CN115389544B - 测量水分子跨细胞膜流出速率的方法及应用、胶质瘤磁共振影像学标志物的测量方法及系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了测量水分子跨细胞膜流出速率的方法：设定磁共振成像参数，并测量扫描时的噪音水平；通过蒙特卡洛模拟优化翻转角并重新设定；扫描定量T1磁共振成像；扫描动态增强磁共振成像并注入造影剂；使用完整快门速度模型SSMfull，对肿瘤内区域每个像素点进行像素分析，获取每个像素点的kio。该方法显著提升了kio的准确度。本发明公开了非疾病诊断为目的的kio作为胶质瘤的磁共振影像学标志物在评估AQP4表达水平上的应用及其测量方法和系统。本发明公开了kio作为胶质瘤的磁共振影像学标志物在制备预测胶质瘤对放化疗治疗的敏感性产品中的应用。通过上述应用、方法或系统实现了对胶质瘤内AQP4表达水平的无创、定量测量和成像。

Description

测量水分子跨细胞膜流出速率的方法及应用、胶质瘤磁共振 影像学标志物的测量方法及系统
技术领域
本发明属于磁共振成像的技术领域，特别涉及测量水分子跨细胞膜流出速率的方法及应用、胶质瘤的磁共振影像学标志物的测量方法。
背景技术
脑胶质瘤是成年人中最常见的中枢神经(CNS)疾病，约占原发性脑肿瘤的60％-70％。近期，大量研究表明AQP4(水通道蛋白4)在胶质瘤细胞的迁移、增殖和瘤周水肿都有重要作用，是胶质瘤预后的重要生物标记物。相比于正常脑星形胶质细胞，AQP4在胶质瘤中表达量显著增加，且其表达位置从星形胶质细胞末足(血管周围)向整个细胞膜重分布。研究表明，不同类型的胶质瘤细胞AQP4表达对抗癌药物替莫唑胺(TMZ)治疗表现出不同的反应。综上所述，AQP4表达水平和位置变化是胶质瘤转化和治疗抵抗的早期指标之一。
目前，传统的活检结果是目前唯一的表征AQP4在体的表达水平的标准。但活检采样只能单点或者有限点采样，使其无法获取AQP4在胶质瘤中的分布和动态信息，并且是一种有创方法，具有一定风险。由于胶质瘤具有很强异质性，采样过疏的片面信息可能附带误判信息。考虑到AQP4表达水平和位置变化在胶质瘤命运中的决定性作用，开发一种非侵入性同时对AQP4在体内表达具有较高空间分辨率的定量成像技术是非常必要的。如公开号为CN106683081A的中国专利提出的基于影像组学的胶质瘤分子标记物IDH1无损预测方法和预测系统。如公开号为CN107169497B的中国专利提出的一种基于基因影像学的肿瘤影像标记物提取方法。CN107169497B利用基因影像学，同时结合影像学和分子技术的优点，发明了一种非侵入、可解释性强的生物标记物提取方法，该方法通过提取肿瘤CT的高维定量影像特征，与对应的肿瘤基因表达模式进行关联；并假设某些定量影像特征可以反映肿瘤的特定基因表达模式，可作为肿瘤的预后标记物。最终目的是提取无侵入、生物学可解释的影像学标记物。
但是，由于AQP4在脑组织中表达浓度很低(≤[8.65±0.80]ng/ml)，使得现有的分子成像技术包括磁共振波谱(MRS)和化学交换饱和转移(CEST)都不能定量AQP4表达。此外，针对特定分子的外源性造影剂也可用于MRI分子成像。然而，目前还没有用于AQP4分子成像的这样的探针，即使有这样的探针，相关的药物开发和批准过程也很漫长和昂贵。
在正常脑星形胶质细胞中，AQP4是中枢神经系统表达的主要水通道，主要分布于星形胶质细胞的血管周围尾足。然而，在胶质瘤中，AQP4上调并从星形胶质细胞末端(血管周围)重新分布到整个细胞膜。AQP4异常表达有助于胶质瘤浸润到大脑中，是胶质瘤癌变的最早指标之一。更重要的是，AQP4还被证明是人类神经胶质瘤迁移、进展、水肿和治疗抵抗敏感的预后生物标志物，以及潜在的治疗目标。
发明内容
本发明的目的在于提供测量水分子跨细胞膜流出速率kio的方法，显著提升了kio的准确度；本发明还提供了测量kio在胶质瘤磁共振影像学标志物上的应用；本发明还提供了胶质瘤磁共振影像学标志物的测量方法及系统，从而实现对胶质瘤内AQP4表达水平的无创、定量测量和成像；本发明还提供了kio在制备预测胶质瘤对放化疗治疗的敏感性产品中的应用，有利于预测治疗反应和促进精准治疗。
本发明采取以下技术方案：
一种测量水分子跨细胞膜流出速率kio的方法，所述方法包括：
(1)设定动态对比增强磁共振成像参数，并测量动态对比增强磁共振扫描时的噪音水平；
(2)通过蒙特卡洛模拟，优化动态对比增强磁共振成像DCE-MRI采集参数中翻转角并重新设定动态增强磁共振成像翻转角；
(3)扫描定量T1磁共振成像；
(4)扫描动态增强磁共振成像，并注入造影剂；
(5)使用完整快门速度模型SSMfull，对肿瘤内区域每个像素点进行像素分析，获取每个像素点的水分子跨细胞膜流出速率kio，也称之为稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio。
在步骤(2)中，从已测量到的血管造影剂浓度Cp中随机选取一组或多组数据，然后模拟真实组织和扫描参数情况，在不同翻转角下合成DCE-MRI数据；合成的DCE-MRI数据中的时间序列信号
Figure GDA0003801822100000021
由完整快门速度模型SSMfull生成，并根据DCE-MRI实验估计的噪音水平在/>
Figure GDA0003801822100000022
中加入相同噪音水平的白噪声，并对添加噪音后的/>
Figure GDA0003801822100000023
使用完整快门速度模型SSMfull进行非线性最下平方拟合；在每个翻转角下，重复上述步骤多次，统计每次重复下拟合的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio；最后，kio拟合结果最接近模拟预设值且方差最小所在的翻转角为最优翻转角。优选的，重复100次以上。具体的，完整快门速度模型SSMfull可以参考CN201910621579.6。
在步骤(2)中，完整快门速度模型SSMfull,将水分子分为三个隔间：血管(b)，间质(o)和细胞内空间(i))，以及两个水交换过程，包括血液和间质之间的水交换和间质与细胞之间的水交换；血液和细胞内空间的水交换忽略不计。基于Gd的造影剂(CA)(Gd-DTPA，Gadopentetate dimeglumine，本发明中的(MAGNEVIST)被认为是一种胞外试剂，仅分布在血管和间质中。间隙空间中造影剂浓度[CAo](T)符合Kety-Schmidt型速率定律：
Figure GDA0003801822100000031
其中，vo是间质空间体积分数，[CAp]是CA在血浆中的浓度，T为时间周期，t为进行时间；完整快门速度模型SSMfull由5个独立却又有生理相关性的参数组成：pb-血管水摩尔分数、po-间质水摩尔分数、kbo-稳态水分子从血管到间质流动速率、kio-稳态水分子从胞内空间到间质流动速率，Ktrans-由CA渗出速率常数Kpe和血浆体积分数vp相乘得到(Ktrans＝Kpe*vp＝Kep*vo)。由po+pi+pb＝1的关系得到胞内水摩尔分数pi。
优选的，在步骤(2)中，在超高场下(>3T)，额外定量测量实际翻转角的空间分布来优化翻转角；在步骤(3)中，定量T1磁共振成像使用多翻转角-短重复时间序列。
优选的，在步骤(5)中，使用自动快门速度分析方法获取肿瘤区域造影剂血管渗出速度Ktrans，只在Ktrans>0.01min-1肿瘤区域进行进一步的SSMfull模型拟合，获取每个像素点的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio。具体的，可以参考CN201910621579.6。
本发明提供的上述方法为一种定量测量kio的方法。
本发明还提供了一种水分子跨细胞膜流出速率kio作为胶质瘤的磁共振影像学标志物在评估AQP4表达水平上的应用。其中，kio不局限于通过上述的定量测量kio的方法得到。kio作为胶质瘤的磁共振影像学标志物上的应用可以用于科学研究。
优选的，所述水分子跨细胞膜流出速率kio和AQP4表达水平的线性关系为：AQP4细胞阳性率＝(kio–A)/B；
其中，A为0.1～0.2s-1，B为13.07～15.04s-1。
本发明还提供了一种非疾病诊断为目的的水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤磁共振影像学标志物评估AQP4表达水平的测量方法，所述测量方法为：
(1)定量测量组织的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio；
(2)利用活检规划系统立体定向取活检组织，定量化该组织的AQP4表达水平；
(3)根据kio和AQP4表达水平，建立两者的线性关系；
(4)定量测量待测组织的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio，根据步骤(3)中的线性关系得到待测组织的AQP4表达水平。
优选的，所述测量方法包括以下步骤：
(1)设定动态对比增强磁共振成像参数，并测量动态对比增强磁共振扫描时的噪音水平；
(2)通过蒙特卡洛模拟，优化动态对比增强磁共振成像DCE-MRI采集参数中翻转角并重新设定动态增强磁共振成像翻转角；
(3)扫描定量T1磁共振成像；
(4)扫描动态增强磁共振成像，并注入造影剂；
(5)使用完整快门速度模型SSMfull，对肿瘤内区域每个像素点进行像素分析，获取每个像素点的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio；
(6)根据动态增强磁共振成像，利用活检规划系统立体定向取活检组织，定量化该组织的AQP4表达水平；
