CN115398005A - 检测测试样品中分枝杆菌属物种的存在的方法 - Google Patents

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CN115398005A CN202180025196.8A CN202180025196A CN115398005A CN 115398005 A CN115398005 A CN 115398005A CN 202180025196 A CN202180025196 A CN 202180025196A CN 115398005 A CN115398005 A CN 115398005A
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Abstract

本发明提供一种通过对测试样品进行液相色谱‑串联质谱法(LC‑MS/MS)来检测测试样品中是否存在分枝杆菌属(mycobacterium)物种的方法。

Description

检测测试样品中分枝杆菌属物种的存在的方法
技术领域
本发明涉及用于检测测试样品中分枝杆菌的存在的超灵敏方法，所述分枝杆菌属于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合群(MTBc)，以及不属于MTBc，也称为非结核分枝杆菌(NTM)或非典型分枝杆菌(mycobacteria other than tuberculosis,MOTT)。该方法还能够识别检测到的分枝杆菌。
背景技术
结核分枝杆菌(MTBc)和非结核分枝杆菌(NTM)物种均被证明会导致人类的肺部疾病。其中，结核病(TB)主要通过吸入由患有症状疾病的患者产生的含有MTBc的气溶胶飞沫传播，而NTM疾病主要通过来自环境的气溶胶传播。然而，吸入后，MTBc和NTM都被肺中的肺泡巨噬细胞吞噬。随后，各种免疫细胞从循环中招集到感染部位。
分枝杆菌物种的检测和识别，特别是在感染的早期阶段的检测和识别，对治疗结果至关重要。早期诊断使医师能够尽早开始治疗。
然而，在标本中，MTBc和NTM物种的鉴别诊断是一项重大挑战。
因此，本发明旨在开发用于检测测试样品中的分枝杆菌的方法，所述分枝杆菌属于MTBc以及不属于NTM，并进一步鉴定检测到的分枝杆菌物种。
发明内容
本发明的目的是一种通过使用利用LC-MS/MS分析仪的多反应监测(MRM)扫描模式对测试样品进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析来检测测试样品中分枝杆菌属(mycobacterium)物种的存在的方法，LC-MS/MS分析仪包括用于生成先驱离子的液相色谱(LC)仪器和用于将先驱离子转换为碎片离子的三重四极杆(Q1、q、Q3)仪器。该方法包括以下步骤：
-使用第一四极杆(Q1)扫描预定质荷比(m/z)值的先驱离子，并使用第三四极杆(Q3)扫描预定质荷比(m/z)值的碎片离子，其中对一组离子对执行扫描，每对离子对由一个先驱离子和所述先驱离子的一个碎片离子组成，所述离子对包括以下m/z值的基本组的离子对：1136.2-395.4、1164.2-395.4、1000-395.4、970-395.4、1122.2-367.4、1166.2-367.4、985.9-367.4、943.9-367.4、1164.2-367.4、1222.2-367.4、942.1-367.4、1024.1-367.4、1080.1-367.4、1096.1-367.4、1150.2-367.4、1192.2-367.4、929.9-367.4、1136.2-339.4；
-根据从扫描中收到的数据，如果存在于测试样品中，则获得霉菌酸(MA)的图谱，
-将获得的霉菌酸图谱与通过使用多反应监测(MRM)扫描模式对参考样品进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析而获得的霉菌酸参考图谱进行比较，以评估霉菌酸的样品图谱和霉菌酸的参考图谱的相容性，以及
-基于评估的相容性，确定测试样品中是否存在分枝杆菌属物种，如果存在，将分枝杆菌属物种分类为以下分类方案中的一组或多组：
