试剂。由于分离试剂对细胞温和且对细胞无毒，因此对其中组分的浓度限制很少。然而，由于过高浓度的分离试剂可能是不必要的和/或导致非预期的后果，无论是对于细胞还是在下游应用中，相对较低浓度的分离试剂可能足以用于从第二细胞群体(在残余细胞:颗粒复合物内)中分离大部分(如果不是全部)颗粒的目的。具体而言，当第二细胞群体呈现低水平的靶部分时，较低浓度的分离试剂可能就足够了。
因此，富集试剂优先实现从靶部分呈阳性的第一细胞群体中基本上脱去颗粒标记，而分离试剂实现从靶部分呈阳性的第二细胞群体(在残余细胞:颗粒复合物内)中基本上分离颗粒。尽管富集试剂相对于分离试剂的功能不同，但是每种试剂可以包含许多或基本上所有的相同组分。例如，每种试剂可以由共同的基础溶液配制。在一个实施方案中，基础溶液可以是水。在一个实施方案中，基础溶液可以是缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、HEPES、MOPS或Hank’s平衡盐溶液。在一个实施方案中，每种试剂可以进一步包含螯合剂，例如EDTA。
然而，假定富集试剂优先富集样品中靶部分呈阳性的第一细胞群体，该样品还包含靶部分呈阳性的第二细胞群体，则富集试剂和分离试剂的各自制剂在一个或多个方面可能不同。在一个实施方案中，富集试剂的配制至少在一个方面不同于分离试剂。例如，富集试剂和分离试剂可以包含不同浓度的相同活性成分。在一个实施方案中，活性成分是聚合物；因此，在一个实施方案中，与分离试剂相比，富集试剂中聚合物的浓度相对较低。在一个实施方案中，聚合物是PEG、基于PEG的或PEG样的。在一个实施方案中，聚合物是葡聚糖、基于葡聚糖的或葡聚糖样的。
基于前述，本公开的方法包括基于不同靶部分阳性细胞群体中的靶部分水平来分离/富集样品中的不同靶部分阳性细胞群体的那些步骤；第一细胞群体的靶部分的水平相对(或平均)低于第二细胞群体的靶部分的水平。
适应本发明的分离方法，可能需要分开、分离或富集不同的细胞群体，所述不同的细胞群体的特征在于第一和第二靶部分的水平不同。例如，第一富集试剂可用于富集第一靶部分阳性的第一细胞群体，第二富集试剂可用于富集第二靶部分阳性的第一细胞群体。接着，第一分离试剂可用于富集第一靶部分阳性的第二细胞群体，第二分离试剂可用于富集第二靶部分阳性的第二细胞群体。
在前述适应中，第一富集试剂和第二富集试剂将分别实现第一靶部分阳性的第一细胞群体和第二靶部分阳性的第一细胞群体的特异性富集。因此，第一富集试剂和第二富集试剂在至少一个方面是不同的，例如关于分别包含在其中的活性成分的性质。同样，第一分离试剂和第二分离试剂将分别实现第一靶部分阳性的第二细胞群体和第二靶部分阳性的第二细胞群体的特异性富集。因此，第一分离试剂和第二分离试剂在至少一个方面是不同的，例如关于分别包含在其中的活性成分的性质。
本公开的方法可以进一步包括在合适的培养条件下培养一个、一些或所有分离的细胞群体。这种方法可以包括以有效的细胞密度和在有效的培养条件下接种分离的细胞群体，以扩增这种分离的细胞群体。
在一个实施方案中，分离的CD271高细胞可以在适合神经嵴细胞的条件下培养，而分离的CD271低细胞可以被丢弃或在适合神经外胚层细胞的条件下培养。
如果细胞是CD271高细胞，则有效细胞密度可以大于1×105个细胞/cm2。如果细胞是CD271低细胞，则有效细胞密度可以大于或小于1×105个细胞/cm2。
测定
在一个方面，本公开的测定包括用于鉴定样品中靶部分阳性的不同细胞群体的那些步骤。
如上所述，所述测定可以从提供细胞样品开始。细胞样品可以来自任何来源，但是在优选的实施方案中，样品是单细胞悬浮液。在一些实施方案中，细胞样品可以包括相对小的细胞簇或细胞块或由其组成，或者细胞样品可以包括相对大的细胞聚集体或由其组成。
在许多情况下，在提供细胞样品之前，可以对它们进行预处理，以将组织或器官分解成组成部分，以澄清其中含有某些污染物的细胞的溶液，或者从基质上分离细胞。
在以组织或器官为起点的实施方案中，将组织或器官解离成单细胞的方法是已知的。例如，组织或器官可以被酶促消化、机械破碎或化学分解。在一些情况下，处理组织或器官可能涉及酶促消化、机械破碎和化学分解的任何组合，以产生合适的细胞悬浮液。
在以包含细胞的溶液为起点的实施方案中，这种溶液可以被澄清以除去污染物等。澄清这种溶液的方法是已知的，包括过滤或化学处理。例如，如果要从血液样品中获得起始细胞，可能需要清除红细胞和/或其他类型的不感兴趣的细胞。在一个实施方案中，血液样品可以通过密度梯度离心来澄清。在一个实施方案中，凝集红细胞可以澄清血液样品，例如通过执行玫瑰花环(RosetteSepTM STEMCELL Technologies)方案。在一个实施方案中，可以通过用裂解缓冲液裂解红细胞来澄清血液样品。在一个实施方案中，可以通过改变红细胞内的渗透压来澄清血液样品。如果包含细胞的溶液是除血液之外的体液，例如尿液，则重要的是浓缩其中的细胞，同时也澄清非细胞成分的溶液。
在一些实施方案中，起始细胞可能先前已经在培养中。如果在悬浮液中生长(即，在非贴壁条件下)，细胞可随时用于本文公开的方法。然而，在悬浮液中生长的细胞通常浸泡在细胞培养基中，沉淀细胞并将其重新悬浮在适当的生理缓冲液如磷酸盐缓冲盐水或EasySepTM缓冲液(STEMCELL Technologies)中可能是合适的。此外，浸泡在细胞培养基中的细胞悬浮液可能不是处于最佳密度，这可以通过离心和重悬(例如在合适的缓冲液中)容易地调节。
在一些实施方案中，起始细胞可能先前已经粘附在基质上进行培养，无论是组织培养皿或培养瓶，还是微载体上。在这样的实施方案中，有必要将细胞从基质上分离，本领域技术人员将知道这可以通过机械、酶促或化学手段来完成。无论细胞是通过机械、酶促或化学方法从基质上分离，还是使用任意这些方法的组合来分离，在开始实施本文公开的方法之前，调节分离的细胞的密度也是必要的。当分离细胞时，应注意尽量减少或避免过度暴露于所述试剂，因为细胞表面上存在的靶部分(和/或其它部分)可能被消化。
本文公开的方法包括宽范围的细胞密度。在一个实施方案中，样品中的细胞密度应该在约1×104个细胞/mL和1×1010个细胞/mL之间，或在约1×105个细胞/mL和1×109个细胞/mL之间，或在约5×105个细胞/mL和5×108个细胞/mL之间。在一个实施方案中，样品中的细胞密度应为约5×107±0.5×107个细胞/mL。
一旦细胞样品悬浮在合适的缓冲液中并调节到合适的密度，样品中的靶部分阳性细胞就用颗粒标记以形成细胞:颗粒复合物。
在一个实施方案中，靶部分是细胞表面标志物。许多细胞表面标志物是已知的，因此包括在本公开中，只要靶部分可以被结合成员如抗体或抗体片段结合。重要的是，对于本文公开的测定，样品中的细胞群体的特征在于独特的或可区分的靶部分水平。例如，第一细胞群体(靶部分呈阳性)的靶部分水平相对低于第二细胞群体(靶部分也呈阳性)的靶部分水平。