(7)对kio值和AQP4表达水平进行线性回归分析，获取AQP4表达水平和kio的线性方程；
(8)重复步骤(3)-(5)，根据步骤(7)中的线性方程将kio图像转换为AQP4表达水平图像，实现肿瘤内AQP4表达成像。
优选的，在步骤(6)中，获取活检组织AQP4免疫组化图片来定量化该组织的AQP4表达水平。
优选的，在步骤(7)中，AQP4表达水平和kio的线性关系为：AQP4细胞阳性率＝(kio–A)/B；
其中，A为0.1～0.2s-1，B为13.07～15.04s-1。
优选的，在步骤(8)中，AQP4表达水平空间分布图，可以利用颜色编码，提高可视度。
本发明还提供了一种水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤的磁共振影像学标志物在制备预测胶质瘤对放化疗治疗的敏感性产品中的应用。
其中，所述放化疗治疗采用的药物为替莫唑胺。
本发明还提供了一种胶质瘤磁共振影像学标志物的测量系统，所述测量系统包括：
图像提取和处理模块，定量测量组织的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio；
后处理模块，建立图像处理模块得到的kio与活检组织的AQP4表达水平的线性关系；
预测模块，对待测组织执行图像提取模块和图像处理模块得到kio，根据后处理模块中的线性关系预测待测组织的AQP4表达水平。
优选地，所述测量系统包括：
预处理模块，设定动态对比增强磁共振成像参数，并测量动态对比增强磁共振扫描时的噪音水平；过蒙特卡洛模拟，优化动态对比增强磁共振成像DCE-MRI采集参数中翻转角并重新设定动态增强磁共振成像翻转角；
图像提取模块，扫描定量T1磁共振成像；扫描动态增强磁共振成像，并注入造影剂；
图像处理模块，使用完整快门速度模型SSMfull，对肿瘤内区域每个像素点进行像素分析，获取每个像素点的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio；
后处理模块，建立图像处理模块得到的kio与活检组织的AQP4表达水平的线性关系；
预测模块，对待测组织执行图像提取模块和图像处理模块得到kio，根据后处理模块中的线性关系预测待测组织的AQP4表达水平。
其中，动态增强磁共振成像扫描参数中的重复时间，保持最短或接近最短。
其中，动态增强磁共振成像的噪音水平，可以通过扫描正常健康被试者获取。
其中，本发明通过蒙特卡洛模拟，优化动态对比增强磁共振成像DCE-MRI采集参数中翻转角(flip angle)，使其对水分子跨膜交换过程检测最敏感。
其中，本发明在扫描开始后的第八帧快速注入造影剂。共振造影剂为T1造影剂，剂量建议参照药厂说明，注射后立即再注射15-20毫升生理盐水，注射速度建议为每秒2毫升。
其中，根据动态增强磁共振成像，结合临床因素，获取最佳的活检点坐标后再进行立体定向取活检组织。其中，可以由专业医生或人员人工勾画肿瘤区域，或通过人工智能方法自动获取肿瘤区域。活检组织的样本个数为45个，该样本量可以进一步提升，从而提高kio表征AQP4水平的精确性。
综上所述，与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1.本发明首次提出胶质瘤中AQP4表达的磁共振影像学标志物–稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio，并证明了AQP4表达水平和kio存在着高度线性关系。
2.本方面提供了一种定量测量稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio的动态对比度增强磁共振成像方法，通过蒙特卡洛模拟，优化了动态对比度增强磁共振成像参数，显著提升了该成像方法对于kio测量的准确度。
3.本发明实现了对胶质瘤肿瘤内AQP4表达的定量成像，能够实现对胶质瘤肿瘤内AQP4表达异质性的测量。AQP4表达水平可以用于科学研究，如对一些抗癌药物及新型治疗手段的治疗效果的研究、AQP4表达水平与胶质瘤迁移、增值等病理过程的关系研究、AQP4表达水平与胶质瘤治疗抵抗的研究。
附图说明
图1为本发明设计的水通道蛋白4磁共振影像标志物的示意图：稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio是胶质瘤内水通道蛋白4表达的磁共振影像学标志物；
图2为本发明提供的胶质瘤的磁共振影像学标志物的测量方法的流程图；
图3为蒙特卡洛模拟流程图；
图4为通过蒙特卡洛模拟优化动态增强磁共振成像翻转角参数的结果；
图5为对45个胶质瘤活检组织的AQP4表达水平和kio平均值进行线性回归分析结果；
图6为实施例产生的一例低级别胶质瘤病人(左)和一例高级别胶质瘤病人(右)肿瘤内AQP4表达水平定量成像结果。
图7为在TMZ治疗期间kio可以精确检测C6细胞系中AQP4的动态表达。
图8为TMZ处理后C6细胞系kio，AQP4和其他参数的变化结果。
图9为TMZ处理后C6细胞系中AQP4表达和分布共聚焦结果。
图10为生物标记物kio在增殖周期中准确地跟踪U87MG细胞系中AQP4的动态调节。
图11为水交换DCE-MRI获得的kio图可以准确、准确地揭示体内AQP4异质性。
图12为kio可以精确地展示每只大鼠胶质瘤模型瘤内AQP4表达水平。
图13为在C6神经胶质瘤大鼠原位模型中观察到kio和AQP4表达之间存在线性相关性。
图14为AQP4的特异性药物干预抑制对皮下大鼠神经胶质瘤模型中kio的影响。
图15为从水交换DCE-MRI获得的kio图揭示了人类神经胶质瘤的瘤内AQP4分布。
图16为胶质瘤患者的特例和样本平均统计数据。
图17为低kio(AQP4)反映了治疗抵抗性胶质瘤表型。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
如图1所示，为本发明设计的水通道蛋白4磁共振影像标志物的示意图：稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio是胶质瘤内水通道蛋白4(AQP4)表达的磁共振影像学标志物的原理为：一个AQP4分子每秒能够允许约0.24pL水分子跨膜转运，而胶质瘤细胞的细胞体积为10pL左右，因此，kio可以表征并放大AQP4在MRI中的信号，从而作为细胞膜AQP4表达水平的线性生物标志物。
如图2所示，本发明提供的胶质瘤的磁共振影像学标志物的测量方法包括：
步骤一，设定动态对比增强磁共振成像参数，并测量动态对比增强磁共振扫描时的噪音水平；具体步骤如下：
(1)在扫描仪中调整DCE-MRI序列参数，设定重复时间(Repetition Time,TR)到最短或接近最短，例如3毫秒。
(2)调整DCE-MRI序列重复次数，在正常被试扫描10分钟，从而统计噪声水平。
步骤二，如图3所示，通过蒙特卡洛模拟，优化动态对比增强磁共振成像DCE-MRI采集参数中翻转角(Flip Angle,FA)，使其对水分子跨膜交换过程检测最敏感。
(1)从既往动态对比增强磁共振成像数据中选取一组造影剂浓度时间曲线Cp(t)或人工模拟Cp(t)，给定初始生理参数：造影剂从血管渗出速率Ktrans＝0.01(每分钟)，血管水摩尔分数pb＝0.05，间质水摩尔分数po＝0.2，稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio＝3赫兹，稳态水分子从血管到间质流动速率系数kbo＝3赫兹。
(2)设定待优化参数-翻转角的调整范围为1-40度。
(3)设定模拟的动态增强磁共振成像参数与实际进行的动态增强磁共振成像参数相同(翻转角除外)
(4)根据三室两交换模型(模型参照专利(专利号ZL 201910621579.6)中提到的完整快门速度模型SSMfull模型)生成DCE-MRI时间序列信号
Figure GDA0003801822100000071
(5)对信号施加随机白噪声，根据DCE-MRI实验估计的噪音水平在
Figure GDA0003801822100000072
中加入相同噪音水平的白噪声，并对添加噪音后的/>
Figure GDA0003801822100000073
使用专利(专利号ZL201910621579.6)中完整快门速度模型SSMfull进行非线性最小平方拟合。
(6)重复流程(3)-(5)100次，统计每次重复下拟合的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio的标准差以及中位数。
(7)重复流程(3)-(6)，直到遍历所有扫描参数组合，kio拟合结果最接近模拟预设值且方差最小所在的翻转角为最优翻转角。
步骤三，根据步骤二，选取使得kio的标准差最小以及中位数最接近设定值的翻转角(如图4所示)，重新设定动态增强磁共振成像翻转角。
步骤四，扫描定量T1磁共振成像；参数设置如下：
视野范围(FOV)：(340mm)2；层厚：1.5mm，80层；像素大小0.8×0.8×1.5mm3；回波时间(TE)/TR＝2.46毫秒/5.93毫秒；翻转角(FA)，2°/14°；频宽，450Hz/像素。
步骤五，扫描动态增强磁共振成像，并在扫描开始后的第八帧快速注入造影剂；
使用3D CAIPIRINHA-Dixon-TWIST采集DCE-MRI数据参数如下：FOV＝340×340×120mm3；FA＝10°；频宽，1090Hz/像素；TR，6毫秒；TE，1.3毫秒；并在扫描开始后的第八帧快速注入造影剂；注射后立即再注射15-20毫升生理盐水，注射速度建议为每秒2毫升。
