CN115364204A - 个体化抗癌主动免疫的综合调动及抗癌免疫力的监测 - Google Patents

Abstract

本发明提供了个体化抗癌主动免疫的综合调动及抗癌免疫力的监测。具体地，本发明采用高剂量寡分割半程放疗或不损伤免疫力低剂量半程化疗诱导“原位疫苗”，并将手术或穿刺活检获得的肿瘤组织制备成单细胞悬液，用一种便携式X线细胞照射仪施于放射压力，诱导“促生抗死”的新抗原(neoantigen)，制备个体化瘤苗，联用免疫增强剂/免疫检查点抑制剂等，达到强化个体抗癌主动免疫，并在治疗全过程用成套试剂盒动态监测患者个体的细胞及体液抗癌免疫力的治疗前后的变化。此发明为抗癌主动免疫治疗与监测提供新途径。

Description

个体化抗癌主动免疫的综合调动及抗癌免疫力的监测

技术领域

本发明涉及个体化抗癌主动免疫的综合调动、个体化瘤苗制备及治疗前后抗癌细胞/体液免疫力改变的监测及试剂盒建立。

背景技术

肿瘤为人类的主要死亡原因。传统的肿瘤治疗主要分为手术、化疗、放疗及免疫治疗。尽管肿瘤的诊断和治疗的方案不断得到改进及水平不断提高，但大部分肿瘤的5年生存率仍然未有明显改善。

现有常规是：外科医生对能够切除的肿瘤，上手就切，对手术中挤压入血的肿瘤细胞，无所防患。对不能能够手术切除的肿瘤，多由肿瘤内科，进行化疗(细胞毒性药物)，即杀伤肿瘤细胞，亦杀伤增殖旺盛的正常组织细胞，造成骨髓干细胞损伤的血细胞降低；胃肠干细胞损伤的食欲不振、恶心呕吐；皮肤干细胞损伤的脱发，患者难以忍受。同时，化疗的“杀敌八百，自损一千”损伤了自身免疫力，大大降低抗癌效应。对化疗杀灭不了的肿瘤，再由放疗处理时，则在自身免疫力受到化疗损伤的情况下，放疗诱导的“原位疫苗”的远隔效应也难以显现。

事实上，主动免疫是人体抗癌的主力军。以调动自身主动免疫为目的的序贯串联放疗-手术-靶向治疗/化疗是提高抗癌疗效的关键。

不可否认，疫苗是人类医学史上最伟大的发明之一。病原体的疫苗消除减少了天花、麻疹、脊髓灰质炎、结核病、麻风、白喉、百日咳、破伤风、狂犬病、肝炎、流感等曾经横扫世界、令人生畏的多种传染病。我们认为，抗癌之路也必须使用肿瘤主动免疫治疗，包括肿瘤疫苗。

现有的免疫治疗(抗PD-1,抗PD-L1,CAR-T，抗CD19/CD20)均为过继性免疫治疗。个体化主动免疫新型疫苗不存在工业化生产过程，故属于三类医疗技术。

利用手术或穿刺获得的患者自身肿瘤组织，经过GLP实验室的肿瘤细胞培养、诱导肿瘤抗原后，均浆，定蛋白含量，分装冻存，为患者个体瘤苗。根据患者治疗需要，随时取出其瘤苗，进行风险较小的患者本人皮内注射，辅以常规免疫增强剂(如GM-CSF/IL2等)，诱导患者本人具有长期记忆的个体化主动免疫反应。

整个制备过程仅需3天，快速，简便及经济。无工业生产介入。

在经济上，这一新型瘤苗疗法是每个肿瘤患者及国家医保均可负担得起。

过继免疫治疗与主动免疫治疗的区别点如下表：

不同点	过继免疫治疗	主动免疫治疗
			抗体/细胞输入	有	无
治疗途径	静脉注射	皮内注射
			疗效维持时间	天--月--年	月--年--永久
细胞免疫记忆	无--弱	有，可极强
			治疗后复发	较快	待探讨
治疗费用	高昂(几十万)	低廉(1-2万)
			工业化生产	必须	不需
三类医疗技术	不是	是
			个体化程度	弱	绝对个体化

2013年后新兴的免疫治疗，如免疫调节点抑制剂(如抗PD-1、抗PD-1、抗CTLA-4等)的应用，越来越受到关注。但是，已经发现这些过继性、抗体性疗法的有效率不高，副作用堪忧。细胞为载体的免疫治疗，(如CART、DC、CIK等)制备繁琐，周期长，应用条件苛刻，疗效不确切，价格昂贵。

2017年后寻找制备肿瘤新抗原、开展抗癌主动免疫又成为免疫治疗的新热点^14-16。肿瘤疫苗的研制是目前肿瘤生物治疗的最主要的方向。

肿瘤主动免疫的焦点在肿瘤抗原上。肿瘤特异性抗原的发现及纯化是几十年都无法解决的难题。目前发现使用的抗癌靶点多为肿瘤相关抗原(TAA，tumor associateantigen)，无肿瘤特异抗原(TSA，tumor specific antigen)。肿瘤特异抗原迄今仍然是个“黑匣子”。我们认为，唯有机体免疫能够有效地识别这一“黑匣子”，从而造成持久的、记忆性的主动免疫抗癌反应。如同世界上没有二片叶子是一模一样的，每个肿瘤的抗原是个体特异性的，因此，瘤苗必须个体化。用自身瘤苗调动自体抗癌免疫，只有这样才能最简单最方便最有效地解决(1)肿瘤的个体化、异质性问题；(2)免疫的个体组织相容性问题，抗原提呈的双信号问题；(3)肿瘤特异抗原的多价性问题，癌蛋白(onco-protein)的变异不是单一的，而是多个。一个一个找出，再合并应用，耗时耗工，即繁琐又昂贵，难以应对数以千万的肿瘤患者，实用性不强^14-16。

事实上，在肿瘤的四大疗法中，放疗/靶向治疗能够在不损伤机体免疫力的情况下，有效诱导释放肿瘤抗原，在3-4周内激发机体主动抗癌免疫。这能够为杀伤手术中释放的肿瘤细胞做好准备，同时，也使肿瘤缩小，手术负荷降低，一举两得。我们认为，手术前放疗是为了诱导释放肿瘤抗原，与常规治疗肿瘤的放疗不相同，故其特点为：(1)半治疗量，即24-32Gy放疗，即足够诱导抗原释放，又不造成周围组织过多损伤，不影响手术伤口愈合；(2)使用SBRT等精准放疗，在4-10Gy/次照射剂量才能够较好有效诱导能够被机体免疫识别的肿瘤新抗原的产生及释放；(3)放疗诱导的免疫反应产生所需的时间为3-4周，之后方可进行手术，以期靠已经产生的自身免疫力杀伤手术中挤压释放的肿瘤细胞，铲除这些转移复发的“祸根”。

手术之后的肿瘤组织是极其宝贵的、可制备个体化瘤苗的资源。但是，目前除了放入福尔马林，送病理外，极少人将其“变废为宝”地收集起来。即使有收集者，亦多直接冻存已经“免疫逃逸”的肿瘤，这种标本只能反映肿瘤能够在体内生长的变异，可用于DNA/RNA及免疫耐受抗原蛋白的分析，但作为瘤苗是不合理的。

手术切下的肿瘤是已经能够逃逸机体免疫识别的，必须在体外经过我们特殊“stress”处理，才能够诱导出为自体免疫系统识别新抗原(neoantigen)。

2017年在美欧又重新掀起使用肿瘤抗原的主动免疫治疗的新热潮，中国不少商业运营也快速照搬照抄。美欧研发的方法无非是用分子生物学手段，将可能检测到的突变基因转化为肿瘤抗原，将它们从免疫识别的“阈下”调到“阈上”。整个过程看似“高、大、上”，实质上是“少、慢、差、费”。整个肿瘤抗原制备的过程至少3-4个月，程序复杂，步骤繁多，技术难度大，价格高昂，在临床应用的可行性极小，即不适合患者肿瘤快速发展病情，也不适合中国肿瘤患者基数大的国情。