在一个实施方案中，靶部分是人CD271，其中CD271高区分神经嵴细胞，CD271低区分神经外胚层细胞和非神经外胚层细胞。
在一个实施方案中，靶部分是人CD49d，其中CD49d高区分神经嵴细胞，CD49d低区分神经外胚层细胞和非神经外胚层细胞。
在一个实施方案中，靶部分是人CD25，其中CD25高区分调节性T细胞和活化T细胞，CD25低区分非活化T细胞。
在一个实施方案中，靶部分是人CD8，其中CD8高区分T细胞，CD8低区分自然杀伤细胞的亚群。
在一个实施方案中，靶部分是人CD56，其中CD56高区分自然杀伤细胞的产生细胞因子的亚群，CD56低区分自然杀伤细胞的细胞毒性亚群。
在一个实施方案中，靶部分是小鼠CD138，其中CD138高区分终末分化的浆母细胞和浆细胞，CD138低区分前B细胞。
熟练的读者将会清楚，本文公开的方法不限于以上指定的靶部分，而是可以推广到任何系统，其中可以基于靶部分水平区分不同的细胞群体。
用颗粒标记靶部分呈阳性的第一细胞群体和靶部分呈阳性的第二细胞群体(以形成细胞:颗粒复合物)可以多种方式完成。在一个实施方案中，颗粒与第一细胞群体和第二细胞群体之间的标记、结合或连接分别由抗体或抗体片段介导。在一个实施方案中，抗体或抗体片段包含颗粒特异性成员和靶部分特异性成员。
本公开的抗体或抗体片段可以对应于能够结合靶部分的任何结构。在一个实施方案中，抗体可以对应于任何同种型，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在一个实施方案中，抗体片段是F(ab)、F(ab’)2、scFv片段或其任何适应物。在一些实施方案中，抗体或抗体片段以高度特异性结合靶部分。因此，优选抗体或抗体片段是单克隆的。
在一个实施方案中，用颗粒标记靶部分是由单个抗体或其片段介导的。在这样的实施方案中，单个抗体或其片段的一个臂结合颗粒(即颗粒特异性成员)，另一个臂结合靶部分(即靶部分特异性成员)。
在一个实施方案中，用颗粒标记靶部分是由一种以上的抗体或其片段介导的。在一个实施方案中，颗粒特异性成员直接或间接连接到靶部分特异性成员。在一个实施方案中，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员形成双特异性复合物。
在一个实施方案中，双特异性复合物包括直接结合到靶部分特异性成员的颗粒特异性成员。在这样的实施方案中，颗粒特异性成员的区域可以直接结合到靶部分特异性成员的区域。例如，颗粒特异性成员的Fc区可以直接与靶部分特异性成员的Fc区缀合。在抗体片段的情况下，颗粒特异性成员的连接部分可以直接与靶部分特异性成员的连接部分缀合。
在一个实施方案中，双特异性复合物包括与靶部分特异性成员间接连接的颗粒特异性成员。在这样的实施方案中，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员的间接连接可以以任何方式实现。例如，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员可以各自结合到共同元件上。例如，共同元件可以是能够与抗体或抗体片段缀合的聚合物。或者，共同元件可以是颗粒或珠子。或者，共同元件可以是互补的一对实体，例如生物素和亲和素/链霉亲和素或两种寡核苷酸，其中每个实体与颗粒特异性成员或靶部分特异性成员之一缀合。在一个实施方案中，颗粒特异性成员和靶部分特异性成员可以在免疫复合物中连接，其中它们通过一种或多种抗体或抗体片段连接。在一个实施方案中，双特异性复合物包含两种抗体或其F(ab’)2片段——颗粒特异性成员和靶部分特异性成员——它们以本文所述的任何方式连接。
所述测定可进一步包括提供相对于靶部分水平(即靶部分阳性的第一细胞群体和靶部分阳性的第二细胞群体中靶部分的总和)的至少饱和量的颗粒。因此，足够量的颗粒可用于标记样品中所有的靶部分阳性细胞，这可提高回收率。
在一个实施方案中，颗粒包被有聚合物。在这样的实施方案中，聚合物可以是PEG、基于PEG的或PEG样的。或者，聚合物可以是葡聚糖、基于葡聚糖的或葡聚糖样的。不管包被颗粒的聚合物的性质如何，颗粒特异性成员应该对(颗粒的)聚合物而不是颗粒本身是特异的。
颗粒可以具有便于细胞:颗粒复合物与样品中的其他细胞分离的性质，所述其他细胞的靶部分不呈阳性。在一个实施方案中，颗粒响应于磁场。在这样的实施方案中，将样品中形成的细胞:颗粒复合物(通过抗体或抗体片段连接)暴露于磁场，如通常在免疫磁性分离中所做的，可以从样品中靶部分不呈阳性的其他细胞中分离细胞:颗粒复合物。在一个实施方案中，颗粒对细胞悬浮于其中的溶液的密度有响应。例如，颗粒的密度可能低于溶液的密度，在这种情况下，细胞:颗粒复合物将漂浮在溶液中。或者，颗粒的密度可能高于溶液和未包含在细胞:颗粒复合物中的细胞的密度，在这种情况下，细胞:颗粒复合物将沉入溶液中。因此，细胞:颗粒复合物可以从样品中靶部分不呈阳性的其他细胞中分离出来。前述颗粒可从各种供应商和/或制造商处获得，包括STEMCELL Technologies。因此，本文公开的测定的早期或初始步骤可进一步包括在连接颗粒和靶部分阳性的细胞(通过抗体或抗体片段)后，从样品中分离细胞:颗粒复合物。
不管颗粒的其它性质如何，当用颗粒(例如通过抗体或抗体片段，如上所述)标记时，颗粒足以改变靶部分阳性细胞的读数(例如侧向散射读数)。在一个实施方案中，细胞:颗粒复合物的流式细胞术读数足够灵敏以区分包含靶部分呈阳性的第一细胞群体的细胞:颗粒复合物和包含靶部分呈阳性的第二细胞群体的细胞:颗粒复合物。在这样的实施方案中，靶部分阳性的第一细胞群体的靶部分水平相对低于靶部分阳性的第二细胞群体的靶部分水平。
因此，一旦形成了细胞:颗粒复合物，该测定包括通过流式细胞术获得细胞:颗粒复合物的读数。假定靶部分呈阳性的第一细胞群体的靶部分水平相对低于靶部分呈阳性的第二细胞群体的靶部分水平，则包含第一细胞群体的细胞:颗粒复合物的读数不同于第二细胞群体的读数。
此外，包含靶部分阳性的第一细胞群体的细胞:颗粒复合物和包含靶部分阳性的第二细胞群体的细胞:颗粒复合物两者的读数不同于未复合的靶部分阳性细胞的读数。
此外，在一些实施方案中，例如当读数是细胞:颗粒复合物的侧向散射分布时，读数将显示对应于它们各自靶部分水平的不同细胞群体。因此，所述测定可进一步包括(在通过流式细胞术获得读数后)将细胞:颗粒复合物与富集试剂(如上所述)接触，并通过流式细胞术重新获得读数，以评估读数的偏移。读数的偏移(例如侧向散射分布)可能优先发生在靶部分呈阳性的第一细胞群体中，表明该群体基本上被去标记。类似地，所述测定还可包括将细胞:颗粒复合物与不同浓度的富集试剂接触，并通过流式细胞术评估对应于富集试剂的每个浓度的读数偏移。因此，这种测定可用于评估细胞:颗粒复合物(特别是对用颗粒标记的特定细胞群体)对富集试剂(如本文前面所述)的剂量反应性。