o属于结核分枝杆菌复合群(MTBc)的组，包括：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、结核分枝杆菌h37rv、田鼠分枝杆菌(M.microti)、卡内蒂分枝杆菌(M.canetti)、牛分枝杆菌山羊亚种(M.bovis caprae)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、居间分枝杆菌(M.interjectum)，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第一组(NTM 1)，包括：蟾分枝杆菌(M.xenopi)，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第二组(NTM 2)，包括：玛尔摩分枝杆菌(M.malmonese)、猿分枝杆菌(M.simiae)，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第三组(NTM 3)，包括：偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种(M.fortuitum acetamydolyticum)、偶遇分枝杆菌(M.fortuitum)、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种(M.fortuitum margeritense)、偶遇分枝杆菌嗜热亚种(M.fortuitumtermophilum)、奇美拉分枝杆菌(M.chimaera)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、海分枝杆菌(M.marinum)，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第四组(NTM 4)，包括：鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium paratuberculosis)、鸟分枝杆菌唾液亚种(M.aviumsilvaticum)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、奇美拉分枝杆菌(M.chimaera)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、土地分枝杆菌(M.terrae)、下枝分枝杆菌(M.shimodei)，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第五组(NTM 5)，包括：鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、鸟分枝杆菌唾液亚种、胞内分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、斯氏分枝杆菌(M.shulgai)、土地分枝杆菌，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第六组(NTM 6)，包括：戈登分枝杆菌(M.gordonae)、斯氏分枝杆菌、偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种、偶遇分枝杆菌、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种、偶遇分枝杆菌嗜热亚种，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第七组(NTM 7)，包括：下枝分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、脓肿分枝杆菌马赛亚种(M.abscessussubsp.Massilense)，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第八组(NTM 8)包括：海分枝杆菌、居间分枝杆菌、斯氏分枝杆菌，
o不属于结核分枝杆菌复合群的第九组(NTM 9)包括：偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种、偶遇分枝杆菌、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种、偶遇分枝杆菌嗜热亚种，鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、鸟分枝杆菌唾液亚种、胞内分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、土地分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、脓肿分枝杆菌马赛亚种。
