CN115380044A - 连续回收蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从流体中连续回收蛋白质的方法，包括使流体中的蛋白质沉淀并将沉淀的蛋白从流体中分离出来。本发明还提供了一种斜板式沉降器，其可用于这种连续的蛋白质回收。

Description

连续回收蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种从流体中连续回收蛋白质的方法，包括在流体中沉淀蛋白质并将沉淀的蛋白质从流体中分离出来。本发明还提供了一种可用于这种连续蛋白质回收的斜板式沉降器。
背景技术
传统来说，生物制药过程已经并且仍然以(半)分批方式进行。在分批过程中，所有单元操作都是按顺序执行的，这意味着当前一个操作完成时，该过程会进入下一步。这一行动过程需要在各个步骤之间将产品收集在储罐中。因此，分批生产过程的特点是停留时间长，在此期间产品的状态有时可能不理想。对于酶或凝血因子等自身不稳定的产品，较长的储存时间和停留时间尤为关键。
因此，针对凝血因子和酶开发了第一个由连续上游组成的混合工艺(例如，灌注细胞培养，包含分批下游工艺)。随着生产细胞系和滴度的进步，瓶颈从上游转移到下游过程。因此，对生物制药连续过程的关注在过去几年中大大增加。据报道，集成的连续过程具有一系列好处，例如(i)提高产品质量，(ii)增加过程控制和过程透明，(iii)降低商品成本(COG)，(iv)更小的设备尺寸，从而减少占地面积(即设施规模)和设备成本，(v)提高产率和(vi)更高的灵活性。值得注意的是，连续过程的全部潜力只能在完全集成、连续或端到端的连续过程中发挥。
蛋白质沉淀可用于生物制药生产过程的下游过程。它通常用于捕获目标蛋白，从而实现显著的体积减少，即目标蛋白的浓缩。沉淀可以线性放大，不需要复杂的设备，而且可以在非变性条件下进行。此外，沉淀原则上可以连续操作，因为唯一的要求是将沉淀剂连续添加到工艺流中并进行有效混合，而且根据沉淀动力学，需要保证足够的时间以完成沉淀。
尽管具有公认的潜力，但重组蛋白的连续沉淀过程的例子很少见(参见参考文献1至3)。在一个示例中，一个两阶段沉淀工艺使用CaCl2去除DNA，随后经冷乙醇沉淀以捕获产物(mAb)，结果显示产率>90％并显著减少杂质(参见参考文献4)。此外，使用聚乙二醇(PEG)连续沉淀各种抗体，随后基于切向流过滤回收沉淀也有报道(参见参考文献5)。一个非常相似的工艺被开发用于连续抗体沉淀，包括集成的连续沉淀分离和洗涤(参见参考文献6)。最后，展示了使用不同沉淀方法连续沉淀杂质，尽管本研究的重点是展示所谓的盘绕流逆变反应器(CFIR)的广泛的应用可能，而不是沉淀工艺的开发(参见参考文献7)。然而，总体而言，明显缺乏连续沉淀过程的例子。
在本发明中，待回收的蛋白质(例如凝血因子)可以被捕获，即沉淀，例如，使用磷酸钙沉淀。至少由于这个特点，它不同于参考文献4中的过程，参考文献4中一种主要杂质(DNA)是使用钙离子沉淀的。在全部参考文献1～7中，产物是使用PEG或冷乙醇沉淀的单克隆抗体。单克隆抗体通常以g/L范围内的滴度生产。该滴度比重组凝血因子的生产滴度高几个数量级。本发明的优势之一是它可以捕获以非常低浓度存在的复杂产物。
连续沉淀过程的主要瓶颈是固液分离步骤。在分批操作中，固液分离可以很容易地通过终端过滤或离心进行。过去，对离心的需求和相关挑战在制造规模上阻碍了沉淀的应用(参见参考文献8)。当连续操作时，离心尤其变得更具挑战性。大多数半连续式离心机在以固定间隔排放固体的情况下运行，会产生不连续的输出。此外，据报道，离心后难以有效地重新溶解沉淀物，这些问题通过使用跨膜流动过滤进行分离得以解决(参见参考文献5)。然而，并非所有沉淀物都适合通过跨膜流动过滤进行分离。此外，在跨膜流动过滤模块中收集的沉淀物的连续分离和溶解也产生周期性输出，类似于离心。
综上所述，对于蛋白质的连续回收方法的改进，特别是包括蛋白质沉淀和连续固液分离(即连续沉淀-液体分离)的连续蛋白质回收方法的需求很大。
发明内容
本发明满足了上述需要而且解决了本领域的上述问题：
发明人惊奇地发现，通过沉淀蛋白质并将沉淀的蛋白质从流体中分离，可以从流体中连续回收蛋白质。当磷酸钙用于蛋白质沉淀时，蛋白质回收允许回收相对较大的蛋白质(例如凝血因子)即使在非常低的浓度下。通过在沉淀前调节包含蛋白质的流体的pH值，以及通过使用限定浓度范围内的磷酸钙，可以进一步提高蛋白质回收的效率。
此外，发明人惊奇地发现，当使用板式沉降器分离蛋白质沉淀并且当该板式沉降器连接到专门设计的底部时，从流体中连续回收蛋白质的方法特别有效。该特别设计的底部包括至少一个用于将包含沉淀蛋白质的流体供应至板式沉降器的入口通道，以及至少一个用于收集沉降的沉淀蛋白质的收集通道，其中入口通道和收集通道彼此流体分离。入口通道和收集通道之间的流体分离(即没有直接的流体连通)促进了对底部流体流动行为的更好控制。具体地，降低或者甚至避免了由供应的流体和下沉的蛋白质沉淀物和/或下沉的分离流体(例如，包含待分离的沉淀蛋白质)的混合物引起的湍流。此外，较少或没有分离的蛋白质沉淀混入新供应的流体(即沉淀悬浮液)中。因此，根据本发明的底部结构提高了分离过程的效率。
此外，发明人发现，当底部进一步包括至少一个与所有入口通道流体分离的洗涤流体供应通道时，这是特别有利的，所述洗涤流体供应通道用于将洗涤流体供应到板式沉降器或底部的收集通道，以便于沉淀的沉淀蛋白质通过收集通道排出(即，洗脱)。这提高了分离过程的效率。例如，当沉淀的蛋白质不能有效排出时，可能是因为有粘附到表面的趋势，例如底部的表面等，供应洗涤液会有助于收集沉淀的蛋白质并通过底部的收集通道将其“冲洗”干净。洗涤液还可以促进沉淀的蛋白质与供应的流体(剩余部分)的分离。这可能很重要，因为流动相可能仍然具有很高的价值(例如，它可能仍然包含目标蛋白质)，而且/或者因为它可能包含人们想要去除的杂质。调整洗涤液的组成和密度进一步提高了分离过程的效率。
发明人已经发现类似于上述的板式沉降器，其可以连接到类似于上述的底部，也可以用于连续分离细胞。因此，在一个实施方案中，根据本发明从流体中连续回收蛋白质的方法包括在流体(例如，细胞培养基)中培养产生蛋白质的细胞，以便细胞释放蛋白质到流体中，然后使用用于细胞分离的板式沉降器从流体中分离细胞。
最后，本发明人出乎意料地发现，当从剩余流体中分离出蛋白质沉淀后，使用EDTA重新溶解沉淀蛋白质时，本发明的蛋白质回收特别有效。在本发明之前，EDTA已被排除作为重新溶解的候选物质，因为它对钙的高络合能力被认为对蛋白质(例如，因子VIII)活性有害。
在上述从流体中连续回收蛋白质的方法中，当板式沉降器包括至少一个用于使沉淀蛋白质沉降的相对较长的沉降通道时，是特别有利的。因此，本发明还提供了一种板式沉降器，包括长度为20cm～150cm、优选40cm～60cm、最优选约50cm的沉降通道。
综上所述，本发明通过提供下述优选实施方案，提供了一种从流体中连续回收蛋白质的改进方法，以及一种改进的板式沉降器：
1.一种从流体中连续回收蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
使流体中的蛋白质沉淀的蛋白质沉淀步骤；和
将沉淀的蛋白质从流体中分离出来的蛋白质分离步骤；
其中所有步骤在一个集成过程中进行。
2.根据第1项所述的方法，其中，该方法的所有步骤连续进行。
3.根据第1或2项所述的方法，其中，所述蛋白质的分子量为250kDa以上，优选所述蛋白质的分子量为500kDa以上。
4.根据第1～3项中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质沉淀步骤之前，包含蛋白质的流体中的蛋白质浓度低于20μg/mL，优选在0.05～20μg/mL之间。
5.根据第1～4项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是凝血因子。
6.根据第5项所述的方法，所述蛋白质是凝血因子VIII。
7.根据第1～4项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是血管性血友病因子(von Willebrand factor)。
8.根据第1～4项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是包含凝血因子VIII和血管性血友病因子的蛋白质复合物(protein complex)。
9.根据第1～8项中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质沉淀步骤中，使用沉淀剂沉淀蛋白质。
10.根据第9项所述的方法，其中，所述沉淀剂选自如下：磷酸钙、聚乙二醇(PEG)、亲和配体、pH调节剂、有机溶剂如乙醇或丙酮、聚电解质如聚丙烯酸或聚乙烯亚胺，以及盐类。
11.根据第9或10项所述的方法，其中，所述沉淀剂包括磷酸盐。
12.根据第9～11项中任一项所述的方法，其中，所述沉淀剂是磷酸钙、磷酸镁或磷酸锌。
13.根据第9～12项中任一项所述的方法，其中，所述沉淀剂为磷酸钙。
14.根据第13项所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括向所述流体中添加钙离子。
15.根据第14项所述的方法，其中，添加所述钙离子至终浓度为10～50mM，优选10～30mM。
16.根据第14项所述的方法，其中，添加所述钙离子至终浓度为10～20mM，优选约15mM。
17.根据第13～16项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括向所述流体添加磷酸根离子。
18.根据第17项所述的方法，其中，添加所述磷酸根离子至终浓度为1～10mM，优选1～5mM。
19.根据第17项所述的方法，其中，添加所述磷酸根离子至终浓度为1～3mM，优选约2mM。
20.根据第9～19项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括混合包含蛋白质和沉淀剂的流体。
21.根据第20项所述的方法，其中，所述混合在选自如下的至少一种反应器中进行：连续搅拌釜反应器(CSTR)、管式反应器(TR)、分段流动反应器和冲击射流反应器。
22.根据第20或21项所述的方法，其中，所述混合在连续搅拌釜反应器(CSTR)中进行。
23.根据第1～22项中任一项所述的方法，其中，在沉淀蛋白质之前，将所述流体的pH调整至8.5～9.0，优选将pH调整至约8.75。
24.根据第1～23项中任一项所述的方法，其中，在沉淀蛋白质之后，所述流体的pH在6～7.5之间，优选6.5～7，最优选约6.5。
25.根据第1～24项中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质分离步骤中，将用于蛋白质分离的板式沉降器、连续切向流过滤或流化床离心用于从流体中分离沉淀的蛋白质。
26.根据第1～25项中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质分离步骤中，将用于蛋白质分离的板式沉降器用于从流体中分离沉淀的蛋白质。
27.根据第26项所述的方法，其中，所述用于蛋白质分离的板式沉降器为斜板式沉降器，所述斜板式沉降器具有下部、上部和至少一个沉降通道，所述沉降通道用于使沉淀蛋白质沉降，所述沉降通道从下部延伸到上部，
在使用期间，斜板式沉降器被配置为定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸到上部，
其中，该至少一个沉降通道在上部连接到用于排出剩余流体的流体出口。
28.根据第27项所述的方法，其中，所述沉降通道的长度在20～150cm之间，优选20～100cm，更优选20～80cm，更优选30～70cm，更优选40～60cm，最优选约50cm。
29.根据第27或28项所述的方法，其中，所述用于蛋白质分离的板式沉降器的至少一个沉降通道连接到底部，所述底部包括至少一个入口通道和至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含沉淀蛋白质的流体供应至板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从所述至少一个沉降通道下降的沉降的沉淀蛋白质，
其中所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道之间以及在所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接。
30.根据第29项所述的方法，其中，所述连接到用于蛋白质分离的板式沉降器的底部还包括至少一个洗涤液供应通道，所述至少一个洗涤液供应通道用于将洗涤液供应至一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离。
31.根据第30项所述的方法，其中，与用于蛋白质分离的板式沉降器的同一沉降通道对应的所述至少一个洗涤液供应通道和所述至少一个收集通道通过该洗涤液供应通道和该收集通道共用的壁部的开口流体连接。
32.根据第30或31项所述的方法，其中，将所述包含沉淀蛋白质的流体通过所述至少一个入口通道供应至与用于蛋白质分离的板式沉降器连接的底部，并且通过所述至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液，
该洗涤液的密度高于所述包含沉淀蛋白质的流体的密度，以及
所述剩余流体通过上部的流体出口排出，所述沉降的沉淀蛋白质通过收集通道排出。
33.根据第32项所述的方法，其中，所述洗涤液的密度比所述包含沉淀蛋白质的流体的密度高0.3～1.5‰，优选比所述包含沉淀蛋白质的流体的密度高0.55～1.20‰。
34.根据第32或33项所述的方法，其中，所述洗涤液包含Tris和氯化钠。
35.根据第34项所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为约2mM的Tris和浓度为约272mM的氯化钠。
36.根据第34或35项所述的方法，其中，所述洗涤液还包含氯化钙。
37.根据第36项所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为4～12mM的氯化钙。
38.根据第36或37项所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为约2mM的Tris、浓度为约231mM的氯化钠和浓度为约12mM的氯化钙。
39.根据第32～38项中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液的pH为7.5以上，优选8以上，最优选约8.25。
40.根据第32～39项中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以固定间隔供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以固定间隔排出。
41.根据第40项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以15～45min、优选约30min的固定间隔供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以15～45min、优选约30min的固定间隔排出。
42.根据第32～41项中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以约20～60mL/min、优选约40mL/min的体积流量供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以约20～60mL/min、优选约40mL/min的体积流量排出。
43.根据第1～42项中任一项所述的方法，其中，该方法在蛋白质沉淀步骤之前还包括以下步骤：
在流体中培养细胞的蛋白质生产步骤，其中该细胞生产蛋白质并将蛋白质释放至流体中；和
将细胞从包含蛋白质的流体中分离出来的细胞分离步骤。
44.根据第43项所述的方法，其中，所述细胞为哺乳动物细胞。
45.根据第44项所述的方法，其中，所述细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
46.根据第43～45项中任一项所述的方法，其中，所述流体为细胞培养基。
47.根据第43～46项中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质生产步骤中，细胞在灌注反应器或恒化反应器中培养，优选在恒化反应器中培养。
48.根据第43～47项中任一项所述的方法，其中，在所述细胞分离步骤中，将用于细胞分离的板式沉降器用于从包含蛋白质的流体中分离细胞。
49.根据第48项所述的方法，其中，所述用于细胞分离的板式沉降器为斜板式沉降器，所述斜板式沉降器具有下部、上部和至少一个沉降通道，所述沉降通道用于沉降细胞，所述沉降通道从下部延伸至上部，
在使用期间，该斜板式沉降器被配置为定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸到上部，
其中，所述至少一个沉降通道在上部连接到用于排出剩余流体的流体出口。
50.根据第49项所述的方法，其中，用于细胞分离的板式沉降器的所述至少一个沉降通道连接到底部，所述底部包括至少一个入口通道和至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含细胞和蛋白质的流体供应至板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从所述至少一个沉降通道下降的沉降细胞，
其中所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道之间以及在所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接。
51.根据第50项所述的方法，其中，所述连接到用于细胞分离的板式沉降器的底部还包括至少一个洗涤液供应通道，所述至少一个洗涤液供应通道用于将洗涤液供应至一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离。
52.根据第51项所述的方法，其中，与用于细胞分离的板式沉降器的同一沉降通道对应的所述至少一个洗涤液供应通道和所述至少一个收集通道通过该洗涤液供应通道和该收集通道共用的壁部的开口流体连接。
53.根据第51或52项所述的方法，其中，将包含细胞和蛋白质的流体通过所述至少一个入口通道供应至与用于细胞分离的板式沉降器连接的底部，并且通过所述至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液，
其中该洗涤液的密度高于所述包含细胞和蛋白质的液体的密度，以及
其中所述沉降的细胞通过收集通道排出，所述包含蛋白质的剩余流体通过上部的流体出口排出。
54.根据第53项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以固定间隔排出。
55.根据第53或54项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以5～90min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以5～90min的固定间隔排出。
56.根据第53或54项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以15～85min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以15～85min的固定间隔排出。
57.根据第53或54项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以25～80min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以25～80min的固定间隔排出。
58.根据第53或54项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以35～75min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以35～75min的固定间隔排出。
59.根据第53或54项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以45～70min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以45～70min的固定间隔排出。
60.根据第53或54项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以55～65min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以55～65min的固定间隔排出。
61.根据第53或54项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以约60min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以约60min的固定间隔排出。
62.根据第53～61项中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以50～70mL/min、优选约60mL/min的体积流量供应，所述沉降的细胞通过收集通道以50～70mL/min、优选约60mL/min的体积流量排出。
63.根据第1～62项中任一项所述的方法，其中，该方法在蛋白质分离步骤之后还包括以下步骤：
将沉淀的蛋白质重新溶解的再溶解步骤。
64.根据第63项所述的方法，其中，在所述再溶解步骤中，使用柠檬酸盐或EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
65.根据第64项所述的方法，其中，所述再溶解步骤中，使用EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
66.根据第65项所述的方法，其中，所述再溶解步骤中，使用终浓度为10～50mM的EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
67.根据第65或66项所述的方法，其中，所述再溶解步骤中，使用终浓度为20～30mM的EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
68.根据第65～67项中任一项所述的方法，其中，所述再溶解步骤中，使用终浓度为约25mM的EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
69.根据第1～68项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是生物制药药物。
70.可通过第1～69项中任一项所述的方法获得的回收的蛋白质。
71.用于生产药物组合物的方法，包括进行第69项所述的方法，并将回收的生物制药药物配制成药物组合物。
72.可通过第71项所述的方法获得的药物组合物。
73.一种用于从流体中分离固体成分的斜板式沉降器，该板式沉降器包括下部、上部和至少一个沉降通道，该沉降通道用于沉降固体成分，该沉降通道从下部延伸至上部，
在使用期间，该板式沉降器被配置为定向，使得所述至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸至上部，
其中，该至少一个沉降通道在上部连接到用于排出剩余流体的流体出口，并在下部连接到底部，
其中，该底部包括至少一个入口通道和至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含待分离的固体成分的流体供应至板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从至少一个沉降通道下降的沉降成分，
其中，所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到该至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个沉降通道之间以及在所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接，
其中，该底部还包括至少一个洗涤液供应通道，所述至少一个洗涤液供应通道用于将洗涤液供应到一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离，而且
其中，所述沉降通道的长度在20～150cm之间，优选20～100cm之间，更优选20～80cm之间，最优选30～70cm之间。
74.根据第73项所述的斜板式沉降器，其中，所述沉降通道的长度在40～60cm之间，优选约50cm。
75.根据第73或74项所述的斜板式沉降器，其中，所述固体成分为沉淀蛋白质，优选包含凝血因子VIII(Factor VIII)和血管性血友病因子的沉淀蛋白质复合物。
76.根据第73～75中任一项所述的斜板式沉降器，其中，该斜板式沉降器含有包含凝血因子VIII和血管性血友病因子的沉淀蛋白质复合物。
附图说明
图1是根据本公开的底部的一个实施方案的示意性剖面图；
图2是根据本公开的底部的一个实施方案的示意性剖面图；
图3是根据本公开的底部的一个实施方案的示意性三维透视图和更概括的本公开的板式沉降器的部件的示意图；
图4是根据本公开的底部的一个实施方案的入口通道、收集通道和洗涤液供应通道的剖面图；
图5是根据本公开的底部的一个实施方案的三维透视示意图；
图6是根据本公开的底部的一个实施方案的三维透视示意图；
图7是形成本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的示意图；
图8A是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的示意图；
图8B是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的示意图；
图8C是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的示意图；
图9A是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的分流器(split)的示意图；
图9B是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的分流器的示意图；
图9C是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的分流器的示意图；
图9D是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的分流器的示意图；
图9E是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的分流器的示意图；
图9F是根据本公开的底部的一个实施方案的一部分的流量分配器的分流器的示意图；
图10是根据本公开的底部的一个实施方案的示意图和，更简要的，本公开的板式沉降器的部件的示意图；
图11是根据本公开的底部的一个实施方案的示意图；
图12是根据本公开的底部的一个实施方案的示意图；
图13是根据本公开的底部的一个实施方案的示意图和更概括的本公开的板式沉降器的部件示意图；
图14是如实施例1中所用的生物反应器[1]和斜板式沉降器与底部[3]组装在一起的组件的示意图。该组件包括多个泵[2]，通过这些泵将细胞培养液输送到该组件，将洗涤液[5]供应到底部并从底部收集固体物质(细胞)[6]。澄清的流体在组件的顶部出口[4]处收集。虚线表示双层夹套和低温恒温器，它们构成了一个额外的流体回路[7]，该回路没有与细胞培养液、已除去固体的液体或收集的固体(细胞)流体连接。
图15是如实施例1所述，在通过双层夹套的温度控制下，从与底部在组装在一起的斜板式沉降器的顶部和底部出口收集的液体流中的产物(凝血因子VIII)的产率和回收率。回收率＝排出斜板式沉降器和底部组件的两种流体的产率总和。上方和下方的数据显示了两次单独运行的结果。
图16是如实施例1所述，在通过双层夹套的温度控制下，从与底部组装在一起的斜板式沉降器的顶部和底部出口收集的液体流中的葡萄糖的产率和回收率。回收率＝排出斜板式沉降器和底部组件的两种流体的产率总和。上方和下方的数据显示了两次单独运行的结果。
图17是如实施例2中所用的生物反应器[1]和斜板式沉降器与底部[3]组装在一起的组件的示意图。该组件包括多个泵[2]，通过这些泵将细胞培养液输送到组件，将洗涤液[5]供应到底部并从底部收集固体物质[6]。澄清的流体在组件的顶部出口[4]被收集。除生物反应器外，整个装置处于2-8℃的冷室中。