步骤六，使用完整快门速度模型SSMfull，对肿瘤内区域每个像素点进行像素分析，获取每个像素点的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio。其详细步骤如下：
(1)根据造影剂在肿瘤区域的增强高于正常组织的现象，由专业医生或人员人工勾画肿瘤区域，或通过人工智能方法自动获取肿瘤区域。
(2)获取动态对比磁共振图像DCE-MRI时间序列肿瘤区域的数据中生物个体的血管造影剂浓度时间信号AIF；
(3)根据步骤(2)中的血管造影剂浓度时间信号，对每个像素点的DCE-MRI时间序列信号进行完整快门速度模型-SSMfull模型的非线性最小平方和拟合，分别得到肿瘤区域内每个像素点的SSMfull模型的DCE-MRI信号拟合结果。SSMfull模型拟合后产生五组生理参数的分布图，所述五组生理参数包括：Ktrans，血管水摩尔分数pb，间质水摩尔分数po，稳态水分子从血管到间质流动速率系数kbo和稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio。
(4)对步骤(3)中的kio和kbo进行误差分析，仅保留95％置信区间在[0s-1 20s-1]区间或95％置信区间下限大于5s-1的像素点结果，产生最终kio、kbo参数的分布图和Ktrans、pb、po参数的分布图。
上述步骤一至步骤六为一种定量测量kio的动态对比增强磁共振成像方法，可以实现本发明的第一个发明目的：显著提升了kio的准确度。
步骤七，利用活检规划系统，根据肿瘤内kio图像，结合临床因素，获取最佳的活检点坐标；详细步骤如下：
(1)在立体定向活检前1-2天，在活检之前，所有患者头部携带立体定向框架，进行MRI结构像扫描。。
(2)通过将按照步骤六的描述完成计算的全肿瘤区域kio图像与上述结构像进行配准融合后导入立体定位活检规划系统，进行立体定向活检规划。
(3)在立体定向手术计划系统中，通过计算目标坐标和轨迹进近角，实现三维图像重建和手术模拟，并确定目标在脑皮层区域的坐标进入点和进针角度。在每个患者中，在最有利的临床因素下，例如，活检轨迹应设计为避免通过沟、皮质动脉、静脉结构或心室进入。选择了多个具有不同kio值的ROI。
步骤八，立体定向取活检组织，并获取该活检组织AQP4免疫组化图片，定量化该组织的AQP4表达水平：
(1)所有活检点组织样本均由三名神经外科医生，按照步骤七中立体定向中活检进入点和目标点的指定轨迹计划，通过手术获取。活检在局麻或全身麻醉下进行，活检针(内径2.0毫米,边切割窗口10毫米)仔细轻轻地插入目标站点，以顺时针(0°、90°、180°、270°)获取活检组织样本。
(2)立体定向活检获得5-10mm长的标本。将需要进行免疫组化获取AQP4表达分布的样本固定和包埋，按照常规免疫组化步骤进行AQP4免疫组化染色。
(3)使用显微镜扫描AQP4免疫组化的整个切片的高清图像。
(4)AQP4免疫组化的扫描图片数字化处理过程如下：首先计算整个切片的AQP4灰度值总和和细胞核个数的比值(AQP4mean)。其次，在免疫组化切片中，选取最强AQP4着色强度(即图片的最高灰度值区域)的区域(ROI)作为AQP4全阳性表达区域。并计算此区域中AQP4灰度值总值和细胞核个数的比值(AQP4max)，最后，该活检点AQP4表达水平(即阳性率)为：(AQP4mean/AQP4max)*100％。
步骤九，重复步骤四到步骤八，获取多个胶质瘤病人的动态增强磁共振图像和立体定向活检组织。
步骤十，对所有活检组织的AQP4表达水平和kio平均值进行线性回归分析，获取AQP4表达水平和kio的线性方程，即AQP4细胞阳性率＝(kio–0.2s-1)/14.1s-1；具体步骤如下：
1.首先将19例患者(WHO I-II 6例，WHO III-IV 13例，其中10例为复发性胶质瘤)，45个活检点样本中每一个立体定向位置活检点的包括kio值在内的磁共振参数与对应的免疫组化的结果(即AQP4阳性率)逐一对应统计。
2.其次，通过线性回归分析的方法评估每个磁共振参数和AQP4表达水平线性拟合系数。获得最优线性相关参数kio和AQP4表达水平的线性方程式和95％置信区间。
3.最终结果如图5所示，AQP4表达水平和kio的线性方程式，即AQP4阳性率＝(kio–0.2s-1)/14.1s-1。
另外，本方法也可以利用机器学习算法引入多个磁共振参数建立AQP4阳性率预测模型替代线性回归分析，进一步提高预测准确率。
步骤十一，根据上述线性方程，将肿瘤内每个像素点的kio图像按照线性计算公式转换为AQP4表达水平图像，实现肿瘤内AQP4表达无创成像。
步骤十二，针对新胶质瘤病人，重复步骤四到步骤六及步骤十一，无需进行进一步立体定向活检，仅通过磁共振扫描和数据分析，即可获取该病人肿瘤内的AQP4表达空间分布图，如图6所示，为一例低级别胶质瘤病人(左下)和一例高级别胶质瘤病人(右下)肿瘤内AQP4表达水平定量成像结果，以及各自对应切面的增强T1加权磁共振图像(上)。
本发明提供的胶质瘤的磁共振影像学标志物的测量系统包括：
预处理模块，执行步骤一、步骤二和步骤三；
图像提取模块，执行步骤四和步骤五；
图像处理模块，执行步骤六；
后处理模块，结合步骤七、步骤八和步骤九，执行步骤十和十一；
预测模块，执行步骤十二。
为了进一步验证kio作为胶质瘤的磁共振影像学标志物在评估AQP4表达水平上的应用和在制备预测胶质瘤对放化疗治疗的敏感性产品中的应用，本发明采用如下实验方法：
细胞培养和TMZ构建治疗抵抗细胞模型
本发明使用胶质瘤细胞系C6和U87MG源于美国典型细胞保藏中心(ATCC,HTB14TM)。以C6细胞培养为例，方法如下：C6细胞在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM,Sigma-Aldrich,D6429-500ML)中培养，该培养基包含10％胎牛血清(FBS,Biological Industries,04-002-1A)和1％青霉素和链霉素双抗(P/S，Gibco，Thermo Fisher Scientific，10378016)，即完整培养基。培养环境为5％CO2+空气的加湿培养箱中，温度37℃。每周更换2次培养基，细胞在对数生长期(II期)进行传代。
C6细胞TMZ(50μM)处理，在完全培养基用溶解0.1％DMSO(对照组)或0.1％DMSO中的50μM TMZ处理。分别在TMZ(50μM)处理的第三天和第七天获得细胞磁共振参数kio和生理信息(细胞形态、AQP4表达、细胞活性和细胞迁移距离等)。
对于原代细胞培养，将胶质瘤活检组织切成1mm*3块，并在37℃下与10ml胰蛋白酶-EDTA(Gibco,25200056)混合10～15分钟，直到大部分块消化成单细胞悬液。然后使用与神经胶质瘤细胞系相同的方法培养细胞悬液(图8流式结果)。
用于MRI测试细胞样本及响应特异性抑制组的方案
为了获得用于MRI的细胞样本，本发明首先用DPBS洗涤U87MG(0.5～1×105)和C6(1～2×106)细胞系，通过向60mm培养皿中加入1mL 0.25％Trypsin-EDTA溶液，并孵育0.5～1.0分钟进行解离，然后用2mL PBS(或补充有5mM Gadoteridol的PBS)重悬。在4℃下以150g的相对离心力将细胞样品离心5分钟，之后将样品重新悬浮在装有250～300μL PBS的MR兼容玻璃样品管中(或PBS+5mM Gadoteridol)。然后，在进行MRI之前，将样品管在4℃，300g离心2分钟。对于AQP4特异性抑制实验，需要将上述步骤中的PBS替换为PBS+抑制剂，即在细胞样本在检测前，与PBS或者含有6.4μM TGN020(Axon，CAS 51987-99-6)的PBS中预培养15分钟(图7中c和d，图8中a)。
体外细胞培养台式MRI系统测量细胞kio
体外细胞培养的0.5T台式MRI测量系统(Pure Devices GmbH，德国)包括：安装在防振台上的MRI系统和包含来自培养箱的活细胞沉淀的自治核磁管，5％CO2+95％O2和PBS上清以确保高存活率，同时安装了温度监测光纤。所有MRI测量均在室温(23.5+/-1℃)下进行。
在测量水交换DCE-MRI之前，使用以下参数进行扩散加权成像(DWI)以定位显示较低表观扩散率的细胞层，参数如下：单层采集，切片厚度5mm，FOV＝12.8×12.8mm2，矩阵大小64×64，16个平均值，以及10s/mm2和2000s/mm2的两个b值。水交换DCE-MRI使用反转恢复准备的涡轮自旋回波(IR-TSE)序列和Gd基造影剂Gadoteridol(ProhanceTM，Bracco诊断公司，普林斯顿，新泽西州)。用于水交换DCE-MRI扫描参数如下：回波时间(TE)3ms，turbofactor＝16，FOV＝12.8×12.8mm2，矩阵大小32×32。水交换DCE-MRI使用两种造影剂(CA)浓度(0mM和5mM)。在[CA]＝5mM时，以13个IR延迟(10ms、30ms、50ms、70ms、90ms、150ms、200ms、400ms、600ms、800ms、1s,5s,5s)重复时间TR一起变化(TR＝IR延迟+5s)和每个IR延迟的单次重复。在[CA]＝0mM时，最长的IR延迟延长至10s，同时TR延长(TR＝IR延迟+10s)，以保证每个TR中纵向磁化的完全恢复。[CA]＝0mM和5mM的单次采集的扫描时间分别为10分钟和5.5分钟。
每个IR延迟的IR-TSE信号(M)由细胞ROI的平均信号获得。然后用平衡磁化强度减去信号并归一化(M0，取为具有最长IR延迟的M)。我们将
Figure GDA0003801822100000121
定义为水交换模型分析的归一化信号：
Figure GDA0003801822100000122
