CN115368560A - 聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖聚合物及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具体涉及一种聚乙二醇‑嵌段‑聚甲硫氨酸‑接枝‑海藻糖聚合物及制备方法和应用。聚乙二醇‑嵌段‑聚甲硫氨酸‑接枝‑海藻糖聚合物具有下述化学结构；将聚乙二醇‑嵌段‑聚甲硫氨酸‑接枝‑炔丙基甘油醚、6‑叠氮‑海藻糖、五水硫酸铜、N,N,N,'N,”N”‑五甲基二乙基三胺溶于水中进行冻融循环，加入抗坏血酸钠脱气处理，并在室温反应；反应结束，将反应液置于透析袋中，用盐酸溶液透析，冻干后得到聚乙二醇‑嵌段‑聚甲硫氨酸‑接枝‑海藻糖。本发明的制备方法简单，合成条件温和；聚乙二醇‑嵌段‑聚甲硫氨酸‑接枝‑海藻糖用作葡萄糖氧化酶稳定剂在冻干后仍保留80～90％的活性。
Description
技术领域
本发明属于海藻糖聚合物及应用技术领域，具体涉及一种聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖聚合物及制备方法和应用。
背景技术
海藻糖是一种非还原性二糖，玻璃化温度114℃，在二糖中最高。存在于动物体内的海藻糖可以保护其抵御极端环境，如冷冻、炎热和干燥等条件，因此用作生物保护剂。在细胞和蛋白质的保存过程中添加海藻糖，可以抑制细胞的失活和蛋白质的变性、降解和聚集，从而维持细胞和蛋白质的结构和功能的稳定性(C.Olsson,H.Jansson,J.Swenson,J.Phys.Chem.B 2016,120,4723-4731)。
将海藻糖引入聚合物中，对蛋白质的保护作用会进一步增强。Maynard课题组以聚苯乙烯结构和聚甲基丙烯酸酯结构为主链，合成了四种连接方式不同的海藻糖聚合物，然后将这些聚合物用作辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的赋形剂，从而提高了酶在保存过程中的活性(J.Lee,E.-W.Lin,U.Y.Lau,et al.,Biomacromolecules 2013,14,2561-2569)。该课题组还将所制备的海藻糖聚合物与胰岛素偶联用于胰岛素的保护，偶联后的胰岛素在受到高温影响后仍能保持较高活性(K.M.Mansfield,H.D.Maynard,ACS Macro Lett.2018,7,324-329)。Langer课题组利用丙烯酸乙烯酯酰化海藻糖，并通过“硫醇-烯迈克尔加成”与三硫醇反应制备了海藻糖水凝胶，经过这种水凝胶保护的蛋白质在高温和冻干处理后依然能保持高稳定性(T.M.O'Shea,M.J.Webber,A.A.Aimetti,et al.,Adv.HealthcareMater.2015,4,1802-1812.)。到目前为止，海藻糖聚合物主要以碳链和生物降解性聚酯为主链，同时在聚合物合成过程中，需要对海藻糖结构中的羟基进行保护与脱保护，制备过程复杂，因此限制了海藻糖聚合物的广泛应用。
聚甲硫氨酸是一种由L-甲硫氨酸聚合而成的聚氨基酸，可以通过含有氨基的物质引发N-羧基L-甲硫氨酸环内酸酐开环聚合得到，具有良好的生物相容性和生物降解性。Deming等利用氨基封端的聚乙二醇作为引发剂，成功的制备了聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸，并通过各种取代基团对聚合物中甲硫氨酸的硫元素进行烷基化(J.R.Kramer,T.J.Deming,Biomacromolecules 2012,13,1719-1723)。当烷基化试剂为炔丙基甘油醚时，可以得到一种含有炔基基团的聚合物聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚，而炔基的引入可以用于后续各种功能化后修饰反应。
综上所述，蛋白质类生物分子的保存对于其功能的实现和延伸有重要意义，而高效安全的蛋白质稳定剂要求此类聚合物材料同时具有生物相容性，低毒性，可在蛋白酶作用下而降解等特点，同时制备条件温和简便。有关以一种聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖及其用于蛋白质保护方面的应用未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，通过合成步骤简单、反应条件温和的方法，制备一种聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖聚合物，并提供一种蛋白质稳定剂应用。本发明以聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚和6-叠氮海藻糖为原料制备了聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。这种聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖聚合物可用作葡萄糖氧化酶的稳定剂，以保护葡萄糖氧化酶在冷冻保存过程中免受破坏。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现。
一种聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖聚合物，具有下述化学结构：
化学结构m的值为23～227，n的值为25～500，聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的分子量为18～348kDa。
本发明的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的合成方法，将聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚、6-叠氮-海藻糖、五水硫酸铜、N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺溶于水中进行冻融循环，加入抗坏血酸钠脱气处理，并在室温反应；反应结束，将反应液置于透析袋中，用盐酸溶液透析，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
优选聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚、6-叠氮-海藻糖、五水硫酸铜、N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺的摩尔比为1:(25～500):(2.5～50):(5～10)。
优选反应时间为24～48小时。
透析过程中，优选透析时间为24～96小时，透析袋的截留分子量的范围为3500～20000。
本发明的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖具备可生物降解、生物相容性好和毒性低等特点，可用作蛋白质稳定剂。尤其作为聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖应用于作葡萄糖氧化酶稳定剂。
将聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖与葡萄糖氧化酶按照(100～200):1的质量比进行混合，然后将该混合物溶液在-40℃下进行冻干；样品经过冻干后测试葡萄糖氧化酶的催化活性。与酶的初始活性相比，经过冻干的样品仍保留80～90％的活性。
在反应步骤中，聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚具有如下所示的化学结构：
其中，该原料通过文献中的方法得到(J.R.Kramer,T.J.Deming,Biomacromolecules 2012,13,1719-1723)。聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚中，乙二醇重复单元m为23～227，甲硫氨酸重复单元的数目n为25～500，此m和n与对应产物聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖聚合物中相应重复单元聚合度一致。