图18是如实施例2所述(对应图17)，从斜板式沉降器的顶部和底部出口以及底部收集的液体流中的产物产率和回收率(顶部)和葡萄糖产率和回收率(底部)，回收率＝排出斜板式沉降器和底部组件的两种流体的产率总和。
图19是如实施例3所述(对应图17)，从斜板式沉降器的顶部和底部出口以及底部收集的液体流中的产物产率和回收率(顶部)和葡萄糖产率和回收率(底部)，回收率＝排出斜板式沉降器和底部组件的两种流体的产率总和。
图20是底部与连接到供应容器[1]的斜板式沉降器[5]组装在一起的示意图，供应容器[1]可以是包含如1M氢氧化钠溶液或缓冲液等工艺流体的生物反应器或容器。该组件包括用于在不同流体路径之间切换的三通阀(标有*)和用于采样的三通阀(标有+)。此外，还包括用于供应洗涤液的容器[2]、用于例如排出液的接收容器[3]、用于收集固体的接收容器[4]和用于已除去固体的液体的接收容器[6]。所有接收容器都包括一个包含无菌过滤器的附加连接，因此可以在不影响组件内无菌条件的情况下进行压力交换。
图21是在不同收集流量下获得的含有悬浮洗涤液中的所收集固体物质(即沉淀物)的级分中色氨酸的产率曲线。色氨酸最初包含在沉淀悬浮液中。
图22是在不同收集流量下获得的含有悬浮在洗涤液中的收集固体物质的分离的专利蓝V染料(Patent Blue V)的产率曲线。专利蓝V染料最初包含在洗涤液中。
图23是定制的沉降检测装置：配备光电发射器和检测器的量筒，用于在沉淀物沉降期间浊度。
图24A-B是用于沉淀和溶解FVIII:vWF复合物的钙、磷酸盐和柠檬酸盐浓度的结果。图例标识翻译为钙浓度[mM]/磷酸盐浓度[mM]/柠檬酸盐：钙。A–未调节pH。B–使用Tris缓冲液调节pH。左y-轴＝FVIII和VWF的产率。右y-轴：体积缩小系数。
图25是通过改变钙和磷酸盐的浓度从CCSN中沉淀FVIII:vWF复合物。钙浓度显示在每组结果的左上角。磷酸盐浓度从左到右＝1.5、2.0和2.5mM。所有样品的pH值使用Tris缓冲液进行调节。误差线代表RSD的五个平行。
图26是在磷酸钙沉淀FVIII:vWF复合物时观察到vWF的钙依赖性沉淀现象。在恒定磷酸盐浓度(2mM)和使用Tris缓冲液调节pH值下进行沉淀。误差线代表三个平行。
图27是使用15mM CaCl2和2mM磷酸盐在不同起始pH值下从CCSN沉淀FVIII:vWF后的FVIII和vWF产率。根据需要，用0.1M HCl和0.1M NaOH调节pH值。误差线对应于三个平行。
图28是磷酸钙沉淀细胞培养基上清液样品(15mM Ca2+，2mM PO4，沉淀前pH 8.5)的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。1-HiMarkTM预染色标准品。2-vWF BDS。3-FVIII BDS。4-澄清的细胞培养基上清液。5-沉淀上清液。6-溶解的未稀释的磷酸钙沉淀。7–溶解的按1:2稀释的磷酸钙沉淀。
图29A-B是在缓冲和非缓冲条件下的沉淀动力学研究中获得的FVIII(A)和vWF(B)沉淀上清液浓度(分别用2M Tris和1M NaOH调节pH值)。
图30是在用磷酸钙及相应的洗脱或溶解组分孵育后，在CCSN中不同种类的磷酸钙(固相)的吸附和洗脱实验中的FVIII和vWF产率。A-原位形成的磷酸钙。B-添加到CCSN中的非原位形成的(湿)磷酸钙。C-混合树脂I(CHT I resin)。D-混合树脂II(CHT II resin)。
图31A-B是单相(H2O和1M NaCl)和两相(磷酸钙沉淀)示踪剂实验的停留时间分布曲线。(A)显示整个数据集，(B)显示同一图的放大版。
图32A-B是(A)在定制的沉淀监测装置中沉淀磷酸钙沉淀物(50mM Tris、15mM钙、2mM磷酸盐)期间获得的归一化浊度信号。(B)磷酸钙沉淀约30分钟后获得的最终浊度水平。误差线代表各平行的标准差。
图33是使用不同的反应器配置，分批和连续沉淀生产的磷酸钙的最大沉降速度。误差线对应各平行的标准差。
图34A-B是在分批(三份)或连续模式下进行的沉淀实验中获得的vWF(A)和FVIII(B)的产率。使用三种不同的反应器配置进行连续沉淀：CSTR、TR+CSTR和TR。CCSN调节pH至9.0并补充2mM磷酸盐。通过添加15mM CaCl2引发沉淀。
图35是使用斜板式沉降器连续沉淀和收集沉淀物的原型装置示意图。泵标有P及其各自的编号。Temp-I＝温度指示器。pH-C＝pH控制回路。Level-I＝用于控制搅拌容器液位的液位指示器。TR＝管式反应器。pH-I＝无控制功能的pH指示器。S＝带有相应编号的取样阀。B-T＝气泡捕集器。T-I＝浊度指示器。
图36A-C是实验1-01的结果。(A)CSTR中的pH值与DP中的FVIII和vWF产率的叠加。(B)vWF产率。(C)FVIII产率。绘制缓冲罐(ST)、上清液(SN)、溶解沉淀(DP)的产率值，回收率(Rec)＝SN+DP。1系统体积约150mL。
图37A-C是实验1-02的结果。(A)CSTR中的pH值与DP中的FVIII和vWF产率的叠加。(B)vWF产率。(C)FVIII产率。绘制缓冲罐(ST)、上清液(SN)、溶解沉淀(DP)的产率值，回收率(Rec)＝SN+DP。1系统体积约150mL。
图38A-C是实验1-03的结果。(A)CSTR中的pH值与DP中的FVIII和vWF产率的叠加。(B)vWF产率。(C)FVIII产率。绘制缓冲罐(ST)、上清液(SN)、溶解沉淀(DP)的产率值，回收率(Rec)＝SN+DP。1系统体积约150mL。
图39A-C是实验1a-01的结果。(A)CSTR中的pH值与DP中的FVIII和vWF产率的叠加。(B)vWF产率。(C)FVIII产率。绘制缓冲罐(ST)、上清液(SN)、溶解沉淀(DP)的产率值，回收率(Rec)＝SN+DP。1系统体积约150mL。
图40A-C是实验2-01的结果(无管式反应器)。(A)CSTR中的pH值与DP中的FVIII和vWF产率的叠加。(B)vWF产率。(C)FVIII产率。绘制缓冲罐(ST)、上清液(SN)、溶解沉淀(DP)的产率值，回收率(Rec)＝SN+DP。
图41A-B是使用磷酸钙从新鲜CCSN中分批参考沉淀FVIII:vWF。pH调节＝调节批次中pH后采集的样品。DP＝溶解的沉淀。SN＝沉淀上清液。(A)vWF产率；(B)FVIII产率。
图42A-B是沉降实验的图片，用于检查缓冲液密度是否适用于斜板式沉降器。CCSN用15mM CaCl2和2mM磷酸盐缓冲液组合物进行沉淀。(A)2mM Tris，pH 8.25，含100mg/L专利蓝V、231mM NaCl和12mM CaCl2。(B)2mM Tris，pH 8.25，含100mg/L专利蓝V，272mM NaCl。
图43是在斜板式沉降器中使用相同密度的洗涤缓冲液所需的CaCl2补充和NaCl浓度之间的权衡。
图44A-B是洗涤缓冲液对产品收率的影响，其中沉淀物沉降到分液漏斗中的洗涤缓冲液中，其中100％参考是(A)CCSN(＝起始材料)和(B)未洗涤的沉淀参考样品。误差线代表在两个不同日期获得的三个平行的标准差。
图45A-B是在排放间隔中应用的不同流量下排放部分中示踪剂的产率。洗涤缓冲液(A)中添加了专利蓝V。进料流(B)中添加了色氨酸。
图46A-C是在不同排放流量下获得的排放峰的叠加：(A)20mL/min。(B)40mL/min。(C)60mL/min。
图47A-B是基于示踪剂测量的产率，排放间隔为30到60分钟之间，(A)在顶部溢流(overflow)中，(B)在排放部分中。
图48A-C是在40mL/min排放流量和不同排放间隔下获得的排放峰的叠加：(A)30min。(B)45min。(C)60min。
图49A-B是在不同排放体积下(A)专利蓝V产率和(B)专利蓝V在排放部分中的相对浓度。排放流量＝40mL/min，排放间隔＝30min。最大PBV浓度：(12.8mL)＝69％，(22.8mL)＝82％，(45mL)＝89％。
图50A-C是在40mL/min的排放流量、30分钟的排放间隔和(A)45mL(来自先前实验的数据，用于比较)、(B)22.8mL、(C)12.8mL的排放体积下获得的排放峰的叠加。
图51是连续沉淀与斜板式沉降器集成过程中记录的数据。左y轴：沉降器软件中记录的进料浊度。右y轴：沉淀软件中记录的缓冲罐和CSTR中的pH值。
图52A-B是通过与连续固液分离(即斜板式沉降器)集成的连续沉淀获得的vWF(A)和FVIII(B)的产率。ST＝缓冲罐。CSTR＝沉淀后、沉降前的样品。TOP＝沉降器溢流。DP＝沉降器排放部分溶解的沉淀。WB＝洗涤缓冲液，沉降器排放部分液相。Rec＝回收率，DP+WB+TOP。
图53是在设置连续沉淀的集成运行期间，板式沉降器软件中记录的浊度信号。从上到下：进料、顶部和污泥的浊度。垂直线代表采样点。
图54A-B是复合物中FVIII和vWF的pH稳定性测试结果(分别为A和B)。误差线代表三个平行的RSD。在没有可见误差线时，表明样品仅被量化了一次。
图55A-B是复合物分开后FVIII和vWF的pH稳定性测试结果(分别为A和B)。误差线代表三个平行的RSD。在没有可见误差线时，表明样品仅被量化了一次。
图56A-B是使用具有结构化底部的斜板式沉降器去除细胞，起始细胞密度为每毫升1.5×106细胞。平均起始浊度为46.2NFU。(A)澄清效率基于细胞计数和浊度的相对减少和绝对值。(B)分离效率基于作为产品替代物的葡萄糖。虚线表示5％的产率。
图57是以每毫升1.5×106的细胞密度，运行期间获得的排放峰。使用结构化底部和丙烯酸玻璃沉降部件进行运行。线的颜色随着随时间排放循环的次数从黑色变为灰色。
图58是联合使用结构化底部和丙烯酸玻璃沉降部件去除细胞得到的产品产率。起始细胞密度为每毫升1.5×106。虚线表示5％的产率(左y轴)。
图59A-B是使用具有常规的、开放式底部的斜板式沉降器去除细胞。起始细胞密度为每毫升1.5×106。平均起始浊度为57.6NFU。(A)澄清效率基于细胞计数和浊度的相对和绝对值。(B)分离效率基于作为产品替代物的葡萄糖。
图60A-B是(A)使用常规的、开放式底部去除细胞期间获得的基于FVIII活性的互补产率。(B)通过收集从常规底部去除的细胞获得的排放峰。颜色随时间渐变，早期排放峰为黑色，后期排放峰为灰色。
图61是在同一日分析的两个不同日获得的溶解的沉淀样品中的FVIII产率，导致第一天(day 1)样品的孵育时间约为24小时。
图62是第一天以4800rcf离心，接下来三天以1000rcf离心，在不同四天获得的溶解的沉淀样品的FVIII产率。重新溶解相应样品后对FVIII直接进行分析。
图63是以1000rcf离心，不同三天获得的溶解的沉淀样品的vWF产率。这些结果对应图62的第2天和第4天。使用在<-60℃下存放的等分试样在同一天内对所有样品进行vWF分析。
图64A-B是随着沉淀前pH的增加对新鲜细胞培养基上清液进行分批沉淀。(A)重新溶解后直接确定的FVIII产率。(B)由解冻样品确定的vWF产率。
图65是用新鲜澄清的收获物进行重复分批沉淀实验的结果，其中沉淀前pH值设置为8.5或8.75。误差线代表来自一个沉淀事件的三个重新溶解的等分试样。
图66A-D是在不同的四天进行的四个不同的沉淀实验(分别为A、B、C和D)，在pH8.75(pH调节后)的缓冲罐中、在沉淀上清液中和在溶解的沉淀中的FVIII产率与在CSTR中观察到的pH值(即在沉淀悬浮液中)的叠加。
图67A-B是在连续沉淀实验中获得的沉淀上清液和溶解的沉淀中的平均产率，实验用日期标记。A-FVIII结果。B-vWF结果。误差线代表在单个实验中采集到的五个样品的标准差。
具体实施方式
本文引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。
定义
除非下文另有定义，本发明使用的术语应根据本领域技术人员已知的共同含义来理解。
本文使用的术语“连续”是指能够以连续(即不间断)流入操作并产生连续(即不间断)或半连续(即离散)输出的过程(例如，在稳定状态)。稳定运行点或稳定状态点可以是，但不必是系统的平衡点。
因此，本文所述“从流体中连续回收蛋白质的方法”是指一种蛋白质回收方法，该方法能够使得该过程作为一个具有连续流入(例如，本发明中包含蛋白质的流体)的整体被操作，然后产生连续或半连续的输出(例如，流体和(回收的)蛋白质)。
本文所述术语“集成过程”是指一种使用其中所有(子)单元物理物理连接的设备操作的过程。该装置可以是，但不必是模块化装置。因此，“从流体中连续回收蛋白质的方法”中“所有步骤在一个集成过程中进行”是指能够以连续的流体输入和连续或半连续的流体和蛋白质输出来操作的方法。其中所有单元物理连接，使得供应给设备的流体被引导通过设备的所有单元，在流体和蛋白质作为输出被排出之前，不会被排出设备。
本文所述术语“流体”与术语“液体”同义，是指处于液态的任意物质。本发明所述“流体”或“液体”也可以是悬浮液，例如，包含细胞和/或沉淀物的悬浮液。
本文所述术语“回收”是指将目标物质与其他物质分离并由此从目标物质中去除这些其他物质的任意过程。去除不必是完全去除，即其他物质的残余量可能仍留在目标物质中。因此，本文所述术语“从流体中回收蛋白质”是指从蛋白质中分离和去除流体(以及流体中可能包含的例如溶解的至少一些成分)，尽管分离和去除不必是彻底的。通常，这种回收会导致体积减少，进而导致目标蛋白质的浓缩。
与本文所述术语“回收”的含义一致，本文所述术语“分离”或“分开”并不意味着两种或多种物质完全分离。因此，所述术语“分离”或“分开”也可用于其中两种或更多种物质被分离，使得一种物质的残余量与另一种物质保持在一起的过程，反之亦然。
本文所述术语“沉淀”是指溶解于流体中的物质成为固相的一部分的过程。这可能意味着物质本身改变了其聚集状态并转变成固体，和/或物质保持溶解但在沉淀后存在于固相中。例如，在使用磷酸钙沉淀蛋白质时，形成的大部分固体可能是磷酸钙，只有一小部分固体可能是蛋白质。然而，可能保持溶解在流体中的大部分蛋白质可能存在于固体磷酸钙絮状物之间和之内的间隙内的流体中。这种溶解在固体磷酸钙絮状物之间和之内的间隙内的蛋白质在本发明中也指“沉淀蛋白质”。
本文所述术语“板式沉降器”具有本领域技术人员已知的含义。优选地，本发明的“板式沉降器”是一种“斜板式沉降器”。US 2012/0302741 A1、US 2,793,186 A1、US 753,646 A1和US 2002/0074265 A1中公开了斜板式沉降器的实例。根据本发明，板式沉降器可用于从流体中分离沉淀的蛋白质，在这种情况下，板式沉降器也称为“用于蛋白质分离的板式沉降器”。然而，根据本发明，板式沉降器也可用于从流体中分离细胞，在这种情况下，板式沉降器也称为“用于细胞分离的板式沉降器”。根据本发明，“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”以及优选连接到板式沉降器的底部的许多可选实施方案是相同的，并且在本发明的一个实施方案中，“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”以及可以连接到它们的底部是相同的。然而，在本发明的另一个实施方案中，“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”以及可以连接到它们的底部在一个或多个特征上不同。
如本文所用，术语某物质的“终浓度”是指物质在组合物(例如流体)中的浓度，是将所述物质添加到所述组合物(例如流体)中的直接结果。因此，“终浓度”不包括在添加所述物质前可能已经存在于组合物(例如流体)中的任意含量的物质。例如，当添加钙离子到例如15mM的“终浓度”时，这意味着钙离子的添加量直接使得组合物(例如流体)中的钙离子浓度为15mM。在这个例子中，为了将钙离子添加到15mM的终浓度，可以将1L浓度为1.5M的钙离子添加到99L的流体组合物中，不论流体组合物中是否已经存在钙离子。
本文所述术语“下降”具有本领域技术人员已知的含义。例如，本发明的板式沉降器可以包括至少一个收集通道，用于收集从至少一个沉降通道下降的沉降固体成分。如本领域技术人员显而易见的，本文所述术语“下降”是指已经沉降的固体成分，即可能已经从至少一个沉降通道下降的固体成分。
根据本发明，每次出现的术语“包含”可以选择性地由术语“由……组成”代替。
实施方案
以下将描述本发明的具体实施方案，但本发明不限于此。此外，以下任意实施方案可以与本发明中的以下任意其他实施方案组合。
根据本发明，从流体中连续回收蛋白质的方法包括使流体中的蛋白质沉淀的蛋白质沉淀步骤；以及从流体中分离出沉淀蛋白质的蛋白质分离步骤；其中所有步骤在一个集成过程中进行。该方法能够以连续(即不间断)输入，然后产生连续(即不间断)或半连续(即离散)输出的过程进行。该方法的输出是(回收的)蛋白质以及已从中回收了(分离)蛋白质的(残留的)流体。
在一个优选的实施方案中，本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的每个步骤是连续进行的。在该实施方案中，该方法的每个步骤能够以连续(即不间断)输入，然后产生连续(即不间断)或半连续(即离散)输出的过程进行。
本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的所有步骤在集成过程中进行。集成过程中，用于该过程的设备内的所有单元都是物理连接的。通常，本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的不同步骤对于它们进行的物理环境具有不同的要求。因此，在一个实施方案中，本发明的用于连续回收蛋白质的方法的每个步骤在用于该方法的设备内的至少一个独立单元中进行。在任何情况下，用于本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的设备内的所有单元都是物理连接的。
在一个实施方案中，本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的蛋白质沉淀步骤和/或蛋白质分离步骤是在0℃～8℃之间的温度下进行，优选2℃～8℃之间。在一个优选的实施方案中，蛋白质沉淀步骤和蛋白质分离步骤均在0℃～8℃，优选2℃～8℃的温度下进行。
本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法包括使流体中的蛋白质沉淀的蛋白质沉淀步骤。沉淀的方法没有特别限制，例如包括通过加热包含蛋白质的流体使蛋白质沉淀，或通过添加沉淀剂使蛋白质沉淀。
在一个优选的实施方案中，本发明的流体中的蛋白质是使用沉淀剂沉淀的。在这种情况下，利用了两种或多种溶质的溶解度的差异。通过添加沉淀剂，改变了给定溶质的溶解度。在溶解度发生这种变化时，会形成固相，即沉淀物。通过沉淀蛋白质，可以实现显著的体积减少。在本发明的从流体中回收蛋白质的方法中，利用蛋白质沉淀有一些优势：沉淀可以线性放大，不需要复杂的设备，而且可以在非变性条件下进行。可用于本发明的沉淀剂包括磷酸钙、聚乙二醇(PEG；优选分子量为6000kDa以上的PEG)、亲和配体、pH调节剂、有机溶剂如乙醇或丙酮、聚电解质如聚丙烯酸或聚乙烯亚胺、以及盐类。
根据沉淀物的组成和使用的沉淀剂，沉淀过程可分为不同的类别。对于沉淀物组成，可以分成两种情况：第一种情况下，沉淀物几乎完全由目标分子组成，例如在PEG沉淀中。第二种可能是共沉淀，其中沉淀物是固体和被该固体捕获的目标分子的混合物，这似乎是磷酸钙沉淀的情况。在下文中会简要解释一些沉淀物及其作用模式，但不希望受到理论的束缚。在亲和沉淀中，利用了亲和配体和目标分子之间的相互作用。基于配体和靶标之间的高亲和力结合，亲和沉淀具有高特异性。亲和配体提供了目标分子之间的交联。随着尺寸的增加，配体-靶标复合物的溶解度降低并从过程溶液中沉淀出来。改变溶液的pH值可直接用于沉淀蛋白质，这在等电沉淀中得到了应用。当溶液的pH值等于特定蛋白质的等电点时，蛋白质的溶解度会显著降低，并会形成沉淀。蛋白质的沉淀可以通过向过程流体中添加有机溶剂来进行，这会导致水活度和介质的介电常数的降低。因此，带电的亲水性蛋白质的溶解度会降低，直到蛋白质沉淀为止。据报道，丙酮和乙醇是最普遍的溶剂。尤其是蛋白质的乙醇沉淀已在血浆分离过程中大规模应用。聚乙二醇(PEG)是一种非离子聚合物，据报道，其性质类似于有机溶剂。PEG是应用最广泛的聚合物，并且具有宽泛的分子量范围。对于PEG，已发现log S和PEG浓度之间存在线性关系。蛋白质溶解度S可以根据等式1计算，式中S0是通过外推到零PEG时的表观固有溶解度，β是斜率，C是PEG浓度：
log S＝log S0–βC (等式1)
使用PEG沉淀蛋白质在很大程度上独立于溶液pH值、离子强度和温度，这使沉淀过程稳定。然而，在沉淀后，从含有蛋白质的部分中去除PEG可能具有挑战性。除了非离子聚合物外，聚电解质也可以用于沉淀。聚电解质的实例是聚丙烯酸和聚乙烯亚胺。最后，可以通过向过程流体中添加盐来沉淀蛋白质。通常，在低浓度下，蛋白质溶解度会增加(盐溶)。在较高浓度下，蛋白质溶解度降低并使得蛋白质沉淀(盐析)。盐的离解离子吸引水分子。因此，高盐浓度会扰乱蛋白质周围水分子的溶剂化层，并屏蔽相同方向的表面电荷之间的排斥。具有多电荷阴离子的盐在盐析蛋白质方面最有效，阳离子则较不重要。
磷酸钙沉淀虽然基于盐，但不同于上述通过盐沉淀蛋白质的原理。磷酸钙在pH值高于6.5的水中难溶(溶解度乘积3×10-7M～6×10-7M，取决于确切的组成)，其溶解度甚至进一步向更碱性的pH值降低。已经详细研究了磷酸钙的组成及其沉淀机理。一般来说，磷酸钙，特别是羟基磷灰石，是生物、地质和工业过程中的重要角色。据报道，磷酸钙可共沉淀病毒载体(参考文献13)，并已被描述用于抗体纯化中的DNA沉淀(参考文献11)。除了DNA沉淀，还观察到宿主细胞蛋白(HCP)的减少。关于磷酸钙沉淀蛋白质的机制，推测是与DNA共沉淀或与带电沉淀物的静电相互作用。
在本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的一个特别优选的实施方案中，蛋白质分离步骤中使用磷酸钙沉淀流体中的蛋白质。在该实施方案中，蛋白质沉淀步骤优选包括根据本发明添加钙离子和磷酸根离子到流体中。在一个优选的实施方案中，添加钙离子至终浓度为10mM～50mM，优选10mM～30mM，更优选10mM～20mM，最优选约15mM。在可与前述实施方案组合的另一个实施方案中，添加磷酸根离子至终浓度为1mM～10mM，优选1mM～5mM，更优选1mM～3mM，最优选约2mM。对本领域技术人员显而易见的，钙离子和/或磷酸根离子通常作为包含钙离子或磷酸根离子的溶液的一部分添加并且可以包含其他离子。一种添加钙离子的合适溶液是例如CaCl2·2H2O的水溶液。一种添加磷酸根离子的合适溶液是例如Na2HPO4的水溶液。
本发明的用于沉淀的可替代性盐可以包括镁或锌(代替钙)与磷酸盐组合。除了提到的那些，磷酸盐与其他二价阳离子如钡、镉、铜、铅和镍形成难溶或不溶的盐。可以基于对患者健康的考虑(例如，当回收的蛋白质是生物制药药物时的毒性)和本发明方法的有关方面(例如可移除性和工艺性能)来选择合适的阳离子。
当在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的蛋白质沉淀步骤中使用沉淀剂时，确保沉淀剂(例如磷酸钙)和/或形成沉淀剂的组分(例如钙离子和磷酸根离子)与包含待回收蛋白质的流体的有效混合是有利的，以确保蛋白质的有效沉淀。因此，在本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的优选实施方案中，蛋白质沉淀步骤包括将包含蛋白质的流体与沉淀剂混合。优选地，该混合在选自连续搅拌釜反应器(CSTR)、管式反应器(TR)、分段流动反应器和冲击射流反应器中的至少一个反应器中进行。在一个实施方案中，混合可以在几个反应器中顺序进行，例如在管式反应器(TR)和连续搅拌釜反应器(CSTR)中。但是，最优选地，混合在连续搅拌釜反应器(CSTR)中进行。
当通过添加沉淀剂沉淀蛋白质时，利用了在添加沉淀剂时出现的两种或多种溶质之间的溶解度的差异。沉淀剂通常作为浓缩储备溶液添加。因此，有效混合有利于确保整个产品工艺的均匀性。因此，优选本发明的用于混合包含蛋白质的流体和沉淀剂的反应器能够提供有效混合。此外，优选反应器提供足够的接触或停留时间以完成沉淀过程。根据工艺流和沉淀剂储备液的动力学和特性，可以选择合适的反应器。在文献中，连续结晶多于连续沉淀，但是，关于混合和停留时间分配要求的基本原理是类似的，这就是针对两者其一描述的反应器也可以应用于另一个的原因。混合悬浮液混合产物移除反应器(Mixed-suspension mixed-product removal reactor)基于连续搅拌釜反应器(CSTR)。这些反应器具有良好的性能，可以广泛应用于生物技术和生物制药行业。它们可以用于培养细胞，作为储存罐和缓冲罐，用于在操作单元间进行调节和病毒灭活。CSTR采用不锈钢材质，可以原位清洗(Cleaning in Place，CIP)和灭菌。随着设备尺寸的减小，由于连续加工，一次性技术已成为一种选择和一种使能技术。特别是对于较低的工作量需求，例如在连续加工中，一次性CSTR是不锈钢容器的可行替代。不锈钢和一次性CSTR都具有直接安装传感器以监测工艺参数的优势。根据混合的需要，可提供搅拌器不同的几何形状和配置。CSTR的特点是停留时间较长，冲洗时间长。先前认为较长的停留时间可能是不利的，尤其是在活动过程中可能出现干扰。但是，如果循环操作中需要使浓度波动平滑，也可以提供好处。CSTR的无量纲停留时间分布(F曲线)由等式2得出，式中无量纲停留时间θ由等式3得出。在等式3中，t是停留时间，
Figure BDA0003785012270000212
是平均停留时间。
F＝e-θ (等式2)
Figure BDA0003785012270000211
相反，与固有较长停留时间的CSTR相比，管式反应器(TR；也称为活塞流式反应器)的特点是停留时间较短。本质上，管式反应器是一个开放式管子或管道，配备了静态混合器。通过使用足够长的反应器，可以提供所需的停留时间，其取决于过程流量和沉淀所需的时间。没有可以用于描述管式反应器的RTD的通用模型。一种选择是通过使用修正的高斯峰值并添加经验因素来近似。虽然PFR在较窄的RTD方面优于CSTR，但先前也被认为在其他方面存在一些劣势。用于在线监测的传感器较难安装。在小规模工艺相应的低流量下，沉淀物可能会沉淀在TR内或被静态混合器截留。此外，该行业缺乏TR经验，预计将阻碍此类反应器在生产过程中的实施和接受度。另一种基于流动的反应器是分段流动反应器。过程流的流动被第二个不混溶相分段，该相可以是液态或气态。与配备静态混合器的TR相比，由于在反应器的空隙中没有安装设备，堵塞的风险显著降低。此外，冲击射流混合器或反应器已被描述用于结晶。根据应用情况，这些反应器可以设计为开放式或封闭式。在封闭、有限的几何形状中，对流动方向的控制水平更高，可以实现更高的射流速度。同时，有限几何结构比开放结构更容易堵塞。
发明人惊奇地发现，在沉淀本发明的蛋白质之前，流体的pH值对蛋白质沉淀效率具有显著影响。因此，在本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的一个优选实施方案中，在沉淀蛋白质之前将流体的pH调节至8.5～9.0之间，优选调节至约8.75。技术人员知晓可用于调节pH的合适物质(例如，酸，碱)。
当根据本发明的蛋白质沉淀步骤沉淀蛋白质时，当pH降至低于6.5或甚至低于6.0时，一些蛋白质如凝血因子VIII的稳定性显著降低。因此，在本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的一个优选实施方案中，沉淀蛋白质之后，流体的pH值在6～7.5之间，优选6.5～7之间，最优选约6.5。
本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法包括将沉淀的蛋白质从流体中分离出来的蛋白质分离步骤。蛋白质分离步骤是固-液分离步骤，其中从液体(即本发明中的流体)中分离出固体(即沉淀的蛋白质)。在本发明的一个实施方案中，在蛋白质分离步骤中，用于蛋白质分离的板式沉降器、连续切向流过滤或流化床离心被用于从流体中分离沉淀的蛋白质。与只有跨膜通量的死端(dead-end)过滤相比，在切向流或错流过滤中存在与膜平行(切向)的额外通量。因此，术语“浓差极化”概括的排斥力减少了。这种操作模式还显著减少了给定沉淀物在膜表面的压实，从而允许存留絮状结构(参见参考文献5和6)。类似的，絮状结构在流化床离心中至少部分存留。通常，使用一次性腔室，其中待分离的悬浮液从腔室的外端进入，澄清的流体离开腔室靠近转子中心。由于这种操作模式在流向中心的流体和来自中心的离心力之间建立了平衡。因此，与传统离心方法相比，在离心过程中固体保留在流化床中，且压实显著减少(参见参考文献14)。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，在蛋白质分离步骤中，用于蛋白质分离的板式沉降器用于从流体中分离沉淀的蛋白质。因此，在该实施方案中，蛋白质分离步骤是使用用于蛋白质分离的板式沉降器从流体中分离沉淀的蛋白质的步骤。
在本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法中，待回收的蛋白质的分子量没有特别限制。然而，本发明人惊奇地发现，该方法也适用于回收大分子蛋白。因此，在一个优选的实施方案中，待回收的蛋白质的分子量为250kDa以上，优选500kDa以上，最优选1MDa以上。