此处使用双位点交换(2SX)SS模型，简而言之，MR信号被认为是两个水位点信号的总和——细胞内和细胞外水，每个位点都假定具有相似的经度恢复率R1，pi和po分别为细胞内和细胞外空间中水分子的摩尔分数，pi+po＝1。然后归一化的IR-TSE信号
Figure GDA0003801822100000123
可以用双指数函数来描述，
Figure GDA0003801822100000124
其中R1,sm和R1,lar分别是较小和较大的R1，psm是显示R1,sm的MR信号的占比。三个参数R1,sm、R1,lar和psm由三个物理参数决定，包括pi、细胞内水流出速率常数(kio)、细胞内水的R1(R1i)和CA依赖的细胞外水R1(R1o)。对于每种情况(例如，TMZ 0、3和7天的C6)，在[CA]＝0mM时，至少三个样品使用IR-TS作为基线数据的测量。R1i是通过在两种不同的CA浓度获得的IR-TSE信号拟合到超过三个样品上来预先测量确定的。
体外AQP4的免疫荧光染色、可视化和定量
在MRI测试后，细胞系样品立即用4％多聚甲醛(PFA)在室温下固定20分钟，然后储存在0.5％PFA(4℃)中，直到进行下游分子生物学实验。对于免疫荧光(IF)测试：(1)在室温下用10％山羊血清(Beyotime,C0265)封闭一小时；(2)AQP4一抗(1：200)4℃过夜孵育后，AQP4二抗(1：500)室温孵育1h；(3)用DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole,Sigma-Aldrich,1:1000)在室温下染色5分钟；(4)用PBS洗涤3次。荧光定量是用微量荧光分光光度计(DFX，Denovix，Wilmington)实现的。从两个荧光通道收集数据：一个以激发/发射波长375nm/435至485nm表征DAPI，另一个以蓝色(激发/发射470nm/514至567nm)通道。在所有测量中，设立空白对照以避免假阳性。所有上述测量均在DCE-MRI结果处理前的的两名研究者独立进行(图7中a右侧)。
TMZ治疗中的细胞活力表征
在TMZ或DMSO治疗的第三天和第七天，为了进行细胞活力测定，将1％CCK-8(CellCounting Kit-8,Beyotime,C0037)添加到96孔板中。孵育1小时后，将上清液用于通过微量分光光度计(Ultrafine Photometer，NanoDrop 2000，Thermo，Waltham)进行光密度测试(图7中e)。
细胞迁移评估
将细胞培养成单层细胞，并用标准的200μl移液器吸头，从细胞培养皿底部画出一条300-500μm宽的条带划痕。再对应条件下培养孵育24小时后，将样品在4％PFA中固定30分钟并用DAPI染色。仅计算划痕区域中的细胞用于细胞迁移计算(图7中b)。
快循环细胞(FCC)和慢循环细胞(SCC)标记分类方法
本发明使用细胞示踪剂的方法来区分FCC和SCC。其中OG(Oregon Green 488Carboxylic Acid Diacetate,Succinimidyl Ester)和CTV(CellTraceTMViolet试剂，ThermoFisher Scientific，Invitrogen C34557)用于区分FCC(OG或CTV强度低)和SCC(OG或CTV强度高，例如，分别在C6细胞系和人胶质瘤原代细胞培养物中的CTV荧光强度>104)。原理是在细胞培养过程中，根据FCC和SCC相同时间内保留OG或CTV的能力不同，鉴定和分离出FCC和SCC细胞群体。具体方法如下，首先，将细胞悬浮在含有25μM OG的PBS中孵育10分钟(细胞培养箱中)。孵育后，将细胞样品在DMEM中洗涤以去除残留染料，然后将其放回培养基中直到显微镜成像。在荧光成像之前，将样品在4％PFA中固定30分钟，然后用DAPI染色。SCC的分数定义为DAPI阳性细胞中OG阳性细胞的分数。对于原代人胶质瘤原代细胞，则使用5μMCTV(与OG相同的方法)染色三天。然后，通过荧光流式细胞仪(FACS)(LSRFortessa X-20,BD,USA)同时测量细胞荧光强度统计和计数。
此外，本发明还使用EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)，一种通过标记新合成的DNA来标记增殖细胞亚型的生物标志物，来标记FCC(高EdU)和SCC(低EdU)。具体方法如下：获取C6细胞悬液并与50μM EdU溶液(Cell-LightTM EdU Apollo567、Ribobio C10338-1，包括EdU溶液和Apollo荧光溶液)在37℃下孵育2小时，然后按照上述IF方法标记AQP4。AQP4染色后，将样品在Apollo荧光溶液中孵育30分钟以荧光标记EdU，然后移动进行FACS测试。
本发明细胞形态学和荧光图像取自荧光倒置显微镜系统(cellSensV1.13，Olympus，Japan)或共聚焦激光扫描显微镜(fv1200，Olympus，Japan)。
两种胶质瘤大鼠模型和磁共振测量方法
所有动物研究实验方案均经浙江大学动物实验委员会批准。成年(7～8周龄)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠获自浙江大学实验动物中心。在神经胶质瘤细胞导入过程中，用2％(v/v)异氟烷(R500IE，RWD Life Science Co.,Ltd，)麻醉大鼠，然后用100μl含有5×106C6细胞和含有1％抗生素的PBS在右腿皮下缓慢注射。肿瘤实施后7-9天，动物被带去进行7T MRI测试，在MRI后迅速切除肿瘤并使用4％PFA固定24h，0.5％PFA保存直到IHC。
对于原位神经胶质瘤模型，除了将C6细胞悬液(0.5×105个细胞/微升，4～5微升/大鼠，2微升/分钟)用10微升微量注射针注入大脑的右侧尾状壳核外，注射坐标位于距前弓形缝0.8mm、矢状缝右侧2mm和深4.5mm的脑区。肿瘤接种两周后，对动物进行9.4T-MRI测试，并在MRI后立即用4％PFA固定24h，0.5％PFA保存直到IHC。所有动物模型的肿瘤体积均未超过4000mm3。
大鼠胶质瘤模型中AQP4的药理特异性抑制作用
此处TGN020用于抑制大鼠神经胶质瘤模型中的AQP4。对于TGN020组，每只动物在水交换DCE-MRI前15分钟用TGN020(3mg/kg，4ml/kg体重)尾静脉内治疗。为了增加溶解度，在静脉注射前，将TGN020在37℃下，反复超声和涡旋以促进溶解分散在盐水(0.9％NaCl)中。在TGN020处理前一天，对同一只动物使用生理盐水(4ml/kg)处理，然后进行水交换DCE-MRI数据采集。在对照组中，动物在第一天和第二天都用相同体积生理盐水处理。在这里，小容量输液后均需要输液后冲洗，以确保大鼠的安全性和治疗效果。
组织学和免疫组织化学
使用石蜡包埋切片对大鼠神经胶质瘤进行IHC。简而言之，在MRI实验后立即用5％异氟烷对大鼠安乐死，并肿瘤组织并用4％PFA固定24h。然后，在将肿瘤组织与MRI数据仔细配准后，沿MRI扫描切面进行切割组织切片(约4μm厚度)。AQP4-IHC进行如下：(1)与抗AQP4兔多克隆抗体在4℃下孵育过夜，然后(2)与第二山羊抗体HRP(辣根过氧化物酶)在室温下孵育1小时。并使用苏木精进行细胞核染色。最后，通过显微镜载玻片扫描系统(VS120，Olympus，Japan)以×20的放大倍率全扫描组织切片。
免疫组化图谱定量化分析过程如下：首先，通过ImageJ(开源Fiji v1.53c，插件：Color deconvolution)在组织学成像中对图像进行染色分离，并使用MATLAB2018(MathWorks，Natick，MA，USA)进一步分析以去除背景并量化核数和AQP4染色(灰色强度)。然后，计算每张载玻片中所有细胞的平均AQP4灰度强度。同时，在所有载玻片中选取具有最高AQP4表达的几个ROI由两名经验丰富的病理学家手动选择，并被视为100％AQP4阳性(AQP4+)。最后，进一步计算每张幻灯片中的AQP4+分数，作为该切片中的平均AQP4灰度密度，通过对ROI中AQP4+％的平均灰度密度进行归一化。IHC和AQP4量化过程中遵循双盲原则。
大鼠神经胶质瘤模型的感兴趣区域(ROI)选择。
由于大多数皮下神经胶质瘤肿瘤显示出高AQP4表达的环形，我们使用同心圆环形状的ROI将MRI肿瘤区域和相应的组织学图像分为六个ROI。首先，我们找到了整个肿瘤的最小外接矩形，并确定了矩形中心坐标(XR，YR)、长度LR和宽度WR。其次，编程自动绘制了一系列同心椭圆曲线将肿瘤分为六个ROI的。同心椭圆曲线的长轴(am)和短轴(bm)计算如下：
Figure GDA0003801822100000151
Figure GDA0003801822100000152
其中m是每条同心椭圆曲线的序列号(从外部(m＝1)到内部(m＝6))和q＝0.75。
人脑胶质瘤的水交换DCE-MR和立体定向活检(步骤七，利用活检规划系统，根据肿瘤内kio图像，结合临床因素，获取最佳的活检点坐标)。
通过立体定向活检获得的样本通常很小。尽管如此，本发明在处理标本的实践中进行了一些修改，以适应全方位的组织学、免疫细胞化学和超微结构研究。对于5至10毫米长的标本，从活检针中取出后然后将细尖端放在生理盐水浸泡的玻璃瓶中转移到实验室，以避免干燥。然后将活检标本以不同目的分成多个小样本，例如可以选择一个用于冷冻保存，另一个也可以固定在戊二醛中进行电子显微镜检查。其余标本分别固定、包埋并进行常规IHC和HE染色处理。该方法允许对可比较的连续样本进行特殊染色程序和IHC研究。每个样本都根据都对应特定kio值。在神经病理学家对组织进行组织学鉴定为胶质瘤后，按照与大鼠胶质瘤模型类似的IHC方案进行AQP4和ZEB1染色和图像数字化分析。