该方法可以进一步包括执行对离子对的扫描，所述离子对包括以下m/z值的补充组的离子对：1124.1-395.4、1180.2-395.4、1192.2-395.4、1196.2-395.4、1220.2-395.4、1222.2-395.4、1250.2-395.4、1252.2-395.4、1264.3-395.4、1280.2-395.4、1294.3-395.4、1028.1-395.4、942-395.4、998-395.4、1038.1-395.4、1152.2-367.4、1178.2-367.4、1180.2-367.4、957.9-367.4、971.9-367.4、915.9-367.4、1014-367.4、958-339.4、1136.1-367.4、1108.1-367.4、1250.2-367.4、1194.2-367.4、1194.2-339.4、970-367.4、913.9-367.4、885.9-339.4、914-339.4、1052.1-339.4、1052.1-367.4，以在属的水平上鉴定选自以下组成的组中的分枝杆菌属物种：结核分枝杆菌、结核分枝杆菌h37rv、田鼠分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、牛分枝杆菌山羊亚种、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种、偶遇分枝杆菌、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种、偶遇分枝杆菌嗜热亚种、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、鸟分枝杆菌唾液亚种、胞内分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、猿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、戈登分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、土地分枝杆菌、下枝分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、脓肿分枝杆菌马赛亚种、海分枝杆菌、居间分枝杆菌。
基本组的离子对的扫描可以在补充组的离子对的扫描之后执行。
电离可以在负模式下进行。
附图说明
本发明的这些和其他目的是通过提供一种用于检测样品中的分枝杆菌的方法来实现的。本发明进一步的细节和特征、其性质和各种优点将从附图中所示的优选实施方式的以下具体描述中变得更加明显，其中：
图1表示MS/MS谱峰的强度的示意图，其构成针对基本组的MRM对和补充组的MRM对获得的霉菌酸(MA)图谱；
图2是LC毛细管中样品体积的示意图；
图3示出了根据本发明的LC-MS/MS分析的示例性扫描参数的表格。
具体实施方式
本文提出的检测分枝杆菌的方法可以对取自感兴趣对象的样品进行，即人体或动物体，优选取自怀疑感染了分枝杆菌的个体。样品的收集不构成本发明的一部分。测试样品优选通过处理体液来制备，例如盐水/痰、尿液、血液或其混合物以提取霉菌酸，如果样品中存在的话，以提供LC-MS/MS分析可接受的样品形式。
检测分枝杆菌的方法包括对测试样品进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析。该方法能够检测选自由以下组成的组中的至少一种分枝杆菌物种：结核分枝杆菌、结核分枝杆菌h37rv、田鼠分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、牛分枝杆菌山羊亚种、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种、偶遇分枝杆菌、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种、偶遇分枝杆菌嗜热亚种、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、鸟分枝杆菌唾液亚种、胞内分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、猿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、戈登分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、土地分枝杆菌、下枝分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、脓肿分枝杆菌马赛亚种海分枝杆菌、居间分枝杆菌。
根据本发明的方法是具体的：可以评估来自上述组别中的任何细菌物种是否存在于所研究的样品中并鉴定细菌物种。此外，该方法是超灵敏的-测试样品中存在约50个单独的细菌细胞足以获得可靠的阳性结果。
根据本发明的方法利用一组霉菌酸(mycolic acid，MA)的参考图谱，所述霉菌酸的参考图谱使用在MRM(多反应监测)模式下工作的LC-MS/MS分析由选自上述组的分枝杆菌物种的参考样品获得。
根据本发明，将MA的参考图谱与获得的MA的样品图谱进行比较，而基于评估的图谱相容性，确定：样品中是否存在分枝杆菌物种，如果存在—上面列出的组别中的哪些特定物种存在于所研究的样品中。