在本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法中，在蛋白质沉淀步骤之前，在本发明的液体中待回收的蛋白质浓度没有特别限制。然而，本发明人惊奇地发现，该方法也适用于回收非常低浓度的蛋白质。因此，在一个优选实施方案中，包含蛋白质的流体中的蛋白质浓度低于20μg/mL，优选在0.05～20μg/mL之间。
在本发明的从流体连续回收蛋白质的方法中，蛋白质的类型没有特别限制。本发明中的蛋白质包括重组蛋白质和其他来源的蛋白质，例如从(人)血浆获得的蛋白质，但本发明优选的蛋白质是重组蛋白质。根据本发明的蛋白质包括但不限于血液因子、免疫球蛋白、替代酶、生长因子及其受体和激素。优选的血液因子包括凝血因子I(纤维蛋白原)、凝血因子II(凝血酶原)、组织因子、凝血因子V、凝血因子VII和凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、血管性血友病因子(vWF)、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI1)和纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI2)。优选的免疫球蛋白包括来自人血浆的免疫球蛋白、单克隆抗体和重组抗体。本发明的蛋白质可以包括功能性多肽变体。本发明的蛋白质优选个别人的蛋白质或人的重组蛋白质(或其功能变体)。
在一个优选的实施方案中，从流体中连续回收蛋白质的方法中的蛋白质是凝血因子。本发明的凝血因子包括凝血因子I(纤维蛋白原)、凝血因子II(凝血酶原)、组织因子、凝血因子V、凝血因子VII和凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII。本发明优选的凝血因子是凝血因子VII(FVII)和凝血因子VIII(FVIII)。本发明最优选的凝血因子是凝血因子VIII。优选地，FVIII是人FVIII，可以通过重组在例如CHO细胞中产生。
在本发明的另一个优选实施方案中，待回收的蛋白质是血管性血友病因子(vWF)。在一个特别优选的实施方案中，待回收的蛋白质是包含凝血因子VIII和血管性血友病因子(vWF)的蛋白质复合物。该蛋白质复合物优选包含重组人凝血因子VIII和重组人血管性血友病因子(vWF)。
血友病A是最著名的凝血障碍之一，由缺乏凝血因子VIII(FVIII)辅助因子活性导致。在健康个体中，FVIII充当凝血级联反应的核心辅助因子。FVIII是在哺乳动物中发现的一种微量血浆糖蛋白，作为凝血因子IXa的辅助因子参与凝血因子X的活化。凝血因子VIII的遗传性缺失导致的出血性疾病血友病A可以用纯化的凝血因子VIII成功治愈。该纯化的凝血因子VIII可以从血浆中提取，或通过基于重组DNA的技术生产。患者需要终生的替代治疗，但这种情况通常会因FVIII抑制剂的开发而变得复杂。在因缺乏血管性血友病因子(vWF)导致的血管性血友病(vWD)病例中可以观察到部分相似的症状。vWF和FVIII形成非共价(蛋白质)复合物，可延长FVIII半衰期并保护其免于过早活化。当vWF的数量和质量受到影响时，FVIII表现的后果会显示与血友病A相似的症状。全长FVIII是一种高达330kDa的大分子糖蛋白(基于SDS-PAGE)，由2332个氨基酸组成，在血浆中以异二聚体形式循环。全长FVIII由三个以短间隔物为边界的A结构域、一个B结构域和两个C结构域构成。细胞内蛋白水解产生的血浆中的异二聚体，其由轻链和重链组成。轻链和重链不再共价连接，而是通过金属离子连接A1和A3结构域。金属离子尚且未知，最有可能的候选是铜和钙。通过凝血酶水解活化，活性异源三聚体形成，其通过金属离子和离子相互作用松弛结合，因此可以快速解离。FVIII的B结构域没有任何已知功能。FVIII具有非常有限的固有的体外和体内稳定性。这一事实对其生产、回收、纯化和存储提出了重大挑战。
血管性血友病因子(vWF)是一种大分子多聚体血浆蛋白。vWF的最小亚基由前vWF-二聚体组成，较大的多聚体由此形成。其分子量从二聚体的约500kDa到最大变体的超10000kDa。vWF具有多种功能，可简单概括为血小板结合、胶原结合和FVIII结合。此外，据报道，vWF可调节对FVIII的记忆性免疫反应，这使得vWF成为FVIII抑制剂形成的重要因子。在vWF发挥生理功能时，其与胶原蛋白结合，随后在受到剪切应力时展开。在其展开的形式中，vWF能够桥接胶原蛋白和血小板，从而vWF引发并辅助血栓形成。
在本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的一个实施方案中，该方法进一步包括蛋白质沉淀步骤之前的蛋白质生产步骤和细胞分离步骤。在该实施方案中，蛋白质生产步骤实在流体中培养细胞的步骤，其中细胞产生蛋白质并将蛋白释放到流体中，而细胞分离步骤是从包含蛋白质的流体中分离细胞的步骤。因此，在该实施方案中，本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法包括以下步骤：在流体中培养细胞的蛋白质生产步骤，其中细胞产生蛋白质并将蛋白释放到流体中；将细胞从包含蛋白质的流体中分离出来的细胞分离步骤；使流体中的蛋白质沉淀的蛋白质沉淀步骤；以及将沉淀的蛋白质从流体中分离出来的蛋白质分离步骤。所有步骤都在一个集成过程中进行。在一个优选实施方案中，所有步骤都连续进行。
在一个实施方案中，细胞分离步骤、蛋白质沉淀步骤和/或蛋白质分离步骤在0℃～8℃、优选2℃～8℃的温度进行。在一个优选实施方案中，所有细胞分离步骤、蛋白质沉淀步骤和蛋白质分离步骤均在0℃～8℃、优选2℃～8℃的温度进行。
在本发明的方法的实施方案中，包括蛋白质生产步骤和细胞分离步骤，其中流体优选细胞培养基。本领域技术人员清楚，当在细胞培养基中培养细胞时，细胞培养基的成分会发生变化，这是因为细胞会分泌产物和副产物到培养基中并消耗营养物质。本文所述术语“细胞培养基”是指细胞培养之前和之后的细胞培养基，即分别指“新鲜的”和“用过的”细胞培养基。合适的细胞培养基取决于在该实施方案中使用的生产蛋白质的细胞的类型，并且是本领域技术人员已知的。
本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法中可以使用的细胞没有特别限制。然而，优选的细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞或人胚肾(HEK)细胞。在一个特别优选的实施方案中，细胞是CHO细胞。
哺乳动物细胞常用于生产重组蛋白质(例如，生物制药药物)，这些蛋白质可以分泌到细胞培养基(也称为细胞培养液)中，最终可以回收，例如配制成药物组合物。但是，为了使细胞能够产生重组蛋白质，细胞需要包含相应的遗传信息。因此，在本发明的优选实施方案中，细胞包含编码待回收的蛋白质(例如生物制药药物)的遗传信息，使得细胞能够产生所述蛋白质。
本发明涉及一种连续方法。因此，优选在蛋白质生产步骤中，细胞培养也连续进行。连续细胞培养过程包括灌注培养、恒浊培养和恒化培养。因此，在本发明的一个实施方案中，在蛋白质生产步骤中，细胞在灌注反应器、恒浊反应器或恒化反应器中培养。在一个特别优选的实施方案中，细胞在恒化反应器中培养。
在细胞分离步骤中，从蛋白质生产步骤输入并因此仍包含在本发明流体(例如，用过的细胞培养基)中的任意生产蛋白质的细胞被分离，并由此从流体中除去。因此，该步骤是固-液分离步骤，其中从液体(即本发明的流体，例如细胞培养基)中分离出固体物质(即细胞)。在一个优选的实施方案中，在细胞分离步骤中，可能从蛋白质生产步骤中输入的细胞碎片也被分离并由此从流体中除去。在可以与前述实施方案结合的另一个实施方案中，可以通过过滤除去细胞碎片。
在一个特别优选的实施方案中，在细胞分离步骤中，用于细胞分离的板式沉降器用于将细胞与包含蛋白质的流体分离。因此，在该实施方案中，细胞分离步骤是使用用于细胞分离的板式沉降器从流体中分离细胞的步骤。
本发明的“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”是适用于指定目的的任意板式沉降器，即分别适用于蛋白质分离或细胞分离。优选地，本发明的板式沉降器是斜板式沉降器。可用于本发明的斜板式沉降器的示例公开于US 2012/0302741 A1、US 2,793,186 A1、US 753,646 A1和US 2002/0074265 A1中，其全部内容并入本文。
以下描述了板式沉降器以及可以连接到这种板式沉降器的底部，其特别优选用于本发明。由于本发明的“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”以及可以连接到这些板式沉降器的底部的许多可选实施方案是相同的，因此在以下仅统称“板式沉降器”和“底部”，不区分本发明的“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”以及相应的底部。然而，除非另有说明，以下关于“板式沉降器”和/或相应的“底部”描述的所有实施方案都是“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”以及相应的底部的本发明实施方案。在一个实施方案中，本发明的“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”以及相应的底部包括以下部分或全部特征，使得它们(结构上)相同。然而，在本发明的另一个实施方案中，“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”和/或它们对应的底部在一个或多个特征上不同，例如，“用于蛋白质分离的板式沉降器”或其底部可以包括以下一种或几种特征，而“用于细胞分离的板式沉降器”或其底部不包括这些特征，反之亦然。
斜板式沉降器可用于从流体中分离成分，即在本发明中，用于从本发明的流体中分离沉淀的蛋白质或细胞。在斜板式沉降器中，待分离成分可以沉降其上的沉降板沿倾斜而不是垂直方向延伸，即沿相对于重力方向倾斜的方向延伸。流体从板式沉降器的底端以足够高的压力供应到板式沉降器，使得流体沿着沉降器的沉降板向上流动。待分离的固体成分可以例如已经以固体形式存在于供应的流体中。或者，待分离的成分可以在例如重力的影响下沉淀。剩余的流体继续流动并最终从板式沉降器顶部的出口排出。从板式沉降器的底部收集分离出的成分(例如，沉淀的蛋白质或细胞等固体成分)。板式沉降器的底端可以连接到通常称为“底部”的部件，有时也称为“接收部”，该部件包括用于供应含有待分离成分的流体的供应通道和用于收集分离成分的收集通道。
斜板式沉降器可以包含数个沉降板。因此，分离过程可以在每个沉降板上同时进行。因为包含待分离成分的流体被供应和分离的成分被收集都在板式沉降器的底部，分离的成分可能混入新供应的流体并因此沿着板式沉降器向上带回。这可能降低分离过程的效率。因此，在本发明特别优选的实施方案中，本发明的板式沉降器连接到特别设计的底部。在以下公开中描述了板式沉降器(可以是组件的一部分)以及本发明优选使用的特别设计的底部。
本公开的多方面涉及用于连接到用于从流体中分离固体成分的组件的底部，所述组件包括斜板式沉降器，所述斜板式沉降器具有至少一个用于使待分离的固体成分沉降的沉降通道，板式沉降器包括下部和上部，所述至少一个沉降通道从下部延伸至上部，其中底部构造成与斜板式沉降器的下部连接。
本文所述术语“底部”不应被理解为意指底部必须位于使用中组件的“底端”和/或组件位于底部(使其承担“足部”的角色)。底部可以在底端，也可以不在底端。换言之，底部本身可以例如位于另一个部分或完全处于底部之下的部件之上。底部可以构成或不构成组件的部分或全部置于其上的足部部件，这取决于所讨论的实施方案。
本公开包括可以(直接或间接)连接到斜板式沉降器的独立形成的底部。然而，本公开还包括具有作为较大的一体成型部件的一部分的底部的组件(例如，底部可以与组件的另一部件一起构成一个整体)
底部可包括至少一个入口通道和至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含待分离的固体成分的流体供应至板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从至少一个沉降通道下降的沉降固体成分。该固体成分可以原样收集，或者可以以悬浮形式收集，形成流体的一部分。固体成分可能已经以固体形式存在于供应的流体中，或者可能从板式沉降器的流体中沉淀出来。该收集通道还可用于从供应给包含板式沉降器的组件的流体中收集流体成分(例如，较重的成分)。
所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离。“流体分离”意味着在底部的入口通道和收集通道之间没有直接的流体连接。例如，底部的壁可以将入口通道和收集通道隔开，然而，当然可以存在间接的流体连接(例如，通过连接到底部的组件中的沉降通道)。根据本文使用的术语，后者不因没有使用“流体分离”而排除。
入口通道和收集通道可连接到组件(其可连接底部)的至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和至少一个沉降通道之间以及在所述至少一个收集通道和至少一个沉降通道之间分别形成流体连接。
入口通道和收集通道之间的流体分离(即，没有直接的流体连通)可以提高对底部流体流动行为的更好控制。具体地，在底部中由供应的流体和下降的分离的固体成分(例如，沉淀物)和/或下降的分离的流体(例如，包含待分离的固体成分)或底部的混合物引起的湍流可能会减少甚至避免。此外，较少或没有分离的成分可混入新供应的流体中。因此，根据所述实施方案的底部，利用连接到底部的组件进行分离过程的效率可以得到提高。
根据一些实施方案，底部配置为连接到具有板式沉降器的组件，该板式沉降器包含多个沉降通道和分隔相邻沉降通道的分隔板。底部可以包括多个入口通道和多个收集通道，其中所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道分别与其他所有入口通道和收集通道流体分开。
入口通道的数量可以与收集通道的数量相等或不等。同样，入口通道和收集通道的相应数量可以与组件中沉降通道的数量相等或不等，底部被配置为连接至该组件。对于一些实施方案，入口通道的数量与收集通道的数量相同并且也与沉降通道的数量相同，使得底部的每个沉降通道包括一个入口通道和一个收集通道。这可以特别提高连接到底部的组件的分离效率。
所述至少一个入口通道及其对应的沉降通道之间的流体连接以及所述至少一个收集通道及其对应的沉降通道之间的流体连接可以分别与所有其他沉降通道和所有其他入口通道和收集通道之间的流体连接分开。这样，与包含所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道及其对应的沉降通道和其他成对通道的成对通道相关联的底部中的湍流和/或其它流体扰动可以降低或甚至完全避免。这可以进一步提高连接到底部的组件的效率。
根据一些实施方案，底部可以包括一个单独的入口通道和一个单独的收集通道，用于对应组件至少50％的沉降通道，底部被配置为可以连接到该组件。这可以提高效率，因为从不与对应配对通道关联的通道数量为50％或以下的角度看，配对程度高。这可以允许降低或抑制与相邻通道相关联的湍流或其它流体扰动，这些相邻通道尽管属于不同的配对通道却没有分开。
可选地，为对应组件的至少75％的沉降通道或至少95％的沉降通道提供一个单独的入口通道和一个单独的收集通道。这可以分别进一步提高效率。
根据一些实施方案，底部可以包括用于多个沉降通道中的每一个沉降通道的一个独立收集通道和一个独立入口通道，其中对于每对对应的入口通道和沉降通道以及每对对应的收集通道和沉降通道，可分别形成独立的流体连接。这可以使包括与底部相结合的板式沉降器的组件的效率特别高。具体而言，可以最小化与相邻配对通道相关联的扰动流，并且可以将分离的固体成分的损失保持在低水平或乃至于避免。
根据一些实施方案，底部可以配置成连接到朝向使用位置的组件，使得入口通道的端部和靠近板式沉降器的收集通道的端部在重力方向上延伸。换言之，待连接到组件的底部的连接部分可以分别相对于入口通道和收集通道的端部定向，使得在组件和准备使用的底部之间处于连接状态下，连接部分相对于重力方向定向时，端部在重力方向上延伸。根据一些实施方案，当底部如所述定向时，延伸方向与重力方向间可能存在角度。该角度可以在0°～15°的范围内，可选地在0°～10°，或者甚至在0°～5°。这可以进一步提高效率。
与端部的重力方向(即竖直方向)相同或相似的延伸方向可分别促进不同供应通道和/或收集通道中的相似或乃至于相等的流体静压。这意味着可以促进具有连接到底部的板式沉降器的设备均匀使用。
根据一些实施方案的底部可以包括至少一个洗涤液供应通道，用于将洗涤流体(或不同的流体)供应到沉降通道或收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离。同样，流体分离是指在底部没有直接连通，但不排除可能存在的间接连接(例如，通过沉降通道)。与其他洗涤流体供应通道和入口通道流体分离可以降低或甚至避免降低效率的流体扰动的发生，例如与相邻通道关联的湍流。
一个或一些洗涤流体供应通道提供了供应另一种流体的可能性，例如，可用于促进收集分离的流体或固体成分(例如，沉淀物)的洗涤流体。这可以提高分离过程的效率。例如，当固体成分往往不能有效排出时，可能是因为有粘附到例如收集通道的一部分等的表面的倾向，供应洗涤液可以有效地收集固体成分并通过底部的一个或几个收集通道将其“清洗”下来。洗涤流体还可以促进固体成分和供应的流体(剩余部分)的分离。这可能很重要，例如，因为流动相可能具有高价值和/或因为它可能包含人们想要去除的杂质。在不使用洗涤液的情况下也可以完成结合或粘附固体的去除，从这个角度来看，洗涤液的使用是可选的。
对应于同一沉降通道的至少一个洗涤液供应通道和至少一个收集通道可以流体连接，例如，通过由所述洗涤液供应通道和所述收集通道共用的壁部的开口。在底部内可以存在流体连接的情况下，流体连接可以是直接的。这可以抑制或甚至防止供应的洗涤流体意外地沿着沉降通道被引导并从顶端排出，还可以降低沿板式沉降器向上输送并在顶端排出的洗涤液的量。
底部中的流体供应通道和收集通道之间的流体连接可以提高洗出分离的流体或固体成分并通过收集通道收集的过程的效率。它还可以通过抑制或防止干扰流来额外地增加流动效率，因为洗涤流体可以直接被引向收集通道。
根据一些实施方案的底部可以包括至少一个通道内的分配部分，用于在跨越所述特定通道的横截面的至少一个延伸方向上均匀地分配液体流通过靠近相应沉降通道的第一通道的一部分。第一通道可以直接与待连接的沉降通道相连，或在其间可以有另外的部件。通道内的分配部分可以增加具有板式沉降器的设备的使用效率，因为其可以例如提高施加到所讨论的相关沉降通道的负载的均匀度。
所述第一通道是入口通道或收集通道或洗涤液供应通道。更一般地说，可以将通道内的分配部分可以提供至一个或几个入口通道和/或一个或几个收集通道和/或一个或几个洗涤液供应通道。对于一些实施方案，每个入口通道有一个通道内分配部分，每个收集通道有一个通道内分配部分，每个洗涤液供应通道有一个通道内分配部分。这尤其可以提高底部的效率，因为对于供应到连接组件的流体以及从组件排出(收集)的流体/成分，它可以促进在底部的所有涉及的通道上特别均匀的流动分布。
根据一些实施方案的底部可以包括至少一个通道间分配部分，用于在多个入口通道和/或洗涤流体供应通道和/或收集器上，沿来回板式沉降器的方向均匀地分配流体。可以有一个或几个通道间分配部分。可以为部分或全部入口通道配置一个或多个通道间分配部分，可以为部分或全部收集通道配置一个或多个通道间分配部分，并且可以为部分或全部洗涤液供应通道配置一个或多个通道间分配部分。然而，几种通道间分配部分在上下文中也可以简单地合称为“通道间分配部分”。
根据一些实施方案，所有入口通道、所有收集通道和所有洗涤流体供应通道可以流体连接到通道间分配部分。这尤其可以提高底部的效率，因为对于供应到连接组件的流体以及从其排出的流体，它可以促进在所有现有通道上的流动分布特别均匀。根据一些实施方案，第一通道间分配部分可以连接到所有入口通道，第二通道间分配部分可以连接到所有收集通道，第三通道间分配部分可以连接到所有洗涤流体供应通道。术语“第一”、“第二”和“第三”仅用作区分三种通道间分布部分的标签。
通道内分配部分可以将第一通道的上部与该第一通道的下部连接，其中该上部位于对应的沉降通道附近。后者意味着上部比下部更靠近底部连接到包括板式沉降器的设备的位置。
第一通道的下部可以分成两个(或多个)相等的第一横截面的连接通道，并且所述连接通道可选地至少一次进一步分成(两个或多个)具有相应相等的第二横截面的相应连接的子通道。“相等的第一横截面”和“相等的第二横截面”是指在第一次拆分之后通道的所有横截面都相等，对于第二次拆分之后的通道也是如此。拆分后的通道可以与拆分前的通道具有相同的横截面，也可以不同。因此，第一横截面可以与相应的第二横截面相同或不同。
在各自最后一次拆分后，所有连接子通道的端部连接到上部，以便在分布方向上均匀分布。这可以特别促进由通道内分配部分影响的流体分配的均匀性。在分叉(通道点被分成两个或更多个通道点)之前和之后，流量可以保持或可以不保持基本恒定。根据一些实施方案，所有拆分可以使通道的数量加倍。对于其他实施方案，可以在分叉点处拆分成三个或更多通道。不同的拆分数也可以与不同的拆分点相关联。
当通道定向成在垂直方向上延伸时，可以在相同的高度实现进一步的拆分。例如，第一次拆分可以分为两个通道，在第N次拆分之后(其中每次都处于特定高度)，可能有2N个通道。后续的几次拆分之间的高度差可以相同或可以不同。所有通道的横截面可以相同。相对于先前的拆分数，在对应于分叉通道系统中的不同阶段的每对通道之间的横截面可以相同或不同。
一个或多个通道间分配部分中的每一个可以包括将连接到一个或多个入口通道或一个或多个洗涤流体通道或一个或多个收集通道的上部和下部。下部可以分成第一横截面相等的两个连接通道。所述连接通道可以至少一次进一步分成具有相应其他相等横截面的相应连接子通道，其中所述第一横截面与对应其他横截面相同或不同，并且其中在各自最后分叉后的所有连接子通道的端部连接到上部，以便在分布方向上均匀分配。分配方向可以部分或完全垂直于入口通道和/或收集通道和/或洗涤流体供应通道的至少一部分的延伸方向。
这可以特别促进由通道间分配部分影响的流体分配的均匀性。在分叉(通道点被分成两个或更多个通道点)之前和之后，流量可以保持或可以不保持基本恒定。根据一些实施方案，所有拆分可以使通道的数量加倍。对于其他实施方案，可以在分叉点处拆分成三个或更多通道。在拆分点的拆分数可以在拆分点之间不同，也可以对所有拆分点都相同。
当连接通道定向为在垂直方向上延伸时，可以在相同的高度处实现进一步的拆分。例如，第一次拆分可以分成两个连接通道，在第N次拆分之后(其中每次都处于特定高度)，可能有2N个通道。后续的几次拆分之间的高度差可能相同或可能不同。所有通道的横截面可以相同。相对于先前的拆分数，在对应于分叉通道系统中的不同阶段的每对通道之间的横截面可以相同或不同。
根据一些实施方案，通道内分配部分和通道间分配部分可以连接。将两种类型的分配部分串联组合可以特别促进流动分配的均匀性，因此特别有利于底部(以及由此连接到底部的设备)的效率。通道内分配部分可以配置为比通道间分配部分更靠近板式沉降器。
可以有一个通道间分配部分连接到几个通道内分配部分，后者之一连接到每个入口通道，和/或可以有一个通道间分配部分连接到几个通道内分配部分，后者一个连接到每个收集通道。可以有一个通道间分配部分连接到几个通道内分配部分，后者之一连接到每个洗涤流体供应通道。当对于每个入口通道，每个收集通道，每个洗涤液供应通道，分别有一个通道内分配部分，并且当各组入口通道关联的通道内分配部分，收集通道关联的通道内分配部分和洗涤流体通道关联的通道内分配部分各自优选于(就朝向连接设备的流动方向而言)一个或多个通道间流动分配部分，这可以特别提高底部的有效性和效率。特别地，它可以特别促进朝向设备的流动分布的均匀性，因此也促进斜板式沉降器的各种沉降通道中的流动的均匀性。
所有的入口通道和收集通道可以成对配置，因为每个入口通道可能总有一个收集通道(反之亦然)，使得一对通道与板式沉降器的一个或几个相应的沉降通道分别关联。所有入口通道、收集通道和洗涤流体供应通道都可以作为三联体使用。
所有的入口通道可以分别由一个对应的通道间分配部分供流，所有的收集通道可以由一个对应的通道间分配部分连接。所有洗涤流体供应通道可以由相应的相应通道间分配部分供流。
所有入口通道可与一个通道内分配部分相关联，所有收集通道可与一个通道内分配部分相关联。所有的洗涤液供应通道可与一个通道内分配部分相关联。该关联应理解为表示在通向相应入口通道的流动路径中具有一个相应的通道内分配部分。
对于包括一个或多个通道内分配部分和一个或多个通道间分配部分的底部的一些实施方案，通道内分配部分的分布方向可以是靠近板式沉降器的第一通道的端部连接的横截面的纵向延伸方向。第一通道也可以在所述的方向上完全延伸。通道间分配部分的分布方向可以垂直于通道内分配部分的分布方向。这可以导致特别有效的流量分配模式。特别地，它可以允许紧凑构造的底部。
一个或多个通道内分配部分可以是分形流量分配器。同样，一个或多个通道间分配部分可以是分形流量分配器。分形流量分配器随后分成几个拆分级别，并且可以通过增加或减少拆分级别的数量来放大或缩小。
底部的一些实施方案被配置为连接到组件，该组件具有彼此平行延伸的相邻沉降通道的底表面，所述底表面包括在除了沉降通道的倾斜方向之外的任意方向上不倾斜的至少一部分。此外，整个底表面可以仅在沉降通道的倾斜方向上倾斜。
沉降通道相对于重力方向的倾角可以在5°～85°(或15°～75°)的范围内。这可以提高(或甚至进一步提高)分离过程的效率。根据一些实施方案，该角度在50°～70°的范围内，可选地在55°～65°，以及可选地在58°～62°。在这些越来越窄的范围内的角度越来越能进一步地提高分离过程的效率。
本公开的另一方面涉及一种用于将固体成分与流体分离的组件。该组件可以包括具有下部、上部和至少一个沉降通道的斜板式沉降器，该至少一个沉降通道用于使待分离的固体成分分离沉降。该沉降通道可以从下部延伸到上部。
板式沉降器可以是斜板式沉降器。它可以被配置为在使用中定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向从下部延伸到上部。板式沉降器的至少一个沉降通道可以在上部连接到用于排出剩余流体的流体出口并且在下部连接到根据前述实施方案中任一项的底部。来自待分离流体(或仅固体成分)已被部分或完全从中分离的剩余流体可通过流体出口从上部排出。
该组件可以包括多个用于使待分离的固体成分沉降的沉降通道，所述沉降通道从下部延伸到上部，并且板式沉降器还可以包括分隔相邻通道的分隔板。板式沉降器可以被配置为在使用中定向，使得分隔板在重力方向上不重叠。当组件被安装成使其被定向以供使用时，分隔板可以在重力方向上定向，使它们是在相邻沉降通道之间垂直延伸的分隔壁。
多个沉降通道可以在上部连接到用于排出剩余流体的至少一个流体出口。多个沉降通道在下部连接到根据前述权利要求中任一项所述的底部。所述多个沉降通道中的每个沉降通道可以连接到一个或多个入口通道和一个或多个收集通道，并且还可以连接到一个或多个洗涤液供应通道。根据一些实施方案，可以实现入口通道和收集通道对与一个沉降通道之间的一一对应，并且根据一些实施方案，针对一个沉降通道，可以存在一个三元组，包括一个入口通道、一个收集通道和一个洗涤通道供应通道。
对于根据本公开的组件的实施方案，沉降通道的宽度通常可以在5～200cm之间，可选40～150cm的范围。沉降板(沉降通道的底部)的高度通常可以在10～200cm之间。两个沉降板之间的距离通常可以在0.3～10cm的范围。
每厘米板宽的流体出口数量(在最靠近板式沉降器的流量分配器的最后一次拆分之后)可以在每厘米0.2个出口到每厘米2个出口的范围内，可选地在每厘米0.5个出口至每厘米1个出口之间。
根据本公开的底部的流量分配器的流体通道的纵向截面可以是(至少部分地是)方形或矩形或圆形。
根据一些实施方案，本文描述的任一实施方案的底部可以与本文描述的任一实施方案的组件联合使用(到目前为止没有不兼容)，从而不同沉降通道中的流体静压之间的相对差异不超过10％的阈值。可选地，该差异不超过5％的阈值，而且可选地，该差异不超过3％的阈值。这些阈值可以(随着较低阈值的增加而增加)确保不同沉降通道中的流体静压保持非常相似(或者甚至基本或完全相同)。这促进了组件的均匀和均衡使用，从而提高了效率，因为其可以优化利用组件的容量。
根据组件的用途的一些实施方案，所述用途包括通过至少一个入口通道向板式沉降器供应包含待分离的固体成分的流体，以及通过至少一个洗涤流体供应通道供应洗涤流体，其中，洗涤流体的密度等于或高于包含待分离的固体成分的流体的密度。这可以提高所需的分离过程的效率。它还可以降低甚至避免洗涤液的损失，因为可以降低洗涤液意外地沿沉降通道向上输送(甚至通过顶端出口排出)的可能。
