CN115399287A - 间歇性低氧方法的应用及设备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及低氧训练领域,尤其涉及一种间歇性低氧方法的应用及设备。本发明提出间歇性低氧方法在用于提高哺乳动物运动能力、记忆力、注意力和创造力中的应用,以及在用于提高脑血流量或脑血氧饱和度中的应用。本发明实施例还提出一种用于促进哺乳动物功能性血管新生、和/或改善哺乳动物缺血性脑损伤的设备,该设备为低氧和常氧交替进行,低氧的氧气体积百分比含量为13%,低氧吸入的时间为5分钟、常氧的吸入时间为5分钟为一个循环;每天进行10个循环,连续进行14天。本发明的间歇性低氧方法不会造成神经功能损伤,通过诱导大脑功能性微血管新生,提高运动能力或记忆力。
Description
技术领域
本发明涉及低氧训练领域,尤其涉及一种间歇性低氧方法的应用及设备。
背景技术
低氧是指当空气中的氧浓度低于正常空气中的氧浓度(一般指21%)或生物体的氧气消耗量超过氧气供应量。可见于衰老、病理状态、气候变化和实验干预等。轻度或中度缺氧会引发细胞和生理适应,使生物体对随后的缺氧或缺血性损伤更具抵抗力。因此,很多研究学者开展低氧预适应相关研究,探究其作为潜在的非药物治疗干预疾病的保护途径及机制。
间歇性低氧训练(Interval hypoxia training,IHT)是一种模拟低氧、高压的呼吸环境来进行呼吸训练的方法。间歇性低氧训练对心血管系统、代谢类疾病和改善人脑认知有着比较明显的治疗效果,具有广泛的应用。但间歇性低氧训练如条件控制不当,可能会造成神经功能损伤。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种间歇性低氧方法的应用及设备。
本发明提供了一种间歇性低氧方法在用于提高哺乳动物运动能力、记忆力、注意力和创造力中的应用,间歇性低氧方法为低氧和常氧交替进行,低氧的氧气体积百分比含量为11%~13%,常氧的氧气体积百分比含量为21%;低氧吸入的时间为5~9分钟,常氧的吸入时间为5~9分钟,为一个循环;每天进行6~15个循环,连续进行7~21天。
可选的,间歇性低氧方法为低氧和常氧交替进行,低氧的氧气体积百分比含量为11%~13%,常氧的氧气体积百分比含量为21%;低氧吸入的时间为5~9分钟,常氧的吸入时间为5~9分钟,为一个循环;每天进行6~15个循环,连续进行7~21天。
可选的,低氧的氧气体积百分比含量为13%;低氧吸入的时间为5分钟,常氧的吸入时间为5分钟,为一个循环;每天进行10个循环,连续进行14天。
可选的,哺乳动物为人、鼠、马、牛、羊、狗、兔、猪或猴。
本发明提供了一种用于促进哺乳动物功能性血管新生、和/或改善哺乳动物缺血性脑损伤的设备,设备包括电源模块、控制模块、低氧发生模块和显示模块,低氧发生模块用于交替提供低氧和常氧,低氧的氧气体积百分比含量为11%~13%,常氧的氧气体积百分比含量为21%;以提供低氧5~9分钟、常氧5~9分钟为一个循环。
可选的,低氧的氧气体积百分比含量为13%,以提供低氧5分钟、常氧5分钟为一个循环。可选的,针对每一个哺乳动物,设备每天运行6~15个循环,连续进行7~21天;哺乳动物为人,鼠,马,牛,羊,狗,兔,猪或猴。
可选的,控制模块包括:设置模块、报警模块和矫正模块;设置模块用于低氧前设置氧浓度、温度、湿度、压强、亮度参数的目标值和波动范围;温度设置为22~25℃;湿度设置为40%~60%,压强设置为100~110KPa,光强设置为自然光1级。
可选的,低氧发生模块包括:氧气供应模块、氮气供应模块、二氧化碳供应模块、入气口、阀门控制模块、气体流量控制模块、气体混合模块、出气口和低氧舱;氧气供应模块供应低氧系统需要的氧气;氮气供应模块供应低氧系统需要的氮气;二氧化碳供应模块供应低氧系统需要的二氧化碳;气体流量控制模块设置气体流量为200~300mL/min,经阀门控制模打开氧气供应模块、氮气供应模块和二氧化供应模块的阀门,气体经入气口进入到气体混合模块,随后经出气口进入到低氧舱;低氧结束后,阀门控制模块自动关闭;低氧舱包括亮度模块、检测模块和观察模块。