对于IEM，采用免疫金银标记法检测AQP4，步骤如下：(1)将活检组织快速固定在IEM缓冲液(含有0.2％戊二醛和2％多聚甲醛的PBS溶液)中，室温下放置2h，然后在含有50mM甘氨酸的PBS中室温孵育15分钟，(2)用含有5％山羊血清、1％Triton和1％鱼胶原蛋白的PBS封闭和透化样品40分钟，(3)将样品与初级抗体在PBS中制成，含1％鱼胶原蛋白，在4℃过夜，(4)在4℃下在含有1％山羊血清和1％Triton的PBS中通过金缀合的二抗进行后嵌入免疫金标记过夜，(5)使用HQ Silver Enhancement Assay Kit(Nanoprobes,2012-45ML)在黑暗中进行银增强，以观察AQP4免疫反应性，(6)银增强步骤前后，用去离子水冲洗样品数次。(7)用含有0.2％OSO4的PBS固定免疫标记的标本2h，用0.5％乙酸双氧铀染色样品1h，在梯度乙醇中对样品进行脱水，然后用Epon812培养基将样品压平并包埋。此后，在Jeol-1200电子显微镜(JEOL Ltd.，Tokyo，Japan)下观察超薄切片(70nm厚度)。上述过程遵循双盲实验规则。
通过上述实验验证了：
kio可以精确检测C6细胞系在替莫唑胺(TMZ)治疗过程中AQP4的动态表达
为了评估水交换DCE-MRI在TMZ治疗胶质瘤期间检测AQP4表达水平动态变化的能力，本发明利用上述TMZ孵育诱导C6细胞，构建治疗胶质瘤模型。如图7中a，共聚焦荧光图像显示：随着TMZ处理时间增肌，AQP4表达持续减少，并且在TMZ处理的第7天AQP4的表达水平几乎完全不存在，仅在少数细胞膜尾足检测到AQP4(图7中a；图8中a、b、c)。使用微荧光分光光度计(QFX,Denovix,Wilmington)进一步量化AQP4表达水平，即荧光强度(rfu)，在TMZ治疗的第三天和第七天下降了42.5％(p＝0.0013)和85.9％(p<0.0001)(图7中a，右)，而在对照组中未观察到显著变化(图9中b)。另外，正如预期的那样，细胞迁移(划痕实验，图7中的b)、增殖速率(图8中e)、Ki-67表达水平(图8中d)以及通过CCK-8(Cell Count Kit-8)获得的细胞活力和增殖指数(图7中e)均随着TMZ处理时间增加而逐渐下降。
对照组中的C6细胞系在TMZ处理前kio＝10.9±0.7s-1(n＝10，图7中c)，在TMZ治疗第三天kio迅速降至6.7±0.8s-1(下降37.3％，p＝0.0008，n＝6)，并在第七天降至5.8±0.2s-1(下降45.5％，p<0.0001，n＝7))(图7中c)。在TMZ治疗第7天的kio减少幅度(10.9-5.8＝4.9s-1)与AQP4表达下降85％的幅度非常匹配，即85％AQP4调节的kio＝85％*5.8s-1＝4.9s-1，表明在TMZ处理中kio的动态变化主要受到AQP4途径的特异性调节。这一解释在使用TGN020对TMZ 7天的胶质细胞AQP4特异性抑制的结果中被进一步证实，该结果表明在TMZ 7天，由于AQP4几乎不表达，TGN020无法使得kio进一步降低(图7中d)。
其中，关于图7-图9的具体说明：
图7为在TMZ治疗期间kio可以精确检测C6细胞系中AQP4的动态表达：a：TMZ处理C6细胞后，AQP4(红色)表达和分布图像(共聚焦显微镜)。右侧为TMZ处理后，C6细胞系的AQP4和DAPI的定量rfu结果(微荧光分光光度计测定)从左到右n＝(4,3,3)。标尺:25μm。b：C6细胞在TMZ处理的不同时间点迁移能力测量结果，其中被DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole)标记的细胞核，在划痕区域以绿色显示。右侧条形图显示了所有细胞在划痕区域的迁移距离的总和。(从左到右n＝(13,4,7))，并根据对照组的结果进行标准化。标尺，200μm。c：TMZ化疗过程中C6细胞kio动态变化趋势n＝(10,6,7)，(G～I：从左至右底端数字分别表示为对照，TMZ第3天，TMZ第7天)。d：在TMZ治疗C6细胞的第7天，利用TGN020特异性抑制AQP4(标记为“+”，而其他没有TGN020的标记为“-”)也不会导致kio进一步降低。e：通过CCK-8光密度(OD)计算细胞活力(n＝(4,3,3))。数据显示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns不显著。
图8为TMZ处理后C6细胞系kio，AQP4和其他参数的变化结果：a-f：a，处理组和对照组kio变化，n＝(4,6,4,6)，p＝0.0099,p＝0.0006，b，处理组和对照组AQP4变化，AQP4(rfu)/DAPI(rfu),n＝(3,5,3,3),p＝0.0328,p<0.0001，c，处理组和对照组的迁移长度(由对照组标准化)，n＝(5,4,8,8),p＝0.0836,p＝0.0001。d，处理组和对照组Ki-67(rfu)/DAPI(rfu)，n＝(3,6,3,6)，p＝0.1041,p＝0.0133，e，处理组和对照组细胞增殖速度。n＝(6,15,3,34,13)，p＝0.0505,p＝0.0001。f,为SCC分数(OG+细胞数/总细胞数)。n＝(4,3,3,3)。其中对照组：仅使用DMSO孵育的C6细胞系。在e中，还显示了AQP4 KO组的结果。数据显示为平均值±标准误。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，ns，不显著。
图9为TMZ处理后C6细胞系中AQP4表达和分布共聚焦结果：a，C6细胞系中AQP4和DAPI的细胞形态学共聚焦显微镜图像。标尺，25μm。b，c，在a中的白虚线上AQP4表达水平定位分析结果，即定量分析在距离细胞核核心远近不同位置上，AQP4和细胞核荧光强度动态变化的，结果表明：在TMZ 7天，AQP4表达水平下降，同时AQP4表达最高峰值的定位在远离细胞核的位置，且细胞核荧光出现部分高亮和不规则纹理。
定量kio精确地推断出在细胞增殖周期中AQP4的动态调节
为了评估生物标志物kio检测与胶质瘤细胞增殖相关的动态AQP4调节的能力，本发明通过在U87MG的生长曲线的不同阶段进行SS-DCE-MRI测量，其中在细胞增殖曲线中细胞表现出不同的增殖状态以及不同的细胞密度和形态(图10中的a)。观察到一个典型的细胞生长增殖S型曲线，可分为(I)适应期(0小时-48小时)，其中细胞适应培养条件而不分裂；(II)对数(log)生长期(72hr-96hr)，其中细胞快速增殖，导致细胞数量呈几何指数增长；(III)静止期和衰亡期(从120小时开始)，其中细胞总体增殖减慢。AQP4表达水平在II期达到峰值，在I期降低60.4％(p<0.0001)，在III期降低66.0％(p<0.05)(图10中的b，c)。有趣但不足为奇的是，kio显示出与增殖周期相似的趋势：kio也在对数期II达到峰值(6.7±0.8s-1，n＝27，小于之前使用0.1％DMSO的结果)并在I期(5.04±0.68s-1，p<0.0001)和III期(4.6±0.9s-1，p<0.0001)降低(图10中的d)。此外，在第一阶段，TGN020的抑制不会导致kio的显着降低(图10中的e)，表明大多数AQP4调节kio活性在第一阶段消失是其值小于对照组的原因。
如图10所示，生物标记物kio在增殖周期中准确地跟踪U87MG细胞系中AQP4的动态调节：a：U87MG细胞系在不同增殖期的形态，包括适应期I、对数期II、静止期和衰退期III。标尺＝100μm。b：U87MG细胞系中AQP4(红色)的变化典型的显微镜结果图片。(c，d)：三个细胞周期阶段的AQP4表达和kio。e：用TGN020(n＝6)抑制AQP4不会导致I期进一步降低kio。在c-e中，条形高度和误差条宽度分别代表平均值和标准误，*p<0.05，***p<0.001，ns不显着，c中p＝0.7767，d中p＝0.2207，e中p＝0.4031。在c-e中，数据点(如点图)覆盖相应的框，双边未配对t检验f：使用来自U87MG和C6细胞系的数据进行kio和AQP4表达之间的相关性分析。每个细胞系使用相同的符号(C6为三角形，U87MG为点)，实线反映线性回归，两条虚线之间的面积反映95％置信区间。
生物标记物kio与C6和U87M细胞系中的AQP4表达呈线性相关
为了进一步评估kio在量化AQP4表达方面的能力，在kio和AQP4表达(rfu值，检测方法参见AQP4荧光分光光度计检测)之间进行了直接相关分析。在图10中f，kio与AQP4显示出显着的正相关(相关系数R＝0.92，p＝0.01)，这表明即使在神经胶质瘤细胞类型中，kio也能够准确地表示AQP4动态表达。
从水交换DCE-MRI获得的体内kio图可以准确地揭示大鼠胶质瘤模型中肿瘤内和肿瘤间AQP4的异质性
为了进一步证明水交换DCE-MRI在体内检测AQP4的准确性，通过在SpragueDawley(SD)大鼠的右腿皮下植入C6细胞系来建立胶质瘤动物模型。体内水交换DCE-MRI是通过临床使用的基于Gd的CA(钆喷酸二甲胺，广州，中国)实现的。为了更好的估计kio，本发明使用了两次注射CA的方法，与传统的单次注射造影剂的方法相比，它将kio估计的精度提高了10倍。此外，使用稳态多梯度回波(MGE)序列来克服由造影剂引起的潜在T2*伪影。并结合数值模拟以优化MGE序列参数(例如最优参数：重复时间(TR)＝100ms和翻转角(FA)＝20°)。最后，对SS模型拟合进行了仔细的误差分析，以去除具有较大拟合误差的kio。总之，这些步骤保证了水交换DCE-MRI在生理范围内估计kio的准确性([0s-1,10s-1])(图11中的c)。