在一个实施方案中，所述测定还可以包括以靶部分上的读数如侧向散射分布进行门控。
在一个实施方案中，如上文所述，所述测定可进一步包括在获取读数之前，富集样品中靶部分呈阳性并因此包含在细胞:颗粒复合物中的细胞。在一个实施方案中，样品中细胞:颗粒复合物的富集可以通过免疫磁性细胞分离来进行，如上所述。
试剂盒
在本公开的另一方面，提供了用于实施本文公开的方法和测定的试剂盒。具体地，本公开的试剂盒可用于从样品中富集靶部分阳性的第一细胞群体和/或靶部分阳性的第二细胞群体。
在一个实施方案中，试剂盒包括含有本发明颗粒的管。在一个实施方案中，试剂盒中包含的颗粒是聚合物包被的。在一个实施方案中，颗粒用PEG或PEG衍生物包被。在一个实施方案中，颗粒用葡聚糖或葡聚糖衍生物包被。
在一个实施方案中，试剂盒还包括含有本发明抗体复合物的管。在一个实施方案中，抗体复合物是双特异性复合物。在一个实施方案中，双特异性复合物包含与靶部分特异性成员连接的颗粒特异性成员。
在一个实施方案中，试剂盒还包括含有本发明富集试剂的管。在一个实施方案中，富集试剂含有PEG或含有PEG衍生物。在一个实施方案中，富集试剂含有葡聚糖或含有葡聚糖衍生物。
在一个实施方案中，试剂盒还包括含有分离试剂的管。在一个实施方案中，分离试剂含有PEG或含有PEG衍生物。在一个实施方案中，分离试剂含有葡聚糖或含有葡聚糖衍生物。
在一个实施方案中，富集试剂中PEG(或PEG衍生物)或葡聚糖(或葡聚糖衍生物)的浓度相对低于分离试剂中的浓度。
在一个实施方案中，试剂盒还包括如何进行本文公开的方法和测定的说明书。
以下非限制性实施例是对本发明的说明。
实施例
实施例1：使用不同PSC系分化CD271呈递细胞
神经嵴细胞可以在神经和其他分化方案中自发产生，但在其他应用中，可能需要将起始细胞分化成神经嵴细胞。当PSC分化为神经嵴细胞时，效率可能依赖于细胞系。
根据制造商的方案，在STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒(STEMCELL TechnologiesPart ID#08610)存在的情况下，对各种PSC系进行分化。图1显示了使用STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒(STEMCELL Technologies)将H1 ES细胞、H7 ES细胞、H9 ES细胞、WLS-1C iPS细胞、STiPS-M001 iPS细胞、STiPS-B004iPS细胞和STiPS-R038 iPS细胞分化为CD271高神经嵴细胞的效率。
在分化方案后，用室温PBS(不含Ca2+和Mg2+)或DMEM/F12洗涤分化的细胞，并在37℃下在1mL预热(37℃)的0.25％w/v胰蛋白酶-EDTA或AccutaseTM中孵育5-7分钟，这两者均可从STEMCELL Technologies购买。在使用含胰蛋白酶的溶液的情况下，可能需要将其灭活，例如通过1mL预热(37℃)的0.5％w/v大豆胰蛋白酶抑制剂ACF(STEMCELLTechnologies)。在以300×g离心5分钟(低制动设置)并重新悬浮在合适的缓冲液中之前，可以使用血清移液管去除细胞，并且可以合并类似的样品。
实施例2：流式细胞术
根据实施例1收获的细胞通常重悬于适当体积的无血清溶液中，例如RoboSep缓冲液2(STEMCELL Technologies)或任何其它含磷酸盐缓冲盐水的溶液。在该实施例中，使用含有0.5％w/v牛血清白蛋白和2mM EDTA的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水的组合物来重悬细胞，以获得2.5×107个总细胞/mL的细胞浓度。任选地，在使样品离心之前或之后，可以将收获的细胞通过70um的细胞过滤器以除去较大的主体。
在Beckman Coulter CytoFLEX仪器上使用多达1×106个用荧光染料缀合的抗体染色的细胞进行所有流式细胞术，并使用FCS Express(版本5)进行数据分析。细胞通常在96孔圆底板中染色。
在进行细胞内染色(通常使用抗SOX10和/或抗PAX6荧光染料缀合的抗体)时，首先用200μL冷的4％多聚甲醛固定细胞，并在2-8℃下孵育约15分钟。固定后，将细胞以700×g离心3分钟，重悬于250μL室温PBS+0.1％ Tween20中，并在室温下孵育约15分钟。透化后，将细胞以700x g离心3分钟，重悬于50μL RoboSep缓冲液2(STEMCELL Technologies)中，并用50μL一种或多种抗体的2X染色混合物染色。样品在黑暗中孵育15分钟，然后用RoboSep缓冲液2(STEMCELL Technologies)洗涤两次。最后一次洗涤后，用100μL RoboSep缓冲液2(STEMCELL Technologies)重悬细胞。
实施例3：神经嵴细胞的标志物
神经嵴细胞在历史上是基于细胞内标志物表达如SOX10、PAX7和TFAP2来定义的。由于用于检测这些细胞内标志物的荧光染料缀合的抗体的尺寸相对较大，因此需要细胞固定和透化，这使得细胞不能存活。神经嵴细胞也可以基于表面抗原如CD57、CD271和CD49d的表达来定义。使用表面表达的抗原对于分析神经嵴细胞和其他细胞是有利的，因为它们不经受苛刻的细胞内染色程序并保持存活。神经嵴细胞与外胚层的发育相关细胞种类共享一些细胞标志物的表面表达。一个这样的例子包括神经外胚层细胞，其由PAX6标志物的细胞内表达定义，其也可通过CD271标志物的表面表达来鉴定。然而，这些共有抗原的表面表达水平可以不同，例如CD271。当通过流式细胞术评估时，与SOX10+神经嵴细胞相比，PAX6+神经外胚层细胞在细胞表面上表达的CD271标志物可少10倍。
未分化的PSC表达相对低水平的神经嵴标志物CD271，这通过使用PE缀合的抗CD271抗体对H9细胞进行流式细胞术(如实施例2中所述进行)来评估(图2A)。在如实施例1所述培养细胞后，增加的CD271将靶部分阳性细胞的两个不同群体CD271高和CD271低分层(图2B)。
与CD271一样，如实施例1中所述从H9或B004细胞分化的神经嵴细胞也分层为两个不同的CD49d呈递细胞群体CD49d高和CD49d低(图3)。
对分化的PSC(如实施例1中所述)进行细胞内染色(如实施例2中所述)，以将表面标志物表达与神经嵴细胞的细胞内标志物相关联。SOX10是已知的神经嵴细胞的标志物(Liu和Cheung(2016),Developmental Biology,419,199–216)，而PAX6是已知的神经外胚层细胞的标志物(Liu和Cheung(2016))。从STiPS-F016(iPS)、R038和H1细胞分化的CD271+细胞用荧光染料缀合的抗SOX10和抗PAX6抗体染色，并通过流式细胞术分析(如实施例2中所述)(图4)。