可选的,显示模块用于实时显示低氧舱内的环境参数变化,包括氧气浓度、氮气浓度、二氧化碳浓度、温度、湿度、压强等和间歇性低氧的进程;同时观察实时观察低氧舱内哺乳动物状态。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点:
本发明的间歇性低氧方法不会造成神经功能损伤,同时可通过诱导大脑功能性微血管新生,提高运动能力或记忆力。
本发明的促进哺乳动物功能性血管新生、和/或改善哺乳动物缺血性脑损伤的设备,可以通过诱导大脑功能性微血管新生,具有改善缺血缺氧性脑疾病的作用。
附图说明
图1为本发明实施例中间歇性低氧方式的模式图;
图2为本发明实施例设备的结构示意图;
图3是不同氧浓度间歇性低氧2w的脑血流;每组N=4~9,*p<0.05;
图4是不同氧浓度的间歇性低氧2w的脑血氧;每组N=4~9,*p<0.05,**p<0.01;
图5是13%O2不同低氧模式的实验设计;
图6是13%O2不同模式低氧2w的脑血流;每组N=3~5,*p<0.05,**p<0.01;
图7是13%O2,不同模式低氧2w的脑血氧;每组N=3~5,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001;
图8是不同低氧模式的转棒测试;每组N=7~10,*p<0.05;
图9是不同低氧模式的新物体识别测试;每组N=7~10,*p<0.05,**p<0.01;
图10是皮层、纹状体、海马、丘脑、下丘脑血管重构图;Scale bar,40μm;
图11是将共聚焦图像进行3D重构;
图12是皮层血管直径分布;
图13是定量分析皮层血管长度;每组N=6,**p<0.01,****p<0.0001;
图14是定量分析皮层血管体积;每组N=6~7,*p<0.05,****p<0.0001;
图15是定量分析7个脑区血管总长度;每组N≥25,*p<0.05,**p<0.01;
图16是定量分析7个脑区血管总体积;每组N≥25,***p<0.001;
图17是BrdU在低氧一周后开始注射,BrdU/Lectin共定位标记新生血管;
图18是血管新生相关蛋白表达水平;
图19是基底膜相关蛋白表达水平;
图20是紧密连接蛋白表达水平;
图21是PDGFβ标记周细胞,lectin标记血管;
图22是AQP4标记星形胶质细胞尾足,lectin标记血管;
图23是周细胞对血管的包裹率,每组N=3~4;
图24是星形胶质细胞尾足对血管的包裹率,每组n=3~6。**p<0.01;
图25是低氧预适应的实验设计;
图26是粘纸实验的接触时间,每组N=10;
图27是粘纸实验的摘除时间,每组N=10,***p<0.001;
图28是Garcia Score神经功能评分,每组N=10;
图29是错步实验的总步数,每组N=10,**p<0.01;
图30是错步实验的错误率,每组N=10;
图31是低氧干预缺血性脑卒中模型的实验设计;
图32是卒中3天粘纸实验的接触时间,每组N=10,###p<0.001,****p<0.0001;
图33是卒中3天粘纸实验的摘除时间,每组N=10,###p<0.001,***p<0.001;
图34是卒中3天Garcia Score神经功能评分,****p<0.0001;
图35是卒中3天错步实验的错误率,每组N=10,##p<0.01,####p<0.0001,****p<0.0001;
图36是卒中3天是错步实验的总步数;每组N=10,#p<0.05;
图37是卒中3天的梗死体积的荧光染色结果;
图38是定量计算梗死体积,每组N=4~5,#p<0.05,****p<0.0001;
图39是梗死区周围血管长度,每组N=10~11,**p<0.01;
图40是梗死区周围血管体积,每组N=10~11;
其中:
电源模块1;控制模块2;低氧发生模块3;显示模块4;设置模块5;报警模块6;矫正模块7;氧气供应模块8;氮气供应模块9;二氧化碳供应模块10;入气口11;阀门控制模块12;气体流量控制模块13;气体混合模块14;出气口15;低氧舱16;亮度模块17;检测模块18;观察模块19。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施;显然,说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
本发明实施例的第一方面提出一种间歇性低氧方法在非疾病治疗方面的应用,该应用具体包括提高哺乳动物运动能力、记忆力注意力和创造力,运动能力包括运动耐力和协调性,创造力包括、对新事物探索能力。该应用还包括非疾病治疗目的的提高脑血流量、脑血氧饱和度和脑血管新生。其机制为本发明实施例通过特定的间歇性低氧方式激发了机体代偿性的保护作用,使机体产生了多种促血管生成物质,从而提高脑血流量、脑血氧饱和度,并促进脑血管新生,进而可以提高哺乳动物记忆力。本发明实施例通过神经功能分析表明低氧是否造成神经功能损伤。本发明分别在低氧前、低氧后从运动耐力和协调能力、认知方面评估神经功能,包括转棒疲劳实验和新物体识别测试,实验证实了本发明实施的间歇性低氧方式不会造成神经功能损伤,同时促进了脑血流量,因此可以进一步提高运动能力。
其中,间歇性低氧方法为低氧和常氧交替进行,低氧的氧气体积百分比含量为11%~13%,常氧的氧气体积百分比含量为21%;本发明实施例经筛选实验发现,低氧条件下13%氧气可显著增加小鼠的脑血氧,而低氧条件中的氧气含量过低,不仅不能进一步的增加脑血氧,反而有造成神经损伤的风险。
而如果每个循环中低氧时间延长,会造成神经功能的损伤,而如果低氧条件的时间过短,低氧刺激对于脑部血管的刺激不足,不足以带来显著的生理学变化。低氧吸入的时间为5~9分钟、常氧的吸入时间为5~9分钟为一个循环;低氧的时间不宜高于9分钟,并优选低氧吸入的时间为5~7分钟,常氧的吸入时间为5~7分钟,为一个循环。
而如果低氧刺激次数不够,可能会造成无法激活机体内源性保护机制,或内源性保护机制不足以产生持久的保护效果。每天进行6~15个循环,连续进行7~21天。每天进行8~12个循环,优选10个循环;连续进行10~18天,优选12~16天,最优选14天。
因此,低氧的时间不宜高于9分钟,最优选为5分钟。具体的,该方法的模式图如图1所示。因此采用本发明实施例的方法,从而实现了较持久地增加小鼠脑血流血氧水平且不会造成神经功能和血管结构损伤。
本发明实施例的第二方面提出一种用于促进哺乳动物功能性血管新生、和/或改善哺乳动物缺血性脑损伤的设备。本发明实施例的设备也可用于提高哺乳动物运动能力或提高哺乳动物记忆力,以及提高提高脑血流量或脑血氧饱和度等方面。本发明实施例的设备可以增加血管新生,具体表现为可以增加脑部血管的体积和长度,且新生血管结构完整。
为了进一步说明该设备对哺乳动物缺血性脑损伤的作用,本发明实施例通过先对小鼠应用该设备后,制备缺血性脑卒中模型。通过评估梗死体积和梗死区周围血管分析发现,本发明实施例的设备可以诱导大脑功能性微血管新生,具有抵抗缺血缺氧性脑疾病的作用。
作为本发明实施例的一种具体实施方式,该设备的结构示意图如图2所示。本发明实施例的设备包括电源模块、控制模块、低氧发生模块和显示模块,低氧发生模块用于交替提供低氧和常氧,所提供低氧的氧气体积百分比含量为11%~13%,所提供常氧的氧气体积百分比含量为21%,以提供低氧5~9分钟、常氧5~9分钟为一个循环。
作为本发明实施例设备的一种改进,低氧的氧气体积百分比含量为13%,以提供低氧5分钟、常氧5分钟为一个循环。
作为本发明实施例设备的一种改进,针对每一个哺乳动物,本发明实施例本发明实施例的设备每天运行6~15个循环,连续进行7~21天;并进一步优选每天运行10个循环,连续进行14天。
具体的,哺乳动物可以为人,也可以为其他哺乳动物,例如鼠、马、牛、羊、狗、兔、猪或猴。