上述底部/板式沉降器/组件可用于从流体中分离固体成分。从流体中分离固体成分可以包括：将包含固体成分的流体供应到本发明底部的至少一个入口通道的步骤；使固体成分沉淀的步骤；排出(即收集)剩余流体(即除去了固体的流体)的步骤；以及通过所述底部的至少一个收集通道收集沉降成分的步骤。优选地，使待分离的固体成分(例如，细胞)分离沉降的步骤是使固体成分沉降在作为本发明公开的组件的一部分的斜板式沉降器的至少一个沉降通道中的步骤。在本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法中，这些步骤作为连续过程的一部分进行，其中一些步骤可以同步(即同时)进行：包含固体成分的流体可以连续地供应到底部，而且剩余流体可以连续排出，使得包括在进料流体中的固体成分可以在剩余流体排出前沉降。收集沉降成分的步骤可以间歇进行，例如以固定间隔进行。
根据一些实施方案，待分离的固体成分是沉淀物。根据一些实施方案，待分离的固体成分是细胞。这些细胞可以游离悬浮，或者可以粘附在例如微载体上。
当固体成分是细胞时，这些细胞可能产生蛋白质，例如凝血因子。在这种情况下，根据本公开在将所述流体(包括其中的细胞)送入底部前，细胞可能已经在流体(例如，细胞培养液，也称为细胞培养基)中培养。在这种预先培养过程中，细胞可能已经产生了蛋白质。因此，在根据本公开的实施方案中，本公开中被供应到底部的流体可以包含所述蛋白质。
当根据本公开进行上述分离时，发明人已发现包含在流体(例如，细胞培养液流体)中的固体成分(例如，细胞)可以有效地从所述流体中分离，而溶解在流体中的任何成分(如蛋白质)的损失最小。因此，根据本公开的方法，溶解在流体中的任何成分可以与除去了固体的流动相一起被有效地收集。因此，本公开提供了固体成分与流体的改进分离。
为了更好地理解本公开并展示其如何实施，在以下实施方案中，优选从流体中连续回收蛋白质的方法中优选使用的底部/板式沉降器/组件，将参照附图进行描述。
图1描绘了根据本公开的底部1的实施方案。底部1连接到根据本公开的用于从流体中分离固体成分的组件2的实施方案。
组件2包括斜板式沉降器20。它被称为倾斜的，因为它相对于重力方向(图1中的垂直方向)以角度α延伸。
板式沉降器20的该实施方案包括一个沉降通道21，用于使待分离的流体(例如，待分离的固体成分)沉降。斜板式沉降器20具有倾斜角α，其适合于供应至板式沉降器20的流体的密度和待分离成分(在这种情况下：在沉降通道20的底部的固体成分)的密度(比重等)。
根据本公开的组件和底部的各种实施方案中，板式沉降器20相对于重力方向的倾斜角α可以在5°～85°之间。
板式沉降器20包括下部22和上部23。沉降通道21从下部22延伸到上部23。底部1连接到下部22。上部23连接到流体出口24。从上部23通过流体出口24排出从中已经(至少部分)分离流体(在这种情况下：沉淀的固体成分)的剩余流体。离开出口24(及其方向)的流体由图1中的箭头D表示(“D”代表“排出”)
流体(包括待分离成分)从底部末端通过底部1供应到组件2。分离的成分也通过底端收集。这由图1中的双箭头P表示。
图1的底部1可与组件2分离。然而，本发明还包括与组件2一体成型的底部1(组件2和底部1制成一体)。根据一些实施方案的组件2和底部1之间的连接可以是可逆的，而对于其他实施方案可以是不可逆的。
图2描绘了根据本公开的底部1的另一个实施方案。该底部1连接到根据本公开的用于从流体中分离固体成分的组件2的实施方案。
组件2包括斜板式沉降器20。所述板式沉降器20的该实施方案包括用于使待分离成分沉降的若干沉降通道22。
板式沉降器20包括下部22和上部23。沉降通道21从下部22延伸到上部23。底部1连接到下部22。上部23连接到流体出口24。从上部23通过流体出口24排出从中已经(至少部分)分离流体(在这种情况下：沉淀的固体成分)的剩余流体。离开出口24(及其方向)的流体由图2中的箭头D表示(“D”代表“排出”)。
相邻的沉降通道21由分隔壁25隔开。
流体(包括待分离成分)从底部末端通过底部1供应到组件2。箭头F表示被供应的流体(“F”代表“供应”)。分离的成分也通过底端收集。这由图2中的双箭头C表示(“C”代表“收集”)。
图2的底部1可与组件2分离。然而，本发明还包括与组件2一体成型的底部1(组件2和底部1制成一体)。根据一些实施方案的组件2和底部1之间的连接可以是可逆的，而对于其他实施方案可以是不可逆的。
图3是根据本公开的底部1的实施方案的示意性三维透视图。底部1连接到根据本公开的用于从流体中分离固体成分的组件2的实施方案。
组件2包括板式沉降器20。图3仅示出了两个沉降通道21以避免示意图杂乱，然而沉降通道21的数量可以更高(例如，高得多)。
对于根据本公开的组件2的实施方案，沉降通道21的宽度w通常可以在5～200cm的范围内，可选40～150cm之间。沉降板(沉降通道21的底面)的高度h通常可以在10～200cm的范围内。两个沉降板之间的距离d通常可以在0.3～10cm之间。
该实施方案的沉降通道21的沉降板(底壁)包括不锈钢，其可选电抛光(至分辨率等于或小于0.8μm)。根据一些实施方案，沉降板由不锈钢组成。或者，沉降板可以包括或由塑料组成，例如丙烯酸玻璃(例如，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和/或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETG)改性的)。
根据该实施方案的底部1由不锈钢和/或塑料制成，并且逐层组装而成。或者，可以通过增材制造(例如3D打印)来制备。然而，所有这些特征可以在一些实施方案中存在而在其他实施方案中不存在。
图3的底部1包括若干入口通道10，用于将包含待分离的固体成分的流体供应给板式沉降器20。底部1还包括若干收集通道，用于收集从沉降通道下降的沉降固体成分21。其他实施方案包括仅一个收集通道11和/或仅一个入口通道10。
入口通道10和收集通道11成对提供，使得这两个通道中的每一个通道连接到板式沉降器20的相应沉降通道21。
入口通道10和收集通道11中的每一个都连接到一个对应的沉降通道21，以形成流体连接。在入口通道10和收集通道11之间在底部1内没有直接的流体连接的意义上，入口通道10和收集通道11是流体分离的。它们由壁隔开。然而，存在经由沉降通道21的间接流体连接(如此，分离的固体成分可以在图3中从板式沉降器20向下返回)。
在这种情况下，入口通道10和沉降通道21之间的进料角度为90°。换言之，入口通道10靠近板式沉降器20的端部在重力方向上延伸。此外，收集通道11靠近板式沉降器20的的端部也在重力方向上延伸。
根据其他实施方案，角度
Figure BDA0003785012270000371
可以在5°～90°的范围内，可选地在15°～75°的范围内，或在30°～60°之间。角度
Figure BDA0003785012270000372
也可以与板式沉降器20的倾斜角度α相同或相似。当角度
Figure BDA0003785012270000373
小于90°时，供应通道的主要部分可以例如沿重力方向延伸，靠近与沉降通道连接的末端(或端部)的部分可以具有供应通道的倾斜度改变的部分。例如，可以在供应通道中提供弯曲部(例如，具有边缘)，或者供应通道可以包括弯曲部分，使得相对于水平面的延伸角从90°转变为小于90°的角度
Figure BDA0003785012270000374
入口通道10和收集通道11之间的流体分离(即不存在直接的流体连通)促进了对底部1中流体流动行为的更好控制。具体地，可以降低或甚至避免由所供应的流体和下降的分离的固体成分(例如，沉淀物)和/或底部1中的下降的分离的流体(例如，包括待分离的固体成分)的混合物或由于底部1产生的湍流。因此，根据这些实施方案的底部1可以提高分离过程的效率。
入口通道10和对应的沉降通道21之间以及收集通道11和对应的沉降通道21之间的流体连接，分别与所有其他沉降通道21与所有其他入口通道10和收集通道11之间的流体连接分开。这样，可以降低或甚至完全避免与包括相应入口通道10和收集通道11的一对通道以及对应的沉降通道21和其他通道对相关联的底部1中的湍流和/或其他扰动流。这可以进一步提高连接到底部1的组件2的效率。
图3的底部1包括针对多个沉降通道21中的每一个的一个单独的收集通道12和一个单独的入口通道11，其中针对每对相应的入口通道10和沉降通道21形成独立的流体连接，并且针对每对相应的收集通道11和沉淀通道21形成独立的流体连接。这可以使得包括与底部1结合的板式沉降器20的组件2的效率特别高。具体地说，可以最小化与相邻通道对10、11、21关联的流动扰动。
为了使图3的示意图保持简洁，该图没有区分收集通道11和各自对应的洗涤液供应通道12。洗涤液供应通道12位于入口通道10和收集通道12之间。洗涤液通过洗涤液供应通道12供应，并用于提高通过收集通道11分离成分的排放效率。图4更详细地展示了入口通道10、收集通道11和洗涤液供应通道12的三联体的配置。
更一般地，洗涤液供应通道12可用于将洗涤液直接供应至一个或数个沉降通道21或供应至一个或数个12收集通道。洗涤液供应通道12与其他洗涤液供应通道12和所有入口通道10流体分离。例如，如图4所示。
与其他洗涤液供应通道12和入口通道10流体分离可以降低或甚至避免导致效率降低的流动扰动的发生，例如与相邻通道12关联的湍流。流体分离与底部1自身有关，但并不意味着不存在经由例如连接的板式沉降器20的间接流体连接。
洗涤液可以提高过程的效率。例如，当固体成分可能不能有效排出时，可能是因为存在永久或暂时粘附在沉降板的部分或例如收集通道11的趋势，供应洗涤液可以起到足够的作用以收集固体成分，并在底部1的一个或多个收集通道11中洗脱。
如图4中可见，相应的洗涤液供应通道12和收集通道11(共同对应相同的沉降通道21)通过由所述洗涤液供应通道12共用的壁部15上的开口14流体连接。流体连接可以是直接的，因为流体连接可以存在于底部1内。这可以抑制或甚至避免供应的洗涤液被引导，意外地沿着沉降通道21并经顶端排出。底部1中的流体连接可以提高通过收集通道11洗脱的分离的流体或固体成分并进行收集的过程的效率。这还可以通过抑制或避免干扰流来额外提高流动效率，因为洗涤液可以直接被引导向收集通道11。
图3中也显示了开口14。在这种情况下，洗涤液出口(开口14)相对于重力方向(图3中的竖直方向)的角度ω为90°。或者，也可以相对于水平方向位于15°～90°的范围内，例如，可以在与板式沉降器20的沉降通道21的主要延伸方向的相同方向(或相似的方向)上延伸。
图5和图6描绘了根据本公开的底部1的一个实施方案的示意性三维透视图。
图5的底部1包括通道内分配部分30，用于通过入口通道10、收集通道11和洗涤液供应通道12均匀地分配液体流。通道内分配部分30是分形流量分配器。通道内分配部分30可以提高连接到底部1的组件2的使用效率，因为它可以例如增加施加到相应的沉降通道21的负载的均匀度。
通道内分配部分30对所有的入口通道10、收集通道11和洗涤液供应通道12均匀地分配。在收集通道11的情况下，均匀分配应理解为相对于整个收集通道11的整个直径均等收集的形式。
例如，对于每个入口通道10，通道内分配部分30包括一个通道300，该通道300被分成两个通道301，然后通道301在接近要连接到组件2的部分的方向上再次分成两个通道302，该组件2具有一个板式沉降器20。这可以根据所需的目的按比例放大并且可以称为流量分配器的分形设计。
图5的实施方案包括锥形分配部分，该分配部分均匀地分配离开通道302的流体，以便在要连接到板式沉降器20的连接部分处到达各个入口通道10的宽度方向上的整个横截面。
例如，对于每个收集通道11，通道内分配部分30包括一个通道300，该通道300被分成两个通道301，然后在接近要连接到组件2的部分的方向上再次分成两个通道302，该组件2具有一个板式沉降器20。这可以根据所需的目的按比例放大，并且可以被描述为与流量分配器的分形设计相关联。
还为每个收集通道11和每个洗涤液供应通道12提供了类似的分形通道。为了避免重复，参考关于入口通道10的通道300、301和302解释。
图5的底部1还包括通道间分配部分40，用于在流向或来自多个入口通道11、洗涤液供应通道12和收集通道11之上的板式沉降器的方向上均匀地分配液体流。这可以进一步提高底部1的效率，因为对于供应到连接组件的流体以及从中排出的流体，它可以促进在所有现有通道上的流动分布特别均匀。
特别地，通道间分配部分40是分形流量分配器并且包括用于所有入口通道10、所有收集通道11和所有洗涤液供应通道12的分配部分。
例如，通道400收集来自(所有)收集通道11的流体。在流向连接到底部1的板式沉降器20的方向上，通道400被分成两个通道401，这两个通道401再度被各自分为两个相应的通道402。这解释了流量分配器的分形配置。对于服务所有入口通道10的通道间分配部分存在类似的结构，并且服务所有洗涤液供应通道12的通道间分配部分也存在类似的结构。
通道间分配部分40和通道内分配部分30串联连接，其中通道内分配部分30比通道间分配部分40更靠近所连接的板式沉降器20。
举例说明两个串联的流量分配器如何工作。例如，对于每个收集通道11，一个通道内分配部分首先均匀地收集流体(在收集通道11的横截面上均匀地)。这通过从组件2和底部1之间的连接部分到两个流量分配器30和40之间的连接部分的通道的连续联合来完成。然后，在与多个收集通道11相关联的不同的通道内分配部分，通过通道间分配部分在所有收集通道11上实现均匀收集。关于入口通道10和洗涤液供应通道12也有类似的表述。
图6描绘了底部1的另一个实施方案，包括通道内分配部分30和通道间分配部分40。该实施方案类似图5的实施方案。因此参考图5的表述，只讨论其不同之处。图6的通道间分配部分40，即在通道间分配部分40连接到相邻通道内分配部分30的部分处包括锥形分配部分410。一些实施方案包括这些，而其他实施方案不包括。锥体是可能有助于流量分配器均匀效应的几个方面之一。
更一般地，在作为根据本公开的底部1的通道间分配部分和/或通道内分配部分的示例的分形流量分配器中，可以包括分成两个(或多个)具有相等的第一横截面的连接通道的通道，并且所述连接通道优选至少一次被进一步分成(两个或多个)具有其他相等横截面的相应的连接子通道。此处可能有一次拆分、两次拆分或多次拆分。
图7展示了具有三个拆分级的流量分配器5的示例，其中拆分总是通道数量的两倍。具体来说，通道50被分成两个通道51，这两个通道51又被分别分成两个通道52，其中每个通道52再次被分成两个相应的通道53。这可以根据放大需要按比例放大用于从流体中分离目的成分的组件。
如图7所示的分形流体分配器5可用于每个独立入口通道10，和/或每个独立收集通道11，和/或根据本公开的底部1的每个独立洗涤液供应通道12。如此，流体分配器5可以用作通道内分配部分30(或一部分)。
图7的分形流体分配器5可以额外或可替代地用于几个(或所有)入口通道10，和/或几个(或所有)收集通道11，和/或几个(或所有)洗涤液供应通道12。如此，流体分配器5可以用作通道间分配部分40(或一部分)。
图7的流量分配器5被制成每个通道在拆分前和拆分后的横截面相同。换言之，通道50的横截面等于通道51、52和53中每一个的横截面。图8A展示了这种具有相等横截面的拆分方案。
不过，本公开包括其他实施方案。例如，图8B公开了流量分配器的拆分方案，其中通道的横截面在每次拆分后变小。换言之，在图8B的情况下，通道52的横截面小于通道51的横截面，通道51的横截面小于通道50的横截面。相反，在图8C的情况下，横截面有时在拆分前后相同，有时在拆分前后不同，具体来说，通道51和52的横截面大小相同，而通道50的横截面更大。
图9A～9F展示了可用于根据本公开的底部1的通道间和/或通道内分配部分(的一部分)的流量分配器中的各种可能的拆分几何形状。
所述拆分可以，例如，通过两个角度β和γ进行表征。图9A表示β＝γ＝90°的拆分设置。在图9B的情况下，β和γ都小于90°。在图9C的情况下，β和γ都大于90°。图9D展示了将角度β和γ替换为与单个角度δ相关联的几何形状的示例。拆分也可以由曲线形成，而不涉及锐角，如图9E所示。在图9F的示例中，两个角度β和γ为90°，但边缘被展平，因此拐角处的形状是弯曲的。所有这些分流器都可以用作根据本公开的底部1的流量分配器中的二元分流器(分成两个通道)。但是，也可以使用非二进制拆分(例如，拆分成三个、四个或更多个通道)。
图10示意性描绘了作为连接到一个具有斜板式沉降器20的组件2的底部1中的通道内分配部分30和通道间分配部分40的两个分形流量分配器的串联。道内分配部分30和通道间分配部分40相对彼此旋转90°，使得宽度方向上彼此垂直。因此，可以看到图10中通道间分配部分40的分段拆分，而通道内分配部分30的部件在图10中以线段表示。
如图10的示例，两个流量分配器之间的连接可以是锥形延伸的形式，从而提供一个整体的连接部。或者，如图11所示，可以存在连接部但没有任何锥形部分。另一个示例如图12所示，在通道间分配部分40的不同部分之间没有流体连通，这些部分连接到通道内分配部分30。
图13展示了作为通道内分配部分30和通道间分配部分40的两个分形流量分配器串联的另一个示例，其中在其间存在90°旋转(如图10相关组件的描述)。在图13的示例中，在最后一次拆分前，在通道内分配部分30内实现另一个90°旋转。换言之，在通道内分配部分30最靠近连接组件2的板式沉降器20的部分处，在与先前的拆分垂直的方向上再进行两个通道的拆分。最后在垂直方向上拆分成两个通道60可能特别有用，例如，当要从流体中分离非常大的固体成分时，因为收集部的宽度可能会相当大。分成两半的宽度可以使从收集部抽吸固体更有效。
可以使用根据本公开的底部1和/或组件2的一些实施方案，使不同沉降通道中的流体静压之间的相对差异不超过10％的阈值。可以选择地，该差异不超过5％的阈值，并且可选不超过3％的阈值。这些阈值可以(随较低阈值的增加)确保不同沉降通道中的流体静压非常相似(或者甚至基本或完全相同)。这促进了组件的均匀度和均衡实用，从而提高了效率，因为此举可以优化利用组件的容积。
去除固体(和洗涤液)期间，(通道内和/或通道间分配部分的)流量分配器的通道中体积流量的最大线性速度可以是1mL/min/cm板宽，至多50mL/min/cm板宽。在上部分流器的顶部出口(最靠近板式沉降器)的流体的雷诺数(Reynolds number)可以低于2000。分流器的流体通道的长度可以在0.5cm～5cm的范围内。
本公开的底部/板式沉降器/组件可以用于从流体中分离固体成分(例如，沉淀的蛋白质或细胞)。所述分离可以包括：将包含固体成分的流体供应到本公开底部的至少一个入口通道的步骤；使固体成分沉淀的步骤；排出(即收集)剩余流体(即除去了固体的流体)的步骤；以及通过所述底部的至少一个收集通道收集沉降的成分的步骤。优选地，在排出剩余流体的步骤中，剩余流体不直接从底部排出，而是从组件的其他部分(底部可能是其一部分)排出。例如，剩余流体可以通过至少一个流体出口排出，该流体出口连接到组件的至少一个沉降通道，底部可以是该组件的一部分。优选地，使待分离的固体成分(例如细胞)沉降的步骤是使固体成分沉降在作为本公开的组件的一部分的斜板式沉降器的至少一个沉降通道中的步骤。在该实施方案中，剩余流体(即，除去了固体的流体)可以在作为本公开的板式沉降器的一部分的至少一个沉降通道的上部排出，例如，通过至少一个流体出口连接到至少一个沉降通道。
根据一些实施方案，待分离的固体成分是沉淀物。这些沉淀物可能通过流体中的化学反应形成，并且优选地，在流体被供应到底部时，这些沉淀物已经以固体形式存在于流体中，但也可以从流体中沉淀在例如根据本发明的板式沉降器中。
在根据本公开的从流体中分离固体成分的另一实施方案中，通过将洗涤液(例如，洗涤缓冲液)泵送到底部的至少一个收集通道来收集沉降成分，并通过从底部的至少一个收集通道泵送沉降的成分和洗涤液。类似收集可以以固定间隔进行。收集频率(即，间隔)应根据例如包含固体成分的流体中固体成分的浓度进行调整。当固体成分是细胞时，在调整收集频率时也应考虑这些细胞粘附于表面的可能。在一个特别优选的实施方案中，洗涤液应该具备与包含待分离的固体成分的流体相等的、优选更高的密度，以及比固体成分低的密度。根据本公开，这是为了确保固体成分能够沉降到洗涤液中并且减少洗涤液与流体的混合。当包含固体成分的流体为细胞培养液且固体成分为细胞时，洗涤液可包含14g/L氯化钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1.15g/L磷酸二氢钠，并且pH值为7。
当根据本公开从流体中分离固体成分时，发明人已经发现包含在流体(例如，细胞培养液)中的固体成分(例如，细胞)可以有效地从所述流体中分离出来，而流体中溶解的任意成分(如蛋白质)的损失最小。因此，根据一些实施方案，排出的剩余流体中的固体成分含量为进料至底部的至少一个入口通道的流体中的固体成分含量的小于20％，优选小于10％，最优选小于5％。在另一个实施方案中，排出的剩余流体中的蛋白质含量为进料至底部的至少一个入口通道的流体中的蛋白质含量的大于80％，优选大于90％，最优选大于95％。流体中的固体成分含量优选是指所述流体中固体成分的浓度(例如，以体积/体积计)。本领域技术人员知晓确定这种浓度的各种方法。例如，流体中固体成分的(相对)浓度可以通过浊度测量来确定。流体中的蛋白质含量优选是指所述流体中蛋白质的浓度(例如，以重量/体积或活性单位/体积计)。本领域技术人员将知晓确定这种浓度的各种方法。例如，可以通过抗原ELISA确定以重量/体积计的FVIII浓度。每体积活性单位的FVIII浓度(即FVIII活性)可以通过显色测定法确定。此类显色测定可以测定活性FVIII，并显示浓度，例如，以国际单位(IU)/mL为单位。
再根据本公开的从流体中分离固体成分的另一实施方案中，将包含固体成分的流体连续供应到底部的至少一个入口通道。在该实施方案中，优选地，剩余流体(即，除去了固体的流体)也被连续排出。本领域技术人员将了解如何调节进入底部的体积流量以确保固体成分有足够的时间在例如根据本公开的至少一个沉降通道中沉降。当本公开的方法用于从含有蛋白质(例如，生物制药药物)的流体中分离细胞时，进入底部的连续进料可以来自包括连续细胞培养的生物反应器。这种连续的细胞培养可以是恒化、恒浊或灌注培养。优选地，这种连续细胞培养是恒化培养。
本公开的分离温度没有特别限制。本领域技术人员将理解如何基于例如使用的任意材料和包含在包含固体成分的流体中的任意物质的稳定性来选择合适的温度。但是，用于操作根据本公开的固体成分分离的组件内的温差会导致由温度引起的密度差，这会引起对流，从而降低洗涤液和剩余流体之间的分离效率。因此，优选地，根据本公开，从流体中分离固体成分在均匀温度下进行，即，用于操作该工艺的组件(包括例如底部和板式沉降器)保持在设定温度+/-5℃，优选在设定温度+/-3℃。
与上述一致的是，本发明人发现，当根据本公开的组件位于温度在2℃和8℃之间的冷室中时，从细胞培养液中去除细胞是特别有效的。因此，根据一些实施方案，根据本公开的分离在0℃和10℃之间的温度(即，在5℃+/-5℃的设定温度)下进行，优选地在2℃和8℃之间的温度(即，在5℃+/-3℃的设定温度)下进行。例如，可以通过将组件放置在冷室中来达到这样的温度。如果在根据本公开的方法中，组件连接到生物反应器，则生物反应器可以在与从流体中分离固体组分的温度不同的温度下操作。特别地，如果根据本公开的分离是通过将组件放置在冷室中在0℃和10℃之间或2℃和8℃之间的温度下进行的，生物反应器优选在较高温度(例如，37℃)下操作，因此不位于冷室中。
根据上述实施方案的板式沉降器和底部在PCT/EP2019/066009中公开，其全文并入本文。PCT/EP2019/066009中描述的板式沉降器和底部是根据本发明的“用于蛋白质分离的板式沉降器”和“用于细胞分离的板式沉降器”以及可以连接到这些板式沉降器的底部的优选实施方案。
在上述根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法中可以使用的板式沉降器/底部的描述中，当固体成分是沉淀的蛋白质时，板式沉降器是本发明的“用于蛋白质分离的板式沉降器”。因此，在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的一个优选实施方案中，“用于蛋白质分离的板式沉降器”是斜板式沉降器，其具有下部、上部和至少一个用于使蛋白质沉淀沉降的沉降通道，该沉降通道从下部延伸至上部。使用期间，斜板式沉降器被配置成定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸至上部；其中所述至少一个沉降通道连接到用于在所述上部排出剩余流体的流体出口。
对于蛋白质分离，特别优选用于蛋白质分离的板式沉降器包含相对长的沉降通道。因此，可以选择地，沉降通道的长度在20～150cm之间，优选在20～100cm之间，更优选20～80cm之间，更优选30～70cm，更优选40～60cm，最优选约50cm。
优选地，在上述根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的实施方案中，所述用于蛋白质分离的板式沉降器的至少一个沉降通道与底部连接，其中所述底部包括至少一个入口通道以及至少一个收集通道，所示至少一个入口通道用于将包含沉淀蛋白质的流体供应给板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从至少一个沉降通道下降的沉淀蛋白质；其中所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个沉降通道之间以及所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接。
优选地，在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的该实施方案中，连接到用于蛋白质分离的板式沉降器的底部还包括至少一个洗涤液供应通道，用于将洗涤液供应到一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离。
可选地，在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的该实施方案中，对应所述用于蛋白质分离的板式沉降器的同一沉降通道的所述至少一个洗涤液供应通道和所述至少一个收集通道通过由所述洗涤液供应通道和所述收集通道共用的壁部中的开口流体连接。
优选地，在上述根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的实施方案中，将包含蛋白质沉淀的流体通过至少一个入口通道供应到底部(其连接到用于蛋白质分离的板式沉降器)，并通过至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液；其中洗涤液的密度高于包含蛋白质沉淀的流体的密度；而且其中剩余流体通过上部的流体出口排出，沉降的沉淀蛋白通过收集通道排出。
优选地，在上述根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的实施方案中，洗涤液的密度比包含蛋白质沉淀的流体的密度高0.3‰～1.5‰，优选比包含蛋白质沉淀的流体的密度高0.55‰～1.20‰。
如上所述，与包含蛋白质沉淀的流体的密度相比，洗涤液的密度更高是为了提高所需分离过程的效率。还可以降低甚至避免洗涤液的损失，因为可以降低洗涤液意外地沿沉降通道向上输送(甚至可能通过顶端出口排出)的可能。因此，根据本公开，与包含蛋白质沉淀的流体的密度相比，洗涤液的密度更高是为了确保蛋白质沉淀能够沉降到洗涤液中并减少洗涤液与流体的混合。因此，在为本发明的方法选择洗涤液时，洗涤液的密度(而非组成)是决定性的。因此，原则上任何溶质都可以用来调节洗涤液的密度。本领域技术人员将很清楚可以添加到洗涤液中以调节其密度的合适物质。
优选用于上述根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的实施方案中，特别是当本发明的流体是细胞培养基时，示例性洗涤液包括Tris和氯化钠。例如，洗涤液可包含浓度约2mM的Tris和浓度约272mM的氯化钠。优选地，洗涤液还可包含氯化钙。在该实施方案中，洗涤液可包含浓度约2mM的Tris、浓度约231mM的氯化钠和浓度约12mM的氯化钙。不过，在该实施方案中，氯化钠和氯化钙的浓度可以改变，只要洗涤液的密度保持不变即可。如图43所示，氯化钠和氯化钙浓度的其他可能组合与2mM Tris混合出的密度等于包含约2mMTris和上述浓度的氯化钠和/或氯化钙的洗涤液的密度。因此，作为又一替代方案，根据本发明的洗涤液可以包含浓度约2mM的Tris，并且包含可从图43得出的任意(对应)浓度的氯化钠和/或氯化钙。因此，该实施方案的示例性洗涤液还包含约2mM的Tris、约4mM的氯化钙和约258mM的氯化钠，或约2mM的Tris、约8mM的氯化钙和约245mM的氯化钠。洗涤液的pH值可选，例如，考虑到沉淀物的稳定性，可以为7.5以上，优选8以上，最优选约8.25。
在连续操作中，让蛋白质沉淀沉降一段时间，再通过收集通道排出可能是有利的。因此，在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的一个实施方案中，洗涤液通过至少一个洗涤液供应通道以固定间隔供应，而沉降的蛋白质沉淀通过收集通道以固定间隔排出。这些固定间隔可以在15～45分钟之间，但优选约30分钟。通过至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液以及通过收集通道排出沉降的蛋白质沉淀的体积流量可以为约20～60mL/min，优选约40mL/min。