与之相比，我们的新型瘤苗具有以下超越现有主动免疫方法(如美欧瘤苗)的优势见图34。

瘤苗曾经热火过，但这些“老瘤苗”的制备者们忽视了一个基本事实，即肿瘤能够生长成瘤，证实了它已经逃逸了机体免疫监视。改变这一状况的唯一办法是：上调肿瘤抗原，让机体免疫重新识别这些能够促进肿瘤生长/复发转移的“新抗原”(Neoantigen)。

本发明的新型瘤苗与老瘤苗的不同之处在于：

除了急需序贯串联多种抗癌治疗及建立新型瘤苗的诱导制备及使用方法外，我们看到，目前一个巨大问题是临床上没有监测肿瘤病人抗癌治疗前后，机体抗癌免疫力改变的检测及相应试剂盒。临床医生无法知道患者各种治疗后的体抗癌免疫力状况，无法指导或盲目使用免疫治疗；患者本人不知道何时应当使用或停止增强免疫力的食品/药品，无的放矢，造成物力、财力的巨大浪费。本发明填补空白，建立了能够反映机体抗癌免疫力改变的检测及相应试剂盒，其中包括监测体液免疫反应的抗癌抗体试剂盒，及监测细胞免疫反应抗癌淋巴细胞转化、活化的抗癌CD4/CD8/NK细胞及免疫抑制细胞(MDSC)的检测试剂盒，以有的放矢地指导增强个体免疫力的抗癌治疗方案及有根据地判断疗效及预后。

发明内容

本发明具体地含有以下几个先后序贯步骤：第一步：首先用立体定向放射治疗(约24-32Gy，4-10Gy/次，寡分割)或不损伤免疫力低剂量半程化疗为起始，形成“原位疫苗”，诱导产生自身抗癌主动免疫；第二步：在有了放疗/半程化疗诱导的自身抗癌免疫力的保护下，进行肿瘤手术切除，让免疫细胞杀伤手术中挤压入血的肿瘤细胞(反复转移的祸根)；第三步：将手术切下(或穿刺)获取的肿瘤在生物压力下进行单细胞培养，以制备含大量表达“促生抗死”癌蛋白的个体化肿瘤抗原(自身瘤苗)；第四步：根据手术后病理及影像报告决定自身瘤苗的使用时间：如无转移，则在术后一周左右四肢多点皮内注射自身瘤苗，以进一步诱导全身性抗癌免疫力；如有转移，则先进行靶向治疗/化疗，去除残余的、手术无法去除的多发肿瘤。靶向治疗时，可实施个体化瘤苗免疫；常规化疗时，则待化疗结束后再实行自身瘤苗的主动免疫治疗，以产生持久的、有记忆性的抗癌效应，抑制肿瘤细胞的转移及其导致的肿瘤复发。第五步：如果出现寡复发转移灶，则重复上述1-4个步骤；如果起始诊断即为不可手术的多个病灶或出现多个复发转移灶，无法手术解决，则以放疗为主，射线杀伤所有可见肿瘤灶，并辅以靶向治疗，诱导对新肿瘤抗原的主动免疫反应。放疗/靶向治疗后1-2个月，给于个体化瘤苗(穿刺获得肿瘤组织)及细胞免疫调节剂治疗。

本方法以增强个体抗癌主动免疫力贯穿肿瘤治疗的始末，开创性地序贯串联有机整合肿瘤的四大疗法。以半程放疗/化疗为起始(可加入免疫增强剂，如GM-CSF等及免疫抑制阻断剂)，即诱导“原位疫苗”来杀伤手术释放的癌细胞又减小肿瘤手术负荷；术后用靶向治疗/化疗系统性一过性地去除残余癌细胞，化疗结束一个月后(待化学细胞毒性过后)再用自身瘤苗的四肢皮内注射，全身性地诱导主动免疫，继续杀灭残余癌细胞。

为监测个体化抗癌主动免疫的综合调动激发的对自体肿瘤的体液及细胞免疫反应，本发明同时建立监测不同阶段治疗前后个体化抗癌免疫力的改变的监测试剂盒(包括抗癌淋巴细胞转化、抗癌抗体，活化的抗癌CD4/CD8/NK细胞及MDSC等免疫抑制细胞的检测)，以有的放矢地指导增强个体免疫力的治疗方案。

在本发明的第一方面，提供了一种个体化抗癌主动免疫的综合调动及抗癌免疫力的监测贯穿肿瘤治疗始末的方法，对肿瘤患者以主动免疫疗法(放疗诱导原位疫苗+瘤苗诱导自身主动抗癌免疫反应+免疫调节)进行治疗，并在治疗全过程用动态监测个体细胞及体液抗癌免疫力的变化，

所述方法包括步骤：

(1)以半治疗量放射(约24-32Gy，4-8Gy/次，4-6次，寡分割)或不损伤免疫力的低剂量半程化疗为起始，可联用GM-CSF等免疫增强剂，结束后加入免疫抑制阻断剂；

(2)利用手术或穿刺获得的肿瘤组织，在生物压力下进行单细胞培养，以制备含大量表达“促生抗死”癌蛋白的个体化肿瘤抗原的自身瘤苗；

(3)将上一步骤制备的自身瘤苗施用于所述肿瘤患者，所述施用为多点皮内注射；

其中，使用多点皮内注射自身瘤苗接种的时间基于术后病理、影像报告、及病情状态加以决定：

(A)如无转移，则手术后1-2周用自身瘤苗皮下注射，以诱导抗自身肿瘤的主动免疫反应，系统性地持久性地杀伤微小转移灶；

(B)如有转移，则进行靶向治疗(生长受体抗体/激酶抑制剂、血管生长抑制剂、免疫调节剂等)，可联合瘤苗免疫；如果为化疗，则待化疗结束后2-4周再实行自身瘤苗的主动免疫治疗；

其中，在施用自身瘤苗之前、之中或之后时，可加用免疫增强剂，如GM-CSF，胸腺素28肽/5肽等，免疫抑制阻断剂(如抗PD-1,抗PD-L1,抗CTLA-4等免疫负调节抑制剂、抗CD47等)及各种细胞性治疗；

其中，如果第一轮治疗后肿瘤复发转移，可重复使用上述序贯串联的个体化抗癌主动免疫的综合调动；或以放疗杀伤多点可见肿瘤灶，辅以靶向治疗及免疫调节/增强药物，谨慎使用化疗，减少对抗癌免疫细胞的杀伤；

并且，在放疗、靶向治疗/化疗及免疫调节/增强治疗的前后，动态监测患者抗癌细胞及体液免疫力的变化，以指导治疗及判断预后，所述的监测选自下组：

A.抗癌细胞免疫力监测：以细胞培养、荧光染色及流式细胞仪等技术配合，监测肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化、活化的抗癌CD8⁺IFNγ⁺、CD4⁺IFNγ⁺、NK⁺IFNγ⁺、MDSC细胞等；代表免疫细胞激活的CD25表面标志等；

B.抗癌体液免疫力监测：以酶联免疫法监测抗癌抗体滴度、IL2、IL6、IFNγ等。

在另一优选例中，所述的免疫增强剂或免疫抑制阻断剂可在自身瘤苗之前、之中或之后加用，包括：在瘤苗免疫之前的1周至之后的2周，较佳地，在免疫自身瘤苗之前3天至之后的5天。

(4)肿瘤组织在生物压力下进行单细胞培养，所述的生物压力为高温、低氧及射线，优选为射线，使用一种便携式X线放射仪装置。

在另一优选例中，所述的肿瘤为：实体瘤或非实体瘤。

在另一优选例中，所述的实体瘤来源于：脑、肺、头颈部、皮肤、胰、胃肠道、膀胱、生殖道、脊髓、脾、肾、肝、四肢、骨骼、舌、或喉；和/或所述的非实体瘤来源于血液或骨髓。

在另一优选例中，所述的肿瘤为原发性肿瘤或继发转移性肿瘤，其肿瘤灶可为寡肿瘤或多发多点。

在另一优选例中，所述的肿瘤来源于人的组织或非人哺乳动物组织。

在另一优选例中，所述处理手术或穿刺获得的自体肿瘤为单细胞的方法可选自：用机械剪切法或磨碎肿瘤组织法，将肿瘤组织处理为可培养的、分离的自体或同源肿瘤细胞。

在另一优选例中，体内照射方法可以为常规放疗或SBRT或质子/中子/重离子放疗，诱导“原位疫苗”；所述自体瘤苗是在生物压力下进行单细胞培养，以制备含大量表达“促生抗死”癌蛋白的个体化肿瘤抗原的自身瘤苗制备的，并且所述自体瘤苗被用于制备预防治疗肿瘤及抗癌免疫力监测的组合物。