作为本发明实施例设备的一种改进,控制模块包括:设置模块、报警模块和矫正模块;设置模块用于低氧前设置氧浓度、温度、湿度、压强、亮度参数的目标值和波动范围;设置模块设置参数具体为:温度设置为22~25℃;湿度设置为40%~60%,压强设置为100~110KPa,光强设置为自然光1级。
作为本发明实施例设备的一种改进,低氧发生模块包括:氧气供应模块、氮气供应模块、二氧化碳供应模块、入气口、阀门控制模块、气体流量控制模块、气体混合模块、出气口和低氧舱;氧气供应模块供应低氧系统需要的氧气;氮气供应模块供应低氧系统需要的氮气;二氧化碳供应模块供应低氧系统需要的二氧化碳;气体流量控制模块设置气体流量为200~300mL/min,经阀门控制模打开氧气供应模块、氮气供应模块和二氧化供应模块的阀门,气体经入气口进入到气体混合模块,随后经出气口进入到低氧舱;低氧结束后,阀门控制模块自动关闭;低氧舱包括亮度模块、检测模块和观察模块。
作为本发明实施例设备的一种改进,显示模块用于实时显示低氧舱内的环境参数变化,包括氧气浓度、氮气浓度、二氧化碳浓度、温度、湿度、压强等和间歇性低氧的进程;同时观察实时观察低氧舱内哺乳动物状态。
下面通过实施例进一步说明本发明实施例,所用试剂均为市售。
实施例1
本实施例用于说明本发明实施例的设备对小鼠脑血流血氧的影响。
实验步骤:
将8周龄雄性小鼠分为三组:分别暴露于7%、10%、13%O2的常压低氧舱,每天进行低氧5min-常氧5min,10个循环,持续2周。
实验完成后,通过测定小鼠大脑矢状缝的脑血流血氧,评估本发明实施例的设备对小鼠脑血流血氧的影响。实验结果如图3和图4所示。
由图3和图4可知,13%氧浓度具有更好地提高小鼠脑血流血氧的效果,表现为与对照组相比,10%和13%氧气可增加小鼠脑血流水平,如图3所示,且两者无统计学差异。与对照相比,7%、10%和13%氧气均明显增加小鼠的脑血氧,且13%氧气效果更好,如图4所示。
实施例2
本实施例用于研究本发明实施例的设备对小鼠脑血流血氧的影响。
实验步骤:
将8周龄雄性小鼠暴露13%O2的常压低氧舱,分为4组,示意图如图5所示。
IH组(13%,5min×10次):每天进行低氧5min-常氧5min,10个循环,持续2周;IH组(13%,10min×5次):每天低氧10min-常氧10min,5个循环,持续2周;CH组(13%,14D):13%O2条件下,持续性低氧2周。其中,IH组(13%,5min×10次)为本发明实施例设备组。实验结果如图6~图7所示。
三组设备的其他条件设置为:温度22~25℃;湿度40%~60%,压强100~110KPa,光强设置为自然光1级,气体流量为200~300mL/min。
由图6和图7所示,三组设备均可以增加小鼠脑血流血氧水平,且效果相差不大。为观察脱离低氧环境后对脑血流血氧的长期效果,在小鼠低氧2周后再给予常氧2周,发现IH组设备的效果更持久。
实施例3
本实施例用于研究本发明实施例的设备是否会引起神经损伤。实验分组及设备同实施例2。
实验方法:转棒疲劳实验:设置转棒疲劳仪的起始速度10r/min、加速度4r/min2、最大速度20r/min、时间5min等参数。仪器分为5个通道,将三只小鼠面向里侧轻柔地放置在棒上,点击开始按钮。当小鼠从棒上掉落时,仪器自动暂停相应通道,并记录在棒时间。每只动物测试三次。试验结束后,导出并分析数据。
新物体识别测试:由于认知正常的小鼠,对新事物探索时间较旧事物长,因此通过检测小鼠在新旧物体周围的活动次数和时间,可以检测小鼠的认知记忆能力。认知指数计算公式=(新物体-旧物体)/(新物体+旧物体)。操作如下:
熟悉旧物体:在干净且可以自由活动的场地中放入两个相同且无气味的物体。将小鼠放入场地中自由活动10分钟,保持环境安静。记录小鼠探索物体的时间和次数。探索行为以小鼠鼻子靠近或触碰辨别物体开始,离开结束,小鼠在物体上玩耍或啃咬物体的行为不视为探索行为。
接触新物体:在小鼠熟悉旧物体24小时之后,进行新物体识别记忆的检测。在干净且可以自由活动的场地中放入两个大小相似但形状、颜色不相同且无气味的物体。将小鼠放入场地中自由活动5分钟,保持环境安静。记录小鼠对物体的探索次数和时间。