实施例4：双特异性复合物的制备
通过在PBS中孵育靶部分特异性成员、颗粒特异性成员和接头成员来制备双特异性复合物。单个抗体或抗体片段的浓度可以变化；理论上，大约等摩尔浓度的靶部分特异性成员和颗粒特异性成员将产生最高比例的双特异性复合物。如上所述，所公开的主题与接头成员的类型无关，尽管在这种情况下，接头成员是对靶部分特异性成员和颗粒特异性成员具有特异性的抗体。孵育后，形成的抗体(或抗体片段)的双特异性复合物可用于下游测定，例如细胞分离方案。
当CD271+细胞旨在被双特异性复合物靶向时，抗CD271抗体和针对包被颗粒的聚合物的抗体或抗体片段可包括在初始孵育中。当CD56+细胞旨在被双特异性复合物靶向时，抗CD56抗体和针对包被颗粒的聚合物的抗体或抗体片段可包括在初始孵育中。当CD25+细胞旨在被双特异性复合物靶向时，抗CD25抗体和针对包被颗粒的聚合物的抗体或抗体片段可包括在初始孵育中。当CD127+细胞旨在被双特异性抗体复合物靶向时，抗CD127抗体和针对包被颗粒的聚合物的抗体或抗体片段可包括在初始孵育中。当CD8+细胞旨在被双特异性抗体复合物靶向时，抗CD8抗体和针对包被颗粒的聚合物的抗体或抗体片段可包括在初始孵育中。当小鼠CD138+细胞旨在被双特异性抗体复合物靶向时，抗CD138抗体和针对包被颗粒的聚合物的抗体或抗体片段可包括在初始孵育中。
双特异性复合物形成后，将它们与细胞样品，优选单细胞悬浮液一起孵育，所述细胞样品可以使用常规技术获得。双特异性复合物和细胞孵育后，向样品中加入颗粒。本文中，颗粒是EasySep Releasable RapidSpheres(STEMCELL Technologies,#50201)或EasySep Dextran RapidSpheres(STEMCELL Technologies,#50100)。因此，细胞和颗粒通过双特异性复合物连接，该细胞:颗粒复合物可以基于颗粒的性质进行分离。本文中，颗粒至少对磁场有响应，从而能够对感兴趣的细胞进行免疫磁性分离(在阳性选择方案中)。
实施例5：神经嵴细胞的富集
如实施例1所述，从1C和H9细胞分化出神经嵴细胞。培养6天后，如实施例2所述从培养板中收获细胞，并汇集成单细胞悬浮液。使用PE缀合的抗人CD271抗体，如实施例2中所述进行起始分化细胞群体的流式细胞术。起始分化细胞群体包括少于25％的CD271高神经嵴细胞(图5A)。使用实施例4中所述的抗体复合物，通过免疫磁性分离将CD271+细胞与CD271-细胞分离后，CD271高神经嵴细胞的比例增加至约50％(图5B)。在将阳性选择的CD271+细胞与0.008％ PEG富集试剂孵育后，CD271高神经嵴细胞的比例可进一步增加至约90％(图5C)。
实施例6：用于富集细胞的成分保留在细胞表面
在分离细胞例如CD271+细胞(如实施例5中所述)后，可随后将它们铺在合适的培养基中。在CD271+神经嵴细胞的情况下，将它们重新铺在STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒(STEMCELL Technologies)中，并再培养6天。随后，如实施例1所述收获细胞，并用荧光染料缀合的抗同种型抗体(针对双特异性复合物)和荧光染料缀合的抗颗粒抗体染色。如实施例2中所述，通过流式细胞术分析染色的细胞，并且可以在小部分细胞上检测到抗体组合物和用于通过免疫磁性分离来分离CD271+细胞的颗粒(图6A)。如前所述，从多能干细胞(“PSC”)分化的神经嵴细胞分层为CD271高和CD271低群体(图6B，未标记细胞；以及图6C，通过抗体复合物用颗粒标记的细胞)。然而，还表明，与未被颗粒标记的细胞(图6D)相比，用颗粒标记的细胞的侧向散射分布也可以分辨不同的CD271+细胞群体(图6E)。
由于富集的CD271+细胞可在其表面保留用于进行其分离的颗粒，因此在某些应用中，可能需要主动去除这些成分。根据实施例5分离CD271+细胞后，使用不同浓度的富集试剂(STEMCELL Technologies，#17900)测试CD271高或CD271低从颗粒中的释放效率(图6F)。在所有测试浓度中，CD271低的释放效率高于CD271高。然而，在富集试剂的高浓度下(例如≥0.1％)，几乎所有的CD271+细胞都与颗粒分离。因此，相对较低浓度的富集试剂，例如在大约0.001％和0.1％之间，被作为优化实验的起点。
实施例7：不同富集试剂浓度对去标记CD271高细胞的影响
富集试剂浓度的进一步优化表明，在添加低浓度的含PEG的富集试剂(“第一富集试剂”)后，CD271高细胞可从CD271+细胞中进一步富集。分化的PSC样品中CD271高细胞的平均％纯度约为30％(未显示和图5A)。如实施例5所述，分离CD271+细胞后，起始细胞纯度可增加至平均约70％的纯度(图7A)。在富集方案期间添加0.004％、0.008％或0.016％的第一富集试剂导致CD271高细胞的富集后纯度增加，表明CD271低污染细胞减少。然而，使用相对较高浓度的富集试剂对CD271高细胞的富集后回收是有害的(图7A)。
富集试剂浓度的进一步优化表明，在添加低浓度的含葡聚糖的富集试剂(“第二富集试剂”)后，CD271高细胞可从CD271+细胞中进一步富集。分化的PSC样品中CD271高细胞的平均％纯度约为30％(未显示和图5A)。如实施例5所述，分离CD271+细胞后，起始细胞纯度可增加至平均约80％的纯度(图7B)。在富集方案期间添加0.01％、0.05％或0.5％的第二富集试剂导致CD271高细胞的富集后纯度增加，表明CD271低污染细胞减少。然而，使用相对较高浓度的富集试剂对CD271高细胞的富集后回收是有害的(图7B)。
开发了一种快速准确的流式细胞术测定来筛选富集试剂的最佳浓度。简而言之，如实施例4所述，首先将细胞群体与对感兴趣细胞的靶部分和颗粒都具有特异性的双特异性复合物一起孵育，以允许靶部分阳性细胞的结合。随后，将这样的复合物与具有高侧向散射的颗粒一起孵育，以形成细胞:颗粒复合物。高侧向散射颗粒可定义为在没有细胞和抗体存在的情况下采集时，在Beckman Coulter CytoFLEX仪器上产生约2.5x 104的几何平均荧光强度。因此，细胞:颗粒复合物的侧向散射可以产生1×105或更高的几何平均荧光强度信号，这取决于未标记群体的原始散射分布。洗涤过量的双特异性复合物和颗粒，然后用荧光染料缀合的抗体对细胞进行染色。在第二次洗涤以去除过量的荧光染料缀合的抗体后，将细胞:颗粒复合物与各种浓度的富集试剂一起孵育。由于细胞:颗粒复合物的高侧向散射，有可能通过流式细胞术通过侧向散射的偏移来评估给定浓度的富集试剂的释放效率。通过流式细胞术分析来确定用颗粒标记的细胞的侧向散射信号的几何平均值(图7C)。使用两种富集试剂制剂产生剂量-反应曲线：第一含PEG的富集试剂；和第二含葡聚糖的富集试剂。通过使用可变斜率拟合(四个参数)绘制log[抑制剂]与反应的关系，生成剂量-反应曲线。