在另一优选例中，放射线来源于天然的或人工的放射源；所述的放射线处理选自下组：X/γ线、电子/质子/中子/重离子放射线,以4-10Gy/次，处理自体肿瘤细胞，获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞作为个体化自身瘤苗。所述放射线处理以0.5-10Gy/min剂量率进行。所述的细胞放射线处理的总剂量为4-12Gy/次，时间1-20分钟(较佳地2-10分钟)。细胞培养时间为1-3天。

在另一优选例中，所述照射的肿瘤可为寡肿瘤或多发多点肿瘤或其中较大的、引起症状的肿瘤。

在另一优选例中，所述处理手术或穿刺获得的自体肿瘤为单细胞的方法可选自：用机械剪切法或磨碎肿瘤组织法，将肿瘤组织处理为可培养的、分离的自体肿瘤细胞。

在另一优选例中，肿瘤细胞的生物压力包括各种物理性处理，如高温、缺氧、或放射线处理；

所述的放射线处理选自下组：用选自X/γ线、电子/质子/中子/重离子放射线,以4-10Gy/次，处理自体肿瘤细胞，获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞作为个体化自身瘤苗。

在另一优选例中，所述放射线辐照处理以0.5-10Gy/min剂量率进行。

在另一优选例中，所述的培养处理时间为1-3天。

在另一优选例中，所述培养处理中，使用基本细胞培养液，可加入无抗原性的小分子细胞生长刺激物。

在另一优选例中，所述瘤苗灭活处理可用以下方法：超声破碎细胞灭活法、反复细胞冻融、低渗破裂法、匀浆、或以上的组合。

在另一优选例中，所述放疗、靶向治疗及自身瘤苗免疫时可加用免疫增强剂(如GM-CSF、IL-2、胸腺激素28肽或5肽、中药)等，免疫抑制阻断剂(如抗PD-1、抗PD-1、抗CTLA-4等免疫负调节抑制剂、抗CD47等)。

在另一优选例中，所述的瘤苗佐剂亦可选自下组：脂质体、细胞因子(如G-CSF、CSF、IFNr、IL-2、IL-9，IL-12等)，各种植物蛋白、DNA、减活或灭活病毒、细菌、真菌、微生物、或其及代谢物的不同组合。

在另一优选例中，如果使用常规全程化疗，在细胞毒性化疗后2-4周方使用自身瘤苗。

在本发明的第二方面，提供了一种自体瘤苗的用途，所述自体瘤苗是在生物压力下进行单细胞培养，以制备含大量表达“促生抗死”癌蛋白的个体化肿瘤抗原的自身瘤苗制备的，并且所述自体瘤苗被用于制备预防治疗肿瘤及抗癌免疫力监测的组合物。

在另一优选例中，所述的生物压力是用放射线辐照处理所述肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的放射线辐照处理的总剂量为4-10Gy/次，时间1-20分钟(较佳地2-10分钟)。

在另一优选例中，所述的放射线处理选自下组：用选自X/γ线、电子/质子/中子/重离子放射线,以4-10Gy剂量/次，处理自体肿瘤细胞，从而获得抗原性和抗原提呈性增强的肿瘤细胞作为个体化自身瘤苗。

在另一优选例中，所述放射线辐照处理以0.5-10Gy/min剂量率进行。

在本发明的第三方面，提供了一种抗癌免疫力检测试剂的用途，所述的检测试剂包括用于检测CD8⁺IFNγ⁺、CD4⁺IFNγ⁺、NK⁺IFNγ⁺、MDSC细胞与肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化的试剂盒及体液免疫反应的抗癌抗体试剂盒，所述试剂盒用于在治疗不同阶段监测抗癌治疗前后个体化免疫力的改变。在另一优选例中，所述的试剂盒还用于监测肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化。

在本发明的第四方面，提供了一种便携式X线照射仪装置，用于细胞照射，包括：

高压变电系统：所述高压变电系统提供95-110KV/高压电下使X线发射球管输出高能X线；X线放射室：所述X线放射室提供0.5-2Gy/min的X线对受照射细胞作用的密封(约30X30X30cm³)安全环境；散热系统：所述散热系统及时散发高压变电系统的产热，控制X线发射球管的工作温度范围在10-50℃；控制系统：所述的控制系统可调节改变高压变电系统的电压及电流，使X线发射球管产生所需放射剂量率(约0.5-2Gy/min)；安全防护系统：所述安全防护系统提供六面铅板全密封，防止X线外漏，保证仪器外面射线强度不高于所处外界环境；感知X线放射室门紧闭时方可启动X线发射球管发出射线。