为了研究不同低氧模式对小鼠神经功能的影响,评估了低氧2周和复氧2周后小鼠的运动功能和认知功能。实验结果如图8、图9所示。
实验显示,13%O2处理2周,CH(13%,14D)组会诱导小鼠运动及认知损伤,而IH低氧组不会。表现为小鼠在持续性低氧两周后出现转棒水平下降(如图8所示)和新物体识别能力下降,且在复氧两周后新物体识别能力未恢复(如图9所示)。
上述数据表明本发明实施例的设备较持久地增加小鼠脑血流血氧水平且不会造成神经功能和血管结构损伤。
实施例4
本实施例用于研究本发明实施例的设备对血管新生的作用。实验分组及设备同实施例2。
1、血管长度分析和血管体积分析包括动物灌流及脑组织固定、脑组织冰冻切片、免疫荧光染色、显微镜拍摄、血管图像重构、血管图像计算。
1.1、动物灌流及脑组织固定:低氧设备处理14天结束后,室温吸入异氟烷(0.51~0.64mL/kg)麻醉小鼠,剪开腹部皮肤,打开胸腔,暴露心脏。将灌流用针头插入小鼠左心室,剪开右心耳。用灌流用针管连接室温储存的生理盐水,灌流20mL,4mL/min;待心脏及肝脏由红色变为灰白色后,再用预冷的4%多聚甲醛灌流20mL,2mL/min。然后剪开颅骨,完整取出脑组织放在含有20%蔗糖的4%多聚甲醛脱水液中浸泡,放于4℃冰箱存放,待脑组织沉底后换成含有30%蔗糖的4%多聚甲醛脱水液,放在4℃冰箱储存备用;
1.2、脑组织冰冻切片:将脑组织表面水分吸干,放入包埋剂内,置于-20℃速冻,待包埋剂凝固变为乳白色后,将脑组织放置在冰冻切片机的置物台上,并调正位置。调整冰冻切片机的切片厚度为40μm,进行切片,将脑片浸泡在0.1M PBS溶液中,保存在4℃冰箱备用;
1.3、免疫荧光染色:小鼠尾静脉注射凝集素(lectin),比例1:200,标记皮层、海马CA1、海马CA3、海马DG、纹状体、丘脑和下丘脑等7个脑区的毛细血管内皮细胞。每次取包含皮层、纹状体、海马、丘脑、下丘脑等脑区在内的大脑切片,进行免疫荧光染色;
1.4、显微镜拍摄:用荧光共聚焦显微镜对切片进行三维拍照。将显微镜参数调节为放大倍数为20×,分辨率为1024×1024像素,Z轴间距1μm;拍摄完毕将网络图像导出保存;
实验结果如图10、图12所示,与对照组相比,IH(13%,5×10)组和CH(13%,14D)组在4~10μm范围内血管数量增加。
1.5、血管图像重构:将3D血管图像导入分析软件Imaris中,利用surface界面功能半自动将血管网络重建为软件可识别的状态,利用filament介面功能进行自动计算图像中血管的长度和体积。
用Imaris进行血管重构并进行定量分析的结果如图11所示,13%O2处理2周,IH(13%,5×10)组和CH(13%,14D)组会增加全脑毛细血管长度和体积,图13、图14所示,皮层毛细血管长度和体积增加,如图15、图16所示,7个脑区血管总长度和体积增加。
2、血管新生分析包括标记新生细胞、动物灌流及脑组织固定、脑组织冰冻切片、免疫荧光染色、显微镜拍摄。
2.1、标记新生细胞:在小鼠低氧第8天至第14天,连续7d腹腔注射5-溴脱氧尿苷(BrdU)(100mg/kg)标记增殖期细胞;
2.2、动物灌流及脑组织固定:低氧14天结束后,用20mL室温生理盐水和20mL4℃预冷的4%多聚甲醛进行灌流。完整取出脑组织脱水后放在4℃冰箱储存备用;
2.3、脑组织冰冻切片:将脑组织包埋后,用冰冻切片机进行切片,厚度为40μm。将脑片浸泡在0.1M PBS溶液中,保存在4℃冰箱备用;
2.4、免疫荧光染色:使用抗体BrdU,使用比例1:200的lectin,用来标记血管;通过观察新生细胞标记物BrdU与血管标记物lectin的重叠情况,来分析血管的新生情况;
通过与血管共定位来标记新生血管,结果如图17所示。与对照组相比,IH(13%,5×10)组与CH(13%,14D)组皮层均可观察到血管新生,表明血管长度和体积的增加与血管新生有关。结果表明,本发明实施例的设备可以增加小鼠毛细血管新生,且效果不亚于持续性低氧。