侧向散射的减少与细胞群体的去标记(即从其中去除颗粒)相关。SSC信号从最大侧向散射信号的平均2.5倍的降低代表了充分的去标记和细胞在免疫磁性分离过程中向磁场迁移的能力的降低，允许这样的细胞在阴性部分中被倒出。
实施例8：富集试剂可以在细胞富集的任何时候加入
研究了在富集方案中添加富集试剂的时机。在实施例4所述的细胞分离方案中，改变抗体组合物(“C”)、颗粒(“P”)和富集试剂(“E”)加入细胞样品的顺序。添加顺序似乎不影响CD271高细胞的平均％纯度或平均％回收率(图8A)。
此外，无论是在添加抗体组合物之前、在样品与抗体组合物和颗粒一起孵育之后(“第一次加满之后”)还是在第一次磁性分离之后(“第一次倒出之后”)，富集的CD271高细胞的平均％纯度似乎都没有改变(图8B)。然而，当在第一次加满之后或第一次倒出之后添加富集试剂时，CD271高细胞的平均％回收率似乎增加(图8B)。
实施例9：富集试剂可用于从CD271高神经嵴细胞中分离CD271低细胞
如实施例1所述，从1C和H9细胞分化出神经嵴细胞。培养6天后，如实施例2所述从培养板中收获细胞，并汇集成单细胞悬浮液。使用PE缀合的抗人CD271抗体进行检测，如实施例2所述进行起始分化细胞群体的流式细胞术。初始分化细胞群体包括大约70％的CD271低细胞(图9A)。在如实施例5中所述的CD271+细胞的第一次分离(并使用如实施例4中产生的抗CD271双特异性复合物)之后，随后在含PEG的富集试剂中孵育，CD271低细胞在阴性流出级分中的比例增加至约95％(图9B)。随着第一富集试剂浓度的增加，观察到CD271低细胞的平均纯度略有增加，平均回收率显著增加(图9C)。进行与(B)和(C)中描述的基本相同的程序，但是在免疫磁性分离中使用EasySep Dextran RapidSpheres(STEMCELL Technologies)。在分离分化的CD271+细胞后，将它们与不同浓度的含葡聚糖的富集试剂一起孵育，将CD271低细胞的纯度和回收率与用对照洗涤试剂(EasySepTM方案中通常使用的洗涤试剂)(“0％”)获得的结果进行比较(D)。
实施例10：分离的CD271高神经嵴细胞是有功能的
从细胞群体中富集并在富集试剂中与CD271低细胞分离的CD271高神经嵴细胞(并使用如实施例4中产生的抗CD271双特异性复合物)可在STEMdiffTM神经嵴分化试剂盒(STEMCELL Technologies)中进一步培养和/或维持。将富集的CD271高细胞重新铺板(第0天)并在培养基中放置7天。在第7天，收获细胞培养物，计数，并通过如实施例2所述的流式细胞术进行分析，以量化CD271高和CD271低细胞的数量。图10A显示，CD271高细胞在7天培养期间显示出强扩增，而CD271低细胞显示出低扩增或无扩增。
此外，从细胞群体中富集并在富集试剂中与CD271低细胞分离的CD271高神经嵴细胞(并使用如实施例4中产生的抗CD271双特异性复合物)可在最适于建立神经嵴细胞的细胞密度下进一步培养。在该实施例中，在2×105个细胞/cm2最高达4×105个细胞/cm2的活细胞密度下观察到神经嵴细胞群体的最佳接种密度(图10B)。在同一实施例中，随着接种的CD271高细胞的纯度通过公开的富集程序增加，可以观察到污染性PAX6+细胞群体的减少，由白色箭头表示(图10B)。
此外，从细胞群体中富集并在富集试剂中与CD271低细胞分离的CD271高神经嵴细胞(并使用如实施例4中产生的抗CD271双特异性复合物)可在促进分化为外周神经元的条件下进一步培养。在本实施例中，使用了Lee G等人(2010)Nat Protoc 5(4):688–701的分化方案。在促进分化为表达外周蛋白和Brn3A的外周神经元的条件下培养CD271高神经嵴细胞(图10C)。
实施例11：CD25高细胞可以优先从白细胞分离样品中富集
首先通过使用氯化铵溶液(STEMCELL Technologies Part ID#07850)根据产品信息表溶解红细胞来处理白细胞分离样品(STEMCELL Technologies Part ID#70500)。使用EasySepTM缓冲液(STEMCELL Part ID#20144)洗涤样品两次，将样品加至50mL，并以150x g离心10分钟(无制动设置)。用移液管去除上清液，在CD25高富集方案(基本上如实施例5所述)之前，将细胞沉淀重悬于EasySepTM缓冲液中。
使用PE缀合的抗人CD25抗体进行检测，如实施例2中所述对经处理的白细胞分离样品进行流式细胞术。起始细胞群体包括约2％的CD25高细胞(图11A)。使用如实施例4所述的抗CD25双特异性复合物对CD25+细胞进行第一次分离后，CD25高细胞的比例增加至约57％(图11B)。在用含PEG的富集试剂孵育分离的细胞后，CD25高细胞的比例可进一步增加至约82％(图11C)。
如虚线(IC50)所示，富集试剂的适当浓度可以通过实施例7中所述的测定来确定(图11D)。
随着富集试剂浓度的增加，平均CD25高细胞纯度增加，只有较高浓度的富集试剂对平均CD25高细胞回收率有害(图11E)。
使用富集试剂将CD25高细胞与CD25低细胞分离后，将CD25高细胞与基本上如实施例4中所述形成的抗CD127双特异性复合物一起孵育。该CD127去除程序类似于EasySepTM人类CD4+CD127低CD25+调节性T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies Part ID#18063)中描述的程序。如实施例7所述使用第一富集试剂富集CD25高细胞后，从CD25高群体中去除CD127+细胞导致平均FOXP3+CD25高调节性T细胞纯度增加(图11F)。在CD127+细胞去除后，用于富集CD25高群体的浓度逐渐升高的第一富集试剂对平均FOXP3+CD25高调节性T细胞回收率具有逐渐增加的更有害的影响(图11F)。
实施例12：CD56高细胞可以优先从白细胞分离样品中富集
首先通过使用氯化铵溶液(STEMCELL Part ID#07850)根据产品信息表溶解红细胞来处理白细胞分离样品(STEMCELL Part ID#70500)。使用EasySepTM缓冲液(STEMCELLPart ID#20144)洗涤样品两次，将样品加至50mL，并以150x g离心10分钟(无制动设置)。用移液管去除上清液，注意不要干扰细胞沉淀。在执行CD56高富集方案(基本上如实施例5中所述)之前，将样品悬浮在EasySepTM缓冲液中。