通过使用在MRM模式下工作并利用分析仪的LC-MS/MS分析，以相同的方式获得MA的参考图谱以及MA的样品图谱，分析仪包括配备有电喷雾离子源(ESI)的三重四极杆(Q1，q，Q3)仪器，所述电喷雾离子源(ESI)能够有效电离来自LC仪器的样品材料。在MRM中，感兴趣的先驱离子在串联质谱仪的一级质谱分析器(Q1)中选择并在碰撞室(q)中碎片化，然后特征产物离子(称为碎片离子)在二级质谱分析器(Q3)中选择。因此，霉菌酸被选择性地使用四极杆Q1和Q3的跃迁离子对进行监测。由于来源的原因，每对跃迁离子对也称为MRM对。MRM对中的第一离子将在一级质谱分析器(Q1)中选择，而MRM对中的第二离子将在二级质谱分析器(Q3)中选择。
根据本发明，公开了MRM对的基本组别(Q1/Q3)，包括18个MRM对，提供了该方法所需的特异性和灵敏度。这组18个MRM对专用于检测上述列表中的至少一种分枝杆菌物种的存在。由m/z(质荷比)比表示的MRM对的基本组别(Q1/Q3)列于下表1中第1列。
表1–由MRM对的基本组别获得的参考样品的霉菌酸强度：
Figure BDA0003868018800000061
Figure BDA0003868018800000071
Figure BDA0003868018800000072
Figure BDA0003868018800000081
Figure BDA0003868018800000082
Figure BDA0003868018800000091
表1中列出的每个MRM对都能够获得一个霉菌酸(MA)图谱。只有当样品中存在这种霉菌酸时，才能获得(生成)该图谱，从而确认所研究样品中分枝杆菌的存在。在样品中存在给定的分枝杆菌物种(表1，第2列)的情况下(以所需的数量-至少50个细菌细胞)，响应于由MRM对的值(第1列)表示的施加的选择性，获得霉菌酸的图谱。每个图谱都是MS/MS图谱(直方图)，峰强度列于表1，第3–13列中，以属水平为分枝杆菌物种的参考。
该方法的灵敏度和可靠性的提高是由于选择的MRM对，当MRM对用作分析标准时，可对来自上述组的分枝杆菌物种进行超灵敏的检测和识别。该方法快速简便，可在配备LC-MS/MS分析仪的实验室内完成。
根据本发明的方法的选择性和灵敏度可以通过提供一组补充的34个MRM对来进一步提高—用作参考和测试样品材料的LC-MS/MS分析的进一步标准。表2列出了一组补充的34个MRM对以及MA的相应图谱。
表2–参考样品的霉菌酸强度，为MRM对的补充组获得：
Figure BDA0003868018800000101
Figure BDA0003868018800000111
Figure BDA0003868018800000112
Figure BDA0003868018800000121
Figure BDA0003868018800000122
Figure BDA0003868018800000131
因此，根据本发明，每个获得的MA图谱对应于一个MRM对——用作LC-MS/MS分析标准。如果获得的MA样品图谱与MA的相应参考图谱相容，则以高度灵敏度确认分枝杆菌的存在。
18个MRM对的基本组足以提高的可靠性和灵敏度确认上述组中的分枝杆菌的存在，而此外使用的表2的34个MRM对的补充组进一步提供了对检测到的分枝杆菌的全面鉴定-在属水平上。
MRM对的补充组提供了MA的补充图谱。补充图谱提供了关于给定分枝杆菌的给定霉菌酸存在的额外的、更具体的信息。换句话说，使用MRM对的基本组表示样品中存在的分枝杆菌群，而使用补充组的MRM对表示属水平的分枝杆菌物种。此外，一些MA图谱提供了其他分枝杆菌群的诊断。
图1是MS/MS图谱峰强度的示意图，构成了针对MRM对的基本组和MRM对的补充组获得的MA参考图谱的示意图-并列。基本MRM对在左侧第一列中用黑色矩形标记，而补充MRM对在同一列中用白色矩形标记。在图1中，表1和表2中的峰强度以颜色灰度图形表示，颜色越深，峰强度越大。从图1中可以看出，18个MRM对的基本组提供了对给定分枝杆菌组的检测：MTBc，NTM 1(蟾分枝杆菌)、NTM 2(玛尔摩分枝杆菌、猿分枝杆菌)、NTM 3(偶遇分枝杆菌)、NTM 4(MAIC1)、NTM 4(MAIC1)、NTM 5(MAIC2，堪萨斯分枝杆菌，斯氏分枝杆菌)、NTM 6(戈登分枝杆菌、斯氏分枝杆菌)、NTM 7(脓肿分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、下枝分枝杆菌、龟分枝杆菌)、NTM 8(居间分枝杆菌、海分枝杆菌)和NTM 