在上述根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法中可以使用的板式沉降器/底部的描述中，当固体成分是细胞时，板式沉降器是本发明的“用于细胞分离的板式沉降器”。因此，在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的一个优选实施方案中，“用于细胞分离的板式沉降器”是斜板式沉降器，其具有下部、上部和至少一个用于使细胞沉降的沉降通道，该沉降通道从下部延伸至上部。使用期间，斜板式沉降器被配置成定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸至上部；其中所述至少一个沉降通道连接到用于在所述上部排出剩余流体的流体出口。
优选地，在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的该实施方案中，用于细胞分离的板式沉降器的至少一个沉降通道与底部连接，其中该底部包括至少一个入口通道以及至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含细胞和蛋白质的流体供应给板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从至少一个沉降通道下降的沉降细胞；其中所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个沉降通道之间以及所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接。
优选地，在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的该实施方案中，连接到用于细胞分离的板式沉降器的底部还包括至少一个洗涤液供应通道，用于将洗涤液供应到一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离。
可选地，在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的该实施方案中，对应所述用于细胞分离的板式沉降器的同一沉降通道的所述至少一个洗涤液供应通道和所述至少一个收集通道通过由所述洗涤液供应通道和所述收集通道共用的壁部中的开口流体连接。
优选地，在上述根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的实施方案中，将包含细胞和蛋白质的流体通过至少一个入口通道供应到底部(其连接到用于细胞分离的板式沉降器)，并通过至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液；其中洗涤液的密度高于包含细胞和蛋白质的流体的密度；而且其中沉降的细胞通过收集通道排出，包含蛋白质的剩余流体通过上部的流体出口排出。随后通过根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法中的其他步骤，例如蛋白质沉淀步骤和蛋白质分离步骤，对包含蛋白质的(剩余)流体进一步处理。
如上所述，与包含细胞和蛋白质的流体的密度相比，洗涤液的密度更高是为了提高所需分离过程的效率，还可以降低甚至避免洗涤液的损失，因为可以降低洗涤液意外地沿沉降通道向上输送(甚至可能通过顶端出口排出)的可能。因此，根据本公开，与包含细胞和蛋白质的流体的密度相比，洗涤液的密度更高是为了确保细胞能够沉降到洗涤液中并减少洗涤液与流体的混合。因此，在为本发明的方法选择洗涤液时，洗涤液的密度(而非组成)是决定性的。因此，原则上任何溶质都可以用来调节洗涤液的密度。本领域技术人员将很清楚可以添加到洗涤液中以调节其密度的合适物质。
在连续操作中，让细胞沉降一段时间，再通过收集通道排出可能是有利的。因此，在根据本发明的方法的一个实施方案中，洗涤液通过至少一个洗涤液供应通道以固定间隔供应，而沉降的细胞通过收集通道以固定间隔排出。这些固定间隔可以在5～90分钟、15～85分钟、25～80分钟、35～75分钟、45～70分钟、55～65分钟之间，优选约60分钟。通过至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液以及通过收集通道排出沉降细胞的体积流量可以为约50～70mL/min，优选约60mL/min。
在根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法的一个实施方案中，该方法还包括在蛋白质分离步骤之后将蛋白质沉淀重新溶解的再溶解步骤。优选地，在再溶解步骤中，使用柠檬酸盐或EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。尽管在本发明之前，EDTA已经被排除作为再溶解的潜在候选物，因为其对钙的高络合能力被认为对蛋白质(例如凝血因子VIII)的活性有害，但本发明人惊奇地发现EDTA并不显著影响蛋白质(例如凝血因子VIII)的活性，因此适用于根据本发明的再溶解。此外，本发明人发现EDTA在重新溶解磷酸钙沉淀物方面比柠檬酸盐更有效。因此，在本发明的一个特别优选的实施方案中，使用EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。这种重新溶解可以使用终浓度为10mM～50mM、优选20mM～30mM、最优选约25mM的EDTA进行。
在根据本发明从流体中连续回收蛋白质的方法的一个实施方案中，再溶解步骤在0～8℃、优选2～8℃的温度下进行。
生物制药药物的商业重要性与日俱增。许多生物制药药物为蛋白质。这些蛋白质生物药通常在流体中生产，因此在它们可以配制成药品组合物之前需要进行回收。因此，在根据本发明的从流体连续回收蛋白质的方法的优选实施方案中，待回收的蛋白质是生物制药药物。根据本发明的此类生物制药药物不受特别限制，只要该生物药为蛋白质即可。根据本发明的生物药包括重组生物药和其他来源的生物药，例如从(人)血浆获得的生物制药药物，但本发明优选的生物制药药物是重组生物制药药物。根据本发明的生物制药药物包括但不限于血液因子、免疫球蛋白、替代酶、生长因子及其受体和激素。优选的血液因子包括凝血因子I(纤维蛋白原)、凝血因子II(凝血酶原)、组织因子、凝血因子V、凝血因子VII和凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、凝血因子XIII、血管性血友病因子(vWF)、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活剂抑制剂-1(PAI1)和纤溶酶原激活剂抑制剂-2(PAI2)。优选的免疫球蛋白包括来自人血浆的免疫球蛋白、单克隆抗体和重组抗体。根据本发明的生物制药药物可以包括功能性多肽变体。根据本发明的生物制药药物优选的是个别人的蛋白或人的重组蛋白(或其功能变体)。
通过根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法回收本发明的生物制药药物后，可以将生物制药药物配制成药品组合物。因此，本发明还涉及一种制备药品组合物的方法，包括实施根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法，随后将回收的生物制药药物配制成药物组合物。这样的药品组合物可以根据用于制备药品组合物的已知标准来制备。例如，组合物可以通过适合储存和实施的方式制备，例如通过使用药学上可接受的成分，例如载体、辅料或稳定剂。当将药品组合物施用于患者时，此类药学上可接受的成分在用量上应是无毒的。
本发明提供了一种从流体中连续回收蛋白质的方法，其中该蛋白质可以是生物制药药物，以及一种制备药品组合物的方法。因此，本发明还涉及可通过根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法获得的回收蛋白质，包括可通过用于连续回收蛋白质的方法获得的生物制药药物，而且本发明还涉及一种药品组合物，该药品组合物可通过根据本发明的制备药品组合物的方法获得。
在上述从流体中连续回收蛋白质的方法中，特别有利的是，板式沉降器包括至少一个用于使蛋白质沉淀沉降的沉降通道，且该沉降通道相对较长。因此，本发明还提供了一种板式沉降器，其包括具有该长度的沉降通道。因此，本发明还涉及用于从流体中分离固体成分(例如，沉淀的蛋白质，优选包含凝血因子(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的沉淀的蛋白质复合物)的斜板式沉降器，其中板式沉降器包括下部、上部，以及至少一个用于使固体成分(例如，沉淀的蛋白质，优选包含凝血因子(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的沉淀的蛋白质复合物)沉降的沉降通道，所述沉降通道从下部延伸到上部；在使用中板式沉降器被配置成定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸至上部；其中所述至少一个沉降通道在上部连接至用于排出剩余流体的流体出口并且在下部连接至底部；其中，所述底部包括至少一个入口通道以及至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含待分离的固体成分的流体供应至所述板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从所述至少一个沉降通道下降的沉降成分；其中所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个沉降通道之间以及所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接；其中底部还包括至少一个洗涤液供应通道，用于将洗涤液供应到一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤流体供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离；而且其中沉降通道的长度在20～150cm之间，优选在20～100cm之间，更优选20～80cm，更优选30～70cm，更优选40～60cm，最优选约50cm。在一个优选的实施方案中，斜板式沉降器含有沉淀的蛋白质复合物，该蛋白质复合物包含凝血因子(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)。
下面，将通过实施例阐述本发明，但不仅限于此。
实施例
实施例1～6：概述
在该实施例1～6中，根据本公开的底部的实施方案(以及，更一般地，根据本公开的组件的实施方案)被应用于从动物细胞培养基悬浮液中分离动物细胞，而且用于从其流动相中分离沉淀的固体。
在实施例1～3中，连续培养表达重组凝血因子VIII(FVIII)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中CHO细胞培养温度为37℃。平均而言，细胞培养基的起始浊度为46.6FNU。生物反应器出口直接连接到具有斜板式沉降器的组件的底部入口，如图2所示。在这些实施例中，斜板式沉降器相对于垂直于水平方向的垂直方向(重力方向)的倾斜角度α'＝30°，因此相对于水平方向的夹角为60°。斜板式沉降器由不锈钢制成，与工艺流体接触的表面被电抛光至Ra<0.6μm。组件的内部滞留体积为803mL。沉降部分被分成四个沉降通道，即沉降板(类似图2中的(21))，这些沉降板在实施例1和2中由不锈钢制成的分隔壁(图2中的(25))隔开以及在实施例3中由PMMA制成的分隔壁(图2中的(25))隔开。将洗涤液供应到底部并与底部一起使用。洗涤液由14g/L氯化钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1.15g/L磷酸二氢钠组成，pH值为7。
细胞培养液从生物反应器连续输送到组件。从组件的顶部出口连续收集澄清的流体，即除去了细胞的流体。以60分钟的固定间隔从底部的收集通道收集分离的固体。从底部的固体收集通道收集分离的固体是通过洗涤液泵和固体收集泵的同时运行来进行的，其体积流量分别为62mL/min和60mL/min。细胞收集或一般固体收集的间隔根据细胞培养液中的细胞计数(即固体载荷)进行优化。通常，细胞收集或固体收集的流量根据固体的特性进行优化，例如细胞可能有粘附在表面上的可能，此举是为了避免固体沉淀滞留在底部的收集通道内。
以固定间隔从生物反应器和排出组件的流体中取样进行分析。使用商业葡萄糖分析仪(stat profile prime device，nova biomedical)测定液相中的葡萄糖浓度。产物(FVIII)浓度通过Chromogenix
Figure BDA0003785012270000501
SP4 Factor VIII kit利用显色测定法测定。显色测定可以测量FVIII辅因子的活性，其可以在磷脂和钙存在的情况下，与凝血因子IXa一起将凝血因子X活化为凝血因子Xa。活化的FXa水解显色底物(S-2765)，释放显色基团pNA，其吸光度可在405nm处测量。在测定FX的活化和显色物质产生的条件下，pNA仅取决于FVIII的含量(参见Peyvandi，F.，Oldenburg，J.&Friedman，K.D.:A critical appraisal of one-stage and chromogenic assays of factor VIII activity；Journal of thrombosisand haemostasis:JTH 14，248-261(2016))。对从组件顶部和底部收集的流体中的葡萄糖和FVIII等分析物进行浓度分析是用于建立质量平衡，使在一定时间内回收的分析物的量与同一时期生物反应器中产生/存在的量相关联。使用便携式浊度计Hach 2100Q通过浊度测量评估细胞去除率。浊度计测量样品在圆形比色皿(直径25mm，高60mm)中相对入射光方向成90°的散射光，其光源为发光二极管。
实施例1针对“用于连接到具有板式沉降器的组件的底部，以及具有板式沉降器的组件”(具有附加流体回路的CHO细胞分离)
斜板式沉降器通过连接到低温恒化器的双层夹套冷却，低温恒化器设置为4℃。双层夹套和低温恒化器在图14中由带有泵的虚线表示。底部没有冷却。将装有洗涤液的一次性袋子放在湿冰中进行温度控制，从而产生约0℃的温度。使用这种温度控制模式进行了两次运行，分别持续了49和90个小时。
为了显示根据本公开的斜板式沉降器的底部允许以最小的产物损失从包含产物的流体中分离细胞，对葡萄糖和FVIII的浓度进行了测量。在底部，细胞沉降到供应的洗涤液中，而培养液的全部液体部分从顶部出口收集。洗涤缓冲液的密度必须高于培养液的液体部分，且密度必须低于固体，如此，细胞才可以沉降到洗涤缓冲液中，并实现洗涤液与培养液混合的最小化。在给出的实施例中，给定的洗涤缓冲液就是这种情况。细胞可以成功去除，同时可以在顶部出口以高产率收集包含流体部分的产物。FVIII和葡萄糖的产率的数据绘制在图15和图16中，数值在表1和表2中。作为细胞去除量度的浊度可以在表1中找到。在实施例1的条件下，可以使用葡萄糖作为产物(FVIII)的指示剂，因为葡萄糖不被这些细胞代谢。
表1：产物(FVIII)的产率以在实施例1中在组件的底部和顶部出口处收集的流体部分中存在的量的百分比给出，浊度(以FNU为单位)在实施例1中在顶部出口处收集的流体中测量。含培养液的细胞的平均浊度为46.6FNU。LOD＝检测限；0.2。
Figure BDA0003785012270000511
表2：葡萄糖产率以在实施例1中的组件的底部和顶部出口处收集的流体部分中存在的量的百分比表示。n.d＝未测定。
Figure BDA0003785012270000521
实施例2针对“用于连接到具有板式沉降器的组件的底部，以及具有板式沉降器的组件”(无需额外流体回路的CHO细胞分离)
在实施例2中，斜板式沉降器与底部的组件，包括所有供应和接收容器(生物反应器除外)，设置在温度为2～8℃的冷室中。图17示意性地描绘了该装置。斜板式沉降器和底部与实施例1相同。在这些条件下运行了一次，持续70小时。为了显示根据本公开的斜板式沉降器的底部允许以最小的产物损失从含有产物的液体中分离细胞，测量了葡萄糖和FVIII的浓度。在底部，细胞沉降到供应的洗涤液中，而培养液的全部液体部分从顶部出口收集。洗涤缓冲液的密度必须高于培养液的液体部分，且密度必须低于固体，如此，细胞才可以沉降到洗涤缓冲液中，并实现洗涤液与培养液混合的最小化。在给出的实施例中，给定的洗涤缓冲液就是这种情况。细胞可以成功去除，同时可以在顶部出口以高产率收集包含流体部分的产物。实施例2中获得的FVIII和葡萄糖的产率的数据绘制在图18中，产物(FVIII)的产率值在表3中，作为细胞去除量度的在顶部出口收集的样品中测量的葡萄糖产率和浊度值见表4。浊度数据表明，与通过双层夹套冷却相比(如实施例1中所述)，当斜板式沉降器和底部设置在冷室中时，细胞去除更有效且随时间推移更稳定。
表3：产物(FVIII)的产率以在实施例2中在组件的底部和顶部出口处收集的流体部分中存在的量的百分比给出。
Figure BDA0003785012270000531
表4：葡萄糖的产率以在实施例2中在组件的底部和顶部出口处收集的流体部分中存在的量的百分比给出，浊度(以FNU为单位)在实施例2中在顶部出口处收集的流体中测量。含有培养液的细胞的平均浊度为46.6FNU。
Figure BDA0003785012270000532
实施例3针对“用于连接到具有板式沉降器的组件的底部，以及具有板式沉降器的组件”(用PMMA物理屏障进行CHO细胞分离)
在实施例3中，斜板式沉降器与底部的组件，包括所有供应和接收容器(生物反应器除外)，设置在温度为2～8℃的冷室中。图17示意性地描绘了该装置。斜板式沉降器由不锈钢制成，与工艺流体接触的表面被电抛光至Ra<0.6μm。沉降部分被分成四个沉降通道，即沉降板(类似图2中的(21))，这些沉降板由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成的分隔壁(图2中的(25))隔开。使用此设置运行了一次，持续94小时。为了显示根据本公开的斜板式沉降器的底部允许以最小的产物损失从含有产物的液体中分离细胞，测量了葡萄糖和FVIII的浓度。在底部，细胞沉降到供应的洗涤液中，而培养液的全部液体部分从顶部出口收集。洗涤缓冲液的密度必须高于培养液的液体部分，且密度必须低于固体，如此，细胞才可以沉降到洗涤缓冲液中，并实现洗涤液与培养液混合的最小化。在给出的实施例中，给定的洗涤缓冲液就是这种情况。细胞可以成功去除，同时可以在顶部出口以高产率收集包含流体部分的产物。实施例3中获得的FVIII和葡萄糖的产率的数据绘制在图19中，产物(FVIII)的产率值在表5中，作为细胞去除量度的在顶部出口收集的样品中测量的葡萄糖产率和浊度值见表6。浊度数据表明，与通过双层夹套冷却相比(如实施例1中所述)，当斜板式沉降器和底部设置在冷室中时，细胞去除更有效且随时间推移更稳定。实施例2(不锈钢)和实施例3(PMMA)的分隔壁材料在分离性能方面(基于现有数据)没有差异。
表5：产物(FVIII)的产率以实施例3中在组件的底部和顶部出口处收集的流体中存在的量的百分比给出。LOD＝检测限；0.2IU/mL。
Figure BDA0003785012270000541
表6：葡萄糖的产率以实施例3中在组件的底部和顶部出口处收集的流体中存在的量的百分比给出，浊度(以FNU为单位)在实施例3中在顶部出口处收集的流体中测量。
Figure BDA0003785012270000542
实施例4针对“用于连接到具有板式沉降器的组件的底部，以及具有板式沉降器的组件”(向底部供应和收集工艺流以实现原位清洁)
实施例4涉及一种具有板式沉降器的底部的组件的实施方案，该组件包括与供应容器和接收容器的可切换连接。连接到容器的斜板式沉降器和底部被组装成一个“封闭系统”。使用的容器是多用途玻璃器皿，使用前经高压灭菌。连接元件由硅胶和c-flex软管、鲁尔管和金属接头组成。硅胶管和鲁尔接头一次性使用。但是，所有容器和连接元件也可以是(1)一次性使用和(2)预组装的。在默认状态下，位于底部的三通阀设置为在容器[1]、[2]和[4]以及组件之间建立直接的流体连接。为了实现原位清洁(Cleaning in Place，CIP)，将1M氢氧化钠溶液从供应容器(图20中的[1])泵入板式沉降器和底部的组件中。用1M氢氧化钠完全装满组件并冲洗采样阀(标有+)。用1M氢氧化钠浸泡组件至少15分钟。在浸泡之后，底部的三通阀切换，从而在组件和接收容器(图20中的[3])之间建立直接的流体连接。通过重力流将1M氢氧化钠溶液排入接收容器。在从组件中排出流体的过程中，通过接收容器[6]接收流入的气流。当组件排空时，三通阀切换回原位，在容器[1]、[2]、[4]与组件之间建立直接流体连接，组件可以重新填充。使用缓冲水溶液(例如8g/L氯化钠、0.2g/L磷酸二氢钾、1.15g/L磷酸二氢钠，pH 7)，重复至少两次填充和排放步骤，包括冲洗取样阀。CIP步骤的完整性通过对采自取样阀的样品进行pH测量来确认，其中可接受的pH值小于7.2。
实施例5针对“用于连接到具有板式沉降器的组件的底部，以及具有板式沉降器的组件”(在氨基酸存在下以不同的收集流量分离沉淀的固体)。
在实施例5中，将沉淀悬浮液分离成其固体部分(即沉淀物)及其流体部分(即沉淀上清液)。通过添加由10mM三(羟甲基)氨基甲烷、100mM氯化钠和具有2.7mM磷酸根离子以及15mM钙离子的pH值为8.5的100mg/mL色氨酸组成的水溶液来产生沉淀悬浮液。形成的固体相是非化学计量的磷酸钙。沉淀悬浮液直接连续输送至与斜板式沉降器组合的底部的入口。在这些实施例中，斜板式沉降器从垂直方向倾斜角度α’＝30°，即相对于水平方向(重力方向)倾斜角度α＝60°。斜板式沉降器由不锈钢制成，与工艺流体接触的表面经过电抛光至Ra<0.6μm。由底部和具有单个沉降通道的斜板式沉降器组成的内部滞留体积为630mL。洗涤液供应至底部并与底部一同使用。洗涤液是含有2mM三(羟甲基)氨基甲烷、252mM氯化钠和6mM氯化钙的水溶液。洗涤液密度必须高于沉淀悬浮液中的液体密度并低于悬浮固体的密度，以使固体从最初悬浮的液体中沉降到底部供应的洗涤缓冲液中。对于本实施例中的沉淀悬浮液和洗涤液，其密度符合该标准。
在组件运行中，从组件的顶部出口连续收集除去了固体的流体。以15分钟的固定时间间隔从底部的收集通道收集分离的固体。固体收集是通过洗涤液和固体收集泵以20、40和60mL/min的体积流量同时运行来实现的。
为了证明悬浮固体(即沉淀)的分离和洗涤的成功，在沉淀悬浮液中添加了示踪剂，即色氨酸。将最初包含在沉淀悬浮液中的流体部分转移到洗涤液中，因此可以通过基于色氨酸在280nm处的最大吸光度测量吸光度来监测收集的固体。待测量的样品取自每个固体收集周期后排出组件的流体。绘制于图21中(也可见于表7)的数据显示了在所测试的整个收集流量范围内，悬浮在洗涤液中的收集固体中的色氨酸的产率很低。洗涤液中色氨酸的低产率对应包含待分离固体的流体的低残留率。因此，在收集的固体部分存在最大部分的流体是洗涤缓冲液，这证明了沉淀洗涤的有效性。
表7：含有悬浮在不同收集流量下获得的洗涤液中的收集固体(即沉淀物)的级分中色氨酸的产率值。色氨酸最初包含在沉淀悬浮液中。排放部分的体积为40mL，与排放体积流量无关。
Figure BDA0003785012270000561
实施例6针对“用于连接到具有板式沉降器的组件的底部，以及具有板式沉降器的组件”(在着色剂存在下以不同的收集流量分离沉淀物)
在实施例6中，将沉淀悬浮液分离成其固体部分(即沉淀物)及其流体部分(即沉淀上清液)。通过添加由10mM三(羟甲基)氨基甲烷和具有2.7mM磷酸根离子以及15mM钙离子的pH值为8.5的100mM氯化钠组成的水溶液来产生沉淀悬浮液。沉淀悬浮液直接连续输送至与斜板式沉降器组合的底部的入口。在这些实施例中，斜板式沉降器从垂直方向倾斜角度α’＝30°。斜板式沉降器由不锈钢制成，与工艺流体接触的表面经过电抛光至Ra<0.6μm。由底部和具有单个沉降通道的斜板式沉降器组成的内部滞留体积为630mL。洗涤液供应至底部并与底部一同使用。洗涤液是含有2mM三(羟甲基)氨基甲烷、252mM氯化钠、6mM氯化钙和25mg/L专利蓝V的水溶液，在620nm处有最大吸光度。洗涤液密度必须高于沉淀悬浮液中的液体密度并低于悬浮固体的密度，以使固体从最初悬浮的液体中沉降到底部供应的洗涤缓冲液中。对于本实施例中的沉淀悬浮液和洗涤液，其密度符合该标准。
在组件运行中，从组件的顶部出口连续收集除去了固体的流体。以15分钟的固定时间间隔从底部的收集通道收集分离的固体。固体收集是通过洗涤液和固体收集泵以20、40和60mL/min的体积流量同时运行来实现的。
为了证明悬浮固体(即沉淀物)的分离和洗涤成功，在洗涤液中添加了一种示踪剂，即专利蓝V。将最初包含在沉淀悬浮液中的流体部分转移到洗涤液中，因此可以通过基于专利蓝V在620nm处的最大吸光度测量吸光度来监测收集的固体。用于分析的样品取自每个固体收集周期后排出组件的流体。绘制于图22中(也可见于表8)的数据显示了悬浮在洗涤液中的收集固体中的专利蓝V的高产率。此处，低产率对应包含待分离固体的流体的高残留率。因此，高产率值表明沉淀物与沉淀悬浮液的成功分离和收集的沉淀物的有效洗涤。
表8：含有悬浮在不同收集流量下获得的洗涤液中的收集固体中专利蓝V的产率值。专利蓝V最初包含在洗涤液中。排放部分的体积为40mL，与排放体积流量无关。
Figure BDA0003785012270000571
Figure BDA0003785012270000581
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以对所公开的设备和系统进行各种修改和变形。通过考虑本说明书和本文公开的特征的实践，本公开的其他方面对于本领域技术人员也将是显而易见的。本文旨在将说明书和实施例仅视为示例性的。许多额外的变形和修改是可能的并且被理解为落入本公开的框架内。
实施例7～10：概述
下列材料和方法应用于实施例7～10：
材料
细胞培养上清液
来自分泌rFVIII(octocog alfa)和rvWF(vonicog alfa)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的澄清的CHO细胞培养上清液由Baxalta Innovations GmbH(Orth/Donau，奥地利)提供。通过深度过滤和膜过滤的组合实现细胞的去除和澄清。将细胞培养上清液储存在<-60℃。每当需要时，将等分试剂在2～8℃水浴过夜解冻。
化学品
人血清蛋白、冰醋酸、BIS-Tris、CaCl2·2H2O、钙比色试剂盒、HEPES、兔血清、柠檬酸三钠、Tween 80以及4-羟基-4-甲基-2-戊酮购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO，美国)。DPBS和凝胶电泳用品购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，美国)。分析级NaOH、柠檬酸盐一水合物、二氯甲烷、Na2HPO4、NaCl、PEG10000、PEG20000、
Figure BDA0003785012270000591
磷酸盐测试、三(羟甲基)-氨基甲烷和
Figure BDA0003785012270000592
III来自Merck(Darmstadt，Germany)。PEG2000、4000、6000和8000购自Fluka Chemie GmbH。Chromogenix Coatest SP4 VIII试剂盒购自Coachrom Diagnostica GmbH(Maria Enzersdorf，奥地利)。vWF ELISA抗体购自AgilentTechnologies(Santa Clara，CA，美国)和Szabo Scandic HandelsgmbH&Co KG(Vienna，奥地利)，分别用于包被和检测。CHO HCP ELISA的所有抗体均购自Cygnus Technologies(Southport，NC，美国)。ELISA的检测底物，TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒，购自BIORadLaboratories Inc.(Hercules，CA，美国)。CHT I和II树脂样品由BIORad LaboratoriesInc.提供。rFVIII原料药(BDS)和rFVIII标准物质，以及rvWF原料药和rvWF标准物质由Baxalta Innovations GmbH提供。
基于丙烯酸玻璃的原型设备
不同厚度的丙烯酸玻璃板购自Evonik Industries AG(Essen Germany)。用Speedy400激光切割机(Trotec Laser GmbH，Marchtrenk，奥地利)从板上切割出用于组装的零件，并用70％二氯甲烷、20％冰醋酸、10％4-羟基-4-甲基-2-戊酮和，或胶水Acryfix192的混合物粘合。
实验室器具