附图说明

图1显示放射诱导肿瘤细胞产生新肿瘤抗原(肿瘤蛋白2D电泳及Westernblotting)。

图2显示受到照射后肝癌细胞及其外泌体与肝癌患者血浆外泌体产生新的癌蛋白。

图3显示放疗后肝癌血浆/肝癌细胞株的外泌体上调蛋白在人肝癌与癌旁组织的表达差异。照射后产生新的癌蛋白在肝癌组织的表达量大于癌旁组织，提示可能的促癌作用。

图4显示放疗后肝癌血浆/肝癌细胞株外泌体的上调蛋白CD151/KPNA2表达量与临床预后差相关。

图5显示模拟临床放疗诱导“原位疫苗”的临床前动物抗原位癌有效性实验方案。

图6显示不同放射免疫方案产生了不同的抑制再种植肿瘤生长的抗癌效应。

图7显示模拟临床放疗诱导的“原位疫苗”对肺转移癌抑制的临床前动物实验方案。

图8显示放疗诱导“原位疫苗”对动物实验性肺转移癌的抑制效应。

图9显示放疗诱导“原位疫苗”对小鼠肺转移癌的抑制及生存的延长。

图10显示放疗诱导“原位疫苗”产生的抗肿瘤抗体及淋巴细胞转化增强(特异性免疫的监测)。

图11显示本发明设计的个体化抗癌体液及细胞免疫力监测的方法及成套项目检测试剂盒。

图12显示甲状腺癌¹³¹I内照射后诱导2/3甲癌的抗癌淋巴细胞转化升高。

图13显示甲状腺癌¹³¹I内照射后诱导的抗癌抗体滴度在有病灶的甲癌患者(清灶)的升高比无可见病灶的甲癌患者要高。

图14显示甲状腺癌¹³¹I内照射后诱导的免疫炎症因子(IL-1β及CXCL16)升高。

图15显示弥漫性大肝癌的大剂量SBRT放疗(8Gy/1次)后肝癌的缩小。

图16显示肝癌的大剂量SBRT放疗后血中抗癌淋巴细胞转化在10--43天的动态升高，说明大剂量SBRT放疗可以诱导抗癌细胞免疫反应。

图17显示肝癌的大剂量SBRT放疗43天后血中活化的抗癌CD8⁺IFNγ⁺T细胞明显升高。

图18显示肝癌的大剂量SBRT放疗后血中不同免疫细胞因子在不同时间点升高。

图19显示肝癌的大剂量SBRT放疗43天后血中抗肝癌抗体滴度仍然升高。

图20显示鼻咽癌放疗后产生抗鼻咽癌抗体的动态变化，5--6周明显升高。

图21显示鼻咽癌化疗放疗前后淋转及免疫细胞亚群的动态变化，化疗中抗癌免疫力降低，之后升高，放疗诱导“原位疫苗”，使抗癌免疫力升高。

图22显示使用新型肿瘤疫苗(瘤苗)主动免疫在动物体内有效性实验方法。

图23显示新型瘤苗诱导主动免疫能够抑制皮下接种的原位癌生长(活体成像)。

图24显示新型瘤苗主动免疫后的抗原位癌的动态效应。

图25显示新型瘤苗主动免疫后需要3-5周产生抗肿瘤效应的个体动态观察。

图26显示新型瘤苗主动免疫后产生的抗肺转移癌效应。

图27显示新型瘤苗蛋白对瘤苗主动免疫后血中免疫杀伤细胞的激活转化。

图28显示新型瘤苗主动免疫后强化抗癌细胞免疫效应：T细胞杀伤肿瘤细胞能力增强；抗癌抗体明显升高。

图29显示新型瘤苗主动免疫诱导增强肿瘤抗原的提呈及抗癌抗体生成。

图30显示新型瘤苗接种8周后血中CD4+、CD8+T细胞升高、抑制性Treg降低。

图31显示新型瘤苗主动免疫后，抑制性MDSC降低。

图32显示“原位疫苗”联合个体化瘤苗可全面调动机体抗癌免疫力

图33显示新创的个体化主动免疫治疗的流程图。

图34显示本发明与现有主动免疫方法治疗的不同点。

图35显示个体化瘤苗临床I期(毒副作用)状况小结。

图36显示个体化瘤苗临床I期免疫后的发热程度及发生率。

图37显示个体化瘤苗接种后临床全身及局部反应规律。

图38显示个体化瘤苗接种后7--41天未见产生自身免疫抗体。

图39显示个体化瘤苗接种后未见诱发自身免疫性抗体。

图40显示不同疗法对肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化的影响(食道癌，16例)，GM-CSF有助于激发放疗抗癌免疫反应。

图41显示GM-CSF增强放疗诱导的抗癌淋巴细胞转化、CD4+IFNγ+、CD8+IFNγ+的T细胞免疫反应。

图42显示本发明的关键点“个体化抗癌主动免疫的综合调动：四大疗法有机结合”的有机合理序贯串联组合的步骤。

图43显示本发明研发的用于制备个体化瘤苗的便携式X线细胞照射仪，包括高压变电系统：所述高压变电系统提供95-110KV/高压电下使X线发射球管输出高能X线；X线放射室：所述X线放射室提供0.5-2Gy/min的X线对受照射细胞作用的密封(约30X30X30cm³)安全环境；散热系统：所述散热系统及时散发高压变电系统的产热，控制X线发射球管的工作温度范围在10-50℃；控制系统：所述的控制系统可调节改变高压变电系统的电压及电流，使X线发射球管产生所需放射剂量率(约0.5-2Gy/min)；安全防护系统：所述安全防护系统提供六面铅板全密封，防止X线外漏，保证仪器外面射线强度不高于所处外界环境；感知X线放射室门紧闭时方可启动X线发射球管发出射线。

图44显示本发明研发的细胞放射仪的剂量率表。

图45显示本发明研发的细胞放射仪及变电仪的实物照片。

具体实施方式

本发明提供了抗癌主动免疫的综合调动策略。具体地，本发明人经过长期实验室与临床研究(详见附图1-39)，证实了局部肿瘤放疗能够诱导“原位疫苗”，促进新的“癌蛋白(Neoantigen)”的表达，激发机体抗癌细胞及体液免疫反应，从而抗“原位癌”及“转移癌”。同时，制备个体化瘤苗，在适当时间多点皮内免疫患者本人，调动患者全身抗癌免疫力，从而抗“原位癌”及“转移癌”。

这一“序贯串联肿瘤的放疗、手术、化疗及免疫治疗”是从放疗诱导免疫起始，为手术提供杀伤术中释出的肿瘤细胞提供免疫力，再视情进行全身性的靶向治疗/化疗，杀伤手术无法去除的散在的肿瘤细胞。同时，在无化疗抑制免疫细胞的情况下，用手术获得的经过诱导的个体肿瘤细胞制备的瘤苗多点皮内免疫患者本人，强化全身性抗癌免疫力，从而抑制肿瘤生长及转移。如果在治疗后出现复发寡转移灶，则重复上述放疗→手术→化疗/靶向治疗→瘤苗免疫；如果出现多个复发转移灶，无法手术解决，则以放疗为主，射线杀伤所有可见肿瘤灶，诱导对新肿瘤抗原的主动免疫反应，并辅以靶向治疗、抗体或细胞免疫调节治疗。

同时，为监测不同疗法的各个阶段抗癌治疗后个体免疫力变化，本发明建立了数个诊断试剂盒，包括抗癌抗体、抗癌淋巴细胞转化、肿瘤抗原活化的CD4⁺IFNγ⁺、CD8⁺IFNγ⁺的T细胞及NK⁺IFNγ⁺细胞、抑制性免疫细胞(MDSC等)的检测，以指导临床治疗及预后判断。

本发明的核心是“个体化抗癌主动免疫的综合调动”，关键是“以放疗或个体化新型瘤苗二种手段来调节增强个体化抗癌主动免疫力”，达到四大疗法的有机合理序贯串联，以精准抗癌。其序贯串联有机组合的步骤见图42。

这一四大疗法的有机组合的优点见图32。

本研究数据表明，放疗能够诱导“癌蛋白(Neoantigen)”的产生与释放。视肿瘤部位不同放疗耐受力不同，诱导免疫的放疗剂量可为单次大剂量(6-10Gy)或多次小剂量(4-5Gy X 4-6次)，总剂量16-30Gy。射线可为电子、质子、中子，照射肿瘤越精准越好，减少对周围正常组织损伤，以不影响下步手术伤口的愈合。放疗期间，可以使用GM-CSF，胸腺素、合理膳食等助力放疗诱导的抗癌免疫力形成。

半程放疗或化疗约一个月后，手术在有“原位疫苗”诱导的抗癌免疫力下进行，确保手术挤压的肿瘤细胞被放疗激发免疫力杀伤。

A.个体化主动免疫瘤苗的制备及使用

手术取下的肿瘤可正中切开，在不破坏边缘结果(不影响病理检查)的情况下，取出0.1--2g肿瘤组织，置入无菌培养液，尽快送GLP实验室。

实验室在无菌条件下，去除血管、血细胞等正常组织，用剪切、200-250目钢网上扁镊机械研磨、尼龙网过滤等步骤获得肿瘤单细胞，物理法诱导上调肿瘤抗原，肿瘤细胞在无血清DMEM中培养1-2天后，收集细胞，低渗、冻融、超声等物理手段破碎细胞，获取肿瘤蛋白，BCA法定量蛋白浓度。根据肿瘤蛋白浓度及获得量，分装入2ml试管，每支为0.1--1mg。低温冻存至使用。本瘤苗与现有主动免疫方法(如美国或德国免疫学家)制备的多肽或mRNA瘤苗有显著不同，见图34。

手术后病理诊断决定瘤苗的使用时间。如果有切缘不净或淋巴转移，则按常规进行化疗或靶向治疗或被动/过继抗体治疗，以全身性杀伤肿瘤细胞。如果切缘干净无癌细胞或无淋巴转移，则可在手术出院前日进行第一次瘤苗的接种，取0.5mg自体肿瘤蛋白，可辅以免疫佐剂(如IL2、GM-CSF等)，在四肢皮内多点注射(可行性及临床I期安全性见附图33-39)。2-3周后，强化免疫，每1-2周一次，3-4次。而后，视病情及瘤苗存量而定后续主动免疫的疗程。

免疫佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如，(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如霍乱毒素CT，百日咳毒素PT或大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体，参见例如WO93/13302和WO92/19265；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

B.抗癌免疫力的个体化动态监测方法及试剂盒的建立

除了抗癌主动免疫的综合调动外，本发明还有针对放疗、靶向治疗、免疫治疗前后的抗癌免疫力的改变，以多个抗癌特异性试剂盒来动态监测。

本发明提供的临床前动物实验及临床实验数据(见附图及实施例)表明，放疗、靶向治疗、免疫治疗及瘤苗免疫诱导的抗癌免疫力的改变可以通过抗癌抗体滴度、肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化、活化的CD4⁺IFNγ⁺、CD8⁺IFNγ⁺及NK⁺IFNγ⁺细胞、抑制性免疫细胞(MDSC等)等来监测，其监测时间及试剂盒方法见图11。判断抗肿瘤免疫反应的监测包括：抗肿瘤体液免疫反应评价、抗肿瘤细胞免疫反应评价、抗肿瘤临床反应评价等。