正如预期的那样，对于大多数肿瘤体素，体内SS模型拟合极好。kio图(图11中d)和相应切片的AQP4免疫组织化学(IHC)染色图(图11中e，f)中显示出相似的空间分布。此外，在大多数动物中观察到AQP4表达的强烈肿瘤内异质性，其在肿瘤边缘(侵入区域)显示高表达和在肿瘤核心中低表达(图11中e，f)。kio图谱显示与AQP4相同的表达模式，例如示意图中，组织切片中肿瘤边缘的高kio和肿瘤核心中的低kio。为了在体内验证水交换DCE-MRI定量评估AQP4表达测量的准确性，结合大多数胶质瘤皮下模式动物中AQP4的环形分布，使用一系列同心圆环形状的ROI将肿瘤切片分为六个区域(方法，图11中d，e)。然后计算每个ROI的平均kio值和AQP4阳性(AQP4+)分数。结果表明，从水交换DCE-MRI获得的kio图与每只动物的AQP4+分数具有很强的线性相关性(图11中i，每只动物的相关系数R>0.80，图12)并且平均R＝0.82(p<0.0001，图11中g，n＝10)。这些结果表明，kio可以准确地检测体内神经胶质瘤的瘤内AQP4表达异质性。线性回归分析(图11中g)进一步表明AQP4相关的kio高达10.5s-1，而通过非AQP4途径的kio仅为0.4s-1；每个ROI(总共60个ROI)中AQP4+细胞的分数(AQP4+％)符合线性关系：
kio＝10.5s-1*AQP4+％+0.4s-1。
如图11所示，水交换DCE-MRI获得的kio图可以准确、准确地揭示体内AQP4异质性：a：胶质瘤肿瘤异种移植物的T2加权TSE图像，红色和蓝色矩形分别表示b和d中的FOV。b：叠加在T2加权TSE图像上的Ktrans图。c：Monto Carlo模拟表明，MRI参数(
Figure GDA0003801822100000191
和TR＝100ms)优化确保了水交换DCE-MRI在生理范围内([0s-1,10s-1])。虚线表示输入kio(地面实况)。点和误差线代表估计kio的平均值和标准差，n＝(100,100)。d：叠加在T2加权TSE图像上的kio地图。e：同一切片d的IHC结果叠加在T2加权图像上(左)和没有叠加(右)。在这里，AQP4和细胞核分别被标记为不同颜色。在每只动物中，使用六条等高线将肿瘤切片分成六个同心圆环形状的ROI。f：放大的IHC来自一个肿瘤环形像素(f上部分)和一个肿瘤核心像素(f下部分)，其位置在(d,e)中说明。从左到右，它们是合并后的图像、细胞核和AQP4。g：在60个ROI(每只动物6个ROI，n＝10，来自同一动物的数据以相同符号显示)的ROI平均kio和AQP4阳性分数之间观察到线性相关性。h：这种线性相关性在全肿瘤平均kio和AQP4阳性分数之间仍然存在(n＝10，每只动物使用相同的符号作为g)。在g和h中，实线反映了线性回归，两条虚线之间的区域反映了95％的置信区间。i：每只动物的kio和AQP4+分数之间的肿瘤内相关性分析中相关系数的统计数据(n＝10，黑点)。条形高度和误差条宽度分别代表平均值和标准误。****p<0.0001，Z变换相关系数的双边t检验。
当使用每只动物的全肿瘤平均kio和AQP4表达在肿瘤间水平上进行分析时，kio和AQP4表达之间的这种线性关系仍然存在(图11中h)，结合图12中kio可以精确地展示每只大鼠胶质瘤模型瘤内AQP4表达水平(良好的相关性)，表明kio可以准确地测量肿瘤内和间-肿瘤AQP4异质性。
如图12所示，kio可以精确地展示每只大鼠胶质瘤模型瘤内AQP4表达水平：a-j：在每只实验动物中kio值和AQP4+百分比之间的显著的线性相关性结果。在这里，考虑到AQP4的环形分布，使用一系列同心椭圆形ROI将每个肿瘤切片(包括组织切片和MRI扫描切片)划分为六个同心环形区域。利用每只大鼠的6个区域kio均值及其对应6个AQP4+百分比做相关性分析。k.在TGN020特异性干扰的对照组(图12)中，全肿瘤平均kio在生理盐水注射的两天之间没有显示出显著变化。配对t检验，ns不显著，p＝0.9588。条形高度和误差条宽度分别代表平均值的平均值和标准误差。n＝4。
本发明还通过将C6细胞系植入SD大鼠的右侧尾状壳核构建原位神经胶质瘤模型，并获得水交换DCE-MRI数据。由于原位神经胶质瘤模型(图13中的a，b)中的肿瘤大小远小于皮下神经胶质瘤模型，并且MRI空间分辨率有限，因此仅对原位胶质瘤大鼠间进行kio和AQP4表达之间的相关性分析。正如预期的那样，在全肿瘤平均kio和AQP4表达水平之间观察到线性相关性(R＝0.92，p<0.01，n＝7，图13中c)。此外，通过线性回归确定的AQP4调节和非AQP4调节的kio分别为13.0s-1和1.3s-1，与皮下胶质瘤模型中的相应值非常接近。这些结果进一步证明了kio作为胶质瘤中AQP4表达的成像生物标志物的稳健性。
如图13所示，在C6神经胶质瘤大鼠原位模型中观察到kio和AQP4表达之间存在线性相关性：a、b：来自具有低kio(a)和高kio(b)的两只动物的kio图谱和AQP4典型的IHC结果示例。从上到下分别是对比增强T1加权图像(肿瘤位置用白色虚线圆圈表示)、叠加在T1加权图像上的kio图和白色箭头指向位置的AQP4典型的IHC结果。MRI标尺：2mm；IHC标尺：25μm。c：在7只原位神经胶质瘤大鼠的全肿瘤平均kio和AQP4+分数之间观察到线性相关性。实线反映线性回归分析，两条虚线表示95％置信区间。n＝7。
AQP4的药理特异性抑制作用可以降低大鼠胶质瘤模型中的kio
为了进一步验证水交换DCE-MRI是一种与体内AQP4表达相关的敏感成像方法，进一步在大鼠皮下神经胶质瘤模型中用TGN020特异性抑制AQP4功能。如图14所示：在每只动物(n＝9)扫描水交换DCE-MRI前15分钟，通过尾静脉注射TGN020(3mg/kg，溶解在盐水中)。选择TGN020注射时间可以确保TGN020在水交换DCE-MRI采集过程中达到并保持稳定的摄取水平。作为对照组，相比于TGN020治疗前一天，对同一只动物使用相同体积的生理盐水代替TGN020进行了水交换DCE-MRI测量。结果表明：用TGN020治疗的胶质瘤肿瘤表现出kio值的明显降低，如kio图(图14中b)所示，整个肿瘤平均kio显示从6.3±0.6s-1(注射生理盐水组)显着降低至.5±0.7s-1(注射TGN020组)(43％,n＝9，p＝0.0246,图14中c)。此外，TGN020还将全肿瘤平均Ktrans从0.060±0.015min-1(生理盐水)略微降低到0.045±0.024min-1(TGN020)，这对kio估计没有明显影响，因为大多数肿瘤体素可以仍然通过误差分析并产生可靠的kio测量值(参见图14中b的示例)。在对照组中，每只动物(n＝4)在第一天和第二天用盐水处理，并且在这两天内没有显示出显着的kio变化(图12中k)。尽管由于出于安全考虑，此处使用的TGN020剂量相对较小，加上由于TGN020只能部分抑制AQP4，kio没有被TGN020完全抑制。但是目前的定性结果可以很好地证明kio作为胶质瘤中AQP4表达水平的生物标志物的敏感性和一定的特异性。
如图14所示，AQP4的特异性药物干预抑制对皮下大鼠神经胶质瘤模型中kio的影响：a：动物实验时间线和示意图，表示AQP4特异性抑制剂(TGN020)对体内kio的影响的实验历程。对于TGN020组，同一只动物在第一天注射生理盐水，在第二天注射TGN020。对于对照组，动物在这两天均注射生理盐水。b：利用配准在T2加权TSE图像上的kio图谱，展示TGN020组中AQP4抑制对胶质瘤(C6)的影响。标尺：2mm。c：在用TGN020抑制AQP4后，全肿瘤平均kio降低了43％(从6.3±0.6s-1到3.5±0.7s-1)。双边配对t检验，*p<0.05，此处p＝0.0246。数据点覆盖相应的框，条形高度和误差条宽度分别代表平均值和标准误，n＝9。
kio引导的人神经胶质瘤立体定向活检进一步验证了kio和AQP4表达之间的线性相关性
水交换DCE-MRI通过推注临床批准的造影剂(Gd-DTPA，0.1mmol/kg体重)揭示了人类胶质瘤中kio的肿瘤内异质性。本发明旨在使用kio代替AQP4空间分布引导立体定向活检。众所周知，手术时的大脑转移可能会影响无框架神经导航技术的采样精度。这无可能会影响放射病理学相关性的空间准确性。本发明通过框架立体定向活检技术避免了脑转移从术前MRI到肿瘤取样时间的影响。因此，预计kio图像和活检标本的定量分析会产生高度可靠的评估，这将允许在体素水平上准确解释放射学-组织病理学相关结果。
本发明属于观察性研究，并经山东第一医科大学附属山东省医院机构审查委员会(IRB)批准，同时获得每位受试者的书面知情同意。在2019年5月至2021年8月期间，根据IRB纳入标准招募了21名疑似胶质瘤患者(组织学和分子诊断均通过活检证实)，并使用
Figure GDA0003801822100000211
模型G立体定向框架系统(Elekta AB，瑞典斯德哥尔摩)。在活检之前，进行了水交换DCE-MRI，获得kio地图(图15中c)。然后，将kio值合并到用于指导立体定向活检的结构图像中，并在每个患者中收集具有不同kio值的多个ROI(图15中a)。在过滤掉2名图像配准不佳的患者后，最终分析使用了19名患者的45份活检(6名WHO I-II，13名WHO III-IV，其中10名是复发性胶质瘤)。