微量滴定板购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA，美国)。15和50mL反应管来自Greiner AG(Kremsmünster，奥地利)，2mL安全锁管来自Eppendorf AG(德国汉堡)以及1.5mL反应管来自Sarstedt(Biedermannsdorf，奥地利)。
用于连续沉淀的原型装置
原型装置由泵(Px)组成，泵(Px)为第一个称为“缓冲罐”的容器供应进料流，该容器配备有顶置式搅拌器(向上倾斜的叶片叶轮，直径38mm)，以约150rpm的速度运行。第二个泵(P5)确保流体通过管式反应器从缓冲罐流向50mL玻璃容器，称为“CSTR”，配备顶部搅拌器(向上倾斜的叶片叶轮，直径25mm)，以约150rpm的速度运行。工艺流体从CSTR输送到收集容器或原型斜板式沉降器(泵P8)。钙和磷酸盐储备溶液的添加点位于P5和TR之间。添加原料由注射泵(P6和P7)操作运行。将两个玻璃器皿置于秤上。下面给出了所用设备的完整列表(表9)。除了管式反应器外，管子是1.5mm ID硅胶管(Reichelt Chemietechnik GmbH+Co.)。使用鲁尔(Luer)接头(Cole Parmer)连接各个独立管道。使用自定义编程的LabVIEW(v2018)控制沉淀。
表9：用于连续沉淀的原型机的部分安装设备清单。
Figure BDA0003785012270000601
斜板式沉降器原型
实验室规模的原型斜板式沉降器由不锈钢的沉降部分和3D打印的底部以及定制的丙烯酸玻璃顶部流体收集器组成。由一块板组成并配备了NED 605振动电机(NetterGmbH，Mainz-Kastel，德国)。表10列出了板式沉降器的测量参数。洗涤泵是SP270 EC-BL-L12V隔膜泵(Schwarzer Precision)。污泥泵是配备Easy-Load II泵头的Masterflex L/S(Cole Parmer，Vernon Hills，IL，美国)。沉降器原型配备了具有电磁擦拭功能的定制浊度传感器。该原型通过在National Instruments LabVIEW(v2018)中编程的自定义软件工具进行控制。NI外围设备与表9中列出的设备相同。
表10：斜板式沉降器原型测量值和数据。
总体积[mL] 630
总接收部体积[mL] 44.5
接收部可用体积[mL] 22.3
板宽(长*宽*高)[mm*mm*mm] 50*24*500
倾斜角度[°] 60
底部有8个洗涤剂出口，它们在板的整个宽度(即5厘米)上等距分布。板的长度为50厘米，用于分离沉淀物的宽度为5厘米，但(与表10相反)用于分离细胞的宽度为5.5厘米。没有跨越底部深度的突出结构。悬浮液通过8个进料口供应，这些进料口也在底部的最顶部等距分布。
方法
聚乙二醇(PEG)沉淀
不同分子量(2.000～20.000Da)的PEG用于从CCSN沉淀FVIII:vWF。所有实验均在4℃下使用15mL Greiner管进行。PEG储备溶液在50mM HEPES、pH7.5中制备，PEG 2000、4000、6000和8000的最终浓度为50％(w/v)，PEG 10000和20000的最终浓度为40％(w/v)。在过夜孵育期间，通过以3rpm的速度上下颠倒混合样品。使用Heraeus Multifuge X3 FR外摆转子离心机(Thermo Fisher，Waltham，MA，美国)在4000rcf、4℃下离心1小时形成沉淀物。
PEG沉淀-PEG尺寸筛选
将总体积为5mL的添加剂(PEG储备溶液和缓冲液)与等体积的CCSN混合至最终浓度为5、12和19％PEG。将沉淀物溶解在pH 7.5的5mL 50mM HEPES(含有100mM NaCl)中，通过24小时的上下颠倒混合。沉淀效率通过SDS-PAGE评估。
PEG沉淀-PEG沉淀曲线
使用了PEG 6000、8000、10000和PEG 20000。总体积为10mL，由6.5mL CCSN和3.5mL添加剂组成。测试了4～14％(w/v)的最终PEG浓度。分离后，将沉淀物溶解在3.25mL 15mMTris、pH 7.5的600mM NaCl中。使用基于高通量BLI的方法对溶解的沉淀物中的FVIII浓度进行量化。
CCSN的滴定
使用0.1M HCl或0.1M NaOH滴定细胞培养上清液(CCSN)。滴定在250mL Nalgene瓶中进行，磁力搅拌(～100rpm)，温度为2～8℃。样品在pH 6～8.5或6～9.25下以0.25或0.5单位的增量取样，并以此pH值孵育1小时。通过将样品稀释在分别用于FVIII和vWF:AgELISA定量的测定缓冲液中进行中和。CCSN的滴定无修正，并加入16g/100g含有20.6％(w/w)NaCl和4.14％(w/w)CaCl2的溶液。
磷酸钙分批沉淀
在进行和不进行pH调节的情况下，通过在室温(RT)下添加pH 7.75的2M Tris至最终浓度为50mM或0.25M NaOH，使用解冻的CCSN进行分批沉淀。钙和磷酸盐分别作为4或5M和0.2或0.4M的储备溶液添加。除非另有说明，否则通过上下颠倒进行混合。沉淀物过夜沉降。除去澄清的沉淀上清液，并通过逐渐添加pH 6.5或pH 7.0的1M柠檬酸盐缓冲液来溶解沉降的沉淀，直至沉淀完全溶解。通过目测确定溶解的完全性。
磷酸钙分批沉淀-磷酸钙沉淀洗涤
所用洗涤缓冲液及其室温(RT)(约22℃)下设定的pH值罗列在表11中。缓冲液在2～8℃中使用。洗涤缓冲液B7～B10用于洗涤50mL玻璃分液漏斗中的沉淀物。从顶部添加沉淀物，然后使用蠕动泵产生的低流量从底部供应洗涤缓冲液。使沉淀物沉降到洗涤缓冲液中需约1.5h。通过底部出口收集沉淀悬浮液。溶解的沉淀样品储存于<-60℃直到分析。一式三份测试包括没有添加洗涤缓冲液的参考样品的每种洗涤条件。
表11：从CCSN沉淀后用于洗涤磷酸钙沉淀的缓冲液列表。B7～B10缓冲液用于分液漏斗的洗涤，重点是产率和相同的洗涤缓冲液密度。
Figure BDA0003785012270000631
磷酸钙分批沉淀-沉淀动力学研究
使用配备100mL EasyMax玻璃反应器的EasyMax102合成工作站进行沉淀动力学研究。使用25mm直径的向上倾斜的叶片的叶轮以100rpm进行混合。使用2M Tris(最终pH 8.5)或1M NaOH(最终pH 8.95)实现pH调节。实验在4℃下通过EasyMax102工作站进行温度控制。钙的目标浓度为15mM，磷酸盐的目标浓度为2mM。在添加磷酸盐原料后1～60分钟取样。使用5415R台式离心机(Eppendorf AG，Hamburg，Germany)将所有样品即时离心1min，4000rcf，4℃。分析沉淀上清液中是否存在vWF和FVIII。
磷酸钙分批沉淀-沉淀动力学研究-混合研究
使用不同尺寸的向上倾斜的叶片叶轮在下列反应器中进行混合研究。叶轮直径分别为25mm和38mm。在50～500rpm范围内测试搅拌器的速度。反应器由70mL H2O充满。加入0.35mL 5M CaCl2脉冲，并使用电导传感器监测混合。
磷酸钙分批沉淀-FVIII:vWF与磷酸钙表面的结合研究
将CCSN(25mL)转移到50mL玻璃烧杯中并添加异位形成的沉淀物和CHT树脂(表12)。参考样品是原位沉淀。pH通过添加Tris(终浓度50mM)来调节。将CHT树脂孵育的CCSN与4.5mM磷酸盐混合。将样品与磷酸钙一起孵育约7h(由磁力搅拌器持续混合，约150rpm，2～8℃)。
表12：与CCSN一起孵育的磷酸钙沉淀物和树脂，包括用于沉淀的基质和缓冲液。
磷酸钙表面 类型[-] 基质 pH调节剂 洗脱缓冲液
原位形成 沉淀物 CCSN Tris 1.2M柠檬酸盐，pH 7.5
原位形成 沉淀物 CCSN Tris 3.5M氯化钠，0.3M氯化钙
异位形成 沉淀物 CCSN Tris 1.2M柠檬酸盐，pH 7.5
Figure BDA0003785012270000641
用与磷酸钙连续沉淀的反应器设置
通过在表13中列出的反应器的设置中，以9分钟的平均滞留时间添加2mM Na2HPO4和15mM氯化钙，从50mM Tris缓冲液或CCSN中连续沉淀磷酸钙。CSTR是配备100mL玻璃反应容器的EasyMax102，该反应容器配备38mm直径的斜向上叶轮，以100rpm运行。管式反应器由具有静态混合器的4.8mm内径管组成。使用蠕动泵(Ismatec RegloDigital，1.85mm ID管，ColeParmer，Vernon Hills，IL，美国)操作进料和收获流，即流入和流出反应器。
表13：用于磷酸钙连续沉淀的反应器设置，包括反应器容积和相应的体积流量。
反应器 反应器容积[mL] 体积流量速率[mL/min]
CSTR 90 10
TR 91.9 10.2
TR+CSTR 105.3 11.7
用于磷酸钙连续沉淀的反应器设置-连续反应器中的示踪步骤实验使用H2O和1MNaCl或在50mM Tris和澄清的沉淀上清液中形成的磷酸钙沉淀进行实验。测试反应器已在上述部分描述。通过在反应器中或在反应器出口处的定制流通池中测量电导率来监测NaCl浓度。使用定制的浊度传感器测量磷酸钙絮状物的浓度。示踪剂的浓度以实验结束时达到的浓度进行归一化。通过归一化的示踪剂数据衍生获得停留时间的分布。
磷酸钙连续沉淀的反应器设置-沉降速度的测定
对于混合时间为3、9和45分钟的分批实验和连续沉淀实验(平均停留时间为9分钟)确定沉降速度。CSTR中的连续沉淀由分批沉淀和连续沉淀方法开始。对于分批开始，反应器充满磷酸盐补充缓冲液，并在开始连续沉淀之前加入钙。对于连续启动的实验，反应器最初是空的，缓冲液和钙原料均以连续模式投料。使用由100mL玻璃量筒制成的定制设备监测沉降，该设备配备基于光电二极管发射器和检测器的光学传感器(参见图23)。将样品(50mL)转移到量筒中并监测浊度30分钟。每个实验至少平行三次。
磷酸钙的连续沉淀
使用无蛋白质模型系统(50mM Tris缓冲液，pH 8.5)和解冻的CCSN进行初步的连续沉淀实验。钙和磷酸盐的浓度分别为15mM和2mM。添加磷酸盐和将pH调节至pH 9.0是分批进行的，而钙的添加是以连续模式进行的。对于CCSN的实验，一开始CSTR是空的，而管道和TR填充有缓冲液(50mM Tris缓冲液，pH 8.5，2mM磷酸盐)。在反应器出口以0.5个反应器体积间隔收集样品，在实验结束时间隔更短。使沉淀悬浮液沉降并除去上清液。通过逐渐添加pH 7.5的1.2M柠檬酸盐，使溶解沉淀。
磷酸钙的自动连续沉淀
使用上述材料部分中“连续沉淀的原型设置”中描述的原型设置进行自动连续沉淀。硬件由在National Instruments LabView中编程的定制软件工具补充。连续沉淀的起始材料是10mM Tris，pH 7.4，含100mM NaCl或CCSN。缓冲液实验在室温下进行；CCSN的实验在2～8℃下进行。钙的目标浓度为14.88mM(储存浓度4000mM)。无蛋白缓冲液的磷酸盐目标浓度为2.68mM，CCSN的磷酸盐目标浓度为1.98mM(储存浓度200mM)。通过添加0.5M pH 7.0的柠檬酸盐原液溶解沉淀。在每次使用CCSN进行实验之前，都要校准pH传感器，并用相应的工艺溶液冲洗泵和所有管道。缓冲罐和CSTR预装了CCSN。使用上述设备运行三个连续实验持续约4.5～5h。在没有管式反应器的情况下进行了相同时长的另一项实验。进行了一个持续24小时的沉淀实验和另一个24小时运行的与原型斜板式沉降器集成的沉淀过程。在连续运行中，从缓冲罐、CSTR出口流、斜板式沉降器的溢流口和排出的材料中取样。沉淀悬浮液在2～8℃下沉降，然后从沉淀上清液或洗涤缓冲液取样并溶解沉淀。样品储存在<-60℃待分析。
磷酸钙的自动连续沉淀-pH控制
通过添加0.25M NaOH在缓冲罐中进行pH调节。测量缓冲罐的pH值，并根据输入的pH值通过软件控制的蠕动泵(P4)生成比例或恒定输出。取决于输入pH值的输出流量水平在表14中显示。
表14：自动的连续沉淀中的pH控制，包括实施的参数、默认值和控制机制。ST＝缓冲罐。p-value＝用于控制的比例值。
Figure BDA0003785012270000651
Figure BDA0003785012270000661
磷酸钙的自动连续沉淀–体积控制-缓冲罐
根据重量测定监测缓冲罐中当前的液体体积(ST填充量)。根据相对于控制水平的ST填充量，控制缓冲罐的流出量。同时调节P5、P6和P7的集合(标称主流量)。
表15：自动的连续沉淀原型中缓冲罐的体积控制的参数和限制。
Figure BDA0003785012270000662
Figure BDA0003785012270000671
磷酸钙的自动连续沉淀-体积控制-CSTR
CSTR中的填充水平控制与上述“体积控制-缓冲罐”部分类似。但是，流出量的上下调节是通过改变泵速来实现的。
表16：自动的连续沉淀原型中CSTR的体积控制的参数和限制。
Figure BDA0003785012270000672
连续固液分离
使用上述材料部分“斜板式沉降器原型”中描述的原型斜板式沉降器进行连续固液分离。该系统使用在National Instruments LabVIEW中编程的定制软件进行控制。所有实验均以软件的“运行程序”模式运行。振动电机设定为间隔2min，振动3s。浊度传感器擦拭设备设定为间隔0.25min，7Hz，持续2s。
连续固液分离-在分液漏斗中沉降沉淀
沉淀悬浮液在1L玻璃分液漏斗中沉降。从顶部添加的悬浮液包含50mM Tris、165mM NaCl，pH8.6，用15mM CaCl2和的2mM磷酸盐沉淀，或用0.1M NaOH调节pH至8.5，用15mM CaCl2和2mM磷酸盐沉淀的CCSN。使用Ismatec RegloDigital蠕动泵(Cole Parmer，Vernon Hills，IL，美国)以低流量从分液漏斗底部供应不同成分的洗涤缓冲液。沉淀物沉降约45分钟。通过向洗涤缓冲液中添加100mg/L专利蓝V辅助目测判断不同相之间的混合。所有缓冲液均为2mM Tris，pH 8.25，NaCl和CaCl2浓度如表17中所列。
表17：沉淀悬浮液和洗涤缓冲液与NaCl和CaCl2联用的测试。
缓冲液编号 以取自2的沉淀物测试 NaCl浓度[mM] CaCl<sub>2</sub>浓度[mM]
W1 缓冲液 350 0
W2 缓冲液 300 0
W3 缓冲液 250 0
W4 缓冲液 270 0
W5 CCSN 247 0
W6 CCSN 257 0
W7 CCSN 265 0
W8 CCSN 272 0
W9 CCSN 221 12
W10 CCSN 231 12
连续固液分离-斜板式沉降器操作条件筛选
在10mM Tris缓冲液、pH 8.5，100mM NaCl中产生分批沉淀，用15mM CaCl2和2.7mMNa2HPO4沉淀。沉淀在实验前直接一次制备或每两小时新制备一次，并通过使用磁力搅拌器搅拌保持悬浮。在所有运行中，进料流量为3.5mL/min。洗涤缓冲液组合物为2mM Tris、252mM NaCl、6mM CaCl2、pH 8.2。专利蓝V和色氨酸分别通过620nm和280nm的吸光度测量进行量化。在96孔式样的Tecan InfiniteM200 Pro plate reader(Tecan Trading AG，
Figure BDA0003785012270000681
Switzerland)上测量吸光度。
连续固液分离-斜板式沉降器操作条件筛选-排放流量筛选
洗涤缓冲液和污泥泵的流量设置为20、40或60mL/min。通过改变排放间隔的时间使排放体积保持恒定。洗涤缓冲液中添加了25mg/L专利蓝V作为示踪剂，进料中没有示踪剂，或进料中添加了100mg/L色氨酸，洗涤缓冲液中没有示踪剂。排放间隔设置为15分钟。当示踪剂在洗涤缓冲液中时，排放体积为40mL，当示踪剂在进料中时，排放体积为44mL。额外的4mL是因为污泥泵运行时间稍长以降低洗涤缓冲液的前部。
连续固液分离-斜板式沉降器操作条件筛选-排放间隔筛选
对于所有测试间隔，排放流量保持恒定在40mL/min，排放体积为45mL。在这45mL中，40mL在洗涤泵和污泥泵同时流动的情况下排出，另外5mL仅在污泥流动的情况下排出。排放间隔从30～60min不等。洗涤缓冲液中添加了25mg/L专利蓝V。
连续固液分离-斜板式沉降器操作条件筛选-排放体积减少
排放流量保持在40mL/min，排放间隔设置为30分钟。排放体积为22.8mL和12.8mL。在总排放体积中，4mL仅随污泥流排放，其余的则在洗涤泵和污泥泵同时流动的情况下排放。
连续固液分离-使用斜板式沉降器分离连续沉淀的磷酸钙
进料缓冲液为10mM Tris，含100mM NaCl，pH 7.4的缓冲液。在连续沉淀过程中，通过添加0.25M NaOH完全自动地调节pH值。通过添加钙和磷酸盐原液(分别为4M和0.4M)开始沉淀。连续沉淀装置的出口连接到单板斜板式沉降器的入口。沉降器预先填充了通过10mMTris、100mM NaCl、pH 8.5+15mM CaCl2+2.7mM Na2HPO4澄清产生的沉淀上清液。通过沉降沉淀和随后的两级过滤(1.2μm和0.45μm)实现上清液澄清。沉降器以40mL/min的排放流量、30min的间隔和12.8mL的排放体积运行。进料流量在连续沉淀中自动控制。
用柠檬酸盐滴定钙
对包含10mM CaCl2和20mM缓冲液组合物(取决于目标pH值)的溶液，用1M柠檬酸盐储备原液滴定至与本体溶液相同的pH值。用乙酸缓冲pH 5.0和5.5的溶液，用BIS-Tris缓冲pH 6.0和6.5的溶液，用HEPES缓冲pH 7.0、7.25和7.5的溶液，用Tris缓冲pH 8.0的溶液。在进行任意测量之前，将100mL含钙溶液与2mL Mettler ToledoTM ISA溶液一起添加。使用钙浓度为0.1～100mM的相同缓冲液组分制作标准曲线。滴定以0.1mL/min的添加速率进行。测量在室温和4℃下使用用于温度控制和混合的EasyMax102合成工作站进行。使用钙特异性电极(perfectIONTM comb Ca Lemo组合电极，Mettler Toledo，Columbus，OH，美国)实时监测游离钙。
柠檬酸的高效液相色谱(HPLC)测量
通过高效液相色谱(HPLC)测量柠檬酸对其进行量化。Blumhoff等和Steiger等(分别见参考文献9和10)此前描述了HPLC方法。
游离钙定量
使用96孔板形式的钙比色试剂盒测量钙浓度。标准品和所有样品用水按1:2梯度稀释，得到2.5～0.08mM钙的浓度。根据供应商描述的步骤进行定量。使用TecanInfiniteM200 Pro plate reader(Tecan trading AG，
Figure BDA0003785012270000701
Switzerland)进行测量。
磷酸盐定量
使用Satzer等(参考文献11)描述的方法对磷酸盐进行定量。
FVIII活性定量
使用96孔板形式的Chromogenix Coatest SP4 VIII试剂盒测定FVIII的活性。在每次分析前，新制备测定缓冲液和试剂混合物(CaCl2、磷脂和FIX+FX的混合物)。标准品(参考材料；Baxalta Innovations GmbH，Orth/Donau，奥地利)、内部对照和样品以1:2的比例稀释并转移到测量板上。将试剂混合物添加到样品中并在37℃下孵育5分钟。为了检测，添加显色底物并在405nm，37℃，过5min读取吸光度，使用Tecan InfiniteM200 Pro读板器(Tecan trading AG，
Figure BDA0003785012270000702
Switzerland)每隔30s测量一次。
vWF定量
使用抗原ELISA.MAXISORPTM对样品中的vWF浓度进行定量。测量板用兔抗vWF抗体(DAKO A0082，1:600稀释)包被。使用Tecan Hydroflex洗板机(Tecan Trading AG)和1xTBS缓冲液洗板。标准品、内部对照和样品经1xTBS-T+0.1％HSA样品缓冲液以1:2的比例稀释。用兔抗vWF HRP偶联抗体(DAKO P0226，用DPBS+10％兔血清按1:40.000稀释)检测样品。使用TMB过氧化物酶EIA Substrate Kit进行检测。结果通过使用Tecan InfiniteM200 Proplate reader在490nm处测量吸光度获得。
HCP定量
使用Sauer等(参考文献12)描述的ELISA方法对CHO HCP进行定量。
DNA定量
使用Satzer等(参考文献11)此前描述的PicogreenTM测定法对双链DNA进行定量。
SDS-PAGE
使用3～8％Tris-Acetate凝胶和1x Tris-Acetate缓冲液还原SDS-PAGE。通过混合1份2M DTT、1份样品缓冲液(NuPAGE LDS样品缓冲液(4x))和3份样品制备样品，加热至95℃，10min。为了确定条带大小，使用了HiMarkTM预染色标准。使用银染检测条带。
以下实施例7～10中的所有结果均通过如上文材料部分所述rFVIII(octocogalfa)和rvWF(vonicog alfa)的过程或分析获得。
实施例7：FVIII:vWF复合物的分批沉淀
为了建立基于沉淀的重组FVIII:vWF复合物的连续捕获步骤，进行了分批沉淀实验。由此，测试了不同沉淀剂的沉淀能力。
实施例7.1：使用聚乙二醇(PEG)进行分批沉淀
PEG是第一个被研究关于从细胞培养上清液(CCSN)中沉淀FVIII:vWF复合物的适用性的沉淀剂。在PEG 2000～PEG 20000的宽泛的PEG分子量范围内测试了PEG。通过SDS-PAGE检查沉淀上清液(SN)和溶解的沉淀样品(DP)中是否存在目标蛋白。将SN样品与1:2稀释的CCSN进行比较。对于较低分子量的PEG，SN中的蛋白质浓度与参照物非常相似，表明没有沉淀。随着分子量的增加和PEG浓度的增加，SN样品中蛋白质含量减少，而在相应的DP样品中增加。PEG分子量的阈值似乎是6000kDa。在用12％和19％(w/v)的PEG 6000或更高沉淀的样品中，在溶解的沉淀中检测到了目标蛋白。然而，在高PEG浓度下，溶液变得粘稠。此外，沉淀的有效沉降依赖于离心。
实施例7.2：使用磷酸钙进行分批沉淀
使用磷酸钙进行分批沉淀
对于磷酸钙沉淀用于捕获FVIII:vWF复合物的可行性，首先测试了2～20mM的钙和2～8mM的磷酸盐。所有组合在沉淀前进行调节pH或否的测试。在此，通过添加在环境温度(～21℃)下pH为7.75的2M Tris储备原液进行pH调节，以在细胞培养上清液中产生终浓度50mM的Tris，其目标pH值在4℃约为8.3。磷酸钙的溶解度取决于溶液的pH值。在未调节的CCSN中，只有四分之二的组合导致固体磷酸钙形成，而四分之三的组合在CCSN的pH改变时形成沉淀。未调节CCSN的分析结果和计算得出的体积减少系数可见于图24A，经pH调节的CCSN的结果如图24B所示。对于所有条件，都观察到产率和体积减少之间的反比关系。蛋白质产率与沉淀量直接相关。钙和磷酸盐浓度的增加使得形成的沉淀增加，即产率增加。磷酸钙絮状物通常表现为松散的网络，很容易受到搅拌的干扰，并在沉降过程中表现出一定的压缩。因此，体积减少取决于存在的沉淀物的量。不同的柠檬酸盐含量对产物产率和体积减少几乎没有影响。以产物产率为重点选择条件。用20mM钙和2mM磷酸盐调节pH值后获得的样品表现出高产率和中等程度的体积减少。这种情况被选作进一步调查的起点。
共测试了四种不同的钙浓度(10、15、20和25mM)和三种磷酸盐浓度(1.5、2.0和2.5mM)，每种条件重复5次。通过添加Tris调节并稳定解冻的CCSN的pH值。调节后的溶液pH约为8.3。较高数量的重复允许对数据进行统计评价，以通过方差分析(ANOVA)检验沉淀条件之间的显著差异。数据(结果绘制于图25中)表明在10和15mM钙之间的vWF产率有统计学上的显著差异。磷酸盐浓度在测试范围内没有显著影响。值得注意的是，磷酸盐的浓度范围非常窄，因此不太可能出现大的差异。对于FVIII产率，完全没有检测到显著差异。这些结果显示了在测试浓度范围内vWF的钙依赖性沉淀行为。更详细地研究了钙浓度对vWF的影响。在恒定的磷酸盐浓度和pH值下，钙浓度增加到20mM。在此，仅测定溶解沉淀物中的vWF的浓度，因为根据先前的结果预计钙浓度对FVIII产率没有影响。vWF的产率遵循S形曲线，并在钙浓度≥12.5mM时达到平台期(见图26)。在12.5和20mM之间获得的平均产率为90.2％。在20％的安全范围内，选择15mM钙作为使用2mM磷酸盐，pH 8.3(缓冲的Tris)从CCSN沉淀FVIII:vWF复合物的目标浓度。
沉淀所需的钙和磷酸盐浓度的确定取决于用Tris进行pH调节，所提供的缓冲能力。磷酸钙的沉淀伴随着H+离子的释放。在没有缓冲体系的情况下，观察到pH值的下降。由于磷酸钙沉淀的pH依赖性，蛋白质产率可能会受到pH值下降的影响。因此，在通过用NaOH调节实现的起始pH值范围内对沉淀进行研究。在溶解的沉淀物中，vWF浓度随着起始pH值的增加而增加。FVIII产率首先随着碱性pH的增加而增加，然后在pH>8.5时再次降低。随着沉淀前溶液pH值的增加，体积减少降低(图27)。为了最大限度地提高FVIII和vWF的产率，将pH8.5定义为沉淀前的目标pH。
图28展示了在优化条件下CCSN沉淀的SDS-PAGE凝胶图片。绝大多数蛋白质从沉淀上清液(泳道5)中去除，而溶解的沉淀物(泳道6)中的浓度相对于初始材料(泳道4)中的明显增加。
FVIII:vWF磷酸钙沉淀的分批沉淀动力学
对于沉淀，动力学取决于质量传输，质量传输又取决于混合速率。为了确保沉淀条件的均匀度，必须确保所有样品有效混合。使用两种尺寸的同样向上倾斜的叶片叶轮研究用于动力学研究的CSTR中的混合，该叶轮在增加的搅拌器速度下运行。在添加脉冲后，每个叶轮尺寸和搅拌器速度的混合时间以“电导率恒定的时间”来确定。对于较小直径的叶轮，可以观察到明显更长的混合时间(见表18)。在100rpm下，一分钟内就获得了均匀的溶液。更高的叶轮速度被排除，以避免过度的、不必要的剪切应力。
表18：在EasyMax102中的混合时间，其为具有向上倾斜的叶片叶轮(25mm和38mm直径)的100mL玻璃反应器。
Figure BDA0003785012270000731
对于沉淀动力学，上清液蛋白质浓度是相对于对照样品(即CCSN)定量的，对照代表100％的参考。在沉淀后采集的所有上清液样品中都未检测到FVIII和vWF，这与起始pH值和pH调节方式无关。在图29的图A和图B中，沉淀上清液中的浓度下降到零。这些数据揭示了一种通过磷酸钙沉淀从CCSN中去除FVIII:vWF复合物的快速模式。技术上讲，在所应用的条件下未观察到沉淀动力学，即时间依赖性行为。然而，基于这些结果，确认从CCSN中去除。但是，本实施例中没有分析沉淀物，这使得质量平衡不完全。研究了FVIII:vWF复合物在高pH值时降解的可能性，仅观察到轻微的降解(见下文)。这些发现支持了以下假设，即如果从沉淀上清液中去除FVIII和vWF，则会在沉淀中发现。
FVIII:vWF的磷酸钙捕获机制
沉淀后，产物分子通过沉淀溶解从磷酸钙沉淀中释放出来。因此，释放或回收步骤独立于捕获机制。据推测这是一种特定的而非常规的沉淀机制。该假设基于HCP的部分去除，而抗体保留在溶液中。原则上，这些实施例中提出的捕获过程的潜在现象可能有多种机制，如共沉淀、包含反应(inclusion)或吸附。在吸附过程中，蛋白质将保留在磷酸钙表面，并且可以在不溶解沉淀物的情况下被洗脱。如果蛋白质通过共沉淀被捕获，它将以协调的方式整合到形成的沉淀中。对于包含反应，假设在絮状物内或絮状物间随机整合捕获的蛋白质。共沉淀和包含反应都需要溶解沉淀以释放产物。
为了测试吸附，将湿式磷酸钙(异位形成的磷酸钙)以及色谱树脂CHT I和II添加到细胞培养上清液中并在恒定混合下孵育以避免沉降并确保充分的质量传输。在湿式沉淀物的情况中，分别有18％和90％的FVIII和vWF残留在CCSN中并且没有吸附到沉淀物中。FVIII和vWF溶解后的产率分别为66.1％和11.5％(图30，图C)。使用色谱羟基磷灰石树脂CHT I实现了完整的产物捕获，洗脱部分的回收率对于FVIII为52％，对于vWF为31％(图30，图D)。在此，最初存在的蛋白质中的48％和69％没有被回收，因此可以假设产物仍然与树脂结合。使用第二种类型的羟基磷灰石树脂(CHT II)，FVIII被完全吸附，而60％的大量vWF未被捕获。FVIII的洗脱级分回收率为40％，vWF的为17％(图30，图D)。FVIII和vWF的回收率分别为40％和67％。这些结果表明FVIII可以吸附到新鲜的磷酸钙和化学上相似的固相上。vWF仅吸附到CHT I上，而不吸附到其他树脂上，也没有在异位形成的磷酸钙上。测试从原位形成的磷酸钙沉淀物中进行洗脱，但失败了。在未溶解的原位形成的沉淀物中发现的产物浓度与沉淀物已溶解的范围相同(图30，图B)。在这些实验中，FVIII被有效吸附，而vWF部分保留在溶液中。在这种情况下，必须假设，FVIII和vWF彼此不再形成复合物。通过剪切应力活化vWF，例如作为混合的结果，导致对FVIII的亲和力降低可以解释复合物的破坏。为了测试磁力搅拌器的影响，将磷酸钙原位沉淀并混合数小时。在搅拌过的样品中，FVIII和vWF的产率分别为75％和90％。在倒置混合(inversion mix)的参考样品中，回收了93％的FVIII和99％的vWF。在此，FVIII和vWF的产率同样下降。为了解释由磁力搅拌器的搅拌引入的剪切，包括一个带有未调节细胞培养上清液的搅拌对照。相对于停滞的对照样品，FVIII的活性降低了20％，而vWF的浓度降低了10％。包括磁力搅拌的实验与这些参考值有关，而所有其他实验都与停滞的对照样品有关。为什么FVIII和vWF不像它们是异位形成的磷酸钙和CHT II的单一实体那样独立，结果表明FVIII存在基于吸附的机制。无论固相如何，产物都被捕获，但效率不同。vWF可以被CHT I吸附，部分被CHT II吸附，但不能被异位形成的磷酸钙沉淀。因此，吸附只能是vWF捕获机制的一部分。在此，一般的包含机制似乎更有可能，因为在细胞培养上清液中形成沉淀时捕获是高效的。不能从沉淀中洗脱产物复合物的事实也表明了蛋白质的截留。