抗肿瘤体液免疫反应评价是以肿瘤抗原包被的ELISA方法检测对个体化瘤苗免疫前后患者自身血清中抗自身肿瘤抗体滴度，以客观判断抗肿瘤体液免疫反应。

抗肿瘤细胞免疫反应评价，一般地，包括皮内注射所制备的个体化瘤苗后，1-3天内观察患者自身皮丘大小(迟发型个体化瘤苗免疫反应)；或自身肿瘤刺激特异性淋巴细胞转化实验：包括步骤：取抗凝血，分离淋巴细胞，无血清培养，加入个体化瘤苗或对照载体，培养，判断淋巴细胞转化性增殖水平(H³掺入/MTT/BrdU/EdU法)；个体化瘤苗的免疫调节反应。个体化瘤苗的免疫调节反应包括：检测白细胞分群(如CD4/CD8/CD11b/Gr-1/NK等)及其表面杀伤性标志(如FasL/LIGHT/CD25/TNF-α/IFN-γ等)，根据结果可以分为反应好和反应差两类，反应好的抗体滴度高，皮丘大于0.5cm，因此可以维持原个体化免疫方案；反应差的抗体滴度低，皮丘少于0.5cm，因此可以改变个体化瘤苗使用方法及使用不同手段增强免疫反应。免疫调节细胞亚群包括：调节性T细胞Treg(CD4+CD25+)、髓系来源的抑制性细胞MDSC(CD14-CD11b+)、肿瘤相关巨噬细胞TAM(M1/M2)、调节性树突状细胞DCreg(CD11b+/Gr-1+)，用流式细胞术可检测各亚群。

抗肿瘤临床反应：以肿瘤影像大小评价，根据实验结果，病人免疫状态，肿瘤病情及其它抗肿瘤治疗方案的应用，决定何时加强抗肿瘤免疫，调整个体化治疗方案，继续2、3、4或更多疗程。效果监测包括但不限于影像学指标观察、无瘤生存时间、总生存时间等肿瘤疗效判断标准来判断。

总之，不断跟踪个体免疫状态及根据肿瘤病情不断调整个体化免疫治疗方案，以达最佳抗肿瘤疗效。

如上所述，个体化瘤苗的免疫反应效应可用细胞免疫、体液免疫、临床肿瘤反应来监测，监测时间可在首次免疫后约15天-60天，并通过数据评价，若反应效果不佳时，可重新调整个体化免疫治疗方案，如通过调整免疫佐剂结合、免疫剂量、免疫部位、免疫时间、免疫次数，低剂量放射刺激骨髓等免疫器官。

本发明的主要优点如下：

(1)本发明提出了个体化抗癌主动免疫的综合调动的具体实施方案，提供了临床前动物及临床实验数据，证实了其科学性及可行性，可指导肿瘤的首次及复发转移抗癌治疗。

(2)本发明首次提出了放疗诱导“原位疫苗”的具体方案，可用于肿瘤的首次及复发转移治疗。肿瘤的首次及复发转移抗癌治疗。

(3)本发明首次提出了放疗后的手术时间。

(4)本发明首次提出了手术(或活检)获得肿瘤组织的个体化瘤苗制备方法。用物理方法制备肿瘤单细胞悬液，经(照射和/或加热)激发肿瘤抗原表达和抗原加工提呈功能，培养1-2天后，再经物理方法灭活肿瘤细胞后，辅以佐剂，并按照个体治疗情况确定个体化主动免疫治疗方案，最大限度地激发调动机体抗癌免疫力。瘤苗主动免疫可用于肿瘤的首次及复发转移抗癌治疗。

(5)本发明首次建立了监测放疗、靶向治疗、化疗及免疫治疗前后个体抗癌体液及细胞免疫反应变化的数个诊断试剂盒(抗癌抗体滴度、肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化、活化的CD4+IFNγ+、CD8+IFNγ+及NK+IFNγ+细胞、MDSC等),填补抗癌免疫临床检验的空白。

(6)本发明中所述肿瘤新型诊疗的技术方法，适用于抗癌免疫领域，有效治疗肿瘤及预防复发转移，为本领域提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1放射诱导肿瘤细胞产生新抗原

如图1所示，培养的4T1乳癌细胞分二组经不照射或照射处理，二天后，分别收集肿瘤细胞，超声均浆，获取蛋白，200ug/组进行2D电泳，见恶性环境处理可上调多个癌蛋白(1--2排)。用肿瘤均浆免疫动物所获抗体，进行2D电泳膜的Western blotting，能够识别显示上调的多个癌蛋白，说明：(1)放射能够诱导肿瘤细胞产生新抗原蛋白；(2)这些新的癌蛋白能够诱导免疫反应。

实施例2受到照射后肝癌细胞及其外泌体与肝癌患者血浆外泌体产生新的癌蛋白

如图2所示，获取受照射的人肝癌血浆外泌体、肝癌细胞的裂解液及外泌体，进行蛋白组学分析，与未经照射的相应标本对比，有较多的癌蛋白上调。

实施例3照射后产生新的癌蛋白在肝癌组织的表达量大于癌旁组织

如图3所示，进入TCGA等信息库查询，照射后产生新的癌蛋白在人肝癌组织的表达量大于癌旁组织，提示这些照射刺激的肿瘤高表达的新的癌蛋白可能的促癌作用。

实施例4放疗后肝癌血浆/肝癌细胞株外泌体的上调蛋白与临床预后差相关

如图4所示，TCGA等信息库查询进一步看到，放疗后肝癌血浆/肝癌细胞株外泌体的上调CD151/KPNA2表达量与肝癌预后负相关，表达量高者,预后差。抑制这些癌蛋白的功能或杀灭产生这些癌蛋白的细胞可能有助于抗癌，改善预后。

实施例5模拟临床放疗诱导“原位疫苗”的临床前动物抗原位癌有效性实验

为在动物上证实放疗能够诱导“原位疫苗”，产生抗“原位癌”免疫效应，ICR实验小鼠先被在右后肢皮下接种活H22肝癌细胞，3-6天成瘤后每日对瘤区进行模拟临床常用的放疗剂量(0，2.5，4，6，8Gy)照射，直至每组总剂量40Gy。为证实放疗诱导主动免疫反应的抗癌效应，各组小鼠的腹部皮下被接种等量活H22肝癌细胞，而后每周二次测量腹部皮下肿瘤大小。模拟临床放疗诱导“原位疫苗”的临床前动物抗原位癌有效性实验方案如图5显示。

实施例6不同放射免疫方案产生了不同的抑制再种植肿瘤生长的抗癌效应

实施例5的实验结果表明(图6)，不同放射免疫方案产生了不同的抑制腹部皮下再种植肿瘤生长的抗癌效应。以8Gy照射诱导的抗癌免疫最强，此组腹部皮下再种植肿瘤生长最慢，死亡率最低，有一定的量效关系。

实施例7模拟临床放疗诱导的“原位疫苗”对肺转移癌抑制的临床前动物实验

为在动物上证实放疗能够诱导“原位疫苗”，从而产生抗“转移癌”免疫效应，BABL/c实验小鼠先被在右后肢皮下接种活4T1-Luciferase乳癌细胞，3-6天成瘤后每日对瘤区进行模拟临床常用的放疗剂量(0，2.3，6Gy)照射，直至每组总剂量24Gy。放疗2周后，尾静脉接种活4T1-Luc肿瘤细胞，形成实验性肺转移。2-3周后，腹腔注射luciferin底物，用小鼠活体成像观测经过尾静脉到肺部生长的活4T1-Luciferase乳癌细胞量。模拟临床放疗诱导的“原位疫苗”对肺转移癌抑制的临床前动物实验方案如图7显示。

实施例8放疗诱导“原位疫苗”对动物实验性肺转移癌的抑制效应

实施例7的实验动物活体成像表明，6Gy照射腿部原位癌诱导的免疫力能够明显地抑制实验性肺转移癌的生长，表现为肺转移癌的细胞最少，显示的荧光强度最低，如图8所示(P<0.05)。