本发明的优点在于，聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备方法简单，条件温和，具有实际使用价值；制备的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖用作葡萄糖氧化酶稳定剂在冻干后仍保留80～90％的活性。
具体实施方式
下面通过实施案例对本发明的技术方案作进一步的描述说明。以下具体的实施案例是对本发明的进一步说明，但并不限制本发明的适用范围。
实施例1：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.17g聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝45，n＝25)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺(摩尔比1:25:2.5:5)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入49.6mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应24小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析24小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝45，n＝25，分子量为18kDa。
实施例2：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.16g聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝45，n＝50)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺(摩尔比1:50:5:10)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入53.1mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应24小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析72小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝45，n＝50，分子量为36kDa。
实施例3：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.15g聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝45，n＝75)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺(摩尔比1:75:7.5:15)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入49.6mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应24小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为5000的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析96小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝45，n＝75，分子量为52kDa。
实施例4：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.15g聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝45，n＝100)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺(摩尔比1:100:10:20)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入55.6mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应36小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为5000的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析72小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝45，n＝100，分子量为69kDa。
实施例5：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.14g聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝45，n＝150)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺(摩尔比1:125:12.5:25)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入57.9mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应36小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为10000的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析72小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝45，n＝150，分子量为103kDa。
实施例6：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.14g聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝45，n＝200)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺1:200:20:40)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入59.2mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应48小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为10000的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析72小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝45，n＝200，分子量为137kDa。
实施例7：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.15g聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝23，n＝50)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺(摩尔比1:50:5:10)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入52.1mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应48小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析72小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝23，n＝50，分子量为34kDa。