对于其后溶解的原位沉淀样品，测定溶解沉淀物中HCP和DNA的产率。溶解沉淀物中的HCP产率为30％，这意味着最初存在的HCP的70％在磷酸钙沉淀步骤中被去除。双链DNA大部分与产物一起沉淀。DNA的产率为79％，考虑到磷酸钙沉淀先前已用于抗体过程中的DNA去除这一事实，这并不令人惊讶。
实施例8：FVIII:vWF的连续沉淀
对于沉淀，将单元操作从分批模式切换到连续模式。这需要将起始材料与沉淀试剂连续混合，并提供足够的停留时间以完成沉淀。因此，为了切换到连续操作，需要一个适合磷酸钙连续沉淀的反应器。
选择用于FVIII:vWF的连续沉淀的反应器设置
对于来自CCSN的FVIII:vWF复合物的连续沉淀，反应器选自三种不同的反应器设置：CSTR、管式反应器(TR)以及TR和CSTR的组合(TR+CSTR)。所讨论的反应器的特征在于(1)基于示踪步骤实验的RTD，(2)沉淀物的沉降速度，(3)特定反应器设置产生的产物产率，和(4)根据实际实现的考虑。选择是基于决策矩阵进行的，其中每个类别总共获得3分。在一个类别中表现最好的反应器获得2分，第二好的反应器获得1分。如果两个反应器性能相同，则两个反应器都得到1.5分。选择总分最高的反应器。使用两种不同示踪剂的阶梯实验确定不同反应器设置的RTD。在一个示例中，示踪剂是一种溶剂，而在第二个示例中，磷酸钙被追踪。获得的RTD曲线绘制于图31中。反应器类型的差异在基于TR和CSTR的沉淀反应器之间最为明显，其表现出更宽的RTD。TR的示踪系统的差异可以忽略不计，其中溶质和沉淀物的峰大多重叠。然而，当使用沉淀物进行分步实验时(参见图31B中的RTD图的放大图)，基于CSTR的反应器的RTD峰转移到更长的停留时间。通常，窄RTD优于宽RTD。如果生产过程中出现干扰，如果RTD较窄，这些将影响较小部分的工艺流。因此，TR优于其它基于RTD的反应器设置。
连续模式下的固液分离倾向于使用斜板式沉降器进行。除其他因素外，板式沉降器的性能取决于固体的沉降速度(settling velocity，SV)，例如磷酸钙絮状物。早期的观察表明，反应器类型可能会影响絮状物大小，从而影响絮状物的沉降行为(数据未显示)。因此，该工艺所讨论的反应器类型是用于生产磷酸钙沉淀并确定其沉降行为。使用定制的沉降监测装置监测沉淀沉降。获得的数据被解释为在絮状物沉降时起始浊度和浊度开始降低。浊度信号被归一化，至少三个重复信号的平均值随时间绘制在图32A中。分批沉淀的磷酸钙表现出最快的沉降行为，而TR+CSTR组合和CSTR也以分批沉淀开始。TR中产生的沉淀表现出最慢的沉降。由于观察到的沉降速度不同，给定沉降时间后的最终浊度不同。归一化浊度的降低如图32B所示。这些点对应于图32A中绘制的曲线的最后一点的倒数。实现的浊度降低越多越好。
由浊度随时间的降低，可以推导出沉降速度。最慢沉降部分的沉降速度限制了固液分离步骤。因此，确定了最慢的三分之一(精确值：31.5％)的沉降速度并绘制在图33中。观察到分批沉淀的磷酸钙的沉降速度最高，但是，这些沉淀也表现出单一平行之间的最大差异。对于连续产生的沉淀物，平行之间以及反应器设置和操作模式之间的差异要小得多。在连续沉淀反应器中，TR+CSTR的组合产生最快的沉降沉淀物，其次是单独的CSTR。
对解冻的CCSN中的FVIII:vWF复合物进行连续沉淀，以检验反应器类型和批次与连续操作之间产物产率的潜在差异(图34)。同时监测运行随时间的稳定性。使用与连续沉淀相同的CCSN起始材料和储备原液进行参考的分批沉淀。分批沉淀样品中FVIII和vWF的平均产率分别为35％和99％。连续沉淀样品中的FVIII产率与分批参考相当，但明显低于之前观察到的值。据推测，低FVIII产率可能是由于起始材料的储存时间延长(在-80℃下>1.5年)。分批参考中的vWF产率与此前的分批沉淀结果和使用TR和TR+CSTR连续沉淀获得的结果一致。单独使用CSTR的vWF产率显著降低。在连续沉淀实验过程中采集的样品显示所有反应器运行稳定。对于TR，观察到了初始的上升相，这是由于缓冲液最初从反应器中洗脱。总之，FVIII产率没有差异。然而，在vWF产率方面，CSTR和所有其他沉淀之间存在差异。TR和TR+CSTR中的产物产率相等。
至于在实际实验期间关于处理的实际考虑，包含反应器设置的CSTR比TR具有显著优势。将传感器安装到开放容器中比线性安装更简单。此外，使用CSTR中的一个pH传感器和一个控制单元可以轻松实现pH值的调节。TR中的pH调节需要多个串联的传感器和控制单元。当沉淀在CSTR中进行时，颗粒形成的起源是在搅拌容器中，观察到广泛存在的传感器结垢。
根据描述反应器RTD的数据、这些反应器中沉淀物的沉降、产物产率以及对实际实现和处理的考虑，在预定义的类别中累积积分(见表19)。根据这种基于积分的评估方法，TR+CSTR的组合表现最佳。因此，选择包括TR+CSTR的设置用于在集成的连续沉淀FVIII:VWF的设置中实施。然而，后来的实验表明，沉淀可能会停止并在TR中积聚(参见后续部分)，这表明移除TR或用另一个混合装置替换TR可能是有益的。
表19：选择用于连续沉淀磷酸钙的反应器的决策矩阵，其中包括各个类别的得分和每种反应器的总分。
Figure BDA0003785012270000761
实验室规模的FVIII:vWF的自动连续沉淀
使用自动化的连续原型设备从CCSN连续沉淀FVIII:vWF，如图35所示。首先用无蛋白缓冲液测试该设备，在此过程中建立pH控制参数值，而且在最终的软件版本还在编程时测试软件。用CCSN确认pH控制值(数据未显示)。实验1(图36)运行三个平行，每个持续约4.5～5h或一共处理六个系统体积。在调节pH值的缓冲罐中获得的FVIII和vWF产率结果在100％左右高度稳定。沉淀步骤本身的产率取决于CSTR中的pH值。当CSTR的pH稳定时，产物回收率也稳定。当任何一种沉淀剂储备原液的添加量过少或过多时，观察到CSTR的pH值的干扰。沉淀剂过量会导致pH值降低，而缺乏会导致pH值升高。在连续沉淀进行中观察到的大部分扰动是操作员引起的。该系统及其底层控制机制如预期运行。在稳定状态下，CSTR中的pH值为7.75±0.1。在所有实验中(图36～38)，即使在稳定的沉淀条件下，vWF和FVIII的产率也低于此前在可比的分批实验中观察到的产率。vWF的沉淀似乎不完全，沉淀上清液中存在残留的vWF。对于FVIII，质量平衡是不完全的，在将相关部分相加后，大约50％的FVIII仍然无法计入。进行的FVIII分析是一种活性测定，这意味着该蛋白质可能仍然存在，但没有活性。这可以解释FVIII的明显损失。
在一项实验中，通过从装置中移除管式反应器来研究管式反应器对连续沉淀的影响(图39)。沉淀剂储备原液以相同方式投送，沉淀悬浮液通过开口管输送至CSTR。在这个实验中没有出现任何干扰。CSTR的pH(见图39A)的最初增加是由于未调节的CCSN与来自缓冲罐的pH调节的CCSN的混合。pH值增加，直到达到磷酸钙沉淀增加到足以将pH值降低到其稳态水平的值。在实验过程中，CSTR的pH的稳定性反映在vWF的产率上。对于FVIII，观察到产率随着处理的系统体积的增加而增加。
持续约24h的运行显示了长时间运行连续沉淀的可行性。在仅有沉淀的实验中获得的结果如图40所示。总体而言，自动化控制在整个实验运行时间内产生了稳定的条件。10～18h之间的范围对应于系统不受监测的时间。CSTR的pH在此期间保持稳定。大约18h产物产率的峰值是由手动从管式反应器中置换停滞的沉淀物引起的。此后收集的样品含有较高量的沉淀物。在这个示例下，产率高于100％，因为在该样品中收集的材料对应随时间积累的材料。这些结果说明，可以移除或用另一个操作单元或混合装置替换管式反应器。理想情况下，TR的替代不会导致沉淀物的停滞。
将新鲜的CCSN分批沉淀，作为自动设置中运行的连续沉淀的对照。对于vWF和FVIII，分批沉淀的平均产率分别为88％和66％(见图41)。在分批样品中，vWF的沉淀不完全，8.4％的vWF残留在沉淀上清液中。这已在连续运行中观察到，但在任何先前的分批实验中均未观察到。值得注意的是，用于确定沉淀条件的分批实验始终使用解冻的CCSN进行，而连续实验则使用新鲜(即没有冻融循环)的CCSN进行。CCSN中的碳酸盐缓冲系统可能会受到冻融循环的影响。CCSN缓冲系统的这种差异可能会对磷酸钙沉淀产生影响，进而导致在连续运行和分批参考样品中观察到的产物产率降低。
实施例9：使用斜板式沉降器连续收集沉淀
连续固液分离是连续处理的瓶颈之一。本文公开了斜板式沉降器底部的新概念，并通过实施例1～6举例说明。该实施例9展示了使用根据本公开的这种新的底部/斜板式沉降器的连续沉淀物形成和收集。
用于斜板式沉降器的洗涤缓冲液组合物
根据本公开的新型底部/斜板式沉降器能够实施洗涤步骤。为了使固体沉降到洗涤缓冲液中而不与原始液相充分混合，密度需要按以下顺序排列：
ρ固体>ρ洗涤液>ρ液体 (式4)
根据溶质的浓度，溶液的密度会发生变化。对于磷酸钙沉淀的分离，给出了固体和周围液体的密度。因此，必须选择洗涤缓冲液组合物，使其符合式4的要求。
首先，使用不含蛋白质的沉淀悬浮液和含有不同NaCl浓度的缓冲液进行密度调节，以进行沉降实验。基于多次密度测量计算理论密度(数据未显示)，并调整测试的组合物。如果在没有将洗涤缓冲液与沉淀的母液充分混合的情况下实现了絮状物在洗涤缓冲液中的沉降，则认为该实验是成功的。换言之：在沉降实验结束时是否仍然存在可区分的三个分离的相。对于在无蛋白缓冲液中形成的沉淀，这是在270mM NaCl浓度下实现的。
细胞培养上清液中产生的沉淀以相同方式沉降。在此，测试了添加和不添加补充至12mM的CaCl2的缓冲液。当在沉淀步骤中添加15mM钙时，通过钙比色法测定的沉淀上清液中的残留钙浓度约为12mM。选择该钙浓度作为要补充的最大浓度。不含钙的洗涤缓冲液代表最低补充量。经证明，分别在272mM和231mM NaCl浓度以及0和12mM CaCl2下，密度要求得到满足并且沉降到洗涤缓冲液中是可行的。这些沉降实验结束时拍摄的照片如图42所示。
从这些实验结果中，根据假定图43中线上的CaCl2和NaCl的组合产生相同密度的溶液，可以计算出CaCl2和NaCl之间的折衷。因此，所有得到的溶液应该都适合用作洗涤缓冲液。
使产物产率最大化的洗涤缓冲液钙浓度
洗涤步骤的目的是降低液相钙浓度，以提高后续溶解的效率。为此，需要钙浓度低于沉淀上清液中的钙浓度(即12mM)。在钙浓度为0、4、8和12mM时，测试了四种不同的洗涤缓冲液对产物产率的影响。将这些样品的产率与以相同方式沉降但未洗涤的参考样品进行比较。这些实验中的产率低于先前使用解冻的CCSN的实验(比较图44A)。在分液漏斗中，不可能收集所有存在的沉淀物。当通过漏斗底部出口收集沉淀悬浮液时，靠近漏斗壁的沉淀絮状物保持静止。在早期的分批沉淀实验中，已经发现了磷酸钙沉淀与产物产率之间的强相关性。因此，在分液漏斗实验中观察到的沉淀损失解释了产率的降低。因此，参考样品中的产率对应在任何洗涤缓冲液条件下可获得的最大产率。图44B中比较了洗涤过的样品与该参考样品。结果表明，必须向洗涤缓冲液中添加最少4mM CaCl2才能获得稳定的产物产率。考虑到安全因素，选择由2mM Tris、6mM CaCl2、252mM NaCl、pH 7.75，在室温下组成的洗涤缓冲液用于斜板式沉降器中磷酸钙沉淀的固液分离。
用于磷酸钙收集的斜板式沉降器操作参数优化
原型单板斜板式沉降器设计用于对连续沉淀步骤(即连续捕获)中产生的沉淀物的固液分离。其配备了一个底部，该底部采用本文公开中新开发的分离式入口通道、收集通道和洗涤液供应通道的概念。通过两个同时运行的泵的作用周期性地排出固体。一个泵(污泥泵)抽出浓缩的悬浮液(污泥)，而第二个泵(洗涤泵)在排放循环的第一部分以相同的流量供应洗涤缓冲液。在排放循环的第二部分，污泥泵单独运行，将底部的洗涤缓冲液液位降低到原初水平。这是必要的，因为沉淀迫使洗涤缓冲液向上抬升。最后，沉淀物从母液转移到洗涤缓冲液中，理想情况下两种“相”之间没有任何混合。然而，预计会出现一些混合，其程度取决于排放流量。用两种不同的示踪剂测试了三种流量，以检验洗涤缓冲液和进料流之间的混合。在排放级分中定量示踪剂的浓度。图45A中产率为77％的数据点对应实验中的第一次排放。最可能的是，底部仍然包含一些进料缓冲液作为系统启动的残余物。在所有其他数据点中，当示踪剂分别在洗涤缓冲液或进料流中，产率高于89％和低于11％时，几乎没有观察到混合。在没有混合的理想情况下，如果将示踪剂添加到洗涤缓冲液中，则排放部分的回收率预计为100％，如果将示踪剂添加到进料流中，则预计为0％。在图45A中，随着流量增加，观察到混合增强。在图B中，随着排放流量速率增加，混合首先增强，然后再减弱。
除了基于示踪剂的混合评估外，还比较了在不同流量下获得的排放峰。在最低流量下，峰表现出明显的拖尾现象(图46A)，一旦流量增加到40mL/min，拖尾现象就会消失(图46B)。当流量进一步增加时，峰看起来比以前更宽(图46C)。中等流量似乎平衡了无拖尾和很少混合的有效排放。基于这些结果，使用40mL/min的排放流量进行了以下实验。
上述结果是在排放间隔为15分钟的情况下获得的。在每次排放期间，消耗给定体积的洗涤缓冲液以替换沉淀母液。因此，更短的排放间隔会导致更高的洗涤缓冲液消耗。测试了较长的排放间隔，对应较低的缓冲液消耗(图47)。在这些实验中，专利蓝V的浓度在顶部溢流中被量化。顶部流动部分的产率为零。排放部分的产率在排放间隔最短时最高，随着间隔长度的增加而降低。在45分钟排放间隔内产率分散出宽范围是由于干扰：在这些排放中，系统耗尽了洗涤缓冲液，因此排放物被沉淀悬浮液稀释。总体趋势表明洗涤缓冲液和进料流之间的混合随着间隔长度的增加而增加。即使溶液之间的密度差异会防止大量混合，但在较长时间内扩散效应可能会变得显著。应选择间隔长度以平衡缓冲液消耗、扩散混合和底部的填充水平。每次排放的固体量随着排放间隔长度的增加而增加。增加固体量导致最大排放峰值略有增加，但最主要是导致了更宽的排放峰(见图48)。但是，在测试的排放间隔范围内，底部还没有超载。选择30分钟间隔是为了防止由于扩散导致的过度混合，且出于在恒定排放间隔下测试给定数量的条件的实验的持续时间的实际因素。
沉淀步骤中的体积减少高度依赖于固液分离步骤的效率。以30分钟的排放间隔获得的峰(见图48A)表明，大部分固体在排放的前25mL内排放。为了增加体积减少，必须提前截断排放峰，这意味着要减少排放体积。排放体积首先减少到大约一半，然后减少到原始排放体积的四分之一。在所有条件下，在排放中都获得了高产率的示踪剂(图49A)。与产率相比，排放部分中专利蓝V的浓度随着排放体积的减少而降低(参见图49B)。这是由于排放的操作方式。仅由污泥流产生的排放体积比例随着总排放体积的减少而增加。仅污泥流体积(4mL)保持不变，因为它取决于沉降的沉淀量。对于恒定的排放间隔，沉降的沉淀量假定为恒定。
测试排放体积的排放峰的叠加显示，对于最小排放体积，每个总排放体积的沉淀物体积减少量最大(图50C)。考虑在一个间隔内处理的进料量(30min×3.5mL/min)和排放体积(12.8mL)，最终体积减少了8.2倍。目标是在沉淀物溶解后体积减少至少10倍，这将需要进一步减少排放体积。然而，目前的结果表明，由于引入恒定体积的母液，在较小体积的排放物中示踪剂浓度较低。因此，来自收获的沉淀悬浮液的母液消耗将减少。上面讨论了给定母液消耗对溶解效率的影响。对不同部分(母液、洗涤缓冲液、沉淀物)的钙贡献的计算表明，主要贡献是由于沉淀物本身(在该体积减少范围内)。因此，有效去除母液的重要性变得次要。
连续收集从CCSN沉淀的FVIII:vWF
原型斜板式沉降器用于收集在实验室规模的原型沉淀装置的连续沉淀实验期间在CCSN中形成的沉淀物(图52)。从沉淀中的CSTR收集沉淀的最后一个泵直接进料到倾斜的沉降器中。沉降器以先前确定的排放流量、间隔和体积运行。排放流量为40mL/min，间隔设置为30min，每次循环排放体积为12.8mL。在本次运行中，沉淀发生了重大干扰，在此期间，由于操作员错误，为控制pH值而添加NaOH失败了。因此，缓冲罐中的pH值降至临界水平以下，沉淀中的所有后续步骤都自动暂停。因此，进入沉降器的进料流被中断。在运行期间记录的数据中可以观察到缓冲罐中pH值的下降和随后CSTR中pH的增加(见图51)。进料浊度信号嘈杂。然而，平均而言，它在整个实验过程中保持不变，从而支持了系统的稳定运行。当到沉降器的进料流中断时，每个循环排放的沉淀量减少，最终所有沉淀都被去除(见图53，最下面的图)。沉淀重新开始后可以恢复沉降器稳态运行。稳态运行在两次排放之间的污泥传感器处显示稳定的浊度信号。在沉淀的扰动和随之而来的沉降器进料流的中断期间，顶部的浊度传感器吸入了空气。因此，在此期间观察到顶部传感器处的浊度水平增加(参见图53，中间组)。
在集成运行中获得的产率与在没有连续固液分离的连续沉淀实验中观察到的产率相当。之前标记为SN(沉淀上清液)的物质在本实验中由TOP部分表示。在该级分中发现了尽管经过沉淀步骤仍保留在溶液中的蛋白质(vWF)。将沉淀从沉淀上清液转移到洗涤缓冲液中。在洗涤缓冲液样品中，未检测到vWF和FVIII。根据该数据，似乎磷酸钙絮状物在洗涤缓冲液中是稳定的，并且没有释放任何捕获的产物。对于FVIII，从沉降器排出的溶解沉淀的产率低于沉降器之前收集的溶解沉淀的产率，这可能是由于溶解后的洗涤缓冲液基质所致。洗涤缓冲液不含任何表面活性剂，只要基质主要由CCSN组成，它们就仍然存在。
实施例10：沉降补充数据
关于通过磷酸钙沉淀法沉淀FVIII:vWF复合物，研究了与沉淀相关的方面。产物分子在工艺pH值下的稳定性是沉淀的重要先决条件。对于溶解，研究了柠檬酸盐的最高可能储备浓度。此外，通过实验确定了钙与柠檬酸盐络合的比例。络合比的知识允许估计溶解所需的柠檬酸盐理论值并与观察到的实际需求值进行比较。
FVIII和vWF的pH稳定性
来自CCSN的FVIII:vWF复合物的沉淀包括一个pH调节步骤，如“磷酸钙分批沉淀”中描述的分批沉淀，“磷酸钙分批沉淀-沉淀动力学研究”中的动力学和“磷酸钙连续沉淀”以及“磷酸钙的自动连续沉淀-pH控制”中的连续沉降。为了确定FVIII和vWF稳定的pH区间，将样品滴定到低于和高于CCSN的pH值的不同pH值。
稳定性以相对于CCSN样品的浓度进行评估。当FVIII:vWF复合物完整时，FVIII和vWF在测试的pH范围内都表现出高稳定性。FVIII稳定性在碱性pH下略有下降，而在复合物中，在低于pH 6.5时观察到vWF稳定性下降(分别见图54中的图A和B)。盐原料的加入导致复合物解离。两种分子对溶液pH变化的稳定性都降低了。FVIII和vWF在碱性pH下更不稳定。这些样品的产率约为对照样品的60％(图55C和图55D)。
实施例7～10：结论
由上述实施例7～10得出以下结论。
开发了重组FVIII:vWF复合物的连续捕获步骤。FVIII是一种高度不稳定分子，它与rvWF共表达以增加稳定性。然而，产物仍然相对不稳定，因此在搅拌釜反应器中以连续方式生产。为了降低制造成本，连续下游加工被确定为主要目标。针对捕获步骤，提出了连续沉淀。进行了分批沉淀实验以优化沉淀条件，然后转为连续操作。分批沉淀过程显示，FVIII的产物产率高达92％，vWF的产物产率高达99％。宿主细胞蛋白(HCP)减少了70％，21％的dsDNA被去除。捕获步骤导致体积减少了八倍。
使用原型设备演示了全自动连续处理的概念验证。连续沉淀在稳定状态下运行23小时，之后故意终止实验。只有过程监督和样品处理需要操作员操作。观察到的任何干扰都是操作员引起的。此外，较短的连续沉淀实验的平行实验支持了稳定性和再现性。这些结果证明了当以连续操作为目标时，沉淀在工艺开发中的优势，即简易性。集成的连续运行是基于连续捕获步骤建立沉淀的可行性的概念验证。
使用具有新开发的分离式分口通道、收集通道和洗涤液供应通道的底部概念的斜板式沉降器以连续模式进行固-液分离。所采用的概念允许实施洗涤步骤并在沉降器的各个板上提供均匀分布的流量。在这项工作中，使用设计用于从CCSN收集磷酸钙沉淀的原型斜板式沉降器。使用无蛋白沉淀物确定操作条件，并显示直接适用于在细胞培养上清液中形成的沉淀物。连续沉淀与连续固-液分离成功结合。它们以全自动方式运行>24小时。在此期间，出现了由操作员引起的干扰。干扰消除后，该过程无需任何进一步干预即可返回稳定状态运行。这证明了该过程本身的稳健性及其在受到干扰后恢复的能力。工艺可以恢复并且干扰不会导致整批失败的事实是连续处理的主要好处之一。
最近有报道称，固-液是连续下游加工的瓶颈之一(参考文献6)。在此展示的结果突出了具有新开发的底部概念的斜板式沉降器在固-液分离方面的进步。该概念允许连续的固-液分离，包括沉淀物洗涤，而不会影响絮状物结构。据报道，沉淀压实，从而破坏了原生絮状物，阻碍了PEG沉淀的溶解。通过提供消除固-液分离瓶颈的方法，斜板式沉降器也可以成为连续下游加工中大量沉淀过程的使能技术。沉淀能够减少过程体积，所有后续单元操作都可以从中受益。结果是更短的处理时间，例如柱加样时间，和较低的用于调节步骤等的缓冲需求，从而提高工艺效率。
连续过程非常适应自动化，因为各个步骤本质上是集成的，这意味着物理连接。相反，分批工艺中的各个单元操作是可分离的，这需要额外努力以实现集成和自动化。自动化通过消除与操作员行为相关的工艺变量实现更高程度的产品一致性。此外，可以显著降低生产中的人工成本。完全自动化的工艺还只需要更少的占地面积，因为不需要人工干预。因此，一个连续的，完全自动化的工艺，其商业成本显著降低。
实施例11～13：材料和方法
在随后的实施方案11～13中使用了以下材料和方法：
材料
细胞培养
CHO细胞在10L实验室规模的生物反应器中以恒化器模式进行发酵。使用SPRA培养基以每毫升1.5x106个细胞的细胞密度培养细胞。在一个试验中使用补充有谷氨酰胺的FBA培养基替代标准SPRA培养基。通过暂时降低稀释率，细胞密度首先增加到每毫升3x106个细胞，最终增加到每毫升6x106个细胞。
细胞培养上清
在通过深度过滤和膜过滤澄清前，收集24h用于沉淀实验的含有重组FVIII和重组vWF的CHO细胞培养上清。澄清的细胞培养上清在湿冰上运输，随后等分并储存在<-60℃直到进一步处理。每次实验前，将等分试样在2～8℃的水浴中过夜解冻。或者，在实验的早晨，在37℃水浴解冻等分试样。
化学品和储备原液
从10M NaOH(Merck，480648)稀释制备0.25M NaOH溶液。通过将相应的化学品溶解在水中来制备钙和磷酸盐储备原液。钙(CaCl2*2H2O，Sigma，C5080)储备浓度为4M。磷酸盐储备浓度为0.2M(Na2HPO4，Merck，106580)。通过将柠檬酸(柠檬酸一水合物，Merck，100244)溶解在水中并随后用固体NaOH(Merck，106482)滴定至pH 7.0来制备柠檬酸盐储备原液(1M)。使用的TBS-T缓冲液含有终浓度3.152g/L Tris-HCl(Sigma，T5941)，0.6055g/L Tris-base(Merck，108382)，8.766g/L NaCl(Merck，106404)，0.50mL/L吐温20(Sigma，P9416)。EDTA(Merck，1084211000)在水中的浓度为0.1M。PBS-C(8g/L NaCl，0.2g/L KH2PO4，1.15g/LNa2HPO4，pH 7.0)补充有6或9g/L NaCl，用于在斜板式沉降器中去除细胞。
斜板式沉降器
使用斜板式沉降器原型。该原型由一个具有四个沉降通道的沉降段组成。沉降部分与底部组装在一起，每个沉降通道通过底部单独供应进料流，而且从每个沉降通道下降的固体分别收集在底部的分离式收集通道中。因此，在这些实验中使用的底部是实施例7～10中使用的版本的四倍。沉降部分由丙烯酸玻璃制成，并由四个沉降通道组成。各个沉降通道由2mm丙烯酸玻璃板隔开。该沉降段要么与具有用于每个单独沉降通道的流量分配器的结构化底部组合，要么与本领域已知的常规底部组合，其中所有沉降通道通过沉降段的底部(在下文也称为“常规底部”)的开放空间提供。
方法
斜板式沉降器运行
所述斜板式沉降器原型以3.5mL/min的恒定进料流量运行。运行由在NationalInstruments LabVIEW中编程的定制软件工具控制。对于结构化底部，以60分钟的间隔进行排放，同时洗涤液和排放泵的流量为60mL/min。排放体积保持恒定在每次排放约38mL。对于常规底部，拍房间隔为30分钟，在此期间，在每个仅排放泵的流量约为12mL/min的排放循环中，收集到约12mL固体悬浮液。
细胞培养上清的沉淀
均质化细胞培养上清并在2～8℃使用0.25M NaOH将pH值调节至pH 8.5或8.75。在约150rpm的恒定混合下，磷酸盐和钙储备原液分别添加到2和15mM的终浓度。根据实验设置，将沉淀悬浮液分成较小的等分试样。样品取自原始细胞培养上清以及pH调节后。
固-液分离
通过重力沉降至少3小时，从沉淀上清液中分离沉淀，随后在5000g，10min，4℃下离心。使用Heraeus Multifuge X3 FR外摆式转子离心机(Thermo Scientific)在4℃下离心。对于再现性研究，离心速度和持续时间为4800或1000g，5min，4℃。固-液分离后，对沉淀上清进行取样，随后弃去。离心后在3mL TBS-T缓冲液中重悬，然后将收集的沉淀重新溶解。
分离沉淀的重新溶解
重新溶解的标准方法是添加1M柠檬酸盐，以逐步添加方式完成，直至完全溶解或一次性添加。或者，以相同方式使用0.1M EDTA。对重新溶解的沉淀进行取样。
产物分析
使用基于酶活的96孔板法测定FVIII浓度。该方法基于SP4 FVIII显色试剂盒(Coachrom Diagnostica，82 4094 63)。使用FVIII参考材料基于二次多项式标准曲线定量。FVIII参考材料的第二个样品用作内部对照。对于选定的样品，vWF浓度使用vWF抗原ELISA确定。使用基于vWF参考材料和内部对照的线性校准方法对样品中的vWF浓度定量。
实施例11：使用具有结构化底部的斜板式沉降器去除细胞
在一些实施方案中，本发明包括从包含根据本发明的蛋白质的流体中分离细胞的细胞分离步骤。优选地，该细胞分离使用连接到根据本发明的底部的用于细胞分离的板式沉降器进行。该实施例表明，使用新开发的板式沉降器/底部(以下也指具有结构化底部的斜板式沉降器)进行细胞分离与使用传统的板式沉降器/底部(以下也指具有常规底部的斜板式沉降器)分离细胞相比更有优势。
使用具有结构化底部的斜板式沉降器去除细胞
使用新开发的结构化底部运行了两次。在第一次运行中，目的是研究细胞在斜板式沉降器中的体积。当沉降部分由不锈钢制成时，在运行期间无法监测细胞沉积。使用本示例中使用的透明的，丙烯酸玻璃的沉降段，可以在运行中的任意时间点观察细胞沉降、沉积和滑动。发现细胞沉降在板上时，随后如预期的那样在底部滑动和收集。滑动细胞的瓦状模式优选出现在沉降段的下端，其中大部分细胞被去除。该细胞去除运行持续了137h或近6天，期间，斜板式沉降器的澄清和分离效率稳定，没有干扰出现(图56)。在排放峰的形状中观察到的一致性进一步支持了运行的稳定性(图57A)。基于在沉降器顶部收集的除去了固体的输出流的细胞计数和浊度评估澄清效率。通过测量从板式沉降器的顶部和底部收集的级分中的葡萄糖测量来评估分离效率。先前的结果表明，葡萄糖可以用作产物的替代标记。在实验条件下，细胞的代谢活性降低，因而葡萄糖不会在斜板式沉降器内代谢。通过确定选定样品中的FVIII活性来补充通过葡萄糖测量获得的结果。顶部溢流中的FVIII产率>96％，而在含有去除细胞的部分中低于定量限(>0.2IU/mL)(图58)。
在使用结构化底部进行的第二次运行中，生物反应器中的细胞密度从每毫升1.5到最初的3，最终6x106个细胞。该实验的目的是证明结构化底部适用于具有更高细胞数量级的细胞悬浮液的固-液分离。待分离悬浮液的起始细胞密度增加，导致起始浊度增加。由于较高的初始浊度，除去了固体的流体中的浊度也在运行中增加。然而，相对浊度降低在整个运行过程中保持不变，并且与起始浊度无关(数据未显示)。总的来说，该细胞去除运行持续了大约12天。在整个运行期间，操作完全自动化且高度稳定。这些结果突出了该单元操作对稳定、长期、连续固-液分离的适用性。
使用具有常规底部的斜板式沉降器去除细胞
除了使用结构化底部进行的运行外，还使用传统的开放底部与相同的丙烯酸玻璃沉降部分组合。用常规底部洗涤收集的固体是不可能的。因此，收集的固体保持悬浮在其原始流动相中，因而，固体去除直接转化成了可溶产物的损失。未经预先优化，排放间隔为30分钟，体积约为12mL。根据给定时间窗口内的进料流量和排放体积，这将转化为11.4％的产物损失(产率＝排放体积[mL]/进料量[mL]＝排放流量[mL/min]×排放持续时间[min]/进料流量[mL/min]×排放间隔[min])。
该预期通过从葡萄糖手动测量计算的产率得到验证，其中发现平均为11.4％(图59B)。选定样品中FVIII活性的测定支持了基于葡萄糖的结果。这些数据还显示在收集的固体中FVIII产率为11.4％。在除去了固体的流体中，FVIII的产率约为100％，这使得FVIII的回收率高于100％(图60A)。固-液分离，即细胞去除，的效率不受底部概念改变的影响。顶部溢流中的细胞计数和浊度减少了>97％，并在整个实验过程中保持高度稳定(图59A)。