2.5、显微镜拍摄:用荧光共聚焦显微镜对切片进行三维拍照。将显微镜参数调节为放大倍数为120×,分辨率为1024×1024像素,Z轴间距1μm;拍摄完毕将网络图像导出保存。
3、血管的结构组成分析包括动物灌流及脑组织固定、脑组织冰冻切片、免疫荧光染色、显微镜拍摄、血管图像重构、血管共定位分析、蛋白水平分析;
3.1、流及脑组织固定:低氧14天结束后,用20mL室温生理盐水和20mL4℃预冷的4%多聚甲醛进行灌流。完整取出脑组织脱水后放在4℃冰箱储存备用;
3.2、脑组织冰冻切片:将脑组织包埋后,用冰冻切片机进行切片,厚度为40μm。将脑片浸泡在0.1M PBS溶液中,保存在4℃冰箱备用;
3.3、免疫荧光染色:使用抗体凝集素(lectin),使用比例1:200,用来标记血管;血小板衍生因子受体-β(PDGFR-β),使用比例1:50,用来标记周细胞;水通道蛋白4(AQP4),使用比例1:800,用来标记星形胶质细胞尾足;用PDGF-β标记的周细胞与lectin标记的血管共定位的情况,表示周细胞包裹率,用AQP4标记的星形胶质细胞尾足与lectin标记的血管共定位的情况,表示星形胶质细胞对血管的包裹率。
实验结果如图21、图22所示,与对照相比,使用本发明实施例设备后的小鼠周细胞包裹率无差异,表示用本发明实施例设备不影响新生血管的周细胞对血管的包裹率。
3.4、显微镜拍摄:用荧光共聚焦显微镜对切片进行三维拍照。将显微镜参数调节为放大倍数为120×,分辨率为1024×1024像素,Z轴间距1μm;拍摄完毕将网络图像导出保存;
3.5、血管图像重构:将3D血管图像导入分析软件Imaris中,利用surface界面功能半自动将血管网络重建为软件可识别的状态;
3.6、血管共定位分析:利用共定位界面功能分析周细胞标记物PDGFR-β和血管标记物lectin重叠的体积,来计算周细胞对血管的包裹情况;分析星形胶质细胞尾足标记物AQP4和血管标记物lectin重叠的体积,来计算星形胶质细胞对血管的包裹情况;
如图23、图24所示,与对照相比,与对照相比,使用本发明实施例设备后的小鼠周细胞包裹率无差异,小鼠星形胶质细胞包裹率无差异,表示使用本发明实施例设备的应用不影响新生血管的星形胶质细胞包裹率。
3.7、蛋白水平分析:利用蛋白质组学技术可以检测低氧后血管相关蛋白、基底膜相关蛋白和紧密连接蛋白的变化,从而表明低氧后新生血管结构的完整性。
实验结果为:实验结果如图18~图20所示,与对照组相比,IH(13%,5×10)和CH(13%,14D)均增加内皮连接蛋白(如图20所示)、基底膜相关蛋白(如图19所示)和血管相关蛋白(如图18所示)的表达。上述实验结果说明,本发明实施例的装置诱导的新生血管结构完整。
实施例5
本实施例用于说明本发明实施例设备的效果验证:包括制备缺血性脑卒中动物模型、评估神经功能、评估梗死体积和梗死区周围血管分析。实验分组及设备同实施例2。
1、缺血性脑卒中动物模型的制备方法:
使用本发明实施例的设备对在小鼠进行低氧14天处理,制备缺血性脑卒中模型。用5%异氟醚对小鼠进行深度麻醉,并在O2中用2%异氟醚维持麻醉。分离颈部组织,暴露左颈总动脉并永久结扎。在通过小开颅术暴露大脑中动脉的左远端分支后,用电凝器烧灼以永久阻断该分支。手术期间体温保持在36.5~37.5℃之间。为了确认远端大脑中动脉的闭塞,在手术前,手术中和手术后,使用激光散斑测量小鼠大脑血流。假手术组步骤同上,只是不结扎右颈总动脉,也不烧灼大脑中动脉远端分支。
排除标准:造模后脑血流比基线水平降低小于30%;手术中蛛网膜下腔出血;电凝时造成周围组织损伤导致大量出血。
2、评估神经功能:在缺血性脑卒中模型术后第3天评估神经功能。这些评估包括错步测试、粘纸摘除测试和改良Garcia神经功能评分等独立的行为学测试。操作如下:
2.1、错步测试:小鼠被放置在网格上(40cm×40cm,小格直径:2cm×2cm,离地面50cm)。让小鼠在网格上自由行走,当右前肢踩空时,被定义为错误。通过右前肢错误步数占右前肢总步数的百分比来衡量错误率。