一名患者同一切片的典型Ktrans和kio参数图如图15中b和c所示，其中Ktrans和kio显示不同的空间分布，表明代表不同的病理生理状况。如图15中d所示为典型的活检样本的AQP4-IHC结果，其中，kio＝10.0s-1的样本比kio<0.5s-1的样本显示出更高的AQP4表达。结合IHC和基于透射电子显微镜(TEM)的AQP4抗体免疫电子显微镜(IEM)的原位超微结构检测结果也显示在具有较高kio的活检样本中AQP4阳性纳米金标记点的密度较高，这在亚细胞水平支持了本文的结论(图15中e)。进一步量化了每个活检中的AQP4+分数，并随总结所有45个活检样本，发现kio和AQP4+细胞分数之间存在显着的线性相关性(R＝0.97，p<0.0001)(图15中f)。线性回归方程如下
kio＝14.1s-1×AQP4+％+0.2s-1
这表明AQP4相关的kio(14.9s-1)远大于非AQP4相关的kio(即kio基线，0.2s-1)，并且在人类胶质瘤中，kio主要由AQP4调节的途径控制。kio和AQP4表达之间的这种线性关系仍然存在于为相同患者采集的多个活检样本中，如图15中f所示，其中来自每个患者的数据用不同的符号标记。
如图15所示，从水交换DCE-MRI获得的kio图揭示了人类神经胶质瘤的瘤内AQP4分布：a：使用kio引导的立体定向活检来验证人类神经胶质瘤中的kio-AQP4关系。获得了来自19名神经胶质瘤患者的具有不同(高或低)kio信号强度的多次活检。这里显示了一个示意图谱(kio地图覆盖在水交换DCE-MRI的第70帧上)，其中使用同一根针采集了两个点，以及立体定向活检系统的图片。(b,c)：图a所示同一患者的Ktrans图b和kio图c，配准在水交换DCE-MRI图像上(第70帧)，(a，b，c，标尺：20mm)。(d,e)：分别具有高(左)和低(右)kio立体定向活检的AQP4 IHC(d，标尺100μm)和IEM(e，标尺：0.1μm)的典型示例。在IHC中，AQP4标记为棕色，细胞核标记为蓝色。在IEM中，AQP4用金颗粒标记(黑色箭头)。红色箭头代表神经胶质微丝。在这两个结果中，在kio较大的组织中观察到较高的AQP4表达，反之亦然。f：在来自19名神经胶质瘤患者的45个立体定向活检点中观察到kio和AQP4+细胞分数之间存在线性相关性。每位患者的数据都用不同的符号标记。实线反映线性回归分析，两条虚线表示95％置信区间。
图16还显示了一个特殊病例，是由一个因肿瘤区域较大而接受多针射频消融手术的复发性胶质母细胞瘤患者。在这种特殊情况下，医生沿计划的轨迹安全收集了10个活检样本。本发明在10个活检样本中(R＝0.96)也观察到kio与AQP4之间存在良好的线性相关性，这进一步证明了kio在单例应用中测量AQP4的准确性。此外，如果对每位患者的所有活检数据进行平均，发现活检样本平均kio和平均AQP4之间保留了良好相关性(R＝0.98，图16中的d)。
如图16所示，胶质瘤患者的特例和样本平均统计数据：这是一名复发性胶质母细胞瘤患者，由于肿瘤区域较大，因此接受了多点活检手术。在这种特殊情况下。沿射活检针的计划轨迹安全地收集了10个活检样本。a：kio图谱示例和获取活检样本的位置(白色箭头)。b：a中所示的三个活检点的AQP4 IHC结果示例。标尺：25μm。c：在该患者的10个立体定向活检点中观察到kio和AQP4+细胞分数之间存在线性相关性。d：来自19名患者的19个数据点平均kio和AQP4+细胞分数之间的线性相关性仍然保持不变。这里，对于获得多个活检的患者，该患者所有活检的平均结果用作该患者的最终代表性活检结果。实线反映线性回归分析，两条虚线表示95％置信区间。
总之，上述实验从体外培养的细胞水平，体内两种胶质瘤大鼠模型的动物水平以及人类胶质瘤病例的临床案例，总结表明kio是人类神经胶质瘤中AQP4的强大且敏感的成像生物标志物。
低kio反映了胶质瘤的治疗抵抗力
胶质瘤放射化学治疗后常见肿瘤复发。本文发现低kio(即低AQP4)的细胞可能代表胶质瘤中的治疗抵抗的细胞亚型。仔细观察TMZ处理后的C6细胞核图像纹理表明：部分细胞在TMZ治疗后显示出细胞核损伤，而另一些细胞则显示出基本完整均一的细胞核结构，说明这类细胞亚型具有对细胞核损伤型抗癌药物TMZ的抗性(图17中a)。这些抗TMZ化疗的细胞AQP4表达明显低于对TMZ治疗敏感的细胞(图17中c)。另一方面，在TMZ治疗期间，还观察到静止、慢增殖细胞(SCC)的数量同时增加，说明这些细胞比快速增殖细胞(FCC)对TMZ抗性更强(图17中b)。在这里，SCC通过上述细胞荧光示踪法(见方法)进行标记，其中SCC用CellTrace试剂(用于C6细胞系的Oregon Green(OG)和用于人胶质瘤原代细胞的CellTraceViolet(CTV))标记的阳性细胞(OG+和CTV+)，因为SCC不进行分裂增殖而保留更多的OG和CTV荧光染料而在显微镜下呈现高亮图像。在TMZ治疗的第三天和第七天，SCC的比例分别从TMZ治疗前的6.0(±0.4)％增加到16.0(±0.1)％(p<0.0001)和28.9(±0.3)％(图17中d，图9中f)中。为了进一步证明AQP4表达与细胞周期之间的紧密耦合，在TMZ化疗的第7天，在使用EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)，通过快速标记新合成的DNA来标记增殖期的C6细胞的同时双染AQP4。对应的流式细胞测试结果表明：SCC(低EdU)的细胞AQP4表达低于FCC(图17中e)，反之亦然。在C6细胞的TMZ治疗第七天的细胞形态学图像中发现了一些新的长尾结构或‘伪足’(红色箭头)(图17中b)，这些特征也常被认为是一种治疗抵抗的类干细胞特性。因此，较低的kio(即AQP4)往往与更多的SCC亚型、较低的增殖速率以及治疗抗性表型相关(图17中e，f)。
更重要的是，使用生物标志物ZEB1(锌指增强子结合蛋白1，调节DNA损伤的转录因子)进一步表征了临床胶质瘤活检样本的抗治疗状态(免疫组化方法及定量方法和AQP4相同)，ZEB1已被用作胶质瘤治疗-耐药性的标志物。我们发现复发胶质瘤的较低kio活检样本比从同一受试者较高kio的活检样本有更高的ZEB1表达(图17中f)，进一步表明低kio可能代表治疗抗性神经胶质瘤亚型。来自活检样本(见方法)的原代细胞培养物的流式细胞术结果(图17中g)进一步支持了这一结论，其中来自低kio样本的细胞比高kio样本的细胞显示出更高比例的SCC(或者CTV)表型。
如图17所示，低kio(AQP4)反映了治疗抵抗性胶质瘤表型：a：TMZ处理第三天C6细胞AQP4(红色)和DAPI(蓝色)的共聚焦显微镜图像，其中一些细胞核损伤(长尾箭头)，而其他细胞显示TMZ抗性，细胞核结构更完整(短尾虚线箭头)。标尺从左到右，分别为25μm和5μm。b：使用OG标记的细胞示踪结果，其中慢循环细胞(SCC)在荧光图中显示高信号(长尾箭头)。c：C6在TMZ处理第三天，治疗敏感细胞和治疗抵抗细胞的AQP4表达定量结果。数据显示为平均值±标准误。*p<0.05，这里，p＝0.0465，n＝(4,8)。d：条形图显示TMZ处理后SCC(OG+)的比例增加，****p<0.0001，n＝(7,3,3)。e：用流式细胞仪表征TMZ治疗第7天，AQP4和EdU的表达结果。二维散点图显示了两种不同的细胞表型，分别标记为FCC和SCC。具有较慢增殖的神经胶质瘤细胞(SCC即较低的EdU)显示出比快增殖细胞(FCC)更低的AQP4表达(红色)。f：来自复发性胶质瘤患者的立体定向活检样本的ZEB1结果，其中低kio样本(右kio<0.5s-1)比高kio样本(kio>0.5s-1)的ZEB1表达水平更高。标尺：50μm。柱状图统计结果表明，与kio>0.5s-1(n＝5)相比，kio<0.5s-1(n＝5)的活检点显示出更丰富的ZEB1表达(ZEB1+分数)。细胞核(蓝色)和ZEB1(棕色)数据显示为平均值±标准误。*p<0.05，这里，p＝0.0260。在c、d和f中，数据点(如蓝点图)覆盖相应的框，即双边非配对t检验。g：使用立体定向获取的临床神经胶质瘤活检样本的原代细胞的CTV流式分选结果，其中从低kio样本(右)显示SCC(CTV+)的比例远高于从高kio样本中获得的原代细胞(左)，在e和g中，黑线表示流式细胞仪的门控选择。
TMZ可通过诱导胶质瘤细胞的DNA双链断裂来抑制增殖，并杀死FCC亚型保留SCC亚型。对C6细胞系的TMZ治疗揭示了类似的现象，包括增殖减少和SCC分数增加。此外，TMZ第7天低AQP4表达水平和长尾或伪足形态的细胞亚型，常被认为是GBM中治疗抵抗的干细胞样细胞(GSC)。同样，在营养和氧气被剥夺的静止和衰亡阶段，U87MG细胞系也显示出增殖减少以及AQP4下调。在这两种微环境中，从水交换DCE-MRI获得的kio和AQP4的动态调节密切相关。在TMZ处理(C6)和静止-增殖减少阶段(U87MG)中，观察到AQP4表达水平较低的SCC数量比例增加。这种现象是合理的，因为SCC是一种低增殖细胞亚型，并且AQP4表达水平与细胞增殖有关。更重要的是，低AQP4表达可以通过减慢跨膜转运速率来保护SCC免受TMZ或其他疗法的影响。事实上，观察到低AQP4表达的C6细胞系在TMZ治疗下细胞核没有或少量损伤，表明其抗TMZ状态。此外，来自人类神经胶质瘤的低kio(即低AQP4)活检样本也显示出更高的抗治疗生物标志物ZEB1的表达和更高比例的SCC。总的来说，这些结果表明kio是一种潜在的SCC成像和预测治疗反应的方法。
胶质瘤中AQP4表达水平图谱中的空间和时间异质性在促进精准治疗和预测治疗反应方面具有巨大潜力。由于AQP4表达与治疗抵抗程度相关，kio的异质性可能表明胶质瘤区域存在治疗抵抗差异性。这种AQP4表达图谱在评估复发性胶质瘤病理状况方面具有巨大潜力，并进一步影响治疗策略，衍生许多治疗复发性胶质瘤的替代方法。例如，如果复发性神经胶质瘤表现出高水平的kio，则首选二次放疗和化疗，因为高AQP4表达水平表明肿瘤细胞对放疗和化疗损伤敏感。或者，如果测量到低水平的kio，则首选手术干预，因为这些肿瘤细胞对放射或化学疗法具有很强的治疗抵抗能力。