9(多菌株)，而34个MRM对的补充组在属水平上提供了给定分枝杆菌物种存在的额外信息，包括：结核分枝杆菌、结核分枝杆菌h37rv、田鼠分枝杆菌、卡内蒂分枝杆菌、牛分枝杆菌山羊亚种、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种、偶遇分枝杆菌、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种、偶遇分枝杆菌嗜热亚种、鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、鸟分枝杆菌唾液亚种、胞内分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、蟾分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、猿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、戈登分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、土地分枝杆菌、下枝分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、脓肿分枝杆菌马赛亚种、海分枝杆菌、居间分枝杆菌。因此，补充组MRM对的额外使用可以提供更全面的结果。
本文使用的LC方法不使用色谱分离：流动注射分析(FIA)。取而代之的是，在所研究的液体样品流过毛细管的过程中提供有效电离。引入LC分析仪的研究样品优选在氯仿和甲醇的混合物中稀释，氯仿和甲醇的混合物以氯仿：甲醇的体积比为50：50，并添加2mM氟化铵(AF)混合而成。在上述混合物中稀释的测试样品不会与LC相混合-如图2所示。在对单个样品进行分析期间，所应用的梯度流导致收集多达几十次扫描。LC毛细管的优选直径为0.25μm或更小。
根据本发明的研究样品可以是例如痰或体液的形式，例如尿液、支气管灌洗液、支气管抽吸物等，尽管它们已被识别。可以另外考虑鉴定以最小化各个样品之间的污染风险。可以通过有意地将样品分成几组来最小化风险，例如：从患有肺结核以外的肺部疾病的患者采集的痰液、从分枝杆菌细胞水平低的患者采集的痰液，以及从患有活动性肺结核的患者采集的痰液。
实施例1–样品制备和进行LC-MS/MS分析：
痰液样品通过碱性方法使用N-乙酰半胱氨酸(N-AcCys)显色，该方法包括目测评估小瓶中痰液样品的体积，然后添加将4％氢氧化钠和1％N-AcCys(乙酰半胱氨酸)的溶液的体积(等于痰液样品的体积(溶液：痰液样品的体积比为1：1))到痰液样品中。将得到的混合物在37℃下培养30分钟。接下来，将2.2％柠檬酸钠溶液添加到混合物中，柠檬酸钠：痰液起始体积的体积比为1：2。然后，将0.067mol/L的pH＝6.8的磷酸盐缓冲液加入到混合物中，缓冲液：痰液起始体积的体积比为1：4。接下来，将混合物以300rpm的转速离心30钟。对于痰液以外的样品材料，只需离心即可制备用于LC-MS/MS分析的样品，而在痰液样品的显色仅用于LC-MS/MS分析的情况下，可以省略柠檬酸钠和缓冲液的添加。
在显影之后，样品具有悬浮液的形式，其被消耗成几部分。进一步处理之前，每个部分都被旋涡混合。
接下来，将体积最小为2mL的显色样品的旋涡混合部分转移到单独的派热克斯玻璃(pyrex)小瓶中，以制备用于LC-MS/MS分析的样品。作为一种选择，可以另外取另一部分显影和旋涡混合的样品进行细菌检查和接种分析。
接下来，将显影和旋涡混合样品(2mL)的均质部分转移到小瓶中，并用PTFE密封。接下来，将样品以4500rpm的转速离心30分钟。随后，除去上清液(1.5mL)，并将得到的沉淀物加入2mL的25％氢氧化钾的甲醇溶液(25％KOH在MeOH中)。然后将沉淀物以3000rpm的转速旋涡混合30秒。接下来，用塞子将小瓶密封并在90℃下培养60分钟。接下来，将小瓶冷却至室温并打开。
以下步骤在通风橱下进行。加入1.5mL以水稀释的盐酸(18.5％HCl)中和样品，然后沉淀出KCl白色粉末。接下来，通过在小瓶中加入2mL纯氯仿(ChCl3)对样品进行霉菌酸的提取，然后在液-液相中提取，这通过在旋涡混合器中混合该混合物30分钟来进行。接下来，小心收集透明度低的氯仿相，体积至少为1mL。接下来，将收集的相转移到玻璃小瓶中。小瓶用塞子和隔板封闭。如此制备的样品在-80℃的温度下冷冻保存。或者，样品可以立即准备用于分析。
解冻后，将探针与在甲醇中的4mM氟化铵溶液按体积比-样品：溶液为1：1混合。接下来，对制备的样品进行LC-MS/MS分析。
LC-MS/MS分析过程：
样品的MRM扫描在负电离模式下进行，使用了表1和表2中的总共52个MRM对。基础组的18个MRM对(表1)的信号被应用(触发)，直到达到阈值强度，使用的阈值在图3中-“阈值”列规定。然后，补充组的34个MRM对(表2)的信号被应用(触发)。
LC的应用参数：
A相——甲醇
B相——氯仿
清洗阶段——氯仿：甲醇的体积比为80：20
校准时间：-0.20分钟
进样量：50.00μL
应用的二元梯度参数：
时间[分钟] 流速[mL/min] B相比例[％]
0.00 0.2500 60.0
0.39 0.2500 60.0
0.40 1.0000 100.0