使用PE缀合的抗人CD25抗体进行检测，如实施例2中所述对经处理的白细胞分离样品进行流式细胞术。起始细胞群体包括约0.5％的CD56高细胞(图12A)。在免疫磁性分离中使用抗CD56双特异性复合物(如实施例4所述)对CD56+细胞进行分离后，CD56高细胞的比例增加至约8％(图12B)。在用含PEG的富集试剂孵育分离的样品后，CD56高细胞的比例可进一步增加至约50％(图12C)。
如虚线(IC50)所示，第一富集试剂的适当浓度可以通过实施例7中所述的测定来确定(图12D)。
随着富集试剂浓度的增加，平均CD56高细胞纯度增加，但是浓度越来越高的富集试剂对平均CD56高细胞回收率具有越来越不利的影响(图12E)。
实施例13：CD8高细胞可以优先从白细胞分离样品中富集
首先通过使用氯化铵溶液(STEMCELL Part ID#07850)根据产品信息表溶解红细胞来处理白细胞分离样品(STEMCELL Part ID#70500)。使用EasySepTM缓冲液(STEMCELLPart ID#20144)洗涤样品两次，将样品加至50mL，并以150x g离心10分钟(无制动设置)。用移液管去除上清液，在CD8高富集方案(基本上如实施例5所述)之前，将细胞沉淀重悬于EasySepTM缓冲液中。
使用PE缀合的抗人CD8抗体进行检测，如实施例2中所述对经处理的白细胞分离样品进行流式细胞术。起始细胞群体包括约8％的CD8高细胞(图13A)。在免疫磁性分离中使用抗CD8双特异性复合物(如实施例4所述)对CD8+细胞进行分离后，CD8高细胞的比例增加至约84％(图13B)。在用含PEG的富集试剂孵育分离的样品后，CD8高细胞的比例可进一步增加至约92％(图13C)。
如虚线(IC50)所示，第一富集试剂的适当浓度可以通过实施例7中所述的测定来确定(图13D)。
随着富集试剂浓度的增加，平均CD8高细胞纯度通常增加，但是浓度越来越高的富集试剂对平均CD8高细胞回收率通常具有越来越不利的影响(图13E)。
实施例14：CD138高细胞可以优先从幼稚小鼠脾细胞样品中富集
从幼稚C57BL/6小鼠中取出脾脏，通过70μm尼龙网筛细胞过滤器机械分离到50mL管中。使用保存在2–8℃的EasySepTM缓冲液(STEMCELL Part ID#20144)，在以300x g离心10分钟(低制动设置)之前，将分解的脾悬浮液的体积调整至50mL。去除上清液，将细胞沉淀悬浮在EasySepTM缓冲液中。在CD138高富集方案(基本上如实施例5所述)之前，将单细胞悬浮液保存在冰上。
使用APC缀合的抗小鼠CD267(TACI)抗体和PE缀合的抗小鼠CD138抗体进行检测，如实施例2所述进行分离的脾细胞群体的流式细胞术。起始细胞群体包括少于1％的CD138高细胞(图14A)。在免疫磁性分离中使用抗CD138双特异性复合物(如实施例4中所述)分离CD138+细胞后，CD138高细胞的比例增加至约65％(图14B)。在含PEG的富集试剂中孵育分离的细胞后，CD138高细胞的比例可进一步增加至约76％(图14C)。
如虚线(IC50)所示，通过实施例7中所述的测定可以确定第一含PEG的富集试剂和第二含葡聚糖的富集试剂的合适浓度(图14D)。
首先富集试剂增加了平均CD138高细胞纯度，但是更高浓度的富集试剂不利于平均CD138高细胞回收率(图14E)。
第二富集试剂增加了平均CD138高细胞纯度，并且浓度逐渐升高的富集试剂似乎对平均CD138高细胞回收率没有影响(图14F)。
实施例15：CD138高细胞可以优先从幼稚小鼠骨髓样品中富集
从幼稚C57BL/6小鼠中取出股骨和胫骨，使用研钵和研杵机械分离，然后通过70μm尼龙网筛细胞过滤器进入50mL管中。使用保存在2–8℃的EasySepTM缓冲液(STEMCELL PartID#20144)，在以300x g离心10分钟(低制动设置)之前，将骨髓细胞悬浮液的体积调整至50mL。去除上清液，将细胞沉淀悬浮在EasySepTM缓冲液中。在CD138高富集方案(基本上如实施例5所述)之前，将单细胞悬浮液保存在冰上。
使用APC缀合的抗小鼠CD267(TACI)抗体和PE缀合的抗小鼠CD138抗体进行检测，如实施例2所述进行分离的骨髓细胞群体的流式细胞术。起始细胞群体包括少于1％的CD138高细胞(图15A)。在免疫磁性分离中使用抗CD138双特异性复合物(如实施例4中所述)分离CD138+细胞后，CD138高细胞的比例增加至约30％(图15B)。在用含PEG的富集试剂孵育分离细胞后，CD138高细胞的比例可进一步增加至约75％(图15C)。
含有PEG的第一富集试剂增加了平均CD138高细胞纯度，但是只有最高浓度的富集试剂不利于平均CD138高细胞回收率(图15D)。
含有葡聚糖的第二富集试剂增加了平均CD138高细胞纯度，并且浓度逐渐升高的富集试剂似乎对平均CD138高细胞回收率没有影响(图15E)。
虽然已经参考目前被认为是优选的例子描述了本公开，但是应当理解，本公开不限于所公开的例子。相反，本公开旨在覆盖包括在所附权利要求的精神和范围内的各种修改和等同设置。
所有的出版物、专利和专利申请都以引用的方式整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指示以引用的方式整体并入。

Claims (38)

1.一种从样品中富集靶部分阳性的第一细胞群体和/或靶部分阳性的第二细胞群体的方法，所述方法包括：
a)用颗粒标记第一群体和第二群体以形成细胞:颗粒复合物；
b)将所述细胞:颗粒复合物与富集试剂接触，以基本上脱去所述第一群体的颗粒标记；和
c)从样品中分离所述第一群体，
其中所述第一细胞群体中靶部分的水平低于所述第二细胞群体中靶部分的水平。
2.如权利要求1所述的方法，还包括：
d)将所述样品中的残余细胞:颗粒复合物与分离试剂接触，以基本上将所述第二群体与颗粒分离。
3.如权利要求2所述的方法，还包括：