本发明通过可以水交换DCE-MRI特异性定量测量细胞内分子跨膜流出速率常数kio，作为AQP4表达水平敏感的MRI生物标志物，可准确测量在胶质瘤肿瘤内和肿瘤间AQP4的异质性。在之前的研究中，来自DWI的ADC也显示出通过RNA对AQP4沉默的敏感性，但后来的结果对该结果提出了质疑。众所周知，水交换可能对ADC有贡献，但ADC的使用在体内缺乏跨膜水交换检测的特异性，并且由于存在许多可能的生物物理机制诱导ADC变化，包括细胞肿胀或收缩、细胞密度和形状变化以及间隙几何形状，而存在更多问题。具体而言，早已证明ADC主要反映人类胶质瘤中的细胞密度，这进一步阻碍了ADC作为胶质瘤中水交换的特异性生物标志物的使用。
在临床实践中，水交换DCE-MRI可以与常规MRI扫描一起用于胶质瘤诊断，方法是在造影剂(CA)注射期间添加水交换DCE-MRI序列，而无需额外的资金或时间成本。此外，常规MRI还可用于从正常组织或其他组织中识别胶质瘤肿瘤部分，以便在水交换DCE-MRI中进一步分析瘤内AQP4。本发明使用的水交换DCE-MRI扫描方案可以进一步优化以提高kio估计和AQP4检测的精度，因为在大鼠(图12)和人类神经胶质瘤(图15中f)中仍然可以观察到个体差异。需要改进的方面包括但不限于MRI序列的优化、CA注射和SS模型分析。
水通道蛋白4(AQP4)在胶质瘤命运决定中发挥着重要作用，包括肿瘤迁移、增殖和治疗抗性。组织活检可以定量表征体内AQP4表达水平，但不能提供AQP4在全肿瘤异质分布的信息。本发明提供了一种非侵入性磁共振生物标志物kio来检测和绘制体内胶质瘤中的AQP4，作为对AQP4表达水平敏感的生物标志物。通过定量测量AQP4调节的跨膜水交换，使AQP4在MRI中可见。首次证明AQP4是调节跨膜水交换的主导途径，并且kio是胶质瘤中AQP4表达的敏感生物标志物。然后展示了水交换DCE-MRI在胶质瘤增殖的各个阶段、替莫唑胺TMZ(临床抗癌药)治疗、基因敲除和用TGN020抑制AQP4等AQP4表达和功能动态变化的精确检测能力，并捕获大鼠胶质瘤模型和人体胶质瘤内AQP4表达的空间异质性。此外，低kio细胞表现出更高的治疗抵抗力，这表明AQP4图谱在评估神经胶质瘤的治疗抵抗力方面具有潜在价值。更重要的是，这种方法可以很容易地在全肿瘤MRI上通过放射学诊断和评估胶质瘤，这种技术将显著改善人类胶质瘤的精确评估和治疗。
以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种非疾病诊断为目的的水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤磁共振影像学标志物评估AQP4表达水平的测量方法，其特征在于，所述测量方法为：
(1)采用动态对比增强磁共振成像定量测量组织的稳态水分子从细胞到间质流动速率，即水分子跨细胞膜流出速率kio；
(2)利用活检规划系统立体定向取活检组织，定量化该组织的AQP4表达水平；
(3)根据kio和AQP4表达水平，建立两者的线性关系；
(4)采用动态对比增强磁共振成像定量测量待测组织的稳态水分子水分子跨细胞膜流出速率kio，根据步骤(3)中的线性关系得到待测组织的AQP4表达水平。
2.根据权利要求1所述的非疾病诊断为目的的水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤磁共振影像学标志物评估AQP4表达水平的测量方法，其特征在于，所述测量方法包括以下步骤：
(1)设定动态对比增强磁共振成像参数，并测量动态对比增强磁共振扫描时的噪音水平；
(2)通过蒙特卡洛模拟，优化动态对比增强磁共振成像DCE-MRI采集参数中翻转角并重新设定动态增强磁共振成像翻转角；
(3)扫描定量T1磁共振成像；
(4)扫描动态增强磁共振成像，并注入造影剂；
(5)使用完整快门速度模型SSMfull，对肿瘤内区域每个像素点进行像素分析，获取每个像素点的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio；
(6)根据动态增强磁共振成像，利用活检规划系统立体定向取活检组织，定量化该组织的AQP4表达水平；
(7)对kio值和AQP4表达水平进行线性回归分析，获取AQP4表达水平和kio的线性方程；
(8)对待测组织，重复步骤(3)-(5)，根据步骤(7)中的线性方程将kio图像转换为AQP4表达水平图像，实现肿瘤内AQP4表达成像。
3.根据权利要求2所述的非疾病诊断为目的的水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤磁共振影像学标志物评估AQP4表达水平的测量方法，其特征在于，在步骤(2)中，从已测量到的血管造影剂浓度Cp中随机选取一组或多组数据，然后模拟真实组织和扫描参数情况，在不同翻转角下合成DCE-MRI数据；合成的DCE-MRI数据中的时间序列信号
Figure FDA0004202852460000021
由完整快门速度模型SSMfull生成，并根据DCE-MRI实验估计的噪音水平在/>
Figure FDA0004202852460000022
中加入相同噪音水平的白噪声，并对添加噪音后的/>
Figure FDA0004202852460000023
使用完整快门速度模型SSMfull进行非线性最下平方拟合；在每个翻转角下，重复上述步骤多次，统计每次重复下拟合的kio；最后，kio拟合结果最接近模拟预设值且方差最小所在的翻转角为最优翻转角；
在步骤(2)中，在超高场下，额外定量测量实际翻转角的空间分布来优化翻转角；
在步骤(3)中，定量T1磁共振成像使用多翻转角-短重复时间序列。
4.根据权利要求2所述的非疾病诊断为目的的水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤磁共振影像学标志物评估AQP4表达水平的测量方法，其特征在于，在步骤(5)中，使用自动快门速度分析方法获取肿瘤区域造影剂血管渗出速度Ktrans，只在Ktrans>0.01min-1肿瘤区域进行进一步的SSMfull模型拟合，获取每个像素点的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio。
5.根据权利要求2所述的非疾病诊断为目的的水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤磁共振影像学标志物评估AQP4表达水平的测量方法，其特征在于，在步骤(6)中，获取活检组织AQP4免疫组化图片来定量化该组织的AQP4表达水平。
6.根据权利要求2所述的非疾病诊断为目的的水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤磁共振影像学标志物评估AQP4表达水平的测量方法，其特征在于，在步骤(7)中，AQP4表达水平和kio的线性关系为：AQP4细胞阳性率＝(kio–A)/B；
其中，A为0.1～0.2s-1，B为13.07～15.04s-1。
7.一种根据权利要求1所述的测量方法在评估AQP4表达水平上的应用，其特征在于，所述应用为通过AQP4表达的定量成像评估AQP4表达水平。
8.根据权利要求7所述的测量方法在评估AQP4表达水平上的应用，其特征在于，所述水分子跨细胞膜流出速率kio和AQP4表达水平的线性关系为：AQP4细胞阳性率＝(kio–A)/B；
其中，其中，A为0.1～0.2s-1，B为13.07～15.04s-1。
9.一种根据权利要求1所述的测量方法在制备预测胶质瘤对放化疗治疗的敏感性产品中的应用，其特征在于，所述水分子跨细胞膜流出速率作为胶质瘤的磁共振影像学标志物在制备预测胶质瘤对放化疗治疗的敏感性产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的测量方法在制备预测胶质瘤对放化疗治疗的敏感性产品中的应用，其特征在于，所述放化疗治疗采用的药物为替莫唑胺。
11.一种胶质瘤磁共振影像学标志物的测量系统，其特征在于，所述测量系统包括：
图像提取和处理模块，采用动态对比增强磁共振成像定量测量组织的稳态水分子从细胞到间质流动速率，即水分子跨细胞膜流出速率kio；
后处理模块，建立图像提取和处理模块得到的kio与活检组织的AQP4表达水平的线性关系；其中，利用活检规划系统立体定向取活检组织，定量化该组织的AQP4表达水平；
预测模块，对待测组织执行图像提取和处理模块得到kio，根据后处理模块中的线性关系预测待测组织的AQP4表达水平。
12.根据权利要求11所述的胶质瘤磁共振影像学标志物的测量系统，其特征在于，所述测量系统包括：
预处理模块，设定动态对比增强磁共振成像参数，并测量动态对比增强磁共振扫描时的噪音水平；通过蒙特卡洛模拟，优化动态对比增强磁共振成像DCE-MRI采集参数中翻转角并重新设定动态增强磁共振成像翻转角；
图像提取模块，扫描定量T1磁共振成像；扫描动态增强磁共振成像，并注入造影剂；
图像处理模块，使用完整快门速度模型SSMfull，对肿瘤内区域每个像素点进行像素分析，获取每个像素点的稳态水分子从细胞到间质流动速率系数kio；
后处理模块，建立图像处理模块得到的kio与活检组织的AQP4表达水平的线性关系；
预测模块，对待测组织执行图像提取模块和图像处理模块得到kio，根据后处理模块中的线性关系预测待测组织的AQP4表达水平。
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