0.90 1.0000 100.0
1.00 1.0000 60.0
自动进样器：采样速度：10μL/s；温度：8℃
用洗涤溶液冲洗：模式：取样前后，时间：10s，速度：35μL/s，体积：500μL；
色谱柱的温度(仅毛细管)：30℃。
使样品流过直径为0.25μm的毛细管，样品在50：50的氯仿：甲醇和2mM AF的混合物中稀释，因此样品不与液相合并。
MS/MS的应用参数：
扫描：MRM
预定的MRM：是(高级)
极化：负
所需的扫描时间：0.5000秒
Q1分辨率：低
Q3分辨率：单元
MRM停顿：3.0000毫秒
离子源参数：CUR：20.00psi，TEM：450.00℃，GS1：50.00psi，GS2：70.00psi，CAD：Medium，IS：-4500.00V。
MRM对和扫描参数在图3的表中设置。
接下来将获得的结果与参考数据进行比较，步骤如下：与LC-MS/MS分析仪协同的计算机使用算法，该算法基于所需的模式并提供相应MRM跃迁强度的直方图，包括已经可用于算法的参考跃迁的直方图。对所研究的样品也提供同样的操作。如果未获得一个或多个确定的MRM跃迁作为结果数据-对于扫描(研究)的样品，则此类MRM跃迁添加为“0”值。该算法计算模式(Sref)的直方图面积，而每个MRM跃迁都是以矩形的方式提供的，边长：底＝1，高度＝强度值。接下来，该算法创建第三直方图，该直方图是构成样品数据和参考数据之间差异的不合规区域，接下来该算法以相同的方式(Sdiff)计算第三直方图的面积。绝对值取自MRM跃迁的差值。使用以下公式计算模式的相容性：100*(1-(Sdiff-Sref))，其中负值返回为“0”。测试的/未知的菌株的相容性被处理为属于参考菌株的模式的最高匹配。
实施例2—所得结果与参考数据的比较：
a)对于参考样品，获得模式P与以下霉菌酸的MRM跃迁：KM01、KM02、KM03、KM04、KM05。各个霉菌酸的模式强度如下：100、20、40、60、10。计算模式的直方图面积：Sref＝100+20+40+60+10＝230。作为所研究样品A的LC-MS/MS分析的结果，获得了以下MRM跃迁数据：KM01、KM03、KM05的值分别为20、30、50。因此，样品A的模式用KM02、KM04补充，从而获得20、0、30、0、50的强度值。Sdiff＝|100-20|+|20-0|+|40-30|+|60-0|+|10-50|＝210。这两种模式的相容性(P，A)＝100*(1-210/230)＝8.7％。得到的结果意味着相关性低—识别的确定性弱。
b)发现样品B包含模式(B)：KM01，KM02，KM03，KM04，KM05，100，19，45，55，10。Sdiff＝|100-100|+|20-19|+|40-45|+|60-55|+|10-10|＝11。相容性(P，B)＝100*(1-11/230)＝95.2％。得到的结果意味着相关性高—识别的确定性强。
c)发现样品C包含模式(C)：KM01，KM02，KM03，KM04，KM05，100，100，100，100，100。Sdiff＝270。相容性(P，C)＝100*(1-270/230)＝-17.4％；结果返回为0％。获得的结果意味着没有相关性-没有鉴定：样品中没有检测到分枝杆菌。
虽然本发明已针对有限数量的实施例进行了描述，但应当理解，可以对本发明进行许多变化、修改和其他应用。因此，所附权利要求中记载的要求保护的发明不限于本文所述的实施例。

Claims (2)

1.一种检测测试样品中分枝杆菌属(mycobacterium)物种的存在的方法，所述方法通过使用利用LC-MS/MS分析仪的多反应监测(MRM)扫描模式对测试样品进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析，所述LC-MS/MS分析仪包括用于生成先驱离子的液相色谱(LC)仪器和用于将先驱离子转换为碎片离子的三重四极杆(Q1、q、Q3)仪器，其中，所述方法包括以下步骤：
-使用第一四极杆(Q1)扫描预定质荷比(m/z)值的先驱离子，并使用第三四极杆(Q3)扫描预定质荷比(m/z)值的碎片离子，其中对一组离子对执行扫描，每对离子对由一个先驱离子和所述先驱离子的一个碎片离子组成，所述离子对包括以下m/z值的基本组的离子对：1136.2-395.4、1164.2-395.4、1000-395.4、970-395.4、1122.2-367.4、1166.2-367.4、985.9-367.4、943.9-367.4、1164.2-367.4、1222.2-367.4、942.1-367.4、1024.1-367.4、1080.1-367.4、1096.1-367.4、1150.2-367.4、1192.2-367.4、929.9-367.4、1136.2-339.4；
-基于从扫描中收到的数据，获得霉菌酸(MA)的图谱，如果霉菌酸存在于测试样品中，