实施例9放疗诱导“原位疫苗”对小鼠肺转移癌的抑制及生存的延长

实施例7的实验动物活体成像表明，无放疗(0Gy)/无诱导免疫力的小鼠，实验性肺转移癌的生长最强，生存期最短；原位癌受到2.3Gy放疗的小鼠产生一定的免疫力，肺部转移癌较少，荧光强度为无放疗的1/4；原位癌受到6Gy放疗的小鼠产生的抗癌免疫力最强，荧光强度最低，生存期最长。结果表明，放疗诱导抗癌免疫，证据明确；在总剂量相同时，单次6Gy比2.3Gy对抗癌免疫的诱导更好(P<0.05)。放疗诱导“原位疫苗”对小鼠肺转移癌的抑制及生存的延长如图9显示。

实施例10放疗诱导“原位疫苗”产生的抗肿瘤抗体及淋巴细胞转化增强(特异性抗癌免疫力的监测)

实施例7放疗诱导的免疫力变化可被检测。放疗四周后，抗癌抗体量6Gy>2.3Gy>0Gy；淋巴细胞可被肿瘤抗原激活，向母细胞转化率增高(P<0.05)。放疗诱导“原位疫苗”产生的抗肿瘤抗体及淋巴细胞转化增强(特异性免疫的监测)如图10显示。

实施例11本发明设计的个体化抗癌免疫力监测的方法及成套项目检测试剂盒

抗癌的放疗、靶向治疗、免疫调节治疗、化疗等均可杀伤肿瘤细胞，释放肿瘤抗原，不同程度地诱导抗癌免疫反应。目前临床上没有检测试剂盒可用。本发明设计的个体化抗癌免疫力监测的方法及成套项目检测试剂盒，用于动态观察患者治疗前后抗癌免疫力的改变，以更好地指导抗癌个体化治疗。本发明设计的个体化抗癌免疫力监测的方法及成套项目检测试剂盒如图11显示。

实施例12甲状腺癌¹³¹I内照射后诱导的抗癌淋巴细胞转化升高

21例甲状腺癌患者，经¹³¹I内照射后，14例(2/3)诱导了抗癌淋巴细胞转化率升高，提示¹³¹I内照射能够诱导抗癌免疫反应(图12)。

实施例13甲状腺癌¹³¹I内照射后诱导的抗甲癌抗体滴度的升高

用包被甲癌抗原的ELISA法测定¹³¹I内照射治疗前后的抗体滴度，以治疗后抗体滴度值除以治疗前抗体滴度值，结果表明，有病灶的甲癌患者(清灶)治疗后的升高比无可见病灶的甲癌患者要高，说明杀伤肿瘤细胞越多，诱导的抗癌免疫力越强(图13)。

实施例14甲状腺癌¹³¹I内照射后诱导的免疫炎症因子升高

免疫细胞激活后，能够产生炎症因子，进一步放大或调控免疫反应。甲状腺癌¹³¹I内照射后诱导的免疫炎症因子(IL-1b及CXCL 16)升高(P<0.05)(图14)。

实施例15 8Gy/1次大剂量SBRT放疗后弥漫性大肝癌缩小

一次性8Gy的SBRT放疗可以使弥漫性大肝癌在21-24天明显缩小，除了射线的直接杀伤，亦有8Gy大剂量放疗诱导免疫的清除癌细胞(图15)。

实施例16大剂量SBRT放疗后抗癌淋巴细胞转化率升高

肝癌的大剂量SBRT放疗后，血中淋巴细胞的转化率在10--43天动态升高，合乎细胞免疫激活的时间规律，说明大剂量SBRT放疗的确诱导抗癌细胞免疫反应(图16)。

实施例17肝癌的大剂量SBRT放疗后血中活化的抗癌CD8⁺IFNγ⁺T细胞明显升高

肝癌的大剂量SBRT放疗43天后，血中活化的抗癌CD8⁺IFNγ⁺T细胞明显升高(P<0.05)(图17)。

实施例18肝癌的大剂量SBRT放疗后血中不同免疫细胞因子在不同时间点升高

肝癌的大剂量SBRT放疗后，除了抗癌CD8⁺IFNγ⁺T细胞明显升高，血中不同免疫细胞因子(DcR3、sTNFR、IL2)亦在不同时间点升高(P<0.05)，说明免疫细胞因子参与抗癌效应(图18)。

实施例19肝癌的大剂量SBRT放疗43天后血中抗肝癌抗体滴度仍然升高

ELISA法测定抗肝癌抗体，结果表明，与放疗前相比，肝癌的大剂量SBRT放疗43天后，血中抗肝癌抗体滴度仍然升高(图19)。

实施例20鼻咽癌放疗后产生抗鼻咽癌抗体的动态变化

鼻咽癌放疗1-4周后，可见抗癌抗体产生，但以5--6周升高明显，说明抗体滴度能够监测抗癌免疫反应(图20)。

实施例21鼻咽癌化疗放疗前后淋巴细胞转化及免疫细胞亚群的动态变化

对治疗前后的鼻咽癌患者的淋巴细胞转化(淋转)进行监测，结果表明，治疗前30％患者淋转阳性；化疗中免疫细胞被杀伤，淋转阳性率降低至19％；化疗结束后，免疫力回复，肿瘤抗原诱导的免疫力上升，淋转阳性率可达43％；放疗进一步诱导“原位疫苗”，淋转阳性率增至56％，证实抗癌免疫力可通过检测淋转阳性率来显示(图21)。

实施例22使用新型肿瘤疫苗(瘤苗)主动免疫在动物体内有效性实验方法本发明设计了用载体、佐剂、佐剂+未经处理的肿瘤细胞裂解液、新型肿瘤疫苗(瘤苗)对小鼠足部进行免疫之后比较抗癌免疫力效应的方法(图22)。

实施例23新型瘤苗诱导主动免疫抑制皮下接种的原位癌生长

小鼠足部进行免疫之后4周，大腿背部皮下接种同源肿瘤活细胞，而后用活体成像观察肿瘤生长。结果表明，新型瘤苗诱导主动免疫能够抑制皮下再接种的原位癌生长(P<0.05)(图23)。

实施例24新型瘤苗主动免疫后的抗原位癌的动态效应

为观察肿瘤生长，每周用卡尺测量肿瘤大小，做出肿瘤生长动态图(二次重复实验)。结果表明，新型瘤苗主动免疫后的抗原位癌效应最好(P<0.05)(图24)。

实施例25新型瘤苗主动免疫后需要3-5周产生抗肿瘤效应

在接种肿瘤的小鼠动态观察肿瘤的生长速度，未进行瘤苗免疫的小鼠，肿瘤生长直线上升，而接种新型瘤苗的小鼠肿瘤大小在主动免疫后3-5周内下降，说明产生抗肿瘤效应需要3-5周时间，这与疫苗主动免疫反应的规律相符合(图25)。

实施例26新型瘤苗主动免疫后产生的抗肺转移癌效应

控制转移是肿瘤治疗的关键。新型瘤苗主动免疫28天后，从尾静脉注射同源活肿瘤细胞，用活体成像观察实验性转移肺癌的生长。结果表明，接种新型瘤苗的小鼠产生免疫力比未处理的瘤苗有更强的抗肺转移癌效应(P<0.05)(图26)。

实施例27新型瘤苗蛋白对瘤苗主动免疫后血中免疫细胞的激活转化

获取瘤苗主动免疫后小鼠的血，分离淋巴细胞后，加入新型瘤苗蛋白进行培养。显微镜下观察表明，加入新型瘤苗蛋白对血中免疫细胞有激活转化，表现为细胞变大、折光性强(图27)。

实施例28新型瘤苗主动免疫后强化抗癌细胞免疫效应

在体外无菌培养条件下，将肿瘤细胞与瘤苗免疫后的小鼠淋巴细胞1:10混合培养，测定细胞杀伤后释放的乳酸脱氢酶活性。结果表明，与单独肿瘤细胞或单独T淋巴细胞培养相比，经过免疫的小鼠的淋巴细胞有杀伤肿瘤细胞的能力，新型瘤苗比旧方法直接制备的瘤苗有更强的杀伤力(P<0.05)。