结论
使用丙烯酸玻璃沉降部分，观察实验期间细胞的去除。这些观察结果表明，细胞正如预期那样从板上滑下。此外，显示斜板式沉降器能够处理增加至少4倍的细胞密度，而不会对分离和澄清效率产生不利影响，前提是调整洗涤液密度以补偿更高的进料悬浮密度。将结构化底部与常规底部进行比较，证实在没有洗涤步骤的情况下产物损失增加。排放峰的形状以及循环中收集的细胞数量，随开放性底部波动，而结构化底部则高度稳定。
实施例12：EDTA作为柠檬酸盐的替代物用于重新溶解
在一些实施方案中，本发明包括重新溶解根据本发明的沉淀蛋白质的重新溶解步骤。这种重新溶解可以用柠檬酸盐进行(见上文)。然而，在该例中，EDTA被测试作为柠檬酸盐的替代物，用于重新溶解。在此之前，EDTA被排除在重新溶解的潜在候选之外，因为其对钙的高络合能力被认为对FVIII活性有害。
为了评估孵育时间和增溶剂本身，连续两天进行了两次沉淀实验。将第一天重新溶解的样品置于4℃直到第二天，并在第二天分析所有样品的FVIII活性。该实验获得的数据显示，使用柠檬酸盐重新溶解的样品的产率存在一些差异，而使用EDTA溶解后的产率与之相当(图61)。结果还显示，重新溶解样品的pH值存在明显差异，其中柠檬酸盐溶解样品的pH值约为10，EDTA样品的pH值在7.1和6.5之间。pH的差异可能会影响最终的FVIII。
由于上述实验中观察到产率差异，研究了柠檬酸盐和EDTA重新溶解的再现性。使用来自不同批次在>-60℃下储存不同时长的细胞培养上清，连续四天进行四次沉淀实验。实验条件保持不变，但有一个例外：第一个实验与以下三个实验的不同之处在于用于固-液分离的离心力。因此，沉淀的重新溶解更困难而且需要更多增溶剂。柠檬酸盐溶解后的pH值与离心力无关，但EDTA的rcf值较高时，pH值较低。EDTA溶解沉淀中较低的pH值也导致产率下降。值得注意的是，溶解后pH值的较大变化也反映在对应的产率值的较大变化上(图62)。在接下来的三个沉淀实验中，实验条件保持不变。通过使用1000g的较低离心力，可以获得稳定的柠檬酸盐和EDTA产率值。重新溶解后稳定的产率伴随着稳定的pH值。使用柠檬酸盐的最终pH值在pH 10左右的所有三四天都相对较高，相应的FVIII产率为69.0±0.6％。当使用EDTA进行再溶解时，溶解后的pH值明显较低，约为6.5，其中较低的pH值使得FVIII产率为96.3±4.5％。除了FVIII产率，还测定了相同样品的vWF产率。对于vWF，重新溶解后既没有观察到对pH的依赖性，也没有观察到对使用的增溶剂的依赖性。用柠檬酸盐获得的vWF产率为98.4±4.2％，用EDTA获得的产率为94.1±3.7％(图63)。因此，vWF的沉淀产率在实验条件下高度稳定。这些结果基于样本的vWF抗原含量。
因此，这些实验表明，与柠檬酸盐相比，使用EDTA进行再溶解在更高的FVIII产率方面是有利的。用柠檬酸盐获得的FVIII产率约为70％，而用EDTA获得的FVIII产率在不同的三天都>95％。使用这两种增溶剂，解冻的细胞培养上清以高度可重复的方式沉淀(SD<5％)。
实施例13：磷酸钙沉淀的pH的重要性
本发明包括根据本发明从流体中沉淀蛋白质的蛋白质沉淀步骤。优选地，本发明的方法的该步骤中，使用磷酸钙作为沉淀剂。在该实施方案中，对根据本发明的流体的pH值的影响进行了探索。
在上述一些实验之间观察到的产率差异可能是由于起始材料的差异。对于新鲜细胞培养上清(CCSN)，在沉淀时观察到更大的pH下降。由于磷酸钙沉淀的pH值依赖性，较低的最终pH值可能导致沉淀形成减少，进而可能导致FVIII和vWF产率降低。在以连续模式试验该假说之前，用新鲜的细胞培养上清进行分批沉淀实验。在沉淀前，将pH调节至8.5、8.75和9.0。所有其他参数，例如沉淀剂浓度、混合、样品体积、离心速度、增溶剂等，与实施例12中描述再现性实验中应用的条件保持一致。对于这些条件，使用不同的冻-融的CCSN批次的稳定产率已在实施例12中建立。这些结果与新鲜材料获得的结果之间的差异将因此归因于冻-融循环。新鲜CCSN获得的结果显示，当沉淀前的pH从8.5增加到8.75时，FVIII从80.1％增加到91.8％。沉淀上清液中残留的FVIII浓度(即活性)不随pH值发生明显变化。FVIII沉淀上清中的产率在沉淀前pH 8.5下为5.2％，在pH 9.0时降至3.5％。对于vWF，溶解沉淀中的产率随着pH值增加稳步增加，最高值为106.6％。高于100％的产率归因于抗原ELISA的误差。沉淀上清液中的vWF产率从pH 8.5下的6.8％降至pH 9.0时的2.0％。根据蛋白质产率，最高的pH值似乎是最有利的。然而，考虑到再溶解所需的EDTA消耗及其达到的浓缩系数(或体积减少)，中等pH值平衡了产率和浓度。浓缩系数在pH 8.5时最高，在pH 9.0时最低(表20)。
表20：在沉淀悬浮液和重新溶解后观察到的pH值，沉淀前不同pH设定值对应的EDTA消耗量和最终浓缩系数。
Figure BDA0003785012270000881
基于先前用新鲜CCSN进行的分批沉淀实验，预计vWF的产率约为80％，本实验中超过了该值。然而，在先前进行的实验中，沉淀悬浮液中的pH值(CSTR的pH)为7.75(起始pH值为8.5)。在使用新鲜CCSN的最新实验中，沉淀悬浮液中的最低pH值为8.03。当在不同起始pH值使用解冻的CCSN时，沉淀悬浮液中的pH值为8.14，其中起始pH值为8.5。如先前获得的用解冻CCSN获得的pH值再现于下表21中。结果表明沉淀后的pH对于实现高产率是关键的。虽然产物产率在pH 7.75和8.0(沉淀后)时下降，但当最终pH约为8.15时，发现两种蛋白质的产率均>90％。这些结果也支持了这样一种观点，即补偿起始材料的差异是在实际中是可行的。
表21：在先前实验中观察到的pH值。起始pH＝pH调节的目标pH，其中Tris调节的样品的pH值是计算得出的而非测量的。缓冲物质＝缓冲物质的浓度和名称。n.a.＝不适用。沉淀后pH。ΔpH＝“沉淀后pH”–“起始pH”
Figure BDA0003785012270000891
上诉使用新鲜获得的材料进行的分批沉淀实验表明，通过将起始pH从8.5增加到8.75，产物产率增加了约10％。在相关pH值下重复该实验以验证结果。结果数据与此前的发现相当。图65在图的左半部分展示了此前的结果，右侧展示了新的结果。在不同日期进行的重复之间的差异<6％，在预期范围内。第二次重复证实了测试pH值之间的相对差异。通过将pH设定值从8.5提高到8.75，在第一次沉淀实验中FVIII产率可以从80％提高到92％，在第二次沉淀实验中从86％提高到95％。在所有情况下，沉淀上清中都有少量的FVIII残留。
实施例14：具有优选参数的连续沉淀
材料和方法
细胞培养上清的连续沉淀
使用基本上也用于上述自动连续沉淀的自动化装置进行连续沉淀。以上(实施例7～10，材料和方法)也详细描述了操作参数。通过移除管式反应器并用开放的关键替换，对设置进行些许修改。目标pH值和作用限度的设置在定制软件中进行了修改，以将pH值调节至8.75而非8.5(见表22)。样品取自缓冲罐和CSTR的出口。
表22：pH控制参数的设定值。
pH控制参数 设定值
标称流量[mL/min] 0.04
p值[-] 0.3
临界pH[-] 8.5
下限pH[-] 8.7
目标pH[-] 8.73
上限pH[-] 8.74
固-液分离和重新溶解
通过在1000g、10分钟、4℃下离心从沉淀上清中分离沉淀。使用HeraeusMultifuge X3 FR外摆式转子离心机(Thermo Scientific)进行离心。在离心后重悬于3mLTBS-T缓冲液后，收集的沉淀重新溶解。通过逐步添加0.1M EDTA直至达到完全溶解来实现重新溶解。
结果
使用优化的起始pH值(即沉淀前的pH设定值，见实施例13)和作为优化的增溶剂(见实施例12)的EDTA进行连续沉淀过程。用这些优化的沉淀和增重新溶解条件进行了四次连续沉淀实验。
在沉淀悬浮液中观察到的pH值与图66中显示的图中的FVIII产率结果重叠。在前三个实验中，pH改变后的FVIII产率稳定且高。在第四个实验中，产率仍然稳定，但减少到80％左右。对于溶解的沉淀中的FVIII产率，也观察到类似的模式，其总结在图67A中。前三个实验的产率在74％和84％之间，而最后一个实验的产率为58％。所有四个实验的vWF产率相当。除了产率数据，表23还列出了重新溶解后手动测量的重新溶解样品的平均pH值。最后的连续沉淀实验，其中FVIII产率较低，在重新溶解的样品中也表现出较低的平均pH值。先前在实施例12的再现性研究期间已观察到类似的效果。与先前的这些发现一致，在最近的实验中，vWF产率不依赖于pH。
表23：在新鲜收获的连续沉淀期间采集的五个样品中发现的FVIII、vWF的平均产率和pH，加上所有四个实验的平均值和相应的标准差(SD)。
Figure BDA0003785012270000901
Figure BDA0003785012270000911
总之，对先前示例中描述的连续沉淀过程实施了两个改变。第一个变化涉及起始pH值，从8.5增加到8.75，第二个变化涉及增溶剂，从柠檬酸盐变成EDTA。通过对沉淀过程进行调整，连续过程中的FVIII产率可以从56％增加到74％(对比表24)。vWF产率保持不变。因此，预计FVIII产率在连续沉淀收集中增加相同数量的百分点(表24中的斜体字的预测值)。
表24：整个过程的产物产率总结。假设生物反应器中的产物浓度为100％。该产率值表示直到既定单元操作之前所有步骤的总和。改进的沉淀收集产率是基于改进的连续沉淀结果的估计值。
Figure BDA0003785012270000912
工业适用性
根据本发明的用于从流体连续回收蛋白质的方法可应用于回收各种商业上有价值的蛋白质，例如生物制药药物。根据本发明的制备药物组合物的方法，可以将这种生物制药药物配制成药物组合物。本发明的斜板式沉降器可用于根据本发明的从流体中连续回收蛋白质的方法。因此，本发明具备工业适用性。
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Claims (76)

1.一种从流体中连续回收蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：
使流体中的蛋白质沉淀的蛋白质沉淀步骤；和
将沉淀的蛋白质从流体中分离出来的蛋白质分离步骤；
其中，所有步骤在一个集成过程中进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法的所有步骤连续进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述蛋白质的分子量为250kDa以上，优选所述蛋白质的分子量为500kDa以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质沉淀步骤之前包含蛋白质的流体中的蛋白质浓度低于20μg/mL，优选在0.05～20μg/mL之间。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是凝血因子。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述蛋白质是凝血因子VIII。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是血管性血友病因子。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是包含凝血因子VIII和血管性血友病因子的蛋白质复合物。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质沉淀步骤中，使用沉淀剂沉淀蛋白质。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述沉淀剂选自如下：磷酸钙、聚乙二醇(PEG)、亲和配体、pH调节剂、有机溶剂如乙醇或丙酮、聚电解质如聚丙烯酸或聚乙烯亚胺，以及盐类。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，所述沉淀剂包括磷酸盐。
12.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，所述沉淀剂是磷酸钙、磷酸镁或磷酸锌。
13.根据权利要求9～12中任一项所述的方法，其中，所述沉淀剂为磷酸钙。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括向所述流体中添加钙离子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，添加所述钙离子至终浓度为10～50mM，优选10～30mM。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，添加所述钙离子至终浓度为10～20mM，优选约15mM。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括向所述流体添加磷酸根离子。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，添加所述磷酸根离子至终浓度为1～10mM，优选1～5mM。
19.根据权利要求17所述的方法，其中，添加所述磷酸根离子至终浓度为1～3mM，优选约2mM。
20.根据权利要求9～19中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀步骤包括混合包含蛋白质和沉淀剂的流体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述混合在选自如下的至少一种反应器中进行：连续搅拌釜反应器(CSTR)、管式反应器(TR)、分段流动反应器和冲击射流反应器。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中，所述混合在连续搅拌釜反应器(CSTR)中进行。
23.根据权利要求1～22中任一项所述的方法，其中，在沉淀蛋白质之前，将所述流体的pH调整至8.5～9.0，优选将pH调整至约8.75。
24.根据权利要求1～23中任一项所述的方法，其中，在沉淀蛋白质之后，所述流体的pH在6～7.5之间，优选6.5～7，最优选约6.5。
25.根据权利要求1～24中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质分离步骤中，将用于蛋白质分离的板式沉降器、连续切向流过滤或流化床离心用于从流体中分离沉淀的蛋白质。
26.根据权利要求1～25中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质分离步骤中，将用于蛋白质分离的板式沉降器用于从流体中分离沉淀的蛋白质。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述用于蛋白质分离的板式沉降器为斜板式沉降器，所述斜板式沉降器具有下部、上部和至少一个沉降通道，所述沉降通道用于使沉淀蛋白质沉降，所述沉降通道从下部延伸到上部，
在使用期间，斜板式沉降器被配置为定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸到上部，
所述至少一个沉降通道在上部连接到用于排出剩余流体的流体出口。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述沉降通道的长度在20～150cm之间，优选20～100cm，更优选20～80cm，更优选30～70cm，更优选40～60cm，最优选约50cm。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述用于蛋白质分离的板式沉降器的至少一个沉降通道连接到底部，所述底部包括至少一个入口通道和至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含沉淀蛋白质的流体供应至板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从所述至少一个沉降通道下降的沉降的沉淀蛋白质，
所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道之间以及在所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述连接到用于蛋白质分离的板式沉降器的底部还包括至少一个洗涤液供应通道，所述至少一个洗涤液供应通道用于将洗涤液供应至一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，与用于蛋白质分离的板式沉降器的同一沉降通道对应的所述至少一个洗涤液供应通道和所述至少一个收集通道通过所述洗涤液供应通道和所述收集通道共用的壁部的开口流体连接。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中，将所述包含沉淀蛋白质的流体通过所述至少一个入口通道供应至与用于蛋白质分离的板式沉降器连接的底部，并且通过所述至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液，
所述洗涤液的密度高于所述包含沉淀蛋白质的流体的密度，以及
所述剩余流体通过上部的流体出口排出，所述沉降的沉淀蛋白质通过收集通道排出。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述洗涤液的密度比所述包含沉淀蛋白质的流体的密度高0.3～1.5‰，优选比所述包含沉淀蛋白质的流体的密度高0.55～1.20‰。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中，所述洗涤液包含Tris和氯化钠。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为约2mM的Tris和浓度为约272mM的氯化钠。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中，所述洗涤液还包含氯化钙。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为4～12mM的氯化钙。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中，所述洗涤液包含浓度为约2mM的Tris、浓度为约231mM的氯化钠和浓度为约12mM的氯化钙。
39.根据权利要求32～38中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液的pH为7.5以上，优选8以上，最优选约8.25。
40.根据权利要求32～39中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以固定间隔供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以固定间隔排出。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以15～45min、优选约30min的固定间隔供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以15～45min、优选约30min的固定间隔排出。
42.根据权利要求32～41中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以约20～60mL/min、优选约40mL/min的体积流量供应，沉降的沉淀蛋白质通过收集通道以约20～60mL/min、优选约40mL/min的体积流量排出。
43.根据权利要求1～42中任一项所述的方法，其中，所述方法在蛋白质沉淀步骤之前还包括以下步骤：
在流体中培养细胞的蛋白质生产步骤，其中所述细胞生产蛋白质并将蛋白质释放至流体中；和
将细胞从包含蛋白质的流体中分离出来的细胞分离步骤。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述细胞为哺乳动物细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述细胞为中国仓鼠卵巢CHO细胞。
46.根据权利要求43～45中任一项所述的方法，其中，所述流体为细胞培养基。
47.根据权利要求43～46中任一项所述的方法，其中，在所述蛋白质生产步骤中，细胞在灌注反应器或恒化反应器中培养，优选在恒化反应器中培养。
48.根据权利要求43～47中任一项所述的方法，其中，在所述细胞分离步骤中，将用于细胞分离的板式沉降器用于从包含蛋白质的流体中分离细胞。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述用于细胞分离的板式沉降器为斜板式沉降器，所述斜板式沉降器具有下部、上部和至少一个沉降通道，所述沉降通道用于沉降细胞，所述沉降通道从下部延伸至上部，
在使用期间，所述斜板式沉降器被配置为定向，使得至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸到上部，
所述至少一个沉降通道在上部连接到用于排出剩余流体的流体出口。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，用于细胞分离的板式沉降器的所述至少一个沉降通道连接到底部，所述底部包括至少一个入口通道和至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含细胞和蛋白质的流体供应至板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从所述至少一个沉降通道下降的沉降细胞，
所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道之间以及在所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述连接到用于细胞分离的板式沉降器的底部还包括至少一个洗涤液供应通道，所述至少一个洗涤液供应通道用于将洗涤液供应至一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，与用于细胞分离的板式沉降器的同一沉降通道对应的所述至少一个洗涤液供应通道和所述至少一个收集通道通过所述洗涤液供应通道和所述收集通道共用的壁部的开口流体连接。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中，将包含细胞和蛋白质的流体通过所述至少一个入口通道供应至与用于细胞分离的板式沉降器连接的底部，并且通过所述至少一个洗涤液供应通道供应洗涤液，
所述洗涤液的密度高于所述包含细胞和蛋白质的液体的密度，以及
所述沉降的细胞通过收集通道排出，所述包含蛋白质的剩余流体通过上部的流体出口排出。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以固定间隔排出。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以5～90min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以5～90min的固定间隔排出。
56.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以15～85min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以15～85min的固定间隔排出。
57.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以25～80min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以25～80min的固定间隔排出。
58.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以35～75min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以35～75min的固定间隔排出。
59.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以45～70min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以45～70min的固定间隔排出。
60.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以55～65min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以55～65min的固定间隔排出。
61.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以约60min的固定间隔供应，所述沉降的细胞通过收集通道以约60min的固定间隔排出。
62.根据权利要求53～61中任一项所述的方法，其中，所述洗涤液通过所述至少一个洗涤液供应通道以50～70mL/min、优选约60mL/min的体积流量供应，所述沉降的细胞通过收集通道以50～70mL/min、优选约60mL/min的体积流量排出。
63.根据权利要求1～62中任一项所述的方法，其中，所述方法在蛋白质分离步骤之后还包括以下步骤：
将沉淀的蛋白质重新溶解的再溶解步骤。
64.根据权利要求63所述的方法，其中，在所述再溶解步骤中，使用柠檬酸盐或EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述再溶解步骤中，使用EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
66.根据权利要求65所述的方法，其中，所述再溶解步骤中，使用终浓度为10～50mM的EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
67.根据权利要求65或66所述的方法，其中，所述再溶解步骤中，使用终浓度为20～30mM的EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
68.根据权利要求65～67中任一项所述的方法，其中，所述再溶解步骤中，使用终浓度为约25mM的EDTA重新溶解沉淀的蛋白质。
69.根据权利要求1～68中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是生物制药药物。
70.可通过权利要求1～69中任一项所述的方法获得的回收的蛋白质。
71.用于生产药物组合物的方法，包括进行权利要求69所述的方法，并将回收的生物制药药物配制成药物组合物。
72.可通过权利要求71所述的方法获得的药物组合物。
73.一种用于从流体中分离固体成分的斜板式沉降器，其中，所述板式沉降器包括下部、上部和至少一个沉降通道，所述沉降通道用于沉降固体成分，所述沉降通道从下部延伸至上部，
在使用期间，所述板式沉降器被配置为定向，使得所述至少一个沉降通道在相对于重力方向倾斜的方向上从下部延伸至上部，
其中，所述至少一个沉降通道在上部连接到用于排出剩余流体的流体出口，并在下部连接到底部，
其中，所述底部包括至少一个入口通道和至少一个收集通道，所述至少一个入口通道用于将包含待分离的固体成分的流体供应至板式沉降器，所述至少一个收集通道用于收集从至少一个沉降通道下降的沉降成分，
其中，所述至少一个入口通道和所述至少一个收集通道彼此流体分离，所述入口通道和所述收集通道连接到所述至少一个沉降通道，以在所述至少一个入口通道和所述至少一个沉降通道之间以及在所述至少一个收集通道和所述至少一个沉降通道之间分别形成流体连接，
其中，所述底部还包括至少一个洗涤液供应通道，所述至少一个洗涤液供应通道用于将洗涤液供应到一个沉降通道或一个收集通道，所述至少一个洗涤液供应通道与其他洗涤液供应通道和所有入口通道流体分离，以及
其中，所述沉降通道的长度在20～150cm之间，优选20～100cm之间，更优选20～80cm之间，最优选30～70cm之间。
74.根据权利要求73所述的斜板式沉降器，其中，所述沉降通道的长度在40～60cm之间，优选约50cm。
75.根据权利要求73或74所述的斜板式沉降器，其中，所述固体成分为沉淀蛋白质，优选包含凝血因子VIII和血管性血友病因子的沉淀蛋白质复合物。
76.根据权利要求73～75中任一项所述的斜板式沉降器，其中，所述斜板式沉降器含有包含凝血因子VIII和血管性血友病因子的沉淀蛋白质复合物。
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