2.2、粘纸摘除测试:小鼠被关在干净透明的笼子中1分钟,以适应环境。然后将带有粘性的贴纸(4mm×4mm)以相同的力度贴在小鼠右前爪的掌侧。随后,将小鼠轻柔地放回笼子里,记录小鼠触碰和摘掉粘纸所花费的时间,最多记录60秒。
2.2、改良Garcia神经功能评分:主要从5个表现进行判断:动物的自主运动、体态对称性、前肢伸展运动、抓持和攀爬铁笼能力、两侧身体触觉反射反应。得分从0-15分不等,得分越高,神经功能损伤程度越轻,15分表明无神经功能缺损。
3、动物实验方法:
低氧预适应的实验设计如图25所示;低氧干预缺血性脑卒中模型的实验设计如图32所示。在dMCAO模型前,分别给予2周IH(13%,5min)组和CH(13%,14D)组预处理(图25),在低氧结束24小时内进行dMCAO手术(图31)。采用了dMCAO后3d的神经功能水平和脑梗死体积来评估间歇性低氧预处理的效果。
通过粘纸实验、网格实验和神经功能评分,研究了缺血缺氧损伤相关的神经功能。粘纸实验的接触时间如图26所示,粘纸实验的摘除时间如图27所示,Garcia Score神经功能评分如图28所示。
如图29所示,预适应阶段,IH(13%,5min)组就表现出会提高运动功能而CH组会造成感觉或运动功能下降,IH组的小鼠在单位时间内行走的步数增加,如图29和图30所示。如图27所示,CH组的小鼠摘掉粘纸时间延长。
而在dMCAO术后,实验结果如图32~图36所示,13%O2处理2周,IH组会减轻缺血缺氧相关的神经功能损伤。这表现为与仅进行dMCAO的小鼠相比,IH预处理的小鼠明显减少了接触和摘掉粘纸的时间,实验结果如图32、图33所示;并且网格实验中在增加了单位时间内行走的步数的同时,明显降低了网格实验错误率,实验结果如图35、图36所示。卒中3天Garcia Score神经功能评分如图34所示。
3、评估梗死体积:在缺血性脑卒中模型术后第3天评估梗死体积。步骤包括动物灌流及脑组织固定、脑组织冰冻切片、免疫荧光染色、显微镜拍摄、梗死体积计算。
动物灌流及脑组织固定:用20mL室温生理盐水和20mL 4℃预冷的4%多聚甲醛进行灌流。完整取出脑组织脱水后放在4℃冰箱储存备用;
脑组织冰冻切片:将脑组织包埋后,用冰冻切片机进行切片,厚度为60μm。将脑片浸泡在装有0.1M PBS溶液的孔板里,每间隔6张放在同一个孔里,即第1、7、13……张脑片在同一个孔里,第2、8、14……张脑片在同一个孔里。将脑片保存在4℃冰箱备用;
免疫荧光染色:使用抗体MAP2,使用比例1:300,用来标记神经元;每只动物取一个孔板里的脑片进行染色;
显微镜拍摄:用荧光共聚焦显微镜对切片进行拍照。将显微镜参数调节为放大倍数为5×,分辨率为512×512像素;拍摄完毕将图像导出保存。
梗死体积计算:将显微镜拍摄的图像导入Image J软件,圈定每张脑片的梗死范围,通过软件计算模块计算单张脑片的梗死面积。
梗死体积=梗死面积总和×60μm×6孔。
梗死区周围血管分析:在缺血性脑卒中模型术后第3天评估梗死体积。步骤包括动物灌流及脑组织固定、脑组织冰冻切片、免疫荧光染色、显微镜拍摄、血管长度和体积计算。
动物灌流及脑组织固定:用生理盐水和4%多聚甲醛灌流后,取出脑组织脱水后放在4℃冰箱储存备用;
脑组织冰冻切片:厚度为60μm的冰冻切片,保存在4℃冰箱备用;
免疫荧光染色:使用抗体lectin标记血管;
显微镜拍摄:用荧光共聚焦显微镜对切片进行三维拍照。在显微镜视野内找到梗死区,在梗死区周围随机选择三个视野进行拍照。将显微镜参数调节为放大倍数为20×,分辨率为1024×1024像素,Z轴间距1μm;
梗死体积计算:将3D血管图像导入分析软件Imaris中,利用surface界面功能半自动将血管网络重建为软件可识别的状态,利用filament介面功能进行自动计算,通过此步骤,可计算出图像中血管的长度和体积。