同时，用ELISA方法检测二种方法制备瘤苗免疫小鼠后产生的抗体滴度。结果表明，新型瘤苗比旧方法直接制备的瘤苗产生的抗癌抗体更高(P<0.05)(图28)。

实施例29新型瘤苗主动免疫诱导增强肿瘤抗原的提呈及抗癌抗体生成

用ELISA的OD值相对定量，结果表明，新型瘤苗比旧方法直接制备的瘤苗含更高的抗原的提呈分子，更能够诱导增强抗癌抗体的生成(图29)。

实施例30新型瘤苗接种8周后血中CD4⁺、CD8⁺T细胞升高、抑制性Treg降低

新型瘤苗接种8周后，取血，用荧光标记的抗CD4、CD8及Treg染色后，用流式细胞仪检测淋巴细胞的百分比。结果表明，新型瘤苗接种的小鼠血中CD4⁺、CD8⁺T细胞％较未经过瘤苗免疫的小鼠明显升高(P<0.05)；同时，免疫抑制性Treg降低(P<0.001)。正负调节二者协同，产生新型瘤苗主动免疫的抗癌效应(图30)。

实施例31新型瘤苗主动免疫后，抑制性MDSC降低

血及骨髓中免疫抑制性MDSC肿瘤生长有正相关，MDSC越高，肿瘤越大。新型瘤苗主动免疫5周后，血及骨髓抑制性MDSC均可被降低(P<0.05)，说明新型瘤苗能够调节抗癌免疫功能(图31)。

实施例32“原位疫苗”联合个体化瘤苗可全面调动机体抗癌免疫力

放疗诱导的“原位疫苗”为局部内源性，受到肿瘤微环境影响。如果加上体外制备个体化疫苗的使用，则可全面调动机体抗癌免疫力，提高抗癌疗效(图32)。

实施例33新创的个体化主动免疫治疗的流程图

流程图描述了本发明的新型瘤苗的制备及个体化主动免疫治疗的流程：将手术或活检获得的新鲜肿瘤组织制备成单细胞悬液，同时进行专有仪器处理(专利另发)，1-3天后收获肿瘤细胞，经过均浆，获得肿瘤蛋白，分装冻存。根据临床情况，在适当时间，肿瘤蛋白0.5-2mg，辅以佐剂(如G-CSF、GM-CSF，IL-2，IL-12，等)，进行患者本人四肢皮内接种，而后，强化接种3-4次，每1-3个月复查患者抗癌抗体滴度、个体瘤苗刺激的淋巴细胞转化、活化的抗癌CD4/CD8/NK细胞及免疫抑制细胞(MDSC/Treg)等，根据结果，调整治疗方案，尤其是免疫治疗与放疗的有机结合(图33)。

实施例34本发明与现有主动免疫方法治疗的不同点

本发明与现有主动免疫方法治疗的不同点在于：1.肿瘤抗原的寻找方法；2.肿瘤抗原的个数；3.瘤苗的制备方法；4.瘤苗制备的时长；5.是否需要HLA配型；6.是否诱导强化肿瘤抗原。这些不同说明了本方法的创新性及优越性(图34)。

实施例35个体化瘤苗临床I期(毒副作用)入组小结

在临床I期试验中28人入组，进行88人次个体化新型瘤苗接种，其中12人为1-2次自体瘤苗接种，16人接受3次或以上接种，目的是观察瘤苗的毒副作用(图35)。

实施例36个体化瘤苗临床I期免疫后的发热程度及发生率

个体化瘤苗接种后，50％患者有不同程度的发热，其中37.5--38.5℃者27％；38.5--39℃者12％；>39℃者8％(图36)。

实施例37个体化瘤苗接种后临床全身及局部反应规律

个体化瘤苗接种后临床副作用：(1)全身反应为发热：起始于注射后2hr；峰期于4-10hr；自然消退于12-24hr；一般不需用药，>39℃者，可用扑尔敏对症治疗。(2)局部反应为局部疼痛明显。注射后12-72hr，局部发红，发热，红晕可达2-4cm，2-4天后消退。一般不影响肢体功能，不需局部或全身处理(图37)。

实施例38个体化瘤苗接种后7--41天未见产生自身免疫抗体

尽管是个体化瘤苗，但为全细胞制备，含正常蛋白，故监测是否存在自身免疫反应。对接种自身瘤苗7,14,27,41天后用欧盟试剂盒(毛细管电泳-Western式)的方法检测自身免疫抗体。在阳性及阴性质控反应正常下，自体瘤苗接种患者的不同时间点均无阳性条带出现，提示未出现自身免疫反应，“免疫禁忌株”(针对自身组织的免疫细胞通常在出生时就被杀灭)的理论是正确的，个体化全细胞瘤苗是安全的(图38)。

实施例39个体化瘤苗接种后未见诱发自身免疫性抗体

在个体化瘤苗接种后7-41天，用欧盟试剂盒检测了11种不同的自身免疫性抗体，均未见诱发自身免疫性抗体(图39)。

实施例40不同疗法对肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化的影响

探讨了放疗、放疗+化疗、放疗+GM-CSF不同疗法对肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化的影响。结果表明，放疗+化疗对淋转有抑制，放疗可诱导免疫淋转，如果加用GM-CSF则有助于增强放疗抗癌免疫反应(图40)。

实施例41GM-CSF增强放疗诱导的抗癌免疫反应

GM-CSF增强放疗诱导的抗癌免疫反应表现为：放疗+GM-CSF四周～71天后，肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化及活化的CD8⁺IFNγ⁺T细胞明显升高(图41)。

实施例42：个体化抗癌主动免疫的综合调动：四大抗癌疗法序贯串联合理有机结合

用半剂量放疗或化疗释放“原位疫苗”，诱导主动免疫，为手术提供杀伤术中释出的肿瘤细胞的免疫力，再视病情进行全身性的化疗或靶向治疗，杀伤手术无法去除的散在的肿瘤细胞。同时，在无化疗抑制免疫细胞的情况下，用手术获得的经过诱导的个体肿瘤细胞制备的瘤苗多点皮内免疫患者本人，强化全身性抗癌免疫力，从而抑制肿瘤生长及转移。如果在治疗后出现复发寡转移灶，则重复上述放疗--手术--化疗/靶向治疗--瘤苗免疫；如果出现多个复发转移灶，无法手术解决，则以放疗为主，射线杀伤所有可见肿瘤灶，诱导对新肿瘤抗原的主动免疫反应，并辅以靶向治疗、抗体或细胞免疫调节治疗。

同时，为监测不同疗法的各个阶段抗癌治疗后个体免疫力变化，本发明建立了数个诊断试剂盒，包括抗癌抗体、抗癌淋巴细胞转化、肿瘤抗原活化的CD4⁺IFNγ⁺、CD8⁺IFNγ⁺及NK⁺IFNγ⁺细胞、抑制性免疫细胞(MDSC、Treg等)的检测，以指导临床治疗及预后判断(图42)。

实施例43-45一种便携式X线细胞照射仪

图43-44显示了本发明用于制备个体化瘤苗的便携式放射仪器，其剂量率表见图43。本放射仪安全、可靠、便于携带、使用方便、造价低，适合于实验室细胞照射。本X线放射仪装置，包括：高压变电系统：所述高压变电系统提供95-110KV/高压电下使X线发射球管输出高能X线；X线放射室：所述X线放射室提供0.5-2Gy/min的X线对受照射细胞作用的密封(约30×30×30cm³)安全环境；散热系统：所述散热系统及时散发高压变电系统的产热，控制X线发射球管的工作温度范围在10-50℃；控制系统：所述的控制系统可调节改变高压变电系统的电压及电流，使X线发射球管产生所需放射剂量率(约0.5-2Gy/min)；

安全防护系统：所述安全防护系统提供六面铅板全密封，防止X线外漏，保证仪器外面射线强度不高于所处外界环境；感知X线放射室门紧闭时方可启动X线发射球管发出射线。

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14.Ott PA,Hu Z,Keskin DB,Shukla SA,Sun J,Bozym DJ,Zhang W,Luoma A,Giobbie-Hurder A,Peter L,Chen C,Olive O,Carter TA,Li S,Lieb DJ,Eisenhaure T,Gjini E,Stevens J,Lane WJ,Javeri I,Nellaiappan K,Salazar AM,Daley H,Seaman M,Buchbinder EI,Yoon CH,Harden M,Lennon N,Gabriel S,Rodig SJ,Barouch DH,AsterJC,Getz G,Wucherpfennig K,Neuberg D,Ritz J,Lander ES,Fritsch EF,Hacohen N,WuCJ.An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients withmelanoma.Nature.2017 Jul 13；547(7662):217-221.doi:10.1038/nature22991.PMID:28678778