-将获得的霉菌酸的图谱与通过使用多反应监测(MRM)扫描模式对参考样品进行液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析而获得的霉菌酸的参考图谱进行比较，以评估霉菌酸的样品图谱和霉菌酸的参考图谱的相容性，以及
-基于评估的相容性，确定测试样品中是否存在分枝杆菌属物种，如果存在，将分枝杆菌属物种分类为以下分类方案中的一组或多组：
ο属于结核分枝杆菌复合群(MTBc)的组，包括：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、结核分枝杆菌h37rv、田鼠分枝杆菌(M.microti)、卡内蒂分枝杆菌(M.canetti)、牛分枝杆菌山羊亚种(M.bovis caprae)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、居间分枝杆菌(M.interjectum)，
ο不属于结核分枝杆菌复合群的第一组(NTM 1)，包括：蟾分枝杆菌(M.xenopi)，
ο不属于结核分枝杆菌复合群的第二组(NTM 2)，包括：玛尔摩分枝杆菌(M.malmonese)、猿分枝杆菌(M.simiae)，
ο不属于结核分枝杆菌复合群的第三组(NTM 3)，包括：偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种(M.fortuitum acetamydolyticum)、偶遇分枝杆菌(M.fortuitum)、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种(M.fortuitum margeritense)、偶遇分枝杆菌嗜热亚种(M.fortuitumtermophilum)、奇美拉分枝杆菌(M.chimaera)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、海分枝杆菌(M.marinum)，
ο不属于结核分枝杆菌复合群的第四组(NTM 4)，包括：鸟分枝杆菌(M.avium)、鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium paratuberculosis)、鸟分枝杆菌唾液亚种(M.aviumsilvaticum)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、奇美拉分枝杆菌(M.chimaera)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、土地分枝杆菌(M.terrae)、下枝分枝杆菌(M.shimodei)，
ο不属于结核分枝杆菌复合群的第五组(NTM 5)，包括：鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、鸟分枝杆菌唾液亚种、胞内分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、斯氏分枝杆菌(M.shulgai)、土地分枝杆菌，
ο不属于结核分枝杆菌复合群(NTM 6)的第六组，包括：戈登分枝杆菌(M.gordonae)、斯氏分枝杆菌、偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种、偶遇分枝杆菌、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种、偶遇分枝杆菌嗜热亚种，
ο不属于结核分枝杆菌复合群的第七组(NTM 7)，包括：下枝分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、脓肿分枝杆菌马赛亚种(M.abscessussubsp.Massilense)，
ο不属于结核分枝杆菌复合群的第八组(NTM 8)包括：海分枝杆菌、居间分枝杆菌、斯氏分枝杆菌，
ο不属于结核分枝杆菌复合群的第九组(NTM 9)包括：偶遇分枝杆菌乙酰氨基裂解亚种、偶遇分枝杆菌、偶遇分枝杆菌玛格丽特亚种、偶遇分枝杆菌嗜热亚种，鸟分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种、鸟分枝杆菌唾液亚种、胞内分枝杆菌、奇美拉分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、土地分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、脓肿分枝杆菌马赛亚种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述电离以负离子模式进行。
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