通过免疫荧光染色标记神经元发现,与仅进行dMCAO的小鼠相比,IH(13%,5min)组可以减轻dMCAO 3d的梗死体积,实验结果如图37、图38所示。评估梗死区周围的血管长度和体积,发现与持续性低氧相比,使用本发明实施例设备可以增加梗死区周围血管长度和体积,实验结果如图30、图40所示,说明使用本发明实施例设备发挥保护作用的方式与血管相关。
如上述实验结果所示,本发明实施例的设备可以通过提高血管密度来减轻dMCAO神经功能损伤和脑梗死体积。
以上所述仅是本发明的具体实施方式,使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种间歇性低氧方法在用于提高哺乳动物运动能力、记忆力、注意力和创造力中的应用,其特征在于,所述间歇性低氧方法为低氧和常氧交替进行,所述低氧的氧气体积百分比含量为11%~13%,所述常氧的氧气体积百分比含量为21%;
所述低氧吸入的时间为5~9分钟,所述常氧的吸入时间为5~9分钟,为一个循环;每天进行6~15个循环,连续进行7~21天。
2.一种间歇性低氧方法在用于提高脑血流量或脑血氧饱和度中的应用,其特征在于,所述间歇性低氧方法为低氧和常氧交替进行,所述低氧的氧气体积百分比含量为11%~13%,所述常氧的氧气体积百分比含量为21%;
所述低氧吸入的时间为5~9分钟,所述常氧的吸入时间为5~9分钟,为一个循环;每天进行6~15个循环,连续进行7~21天。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述低氧的氧气体积百分比含量为13%;
所述低氧吸入的时间为5分钟,所述常氧的吸入时间为5分钟,为一个循环;每天进行10个循环,连续进行14天。
4.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述哺乳动物为人、鼠、马、牛、羊、狗、兔、猪或猴。
5.一种用于促进哺乳动物功能性血管新生、和/或改善哺乳动物缺血性脑损伤的设备,其特征在于,所述设备包括电源模块、控制模块、低氧发生模块和显示模块,所述低氧发生模块用于交替提供低氧和常氧,所述低氧的氧气体积百分比含量为11%~13%,所述常氧的氧气体积百分比含量为21%;以提供所述低氧5~9分钟、所述常氧5~9分钟为一个循环。
6.根据权利要求5所述的设备,其特征在于,所述低氧的氧气体积百分比含量为13%,以提供所述低氧5分钟、所述常氧5分钟为一个循环。
7.根据权利要求5或6所述的设备,其特征在于,针对每一个哺乳动物,所述设备每天运行6~15个循环,连续进行7~21天;
所述哺乳动物为人、鼠、马、牛、羊、狗、兔、猪或猴。
8.根据权利要求5所述的设备,其特征在于,所述控制模块包括:设置模块、报警模块和矫正模块;所述设置模块用于低氧前设置氧浓度、温度、湿度、压强、亮度参数的目标值和波动范围;温度设置为22~25℃;湿度设置为40%~60%,压强设置为100~110KPa,光强设置为自然光1级。
9.根据权利要求5所述的设备,其特征在于,所述低氧发生模块包括:氧气供应模块、氮气供应模块、二氧化碳供应模块、入气口、阀门控制模块、气体流量控制模块、气体混合模块、出气口和低氧舱;
所述氧气供应模块供应低氧系统需要的氧气;氮气供应模块供应低氧系统需要的氮气;二氧化碳供应模块供应低氧系统需要的二氧化碳;
所述气体流量控制模块设置气体流量为200~300mL/min,经阀门控制模打开氧气供应模块、氮气供应模块和二氧化供应模块的阀门,气体经所述入气口进入到所述气体混合模块,随后经所述出气口进入到所述低氧舱;低氧结束后,所述阀门控制模块自动关闭;
所述低氧舱包括亮度模块、检测模块和观察模块。
10.根据权利要求5所述的设备,其特征在于,所述显示模块用于实时显示低氧舱内的环境参数变化,包括氧气浓度、氮气浓度、二氧化碳浓度、温度、湿度、压强等和间歇性低氧的进程;同时观察实时观察低氧舱内所述哺乳动物状态。
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