15.Keskin DB,Anandappa AJ,Sun J,Tirosh I,Mathewson ND,Li S,OliveiraG,Giobbie-Hurder A,Felt K,Gjini E,Shukla SA,Hu Z,Li L,Le PM,

RL,RichmanAR,Kowalczyk MS,Abdelrahman S,Geduldig JE,Charbonneau S,Pelton K,IorgulescuJB,Elagina L,Zhang W,Olive O,McCluskey C,Olsen LR,Stevens J,Lane WJ,SalazarAM,Daley H,Wen PY,Chiocca EA,Harden M,Lennon NJ,Gabriel S,Getz G,Lander ES,Regev A,Ritz J,Neuberg D,Rodig SJ,Ligon KL,SuvàML,Wucherpfennig KW,Hacohen N,Fritsch EF,Livak KJ,Ott PA,Wu CJ,Reardon DA.Keskin DB,et al.Neoantigenvaccine generates intratumoral T cell responses in phase Ib glioblastomatrial.Nature.2019 Jan；565(7738):234-239.doi:10.1038/s41586-018-0792-9.PMID:30568305

16.Sahin U,Derhovanessian E,Miller M,Kloke BP,Simon P,

M,BukurV,Tadmor AD,Luxemburger U,

B,Omokoko T,Vormehr M,Albrecht C,ParuzynskiA,Kuhn AN,Buck J,Heesch S,Schreeb KH,Müller F,Ortseifer I,Vogler I,GodehardtE,Attig S,Rae R,Breitkreuz A,Tolliver C,Suchan M,Martic G,Hohberger A,Sorn P,Diekmann J,Ciesla J,Waksmann O,Brück AK,Witt M,Zillgen M,Rothermel A,KasemannB,Langer D,Bolte S,Diken M,Kreiter S,Nemecek R,Gebhardt C,Grabbe S,

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Sahin U,et al.Personalized RNAmutanomevaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity againstcancer.Nature.2017；547(7662):222-226.doi:10.1038/nature23003.PMID:28678784

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在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种个体化抗癌主动免疫的综合调动及抗癌免疫力的监测贯穿肿瘤治疗始末的方法，其特征在于，对肿瘤患者以主动免疫疗法(放疗诱导原位疫苗+瘤苗诱导自身主动抗癌免疫反应+免疫调节)进行治疗，并在治疗全过程用动态监测个体细胞及体液抗癌免疫力的变化，

所述方法包括步骤：

(1)以半治疗量放射(约24-32Gy，4-8Gy/次，4-6次，寡分割)或不损伤免疫力的低剂量半程化疗为起始，可联用GM-CSF等免疫增强剂，结束后加入免疫抑制阻断剂；

(2)利用手术或穿刺获得的肿瘤组织，在生物压力下进行单细胞培养，以制备含大量表达“促生抗死”癌蛋白的个体化肿瘤抗原的自身瘤苗；

(3)将上一步骤制备的自身瘤苗施用于所述肿瘤患者，所述施用为多点皮内注射；

其中，使用多点皮内注射自身瘤苗接种的时间基于术后病理、影像报告、及病情状态加以决定：

(A)如无转移，则手术后1-2周用自身瘤苗皮下注射，以诱导抗自身肿瘤的主动免疫反应，系统性地持久性地杀伤微小转移灶；

(B)如有转移，则进行靶向治疗(生长受体抗体/激酶抑制剂、血管生长抑制剂、免疫调节剂等)，可联合瘤苗免疫；如果为化疗，则待化疗结束后2-4周再实行自身瘤苗的主动免疫治疗；

其中，在施用自身瘤苗之前、之中或之后时，可加用免疫增强剂，如GM-CSF，胸腺素28肽/5肽等，免疫抑制阻断剂(如抗PD-1,抗PD-L1,抗CTLA-4等免疫负调节抑制剂、抗CD47等)及各种细胞性治疗；

其中，如果第一轮治疗后肿瘤复发转移，可重复使用上述序贯串联的个体化抗癌主动免疫的综合调动；或以放疗杀伤多点可见肿瘤灶，辅以靶向治疗及免疫调节/增强药物，谨慎使用化疗，减少对抗癌免疫细胞的杀伤；

并且，在放疗、靶向治疗/化疗及免疫调节/增强治疗的前后，动态监测患者抗癌细胞及体液免疫力的变化，以指导治疗及判断预后，所述的监测选自下组：

A.抗癌细胞免疫力监测：以细胞培养、荧光染色及流式细胞仪等技术配合，监测肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化、活化的抗癌CD8⁺IFNγ⁺、CD4⁺IFNγ⁺、NK⁺IFNγ⁺、MDSC细胞等；代表免疫细胞激活的CD25表面标志等；

B.抗癌体液免疫力监测：以酶联免疫法监测抗癌抗体滴度、IL2、IL6、IFNγ等；

(4)肿瘤组织在生物压力下进行单细胞培养，所述的生物压力为高温、低氧及放射线，优选为放射线，使用一种便携式X线放射仪装置。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤为：实体瘤或非实体瘤；所述实体瘤来源于：脑、肺、头颈部、皮肤、胰、胃肠道、膀胱、生殖道、脊髓、脾、肾、肝、四肢、骨骼、舌、或喉；和/或所述的非实体瘤来源于血液或骨髓。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤为原发性肿瘤或继发转移性肿瘤，其肿瘤灶可为寡肿瘤或多发多点。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述处理手术或穿刺获得的自体肿瘤为单细胞的方法可选自：用机械剪切法或磨碎肿瘤组织法，将肿瘤组织处理为可培养的、分离的自体或同源肿瘤细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述放疗诱导原位疫苗中的体内放疗方法可以为常规放疗或SBRT或质子/中子/重离子放疗，诱导“原位疫苗”。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自身瘤苗是在生物压力下进行单细胞培养，以制备含大量表达“促生抗死”癌蛋白，并且所述自体瘤苗被用于制备预防治疗肿瘤及抗癌免疫力监测的组合物。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，瘤苗灭活处理可用以下方法：超声破碎细胞灭活法、反复细胞冻融、低渗破裂法、匀浆、或以上的组合；所述的瘤苗佐剂亦可选自下组：脂质体、细胞因子(如G-CSF、CSF、IFNr、IL-2、IL-9，IL-12等)，各种植物蛋白、DNA、减活或灭活病毒、细菌、真菌、微生物、或其及代谢物的不同组合。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，放疗、靶向治疗及自身瘤苗免疫时可加用免疫增强剂(如GM-CSF、IL-2、胸腺激素28肽或5肽、中药)等，免疫抑制阻断剂(如抗PD-1、抗PD-1、抗CTLA-4等免疫负调节抑制剂、抗CD47等)。

9.一种抗癌免疫力检测试剂的用途，其特征在于，所述的检测试剂包括用于检测CD8⁺IFNγ⁺、CD4⁺IFNγ⁺、NK⁺IFNγ⁺、MDSC细胞与肿瘤抗原刺激的淋巴细胞转化的试剂盒及体液免疫反应的抗癌抗体试剂盒，所述试剂盒用于在治疗不同阶段监测抗癌治疗前后个体化免疫力的改变。

10.一种便携式X线照射仪装置，用于细胞照射，其特征在于，包括

高压变电系统：所述高压变电系统提供95-110KV/高压电下使X线发射球管输出高能X线；X线放射室：所述X线放射室提供0.5-2Gy/min的X线对受照射细胞作用的密封(约30×30×30cm³)安全环境；散热系统：所述散热系统及时散发高压变电系统的产热，控制X线发射球管的工作温度范围在10-50℃；控制系统：所述的控制系统可调节改变高压变电系统的电压及电流，使X线发射球管产生所需放射剂量率(约0.5-2Gy/min)；安全防护系统：所述安全防护系统提供六面铅板全密封，防止X线外漏，保证仪器外面射线强度不高于所处外界环境；感知X线放射室门紧闭时方可启动X线发射球管发出射线。

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