实施例8：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.19g聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝113，n＝50)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺(摩尔比1:50:5:10)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入51.0mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应48小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为3500的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析72小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝113，n＝50，分子量为38kDa。
实施例9：
聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备：
将0.15g乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚(其中m＝227，n＝500)、0.18g 6-叠氮-海藻糖、12.5mg五水硫酸铜、21μL N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺(摩尔比1:500:50:100)溶于水中，进行3次冻融循环，后加入75.3mg抗坏血酸钠，再进行三次通氮气-抽真空循环，然后将反应恢复至室温并反应48小时。反应结束，将反应液置于截留分子量为20000的透析袋中，用0.1M的盐酸溶液透析96小时，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
上述反应得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖结构如下所示，其中，m＝227，n＝500，分子量为348kDa。
实施例10：
将实施例2中得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖与葡萄糖氧化酶按照质量比100:1溶于磷酸盐缓冲液中配制成溶液。将溶液置于-40℃中使溶液完全冻住，放入冻干机中冻干。冻干后的固体用相同体积的水溶解，置于4℃冰箱保存。测试时，将25μL0.2M葡萄糖溶液和25μL葡萄糖氧化酶溶液置于96孔板中并在35℃下孵育10分钟，加入50μL0.5μg mL-1的辣根过氧化物酶溶液和50μL 0.5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，1分钟后加入20μL 1M的硫酸溶液终止，使用酶标仪读取450nm处的吸光度。通过计算，经过6次冻干后的葡萄糖氧化酶可以维持80％的活性，而不加聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的葡萄糖氧化酶完全失活。
实施例11：
将实施例3中得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖与葡萄糖氧化酶按照质量比100:1溶于磷酸盐缓冲液中配制成溶液。将溶液置于-40℃中使溶液完全冻住，放入冻干机中冻干。冻干后的固体用相同体积的水溶解，置于4℃冰箱保存。测试时，将25μL0.2M葡萄糖溶液和25μL葡萄糖氧化酶溶液置于96孔板中并在35℃下孵育10分钟，加入50μL0.5μg mL-1的辣根过氧化物酶溶液和50μL 0.5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，1分钟后加入20μL 1M的硫酸溶液终止，使用酶标仪读取450nm处的吸光度。通过计算，经过6次冻干后的葡萄糖氧化酶可以维持85％的活性，而不加聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的葡萄糖氧化酶完全失活。
实施例12：
将实施例4中得到的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖与葡萄糖氧化酶按照质量比200:1溶于磷酸盐缓冲液中配制成溶液。将溶液置于-40℃中使溶液完全冻住，放入冻干机中冻干。冻干后的固体用相同体积的水溶解，置于4℃冰箱保存。测试时，将25μL0.2M葡萄糖溶液和25μL葡萄糖氧化酶溶液置于96孔板中并在35℃下孵育10分钟，加入50μL0.5μg mL-1的辣根过氧化物酶溶液和50μL 0.5mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，1分钟后加入20μL 1M的硫酸溶液终止，使用酶标仪读取450nm处的吸光度。通过计算，经过6次冻干后的葡萄糖氧化酶可以维持90％的活性，而不加聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的葡萄糖氧化酶完全失活。
本发明公开和提出的一种聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明精神、范围和内容内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (8)
1.一种聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖聚合物，其特征在于，具有下述化学结构：
2.如权利要求1所述聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖聚合物，其特征是，m的值为23～227，n的值为25～500，聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的分子量为18～348kDa。
3.如权利要求1所述聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的合成方法，其特征是，将聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚、6-叠氮-海藻糖、五水硫酸铜、N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺溶于水中进行冻融循环，加入抗坏血酸钠脱气处理，并在室温反应；反应结束，将反应液置于透析袋中，用盐酸溶液透析，冻干后得到聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖。
4.根据权利要求3所述的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的合成方法，其特征在于：聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-炔丙基甘油醚、6-叠氮-海藻糖、五水硫酸铜、N,N,N,'N,”N”-五甲基二乙基三胺的摩尔比为1:(25～500):(2.5～50):(5～10)。
5.根据权利要求3所述的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的合成方法，其特征在于：反应时间为24～48小时。
6.根据权利要求3所述的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖的合成方法，其特征在于：透析过程中，透析时间为24～96小时，透析袋的截留分子量的范围为3500～20000。
7.权利要求1的聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖应用于作葡萄糖氧化酶稳定剂。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将聚乙二醇-嵌段-聚甲硫氨酸-接枝-海藻糖与葡萄糖氧化酶按照(100～200):1的质量比进行混合，然后将该混合物溶液在-40℃下进行冻干；样品经过冻干后测试葡萄糖氧化酶的催化活性。
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