e)从所述样品中分离第二群体。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述靶部分是细胞表面标志物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述细胞表面标志物是人CD271、人CD25、人CD49d、小鼠CD138、人CD8或人CD56。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述颗粒包被有聚合物。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述颗粒响应于磁场。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，还包括在步骤a)之后和步骤c)之前，从所述样品中分离所述细胞:颗粒复合物。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，还包括提供相对于所述第一群体和所述第二群体的靶部分的水平至少饱和量的颗粒。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中用颗粒标记所述第一细胞群体或所述第二细胞群体是由抗体或抗体片段介导的。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包含颗粒特异性成员和靶部分特异性成员。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述颗粒特异性成员直接或间接连接至所述靶部分特异性成员。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述颗粒特异性成员和所述靶部分特异性成员形成双特异性复合物。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述富集试剂的配制不同于所述分离试剂。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述富集试剂和所述分离试剂各自包含聚合物。
16.如权利要求15所述的方法，其中与所述分离试剂相比，所述富集试剂中聚合物的浓度相对较低。
17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述聚合物是PEG(聚乙二醇)、基于PEG的聚合物或PEG样的聚合物。
18.如权利要求15或16所述的方法，其中所述聚合物是葡聚糖、基于葡聚糖的聚合物或葡聚糖样的聚合物。
19.一种用于在样品中鉴别靶部分阳性的不同细胞群体的测定，所述测定包括：
a)用颗粒标记所述靶部分以形成细胞:颗粒复合物；和
b)通过流式细胞术获得所述细胞:颗粒复合物的读数，
其中所述第一细胞群体中所述靶部分的水平低于所述第二细胞群体中所述靶部分的水平。
20.如权利要求19所述的测定，其中所述第一群体的细胞:颗粒复合物的读数不同于所述第二群体的细胞:颗粒复合物的读数。
21.如权利要求19或20所述的测定，其中所述第一群体的细胞:颗粒复合物和所述第二群体的细胞:颗粒复合物两者的读数不同于未复合的靶部分阳性细胞的读数。
22.如权利要求19-21中任一项所述的测定，其中所述读数是侧向散射分布。
23.如权利要求19-22中任一项所述的测定，其中所述靶部分是细胞表面标志物。
24.如权利要求23所述的测定，其中所述细胞表面标志物是人CD271、人CD25、人CD49d、小鼠CD138、人CD8或人CD56。
25.如权利要求19所述的测定，其中所述颗粒响应于磁场。
26.如权利要求19所述的测定，还包括提供相对于所述第一群体和所述第二群体的所述靶部分的水平至少饱和量的颗粒。
27.如权利要求19所述的测定，其中用颗粒标记所述第一细胞群体或所述第二细胞群体是通过抗体或抗体片段介导的。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述抗体或抗体片段包含颗粒特异性成员和靶部分特异性成员。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述颗粒特异性成员直接或间接连接至所述靶部分特异性成员。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述颗粒特异性成员和所述靶部分特异性成员形成双特异性复合物。
31.如权利要求22所述的测定，还包括以所述靶部分上的侧向散射分布进行门控。
32.如权利要求19所述的测定，还包括在获取读数之前从样品中分离所述细胞:颗粒复合物。
33.如权利要求19-32中任一项所述的测定，还包括：
c)将所述细胞:颗粒复合物与富集试剂接触；和
d)通过流式细胞术重新获取读数以评估读数的偏移。
34.如权利要求33所述的测定，其用于测量细胞:颗粒复合物对所述富集试剂的剂量反应性。
35.一种试剂盒，其用于从样品中富集靶部分阳性的第一细胞群体和/或靶部分阳性的第二细胞群体，所述试剂盒包括：
a)包含聚合物包被的颗粒的管；
b)包含抗体组合物的管，所述抗体组合物包含与靶部分特异性成员连接的颗粒特异性成员；
c)包含富集试剂的管；和
d)任选地，包含分离试剂的管。
36.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述富集试剂含有PEG或含有葡聚糖。
37.如权利要求35所述的试剂盒，其中所述分离试剂含有PEG或含有葡聚糖。
38.如权利要求35-37中任一项所述的试剂盒，其中所述富集试剂中PEG或葡聚糖的浓度相对低于所述分离试剂中的浓度。
CN202180029444.6A 2020-02-20 2021-02-19 用细胞群体进行的方法和测定 Pending CN115443331A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062979025P 2020-02-20 2020-02-20
US62/979,025 2020-02-20
PCT/CA2021/050190 WO2021163806A1 (en) 2020-02-20 2021-02-19 Methods and assays with populations of cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115443331A true CN115443331A (zh) 2022-12-06

Family

ID=77390264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180029444.6A Pending CN115443331A (zh) 2020-02-20 2021-02-19 用细胞群体进行的方法和测定

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230082631A1 (zh)
EP (1) EP4107253A4 (zh)
CN (1) CN115443331A (zh)
AU (1) AU2021224558A1 (zh)
WO (1) WO2021163806A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5877299A (en) * 1995-06-16 1999-03-02 Stemcell Technologies Inc. Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations
US20190178879A1 (en) * 2012-08-23 2019-06-13 Stemcell Technologies Canada Inc. Compositions and methods for rapid and reversible biomolecular labeling
WO2014029012A1 (en) * 2012-08-23 2014-02-27 Stemcell Technologies Inc. Compositions and methods for rapid and reversible biomolecular labeling
EP3037170A1 (en) * 2014-12-27 2016-06-29 Miltenyi Biotec GmbH Multisort cell separation method
CN112469816A (zh) * 2018-06-06 2021-03-09 加拿大干细胞技术公司 用于富集髓系来源的抑制细胞的试剂盒、组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230082631A1 (en) 2023-03-16
EP4107253A1 (en) 2022-12-28
EP4107253A4 (en) 2024-04-03
WO2021163806A1 (en) 2021-08-26
AU2021224558A1 (en) 2022-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Baghaei et al. Isolation, differentiation, and characterization of mesenchymal stem cells from human bone marrow
Seiler et al. Improvement of an in vitro stem cell assay for developmental toxicity: the use of molecular endpoints in the embryonic stem cell test
Fong et al. Separation of SSEA-4 and TRA-1–60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS)
EP2875819B1 (en) Compositions of cardiomyocyte subpopulations
CA2649234C (en) Method and device to fractionate stem cells
AU2007357127B2 (en) Method for identifying and selecting cardiomyocytes
KR101318713B1 (ko) 세포내 미토콘드리아를 지표로 이용하는 심근 세포의 선별방법
CN106047804B (zh) 一种脂肪干细胞的纯化方法及干细胞在成骨诱导及成软骨诱导上的应用
EP3464562B1 (en) Process for generation, identification and isolation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and cardiomyocyte subpopulations
EP2850203B1 (en) Cell-surface signatures for isolating neurons from cell cultures derived from pluripotent stem cells
DK2634195T3 (en) Separation of living pristine neurons
Choi et al. Purification of pig muscle stem cells using magnetic-activated cell sorting (MACS) based on the expression of cluster of differentiation 29 (CD29)
Chalmers et al. Theoretical analysis of cell separation based on cell surface marker density
Burdsal et al. Tissue-specific, temporal changes in cell adhesion to echinonectin in the sea urchin embryo
CN115443331A (zh) 用细胞群体进行的方法和测定
CN111440760B (zh) 一种人多能干细胞高效分化得到内皮祖细胞的方法
CN101418284A (zh) 分离纯化人羊水干细胞的方法
JP2019150039A (ja) ヒト角膜内皮細胞（ｈｃｅｃ）の同定及び分離
JP2007143524A (ja) 細胞分離方法ならびに細胞検査方法とその試薬キット
Lagar’kova et al. Characteristics of human bone marrow mesenchymal stem cells isolated by immunomagnetic selection
Naung et al. Dilutional and centrifugation factors of lower density gradient separation media on osteoprogenitor cells separated from concentrated bone marrow aspirate
JP2006050974A (ja) 心筋前駆細胞の単離方法及び単離用デバイス
Hsieh High Gradient Labelling-free Isolation of Cardiomyocytes from Heterogeneous Populations
SG183071A1 (en) Method for identifying and selecting cardiomyocytes
Iovino et al. Colon

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination