CN115354043A - 一种动物模型 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于产生一种动物模型的方法，其中所述动物模型的心肌细胞中SERCA2a的磷酸化受损；和/或动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力受损。在这项研究中，使用敲入小鼠模型研究涉及SERCA2a‑Thr484磷酸化的糖尿病性心肌病的病理生理机制。利用这种小鼠模型及其衍生的心肌细胞来揭示SERCA2a在心肌胰岛素抵抗和糖尿病性心肌病发病机制中的潜在作用。
Description
技术领域
本发明总体涉及心肌病领域，特别地涉及一种心肌细胞中SERCA2a磷酸化受损而影响心脏收缩力和前体蛋白加工导致糖尿病性心肌病的动物模型。
背景技术
糖尿病性心肌病是与2型糖尿病(T2D)相关的进行性并发症，导致糖尿病患者心脏功能恶化，而与冠状动脉疾病和高血压无关。现在关于糖尿病性心肌病发病机制的分子机制研究已有很多。
心肌细胞的收缩特性受代谢和激素因素的影响，其病理改变与糖尿病性心肌病的发展有关。例如，T2D中的高血糖和血脂异常会导致心脏毒性，从而诱导氧化应激并损害线粒体功能。心脏是一种胰岛素敏感器官，其中心肌胰岛素抵抗会抑制葡萄糖代谢并导致心肌细胞转向利用脂肪酸氧化提供能量。这种底物转移会降低糖尿病心脏的代谢灵活性。除了这些代谢变化外，心肌胰岛素抵抗还会导致心肌细胞中Ca2+转运能力失调。反过来，细胞溶质Ca2+的升高可能通过尚不清楚的机制造成胰岛素抵抗。这些代谢攻击、胰岛素作用受损和异常的细胞Ca2+转运能力在糖尿病性心肌病发病机制中的作用尚不清楚。因此，构建糖尿病性心肌病有关的动物模型具有重要意义。获得这样的动物模型用于研究糖尿病性心肌病发病机制，筛选针对糖尿病性心肌病有效的药物以及测定给药方案的功效以及安全性。
发明内容
在本文中，通过使用敲入小鼠模型研究涉及SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化和/或SERCA2a-Lys480或者SERCA2a-Lys481磷酸化依赖的糖尿病性心肌病的病理生理机制；并且，利用这种小鼠模型及其衍生的心肌细胞来揭示SERCA2a在心肌胰岛素抵抗和糖尿病性心肌病发病机制中的潜在作用。
如本文所揭示的，SERCA2a对于介导心脏中的胰岛素作用至关重要，并且其Thr484、Thr499、Ser495和/或Ser488磷酸化、Lys480或者Lys481磷酸化依赖通过调节SR Ca2+再摄取以维持心脏功能。SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488的磷酸化受损、SERCA2a-Lys480或者SERCA2a-Lys481的磷酸化依赖受损既是心肌细胞胰岛素抵抗的结果也是原因。由胰岛素抵抗导致的SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化受损、SERCA2a-Lys480或者SERCA2a-Lys481磷酸化依赖受损是糖尿病心肌病早期发病的机制。本文的研究结果揭示糖尿病性心肌病的早期病理机制且对该疾病的治疗具有指导意义。
由此，本发明提出了一种动物模型以及用于产生动物模型的方法，其中所述动物模型的心肌细胞中SERCA2a的磷酸化受损；和/或动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力受损。
在一些实施例中，SERCA2a的磷酸化受损为所述SERCA2a的磷酸化靶点有突变导致和/或所述SERCA2a的磷酸化依赖靶点有突变导致。优选地，所述磷酸化靶点为SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488，所述磷酸化依赖靶点为SERCA2a-Lys480或SERCA2a-Lys481。进一步地，所述磷酸化靶点SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495以及SERCA2a-Ser488突变为丙氨酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)或者甘氨酸(Gly)。进一步地，所述磷酸化靶点SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495以及SERCA2a-Ser488突变为丙氨酸(Ala)或者甘氨酸(Gly)。本领域技术人员应当了解，丙氨酸、甘氨酸等氨基酸为侧链惰性的氨基酸，其通常无法被磷酸化或者磷酸化不明显，因此当讨论突变导致蛋白磷酸化异常时，可优先考虑将靶点突变为丙氨酸或者甘氨酸。
在一些实施例中，所述磷酸化依赖靶点为SERCA2a-Lys480，进一步地，所述磷酸化依赖靶点SERCA2a-Lys480突变为突变为丙氨酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)或者甘氨酸(Gly)。
在一些实施例中，所述磷酸化依赖靶点为SERCA2a-Lys481，进一步地，所述磷酸化依赖靶点SERCA2a-Lys481突变为突变为丙氨酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)或者甘氨酸(Gly)。
本领域技术人员应当了解，横纹肌特异性表达的蛋白激酶(SPEG)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(CaMK Ser/Thr)中肌球蛋白轻链激酶(MLCK)亚组的成员(ref.1)。之前的研究表明，肌球蛋白轻链激酶(MLCK)底物序列上都包含高比例的碱性氨基酸和疏水氨基酸，但不含酸性或脯氨酰残基(ref.2)。碱性氨基酸特别是赖氨酸(Lysine)的存在可以显著增强MLCK对靶蛋白的磷酸化水平(ref.3)。此外，在其他蛋白激酶(AMPK,AKT和PKA)中也有报导底物序列上赖氨酸(Lysine)的存在可以增强底物的磷酸化水平，当将赖氨酸突变后，它们下游靶蛋白的磷酸化水平下调(ref.4)。而在SERCA2a-Thr484位点附近存在两个赖氨酸Lys480和Lys481，结合肌球蛋白轻链激酶对底物磷酸化的调控，我们认为Lys480和Lys481是SERCA2a-Thr484的磷酸化依赖位点，是SERCA2a-Thr484位点磷酸化调控所必须的。(参考文献：1.Hsieh CM,Fukumoto S,Layne MD,Maemura K,Charles H,Patel A,Perrella MA,LeeME.Striated muscle preferentially expressed genes alpha and beta are twoserine/threonine protein kinases derived from the same gene as the aorticpreferentially expressed gene-1.J Biol Chem.2000 Nov 24；275(47):36966-73.doi:10.1074/jbc.M006028200.PMID:10973969.2.Blumenthal DK,Takio K,Edelman AM,Charbonneau H,Titani K,Walsh KA,Krebs EG.Identification of the calmodulin-binding domain of skeletal muscle myosin light chain kinase.Proc Natl AcadSci U S A.1985May；82(10):3187-91.doi:10.1073/pnas.82.10.3187.PMID:3858814；PMCID:PMC397740.3.Jackson AE,Carraway KL 3rd,Puett D,Brew K.Effects of thebinding of myosin light chain kinase on the reactivities of calmodulinlysines.J Biol Chem.1986 Sep 15；261(26):12226-32.PMID:3091599.4.Parker BL,Shepherd NE,Trefely S,Hoffman NJ,White MY,Engholm-Keller K,Hambly BD,LarsenMR,James DE,Cordwell SJ.Structural basis for phosphorylation and lysineacetylation cross-talk in a kinase motif associated with myocardial ischemiaand cardioprotection.J Biol Chem.2014 Sep 12；289(37):25890-906.doi:10.1074/jbc.M114.556035.Epub 2014 Jul 9.Erratum in:J Biol Chem.2014 Dec 5；289(49):33875.PMID:25008320；PMCID:PMC4162189.)。
在一些实施例中，SERCA2a的磷酸化受损为心肌细胞中PKB和/或SPEG磷酸化受损导致，或者为心肌细胞中的弗林蛋白酶(FURIN)含量降低和/或所述动物模型的心肌细胞中胰岛素受体(IR)含量降低导致。优选地，所述IR为IRβ。
在一些实施例中，可以通过以下基因功能技术手段中的一种或多种抑制心肌细胞中SERCA2a的磷酸化和/或破坏动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力：CRISPR/Cas9技术、TALEN技术和RNA i技术。
在一些实施例中，动物模型为啮齿动物、兔、猪和类似非人动物；优选地，为啮齿动物(例如，小鼠、大鼠和类似动物)；特别优选地，为小鼠。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的动物模型或者产生的动物模型动物在模拟动物心肌病方面的应用。优选地，所述心肌病为糖尿病性心肌病。优选地，所述心肌病为早期的糖尿病性心肌病。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的动物模型或者产生的动物模型动物在心肌病病理研究方面的应用。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的动物模型或者产生的分离的动物模型的细胞在心肌病病理研究方面的应用。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的动物模型筛选一种或多种候选物质的方法，所述方法包括向所述动物模型动物施用所述一种或多种候选物质。
根据本发明的另一个方面，提出分离的如上任一的动物模型或者产生的分离的动物模型的细胞筛选一种或多种候选物质的方法，所述方法包括向所述动物模型细胞施用所述一种或多种候选物质。
根据本发明的另一个方面，提出分离的如上任一的动物模型测定一种或多种药物的给药方案的功效和/或安全性的非治疗方法。
根据本发明的另一个方面，提出分离的如上任一的分离的动物模型细胞测定一种或多种药物的给药方案的功效和/或安全性的非治疗方法。
附图说明
下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：
图1是根据本发明的一个实施例的西方饮食对小鼠心脏功能以及原代心肌中Ca2+稳态的影响；其中，
图1A表示喂食CD或WD的雄性C57/Bl6J小鼠的体重；n＝9-12；CD，普通饮食；WD，西方饮食；
图1B表示24周龄雄性C57/Bl6J小鼠的葡萄糖耐量试验；给小鼠喂食WD 16周；这些值显示了葡萄糖耐量试验期间曲线下的葡萄糖面积；AUC，曲线下面积；n＝7-8。
图1C表示从CD或WD饲喂的雄性小鼠(10个月大，禁食过夜)分离的原代心肌细胞中SERCA2a、SPEG、AS160、PKB、IRβ的表达和磷酸化；给小鼠喂食WD 32周；在裂解用于免疫印迹分析之前，用或不用胰岛素(300nM，30分钟)刺激原代心肌细胞；
图1D-图1E表示电刺激(0.5Hz)在从CD或WD饲喂的雄性小鼠(7个月大，自由采食)中分离的原代心肌细胞中引发Ca2+瞬变。给小鼠喂食WD 20周；E：代表性Ca2+瞬态图像和曲线；F：幅度、半最大值全持续时间(FDHM)和Ca2+瞬变的时间常数Tau；分析了来自2只CD饲喂小鼠的60个细胞和来自2只WD饲喂小鼠的43个细胞；
图1F-图1G表示通过超声心动图在CD或WD饲喂的C57/Bl6J雄性小鼠中测量射血分数(EF)(F)和缩短分数(FS)(G)(WD饲喂在2个月大时开始)；n＝6-12；以及
图1H为根据本申请一个实施例的磷酸化位点筛选蛋白图谱；
数据以平均值±SEM的形式给出；使用t检验进行统计分析；*表示p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图2是根据本发明的一个实施例的SERCA2aT484A小鼠心肌细胞Ca2+稳态；其中，
图2A表示SERCA2a的WT和T484A敲入等位基因的图解说明；SERCA2a上的Thr484残基通过CRISPR/Cas9辅助敲入替换变为丙氨酸，从而产生SERCA2aT484A敲入小鼠；
图2B表示WT和SERCA2aT484A雌性小鼠(2个月大，自由采食)心肌细胞中的SERCA2a-Thr484磷酸化；
图2C-图2D表示电刺激从WT和SERCA2aT484A小鼠(3个月大，雄性和雌性，自由采食)分离的原代心肌细胞中引发Ca2+瞬变；图2C，具有代表性的Ca2+瞬态图像和曲线；图2D，Ca2+瞬变的幅度、FDHM和Tau的量化；分析了来自3只WT小鼠的70个细胞和来自3只SERCA2aT484A小鼠的57个细胞；
图2E-图2F表示电刺激从WT和SERCA2aT484A小鼠(13个月大，雄性，自由采食)分离的原代心肌细胞中引起的Ca2+瞬变；图2E，代表性的Ca2+瞬态图像和曲线；图2F，Ca2+瞬变的幅度、FDHM和Tau的量化；分析了来自2只WT小鼠的88个细胞和来自2只SERCA2aT484A小鼠的71个细胞；
图2G表示Rcan1.4 mRNA在来自WT和SERCA2aT484A小鼠(2个月大，雄性)的原代心肌细胞中的表达；n＝6；
图2H-图2I表示从WT和SERCA2aT484A小鼠(17个月大，雄性，自由采食)分离的原代心肌细胞中的Ca2+火花；图2H，Ca2+火花频率的量化；分析了来自1只WT小鼠的18个细胞和来自1只KI小鼠的15个细胞；图2I，Ca2+火花的代表性图像；以及
图2J表示从WT和SERCA2aT484A小鼠(4个月大，雌性，自由采食)分离的原代心肌细胞中的肌浆网钙离子含量；分析了来自5只WT小鼠的30个细胞和来自6只KI小鼠的35个细胞；
数据以平均值±SEM的形式给出。使用t检验进行统计分析。**表示p<0.01，***p<0.001；
图3是根据本发明的一个实施例的SERCA2a抑制后原代心肌细胞中的胰岛素信号传导；其中
图3A表示从新生WT或SERCA2aT484A敲入小鼠(雄性和雌性)分离的原代心肌细胞中的胰岛素信号传导；用或不用胰岛素(300nM，30分钟)刺激心肌细胞；使用GAPDH作为上样对照，通过免疫印迹检测PKB和GSK3的磷酸化和PAS反应性磷酸化；
图3B表示从成年WT或SERCA2aT484A敲入小鼠(15个月大，雄性，禁食过夜)分离的原代心肌细胞中的胰岛素信号传导；用或不用胰岛素(300nM，30分钟)刺激心肌细胞；使用FLOT1作为上样对照，通过免疫印迹检测PKB的磷酸化和PAS反应性磷酸化；
图3C表示从成年WT或SERCA2a+/-小鼠(3个月大，雄性，禁食过夜)分离的原代心肌细胞中的胰岛素信号传导；用或不用胰岛素(300nM，30分钟)刺激心肌细胞；使用FLOT1作为上样对照，通过免疫印迹检测PKB和GSK3的磷酸化和PAS反应性磷酸化；以及
图3D表示对照或毒胡萝卜素(TG)预处理的NRVC中的胰岛素信号传导；NRVCs用或不用2μM TG预处理24小时，然后用或不用胰岛素(300nM)刺激30分钟；使用GAPDH作为上样对照，通过免疫印迹检测PKB和GSK3的磷酸化和PAS反应性磷酸化；
图4是根据本发明的一个实施例的Ca2+转运能力受损细胞中FURIN依赖的蛋白前体加工；其中
图4A-图4B表示FURIN、IRβ和IGF1Rβ在WT和SERCA2aT484A小鼠(2个月大，雄性)的原代心肌细胞中的表达；GAPDH用作上样对照；图4A，免疫印迹；图4B，免疫印迹信号的量化；n＝6；
图4C-图4D表示FURIN、IRβ和IGF1Rβ在WT和SERCA2a+/-小鼠(3个月大，雄性)的原代心肌细胞中的表达；GAPDH用作上样对照；图4C，免疫印迹；图4D，免疫印迹信号的量化；n＝6；
图4E-图4F表示FURIN和IRβ在CD或WD饲喂的小鼠(12个月大，雄性)心脏中的表达；给小鼠喂食WD 40周；图4E，代表性免疫印迹；图4F，免疫印迹信号的量化；n＝4；
图4G-图4H表示FURIN、前体IR、IRβ、前体IGF1R和IGF1Rβ在有或没有TG(2μM，24小时)刺激的NRVC中的表达；图4G，免疫印迹；图4H，免疫印迹信号的量化；n＝6；
图4I-图4J表示用TG处理后细胞中的IR处理；在存在或不存在TG(2μM，90分钟)的情况下，用Click-iTTM AHA处理转染了Flag-IR的HEK293细胞指定的时间；使用Flag珠子进行免疫沉淀后，新生前体IR和成熟IRβ与Click-iTTM蛋白反应缓冲液试剂盒反应，并使用HRP标记的抗生物素蛋白抗体进行检测；图4I，代表性印迹；图4J，IR处理的量化，定义为相对于前体IR的成熟IRβ；n＝5；
图4K-图4L表示FURIN表达对TG处理的HEK293细胞中IR和IGF1R加工的影响；FURIN-mCherry或游离mCherry在用或不用TG(2μM)刺激24小时的HEK293细胞中表达；通过免疫印迹在细胞裂解物中检测到FURIN、前体IR、IRβ、前体IGF1R和IGF1Rβ蛋白；图4K，代表性印迹；图4L，定量数据；n＝6；
表示p<0.001(TG向量与对照向量)，
表示p<0.001(TGFURIN-mCherry与对照FURIN-mCherry)，前体IGF1R除外，其中
表示p<0.05(TG FURIN-mCherry与对照FURIN-mCherry)；以及
图4M-图4N表示在TG(2μM)存在下用蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)或溶酶体抑制剂Bafilomycin A1(400nM)处理4小时的HEK293细胞中的FURIN蛋白水平；图4M，代表性印迹；图4N，定量数据；n＝3；
数据以平均值±SEM的形式给出；通过B、D、F和H的t检验、N的单因素ANOVA和L和J的双向ANOVA进行统计分析*表示p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。
图5是根据本发明一个实施例的SERCA2aT484A基因敲入小鼠的心功能及心脏重塑；其中
图5A-图5I表示在指定年龄对麻醉的雄性SERCA2aT484A敲入小鼠和野生型同窝仔鼠进行超声心动图，以测量射血分数(A)、缩短分数(B)、收缩期左心室容积(C)、舒张期左心室容积(D)、收缩期左心室前壁(E)、舒张期左心室前壁(F)、收缩期左心室后壁(G)和舒张期左心室后壁(H)；图5I，超声心动图的代表性图像；n＝18-24；以及
图5J表示Anp和Bnp mRNA在WT和SERCA2aT484A敲入小鼠(4个月大，雄性和雌性)心脏中的表达；n＝9-13；
数据以平均值±SEM的形式给出；使用t检验进行统计分析；*表示p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；以及
图6是根据本发明一个实施例的SERCA2a磷酸化在WD诱导的糖尿病心肌病发展中的作用；其中
图6A-图6B表示射血分数(EF)(A)和分数缩短(FS)(B)通过超声心动图测量雄性WT和SERCA2aT484A小鼠喂食WD图中所示的时期；通过t检验对WT和SERCA2aT484A小鼠之间的每个时间点进行统计分析；EF：*表示p<0.05(WT/0M与SERCA2aT484A/0M)；FS：**表示p<0.01(WT/0M与SERCA2aT484A/0M)；n＝6-9；
图6C表示从WT和SERCA2aT484A雄性小鼠(自由采食)喂食WD 7个月(WD饲喂在4个月大时开始)的原代心肌细胞中通过电刺激引起的Ca2+瞬变；分别来自59个WT细胞(2只小鼠)和83个SERCA2aT484A细胞(2只小鼠)的Ca2+瞬变的幅度、FDHM和Tau；
图6D表示电刺激在从喂食CD的WT和SERCA2aT484A小鼠(15个月大，雄性，随意)分离的原代心肌细胞中引发Ca2+瞬变；分别来自78个WT细胞(2只小鼠)和70个SERCA2aT484A细胞(2只小鼠)的Ca2+瞬变的幅度、FDHM和Tau；
图6E表示SPEG、AS160和PKB在从WT或SERCA2aT484A小鼠(15个月大，雄性，禁食过夜)中分离出来的原代心肌细胞中的磷酸化和表达，以响应胰岛素(300nM，30分钟)；以及
图6F代表了本申请所提出的模型，其中SERCA2a是心脏中介导胰岛素作用的关键因子；胰岛素刺激的SERCA2a-Thr484磷酸化通过调节SR Ca2+再摄取以维持心脏功能，并将FURIN依赖的前体蛋白加工与心脏收缩相结合；SERCA2a-Thr484的磷酸化受损会抑制SR Ca2+再摄取并通过溶酶体促进FURIN降解，从而导致胰岛素受体前体的加工受损。因此，SERCA2a-Thr484的磷酸化受损既是心脏胰岛素抵抗的结果也是原因，并且是WD诱导的糖尿病心肌病早期发病的重要机制；
数据以平均值±SEM的形式给出；使用t检验进行统计分析；*表示p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑的改变。
本申请提到的术语具有一下含义：
术语“SERCA2a”或者“肌浆网钙泵”或者“肌质/内质网钙ATP酶2a”在本文中可以互换，其对于维持钙转运能力，促进心肌细胞正常生活是非常重要的。现有研究发现，在许多心血管疾病，如糖尿病心肌病、心力衰竭中钙转运能力失衡，其潜在机制可能是由于多种因素导致的SERCA2a mRNA、SERCA2a蛋白的表达或活性降低。已有研究表明糖基化修饰、硝化和泛素化的翻译后修饰直接调节SERCA2a蛋白。
术语“糖尿病性心肌病”或“DCM”在本文中可互换使用，是与2型糖尿病(T2D)相关的进行性并发症，可导致糖尿病患者心脏功能恶化，其与高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病及其他心脏病均不同。该病在代谢紊乱及微血管病变之基础上引发心肌广泛灶性坏死，出现亚临床的心功能异常，最终进展为心力衰竭、心律失常及心源性休克，重症患者甚至猝死。
如本文所揭示的，SERCA2a的低磷酸化既是心肌细胞胰岛素抵抗的结果也是原因，这是WD诱导的糖尿病心肌病早期发病的重要机制。在本申请的一些实施例中，糖尿病性心肌病包括心肌细胞中Ca2+转导异常导致的心脏代谢损伤及心脏胰岛素抵抗。在本申请的一些实施例中，糖尿病性心肌病还包括由于SERCA2a表达异常，或者SERCA2a-Thr484位点发生有义突变形成的与心脏能量代谢异常相关的疾病。在本申请的一些实施例中，糖尿病性心肌病也包括因饮食不当引起的糖尿病性心肌病伴随心脏胰岛素抵抗导致SERCA2a-Thr484磷酸化受损。在本申请的一些实施例中，糖尿病性心肌病还可以包括胰岛素受体前体通过FURIN转化酶的加工被抑制而导致的心脏胰岛素抵抗。
术语“SERCA2a的寡聚化”在本申请中是指2个SERCA2a单体在肌质网上形成的二聚体。寡聚化的SERCA2a相对于SERCA2a单体具有更加高效的Ca2+转运能力。
术语“动物模型”在本申请中是指经技术手段改造的非人动物，包括啮齿动物、兔、猪和类似动物。目前优选的是啮齿动物(例如，小鼠、大鼠和类似动物)，小鼠是特别优选的。在一些实施例中，改造动物模型的技术手段可以包括基因工程技术手段，如CRISPR/Cas9技术、TELEN技术或者RNAi技术，以及以上技术的结合。本领域技术人员应当了解，随着生物技术的发展与进步，制备动物模型的手段不仅仅局限于上述所列的基因工程技术手段，因此本申请并不限定制造动物模型的技术手段。在一些实施例中，治疗研究包括但不限于药物的适应症筛选、副作用研究、用法及用量筛选等。
术语“PKB-SPEG通路”在本申请中是指包括IR、PKB、SPEG、SERCA2a和FURIN等形成的调节胰岛素敏感性和心脏功能的回路，是心肌细胞中的胰岛素信号转导途径。
在用胰岛素刺激后，心脏中的SERCA2a在其Thr484、Thr499、Ser495或Ser488上被横纹肌特异性表达的蛋白激酶(SPEG)磷酸化，其中Thr484的磷酸化需在磷酸化依赖位点Lys480和/或Lys481的辅助下完成。该蛋白激酶本身被蛋白激酶B(PKB，也称为Akt)磷酸化。SPEG包含两个Ser/Thr激酶结构域，即SK1和SK2，PKB介导的磷酸化激活SPEG的SK2，从而磷酸化SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488。心脏特异性PKB失活引起的心肌胰岛素抵抗会损害SPEG和SERCA2a的磷酸化，并导致心脏功能障碍。此外，阻止PKB介导的SPEG磷酸化的敲入突变会使其SK2失活，降低SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化，并损害心脏功能。
前体蛋白转化酶FURIN是剪切IR前体以产生IRα和IRβ的关键酶，其成熟和酶活性取决于Ca2+。当PKB-SPEG通路中PKB、SPEG和SERCA2a中任一蛋白质因内因或者外因磷酸化受损，或者被敲除、敲降或沉默时，心肌细胞中的FURIN蛋白显著降低。进一步地，在一些实施例中，认为FURIN的减少是由于因各种原因导致的SERCA2a转导Ca2+的功能受损而导致的RURIN经溶酶体降解。在一些实施例中，认为FURIN蛋白的显著降低进一步导致IR剪切成熟受损。
IR为胰岛素受体，IR的剪切成熟受损可导致心肌细胞的胰岛素抵抗，进而使得PKB、SPEG以及SERCA2a的磷酸化受损。
术语“磷酸化受损”在本申请中是指任何内因或外因导致的胰岛素通过PKB-SPEG通路中的PKB、SPEG和/或SERCA2a等蛋白质不能正常磷酸化。在本申请中，磷酸化受损可以包括因心肌细胞的胰岛素抵抗导致的PKB磷酸化受损、SPEG磷酸化受损或者SERCA2a磷酸化受损。在一些实施例中，PKB-SPEG通路的磷酸化受损是由于SERCA2a基因的碱基置换、编码移位、缺失和插入导致SERCA2a的Ca2+转运能力受损。在一些实施例中，PKB-SPEG通路的磷酸化受损是由于SERCA2a的敲除、敲降或沉默导致SERCA2a的Ca2+转运能力受损。
本领域技术人员应当了解，SERCA2a介导心肌细胞中Ca2+的转导，其可将Ca2+由胞浆转入肌浆网内在心肌细胞钙稳态调节中起重要作用。术语“Ca2+转运能力受损”是指因SERCA2a功能缺失，Ca2+转导异常。在一些实施例中，SERCA2a的功能缺失可能是由于SERCA2a的如磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化修饰、硝化等翻译后修饰异常导致。在一些实施例中，SERCA2a的功能缺失可能由于serca2a基因碱基的缺失、移码、插入、替换导致。在一些实施例中，SERCA2a的功能缺失可能由于SERCA2a的敲除、敲降或沉默导致。在一些实施例中，SERCA2a的功能缺失是由于SERCA2a寡聚化异常导致。
在一些实施例中，SERCA2的磷酸化异常是由于其上的磷酸化位点突变。图1H为根据本申请一个实施例的磷酸化位点筛选蛋白图谱。如图1H所示，SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488突变均可不同程度导致PKB-SPEG通路中SERCA2a的磷酸化受损。
当SERCA2a的磷酸化依赖位点正常表达时，才能保证PKB-SPEG通路中SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化。术语“磷酸化依赖”是指蛋白激酶在磷酸化底物的过程中，需要底物磷酸化位点附近一些特定氨基酸组成的基序才能最大化的增强靶位点的磷酸化水平。
磷酸化依赖受损可由于磷酸化依赖位点的突变导致。本领域技术人员应当了解，磷酸化位点上游或下游的磷酸化依赖位点受损，将间接损害磷酸化位点的磷酸化。根据本申请的一个实施例，SERCA2a-Thr484的磷酸化依赖位点为SERCA2a-Lys480和/或SERCA2a-Lys481，当SERCA2a-Lys480和/或SERCA2a-Lys481突变时，SERCA2a-Thr484将磷酸化受损。
术语“PKB磷酸化受损”在本申请中是指因SERCA2a功能异常引起的Ca2+转运能力异常导致PKB-SPEG通路异常，具体表现为心脏特异性PKB失活，引起心肌胰岛素抵抗并损害SPEG和SERCA2a的磷酸化，并进一步导致心脏功能障碍。
术语“SPEG磷酸化受损”在本申请中是指因SERCA2a功能异常引起的Ca2+转运能力异常导致PKB-SPEG通路异常，具体表现为钙稳态异常的心肌细胞中用胰岛素刺激后，SPEG被蛋白激酶B(PKB，也称为Akt)磷酸化的水平降低。
术语“CRISPR/Cas9”、“CRISPR/Cas9技术”或者“Cas9介导的某突变”在本文中可以互换，是一种基因编辑的方法。
在本申请中，术语“Cas9核酸酶”也可称为，Csn1或Csx12，通常是指与II型CRISPR(有规律地间隔的短回文重复序列)自适应免疫系统相关的RNA引导的DNA核酸内切酶。Cas9核酸酶还可包括野生型蛋白质，直系同源物，及其功能性和非功能性突变体。所述Cas9核酸酶可源于任何合适的细菌。Cas9核酸酶通常包括RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域，分别切割双链DNA分子的两条不同的链。已经在不同的细菌物种如嗜热链球菌(S.thermophiles)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)(Gasiunas，Barrangou etal.2012；Jinek，Chylinski et al.2012)和化脓性链球菌(S.Pyogenes)(Deltcheva，Chylinski et al.2011)中描述了Cas9核酸酶。例如，化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9蛋白，其氨基酸序列参见SwissProt数据库登录号Q99ZW2；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号A1IQ68；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号Q03LF7；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号J7RUA5。
在本申请的一些实施例中，可以使用CRISPR/Cas9技术对serca2a基因或者SERCA2a蛋白进行编辑，使SERCA2a的Ca2+转运能力受损。进一步地，在本申请中，对serca2a基因或者SERCA2a蛋白编辑包括将SERCA2a-Thr484位点突变和/或将SERCA2a-Lys480位点突变和/或将SERCA2a-Lys481位点突变。在一些实施例中，对serca2a基因或者SERCA2a蛋白编辑包括将位点、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488突变。
本领域技术人员应当了解，横纹肌特异性表达的蛋白激酶(SPEG)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(CaMK Ser/Thr)中肌球蛋白轻链激酶(MLCK)亚组的成员(ref.1)。之前的研究表明，肌球蛋白轻链激酶(MLCK)底物序列上都包含高比例的碱性氨基酸和疏水氨基酸，但不含酸性或脯氨酰残基(ref.2)。碱性氨基酸特别是赖氨酸(Lysine)的存在可以显著增强MLCK对靶蛋白的磷酸化水平(ref.3)。此外，在其他蛋白激酶(AMPK,AKT和PKA)中也有报导底物序列上赖氨酸(Lysine)的存在可以增强底物的磷酸化水平，当将赖氨酸突变后，它们下游靶蛋白的磷酸化水平下调(ref.4)。而在SERCA2a-Thr484位点附近存在两个赖氨酸Lys480和Lys481，结合肌球蛋白轻链激酶对底物磷酸化的调控，我们认为Lys480和Lys481是SERCA2a-Thr484的磷酸化依赖位点，是SERCA2a-Thr484位点磷酸化调控所必须的。(参考文献：1.Hsieh CM,Fukumoto S,Layne MD,Maemura K,Charles H,Patel A,Perrella MA,LeeME.Striated muscle preferentially expressed genes alpha and beta are twoserine/threonine protein kinases derived from the same gene as the aorticpreferentially expressed gene-1.J Biol Chem.2000Nov 24；275(47):36966-73.doi:10.1074/jbc.M006028200.PMID:10973969.2.Blumenthal DK,Takio K,Edelman AM,Charbonneau H,Titani K,Walsh KA,Krebs EG.Identification of the calmodulin-binding domain of skeletal muscle myosin light chain kinase.Proc Natl AcadSci U S A.1985May；82(10):3187-91.doi:10.1073/pnas.82.10.3187.PMID:3858814；PMCID:PMC397740.3.Jackson AE,Carraway KL 3rd,Puett D,Brew K.Effects of thebinding of myosin light chain kinase on the reactivities of calmodulinlysines.J Biol Chem.1986Sep 15；261(26):12226-32.PMID:3091599.4.Parker BL,Shepherd NE,Trefely S,Hoffman NJ,White MY,Engholm-Keller K,Hambly BD,LarsenMR,James DE,Cordwell SJ.Structural basis for phosphorylation and lysineacetylation cross-talk in a kinase motif associated with myocardial ischemiaand cardioprotection.J Biol Chem.2014 Sep 12；289(37):25890-906.doi:10.1074/jbc.M114.556035.Epub 2014 Jul 9.Erratum in:J Biol Chem.2014 Dec 5；289(49):33875.PMID:25008320；PMCID:PMC4162189.)。
进一步地，在本申请中，对serca2a基因或者SERCA2a蛋白编辑包括将SERCA2a-Thr484位点突变为丙氨酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)或者甘氨酸(Gly)。进一步地，所述磷酸化靶点SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495以及SERCA2a-Ser488突变为丙氨酸(Ala)或者甘氨酸(Gly)。本领域技术人员应当了解，丙氨酸、甘氨酸等氨基酸为侧链惰性的氨基酸，其通常无法被磷酸化或者磷酸化不明显，因此当讨论突变导致蛋白磷酸化异常时，可优先考虑将靶点突变为丙氨酸或者甘氨酸。
在一些实施例中，对serca2a基因或者SERCA2a蛋白编辑包括将SERCA2a-Lys480突变为突变为丙氨酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)或者甘氨酸(Gly)。
在一些实施例中，对serca2a基因或者SERCA2a蛋白编辑包括将SERCA2a-Lys481突变为突变为丙氨酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、苏氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)或者甘氨酸(Gly)。
术语“TALEN(转录激活物样效应器核酸酶)技术”是区别于上述CRISPR/Cas9技术的另一种基因编辑方法，是通过将TAL效应器DNA结合域与DNA切割域融合产生的人工限制酶。在本申请的一些实施例中，可以使用TALEN技术对SERCA2a基因进行编辑，使SERCA2a的Ca2+转运能力受损。进一步地，对SERCA2a编辑包括使serca2a基因碱基缺失、移码、插入、替换而使得SERCA2a蛋白功能缺失。
术语“RNAi”是指RNA干扰，在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类：TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录；PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。本领域技术人员应当了解，在一些实施例中，通过RNAi技术使SERCA2a基因沉默后同样可以使得PKB-SPEG通路中SERCA2a的磷酸化受损；和/或动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力受损。
术语“模拟动物心肌病”在本申请中是指使动物心肌细胞中SERCA2a的磷酸化受损；和/或动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力受损，使得动物出现心肌病，以用于对应人类或动物的相关疾病的病理学、毒理学、药理学、免疫学等研究。进一步地，模拟动物心肌病还可为该疾病的治疗、缓解及预防提供实验平台。在一些实施例中，心肌病为糖尿病性心肌病。在一些实施例中心肌病为早期的糖尿病性心肌病。
术语“早期的糖尿病性心肌病”在本申请中是指糖尿病性心肌病的早期发病，其是由PKB-SPEG通路中的IR、PKB、SPEG、SERCA2a和FURIN等任一环节受损或表达上调/下调导致的心脏胰岛素抵抗。在一些实施例中，早期的糖尿病性心肌病由于心肌细胞中胰岛素受体IR和/或心肌细胞中的弗林蛋白酶FURIN的含量降低导致。在一些实施例中，早期的糖尿病性心肌病由于IRβ的含量降低导致。在一些实施例中，早期的糖尿病性心肌病由于PKB、SPEG和/或SERCA2a磷酸化异常导致。在一些实施例中，早期的糖尿病性心肌病由于SERCA2a的Ca2+转运能力受损导致。在一些实施例中，早期的糖尿病性心肌病由于SERCA2a的功能缺失导致。
在一些实施例中，SERCA2a的功能缺失可能是由于SERCA2a的如磷酸化、泛素化、乙酰化、糖基化修饰、硝化等翻译后修饰异常导致。在一些实施例中，SERCA2a的功能缺失可能由于serca2a基因碱基的缺失、移码、插入、替换导致。在一些实施例中，SERCA2a的功能缺失可能由于SERCA2a的敲除、敲降或沉默导致。在一些实施例中，SERCA2a的功能缺失是由于SERCA2a寡聚化异常导致。
术语“给药方案的功效和/或安全性”在本申请中是指通过动物模型或者分离的动物模型的细胞筛选的药物的给药方案。对受试者，如小鼠或其他动物及人类，该方案为经过多次实验并综合评估的，其对于疾病具有最有的治疗、缓解或者预防的功效；或者对受试者具有较好的安全性，如副作用是可以接受的或者没有副作用；或者该给药方案综合的对于疾病具有最有的治疗、缓解或者预防的功效，以及对受试者具有较好的安全性，如副作用是可以接受的或者没有副作用。在一些实施例中，给药方案包括药物的载体形式，如制剂、注射液、胶囊、片剂、口服液、丸剂、冲剂以及与其他药物共同作用等。在一些实施例中，给药方案包括给药方式，如嚼服、冲服、注射、佐水口服、佐指定制剂口服等。在一些实施例中，给药方案包括给药剂量，如每日给药总剂量、单次给药剂量、每日给药次数等。在一些实施例中，给药方案包括给药的时机，如饭后、睡前等。
术语“候选物质”在本申请中是指为研究或筛选动物模型或者分离的动物模型的细胞的生理活性、病理活性、毒理、药理、免疫活性等而用于测试的物质。在一些实施例中，候选物质可以为各种形式的用于治疗、缓解或者预防疾病的药物或药物组合物。在一些实施例中，候选物质可以为用于研究疾病病理过程、机制等的实验药品。
术语“WD”和“西方饮食”在本申请中可以互换。其表示相对于喂食正常饮食的小鼠，WD小鼠饮食以高糖高脂为主。
术语“正常饮食”、“正常食物”、“自由采食”、“正常喂养”、“正常饲喂”以及“CD”在本申请中可以互换，其与WD相对，CD喂养小鼠饮食中的糖及脂类含量在公知的健康范围内。
心肌细胞中的Ca2+稳态涉及其在兴奋-收缩偶联过程中在细胞质和肌质网(SR)之间的循环，从而控制心肌的收缩和舒张。Ca2+从细胞质重新摄取到SR是由SERCA2a介导的，其功能障碍是心力衰竭的标志。在用胰岛素刺激后，心脏中的SERCA2a在其Thr484、Thr499、Ser495和/或Ser488上被横纹肌特异性表达的蛋白激酶(SPEG)磷酸化，其中，Thr484磷酸化需在Thr480和/或Thr481磷酸化依赖的辅助下完成，该蛋白激酶本身被蛋白激酶B(PKB，也称为Akt)磷酸化。SPEG包含两个Ser/Thr激酶结构域，即SK1和SK2。PKB介导的磷酸化激活SPEG的SK2，从而磷酸化SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488，其中SERCA2a-Thr484磷酸化在SERCA2a-Thr480和/或SERCA2a-Thr481的辅助下完成。心脏特异性PKB失活引起的心肌胰岛素抵抗会降低SPEG和SERCA2a的磷酸化，并导致心脏功能障碍。阻断PKB介导的SPEG磷酸化的敲入突变会使其SK2失活，降低SERCA2a-Thr484磷酸化，并损害心脏功能。然而，PKB-SPEG通路可能通过磷酸化SERCA2a以外的蛋白质底物来调节心脏功能。因此，在本申请之前，SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化以及SERCA2a-Thr480和/或SERCA2a-Thr481的磷酸化依赖在体内的确切作用并不清楚，特别是关于其在心肌胰岛素抵抗和糖尿病性心肌病发病机制中的作用。
胰岛素通过其受体引发PI3K-PKB通路的激活以发挥其生理作用。这些胰岛素信号的近端成分存在于所有胰岛素反应组织中。然而，人们早就认识到，一些组织可能会产生选择性胰岛素抵抗。例如，在胰岛素抵抗的肝脏中，胰岛素不再能够抑制肝脏糖异生，但表现出增强的促进脂肪生成的活性。这种选择性胰岛素抵抗的存在导致最近提出的组织和/或途径特异性胰岛素作用。胰岛素信号通路的某些组织/通路特异性远端组分或效应因子可能参与这种选择性胰岛素作用的执行。与这个观点一致，胰岛素通路下游的SPEG-SERCA2a信号模块特异性地存在于横纹肌中，并介导心脏中的胰岛素作用。该信号模块不仅表现出组织特异性分布，而且使胰岛素产生通路选择性作用。它调节心脏中的Ca2+稳态，但对全身葡萄糖代谢没有影响。由此，在本文的多个实施例中，通过引入SPEG3A突变或SERCA2aThr484Ala突变破坏该信号模块，导致心脏选择性胰岛素抵抗，损害Ca2+稳态并导致心肌病。本领域技术人员应当了解，SERCA2aThr484Ala突变仅为本申请的一个实施例，而不是对本申请的限制。事实上，SERCA2aThr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488、SERCA2a-Thr480和/或SERCA2a-Thr481突变均可破坏该信号模块，导致心脏选择性胰岛素抵抗，损害Ca2+稳态并导致心肌病。
进一步地，SERCA2aThr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488除了可以突变为丙氨酸(Ala)，还可以突变为苯丙胺酸(Phe)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)或者甘氨酸(Gly)。进一步地，所述磷酸化靶点SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495以及SERCA2a-Ser488突变为丙氨酸(Ala)或者甘氨酸(Gly)。本领域技术人员应当了解，丙氨酸、甘氨酸等氨基酸为侧链惰性的氨基酸，其通常无法被磷酸化或者磷酸化不明显，因此当讨论突变导致蛋白磷酸化异常时，可优先考虑将靶点突变为丙氨酸或者甘氨酸。
如本文中的实验结果所表明的，SERCA2a对于介导心脏中的胰岛素作用至关重要，并且其Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化、Thr480和/或Thr481磷酸化依赖通过调节SR Ca2+再摄取以维持心脏功能，将前体蛋白加工与心脏收缩结合起来(图6F)。SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488的磷酸化受损和/或SERCA2a-Thr480和/或SERCA2a-Thr481磷酸化依赖受损既是心肌细胞胰岛素抵抗的结果也是原因，这是WD诱导的糖尿病心肌病早期发病的重要机制。
如本文的实验数据表明，驱动心脏泵血的节律性心脏收缩本质上与通过细胞浆和SR之间的Ca2+穿梭的FURIN依赖性前体蛋白加工相结合。众所周知，Ca2+调节FURIN成熟和酶活性。本文的实验结果揭示了Ca2+控制FURIN的另一种调节机制，其中SR中的Ca2+减少促进了溶酶体介导的FURIN降解。作为一种前体蛋白转化酶，FURIN具有多种底物，包括IR，其信号传导导致SERCA2a的SPEG依赖性Thr484磷酸化。因此，IR、PKB、SPEG、SERCA2a和FURIN形成了调节胰岛素敏感性和心脏功能的回路。心脏胰岛素抵抗会降低PKB-SPEG轴的活性，从而导致SERCA2a-Thr484的低磷酸化和随之而来的细胞Ca2+掌控能力异常。反过来，受损的Ca2+稳态通过减少FURIN依赖的胰岛素受体前体的加工而加重心脏胰岛素抵抗。因此，该调节回路内不同节点的中断或干扰可能会降低细胞对Ca2+的掌控并促进心脏胰岛素抵抗，最终导致心肌病的发展。
因此，SERCA2a的低磷酸化是糖尿病心肌病早期发病的重要机制。SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化的恢复以及SERCA2a-Thr480和/或SERCA2a-Thr481磷酸化依赖的恢复可能对治疗糖尿病心肌病具有临床价值。SPEG是PKB底物以及SERCA2a的上游激酶。在胰岛素抵抗的心脏中，胰岛素不能激活SPEG的SK2，导致SERCA2a的低磷酸化。SPEG的SK2自身能够磷酸化心肌细胞中的SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488。在一些实施例中，SERCA2a-Thr484通过磷酸化依赖位点SERCA2a-Thr480和/或SERCA2a-Thr481磷酸化。因此，调节SPEG的SK2的表达是早期治疗糖尿病性心肌病的一种可能方式。
SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化通过调节SR Ca2+再摄取将前体蛋白加工与心脏收缩相结合。由于胰岛素抵抗导致的SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488磷酸化受损是糖尿病心肌病早期发病的机制。本文的研究结果对糖尿病性心肌病的治疗具有指导意义。
本发明的一个方面，提出了一种动物模型以及用于产生动物模型的方法。在一些实施例中，动物模型为啮齿动物、兔、猪和类似非人动物；优选地，为啮齿动物(例如，小鼠、大鼠和类似动物)；特别优选地，为小鼠。在本申请中，动物模型为小鼠，如心肌细胞中SERCA2a的磷酸化受损；和/或动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力受损的小鼠。
在一些实施例中，SERCA2a的磷酸化受损为所述SERCA2a的磷酸化靶点有突变导致。优选地，所述磷酸化靶点为SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和/或SERCA2a-Ser488。优选地，所述磷酸化靶点SERCA2a-Thr484突变为丙氨酸(Ala)。本领域技术人员应当了解，将苏氨酸(Thr)突变为丙氨酸(Ala)仅为本申请的一个实施例，而不应当作为本申请的限制。将苏氨酸突变为任意其他氨基酸均可能使得SERCA2a的磷酸化以及钙稳态受损。
在一些实施例中，SERCA2a的磷酸化受损为心肌细胞中PKB和/或SPEG磷酸化受损导致，或者为心肌细胞中的弗林蛋白酶(FURIN)含量降低和/或所述动物模型的心肌细胞中胰岛素受体(IR)含量降低导致。优选地，所述IR为IRβ。
在一些实施例中，可以通过以下基因功能技术手段中的一种或多种抑制心肌细胞中SERCA2a的磷酸化和/或破坏动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+稳态：CRISPR/Cas9技术、TALEN技术和RNA i技术。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的动物模型在心肌病的验证、评级或研究方面的应用。在一些实施例中，本申请的动物模型可用于模拟动物心肌病，以用于相关的病理、毒理、药理、代谢、免疫等相关研究，以及治疗方法、药物、给药方案等的测试与筛选。优选地，所述心肌病为糖尿病性心肌病。优选地，所述心肌病为早期的糖尿病性心肌病。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的动物模型在心肌病病理研究方面的应用。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的分离的动物模型细胞在心肌病病理研究方面的应用。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的动物模型筛选一种或多种候选物质的方法，所述方法包括向所述动物模型动物施用所述一种或多种候选物质。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的动物模型测定一种或多种药物的给药方案的功效和/或安全性的非治疗方法。在一些实施例中，给药方案意指给予受试者的药剂的在受试者体内维持药剂的治疗水平的量。例如，受试者可接受初始剂量的药剂，所述剂量可根据受试者对初始剂量的反应而调整为更高或更低。一旦确定了提供所需治疗水平的剂量，便认为受试者正在接受给药方案。所需治疗水平可为受试者的组织(如血液)中所需的药剂水平；或所需药理作用，如疾病的一种或多种症状的改善。
在一些实施例中，本申请的动物模型可用于对一种或多种药物的单独和/或联合使用的功效进行评估。功效的评估结论例如可以为治愈、缓解、维持、兼用效果增强、兼用无增强、不可同时使用等。在一些实施例中，功效评估包括直至用药后一段时间后PKB-SPEG通路中PKB、SPEG、SERCA2a的磷酸化指标、PKB-SPEG通路中IR及FURIN的含量等、SERCA2a的Ca2+稳态评估。在一些实施例中，功效评估包括直至用药后一段时间后心肌细胞的胰岛素转导评估。
在一些实施例中，本申请的动物模型可用于对一种或多种药物的单独和/或联合使用的安全性进行评估，包括直至用药后一段时间的治疗相关不良事件(TEAE)、临床实验室评估(生化、血液学、尿液分析)、生命体征、自动记录的心电图(ECG)、PKB-SPEG通路中PKB、SPEG、SERCA2a的磷酸化指标、PKB-SPEG通路中IR及FURIN的含量等、SERCA2a的Ca2+稳态，以及局部耐受性评估。
在一些实施例中，分离的如上任一的分离的动物模型的细胞心肌病的验证、评级或研究方面的应用。在一些实施例中，本申请的分离的动物模型细胞可用于模拟动物心肌病，以用于相关的病理、毒理、药理、代谢、免疫等相关研究，以及治疗方法、药物、给药方案等的测试与筛选。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的分离的动物模型的细胞筛选一种或多种候选物质的方法，所述方法包括向所述动物模型细胞的施用所述一种或多种候选物质。
根据本发明的另一个方面，提出如上任一的分离的动物模型的细胞测定一种或多种药物的给药方案的功效和/或安全性的非治疗方法。
根据本发明的另一个方面，提出分离的如上任一分离的动物模型的细胞测定一种或多种药物的给药方案的功效和/或安全性的非治疗方法。在一些实施例中，给药方案意指给予受试者的药剂的在受试者体内维持药剂的治疗水平的量。例如，受试者可接受初始剂量的药剂，所述剂量可根据受试者对初始剂量的反应而调整为更高或更低。一旦确定了提供所需治疗水平的剂量，便认为受试者正在接受给药方案。所需治疗水平可为受试者的组织(如血液)中所需的药剂水平；或所需药理作用，如疾病的一种或多种症状的改善。
在一些实施例中，本申请的动物细胞可用于对一种或多种药物的单独和/或联合使用的功效进行评估。功效的评估结论例如可以为治愈、缓解、维持、兼用效果增强、兼用无增强、不可同时使用等。在一些实施例中，功效评估包括直至用药后一段时间后PKB-SPEG通路中PKB、SPEG、SERCA2a的磷酸化指标、PKB-SPEG通路中IR及FURIN的含量等、SERCA2a的Ca2+转运能力、心肌细胞稳态评估。在一些实施例中，功效评估包括直至用药后一段时间后心肌细胞的胰岛素转导评估。
在一些实施例中，本申请的动物细胞可用于对一种或多种药物的单独和/或联合使用的安全性进行评估，包括直至用药后一段时间的治疗相关不良事件(TEAE)、临床实验室评估(生化、血液学、尿液分析)、生命体征、自动记录的心电图(ECG)、PKB-SPEG通路中PKB、SPEG、SERCA2a的磷酸化指标、PKB-SPEG通路中IR及FURIN的含量等、SERCA2a的Ca2+转运能力、心肌细胞稳态，以及局部耐受性评估。
实施例1:西方饮食(WD)降低胰岛素诱导的SERCA2a-Thr484磷酸化，损害心脏功能
西方饮食(Western diets,WD)会导致系统性胰岛素抵抗并导致糖尿病性心肌病。在一些实施例中，WD小鼠变得肥胖，其葡萄糖耐量受损而发展为全身性胰岛素抵抗(如图1A-图1B所示)。与来自喂食正常食物(normal chow diet,CD)的小鼠的细胞相比，从喂食WD的小鼠分离的原代心肌细胞中的胰岛素受体β亚基(IRβ)减少(如图1C)。相应地，胰岛素刺激的PKB及其底物AS160的磷酸化在来自WD饲喂小鼠的原代心肌细胞中降低(图1C)。本领域技术人员应当了解，胰岛素通过PKB-SPEG通路调节SERCA2a-Thr484的磷酸化。与受损的PKB活化一致，胰岛素刺激的SPEG和SERCA2a-Thr484磷酸化在WD饲喂小鼠的原代心肌细胞中减弱(图1C)。测量原代心肌细胞中的Ca2+瞬变可发现，其在WD喂养小鼠的细胞中被抑制(图1D-E)。WD饲喂小鼠的心肌细胞中半峰全持续时间(FDHM)和时间常数Tau均增加(图1D-E)，表明Ca2+再摄取到肌质网(SR)受损。进一步地，WD喂养小鼠的心脏功能表现出进行性下降，左心室(LV)体积增大和心室壁变薄(图1F-G)。综上，这些数据表明，WD诱导的糖尿病性心肌病伴随心脏胰岛素抵抗导致SERCA2a-Thr484磷酸化受损。
实施例2:SERCA2aThr484Ala敲入小鼠模型的构建以及其基本表型
为了阐明SERCA2a-Thr484磷酸化在糖尿病性心肌病发展中的确切作用，构建立了一个小鼠模型，其中SERCA2a-Thr484通过Cas9介导的位点诱变突变为非磷酸化丙氨酸(图2A)。敲入突变不影响心脏中SERCA2a及其上游激酶SPEG的表达。正如预期的那样，这种突变阻止了敲入小鼠心肌细胞中磷酸化Thr484抗体识别的SERCA2a的磷酸化(图2B)。SERCA2aThr484Ala敲入小鼠是可行的并且没有表现出明显的表型。与它们的野生型(WT)同窝小鼠相比，这些小鼠在给予葡萄糖丸剂后具有正常的空腹血糖水平和清除血糖的完整能力。在SERCA2aThr484Ala小鼠和WT同窝小鼠之间，编码葡萄糖和脂肪酸代谢中关键酶的基因的心脏表达相当，包括Glut1、Glut4、Hk2、Pfk2、Lpl、Cd36、Fatp1、Fabp3、Atgl和Cpt1。类似地，在SERCA2aThr484Ala小鼠的心脏中，GLUT1、GLUT4和CD36的蛋白质水平保持正常。综上，这些数据表明SERCA2aThr484Ala敲入小鼠及其衍生细胞是研究SERCA2a-Thr484磷酸化功能的有用试剂。
实施例3:SERCA2aThr484Ala敲入突变损害心肌细胞中的Ca2+稳态
SERCA2a是Ca2+稳态的关键调节因子，其Thr484磷酸化与调节心肌细胞中Ca2+重新摄取到SR中有关。从年轻小鼠(3个月大)和年老小鼠(13个月大)中分离出原代心肌细胞，并在低频(0.5Hz)电刺激下使用基于Fluo-4的测定法测量Ca2+瞬变。与WT细胞相比，年轻小鼠SERCA2aThr484Ala的心肌细胞中的FDHM和Tau显著增加(图2C-D)，这表明敲入突变延长了Ca2+重新摄取到SR中。SR Ca2+再摄取的延迟可能导致细胞溶质Ca2+升高。事实上，与WT细胞相比，SERCA2aThr484Ala心肌细胞中Ca2+瞬变的幅度(细胞溶质Ca2+的量度)显著降低(图2C-D)，这表明SERCA2aThr484Ala心肌细胞中的胞浆中Ca2+升高。SERCA2aThr484Ala敲入突变对Ca2+稳态的影响在年老小鼠的心肌细胞中持续存在(图2E-F)。还测量了SERCA2aThr484Ala小鼠原代心肌细胞在高频(3Hz)电刺激下的Ca2+瞬变。在高频(3Hz)电刺激下，随着Ca2+再摄取到SERCA2aThr484Ala心肌细胞中SR的延长时间，Ca2+瞬变也被抑制，这与低频(0.5Hz)电刺激的表型变化相似。胞浆Ca2+浓度是基因表达的关键调节因子。与胞浆Ca2+升高一致，在SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的心肌细胞中，Rcan1.4(一种Ca2+反应基因)的mRNA水平显着增加(图2G)。受磷蛋白(Phospholamban)是SERCA2a的关键调节剂，其表达和磷酸化在WT和SERCA2aThr484Ala敲入小鼠之间相当。
接下来检查了原代心肌细胞中的Ca2+火花，发现它们的频率在两种基因型中相当(图2H-I)，这表明RyR2介导的SR自发释放Ca2+很可能没有改变。与此一致地，在SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的心脏中，RyR2的表达和磷酸化是正常的。可能是由于SR Ca2+再摄取缺陷的结果，与WT对照细胞相比，SERCA2aThr484Ala心肌细胞中肌浆网的钙离子载量显著降低(图2J)。
综上，这些数据表明SERCA2aThr484Ala敲入突变会损害心肌细胞中的Ca2+稳态。
实施例4:细胞Ca2+掌控能力异常导致SERCA2aThr484Ala心肌细胞出现胰岛素抵抗
接下来试验了SERCA2aThr484Ala敲入突变是否以及如何影响心肌细胞中的胰岛素信号转导。为此，从新生的和成年的WT和SERCA2aThr484Ala敲入小鼠中分离出原代心肌细胞。有趣的是，与WT细胞相比，胰岛素刺激的PKB磷酸化在新生小鼠SERCA2aThr484Ala敲入心肌细胞中减弱(图3A)。与较低的PKB活化一致，通过PAS(磷酸化-Akt底物)抗体检测到的胰岛素诱导的PKB底物磷酸化在新生SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的心肌细胞中显著降低(图3A)。GSK3是一种PKB底物，其响应胰岛素刺激的磷酸化在新生SERCA2aThr484Ala敲入小鼠心肌细胞中也低于WT细胞(图3A)。在成年SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的心肌细胞观察到类似的胰岛素-PKB信号抑制(图3B)。在SERCA2aThr484Ala敲入小鼠心肌细胞中发生胰岛素抵抗，表明SERCA2a不仅是胰岛素-PKB通路的靶标，而且还是心肌胰岛素信号转导的关键调节因子。
然后，研究了Ca2+掌控能力异常是否会导致心肌细胞出现胰岛素抵抗。据报道，SERCA2a的杂合缺失会损害心脏功能。因此，采用另一种遗传方法通过Cas9介导的诱变缺失小鼠中Serca2a的一个等位基因来抑制心脏中的SERCA2a功能。在杂合SERCA2a敲除小鼠的心脏中，SERCA2a在mRNA水平上降低了50％，在蛋白质水平上降低了30％。与SERCA2aThr484Ala敲入突变类似，SERCA2a的杂合性缺陷削弱了胰岛素刺激的PKB磷酸化，降低了PKB底物的PAS反应性磷酸化，并降低了原代心肌细胞中GSK3的磷酸化(图3C)。然后，采用药理学方法通过毒胡萝卜素(TG)在新生大鼠心室心肌细胞(NRVC)中抑制SERCA2a。同样，SERCA2a的药理抑制作用强烈阻断了响应胰岛素的PKB磷酸化，这伴随着NRVC中胰岛素刺激的GSK3磷酸化和PAS反应性磷酸化PKB底物的显著降低(图3D)。本领域技术人员应当了解，与抑制SRCa2+再摄取的TG不同，Ca2+载体A23187将Ca2+从SR调动到胞质溶胶中。尽管它们的作用模式存在差异，但这两种化合物对细胞Ca2+稳态发挥相似的作用。重要的是，当添加到NRVC或H9C2心肌细胞中时，A23187会导致类似于TG的胰岛素抵抗。
综上，这些数据表明异常Ca2+处理导致SERCA2aThr484Ala敲入小鼠心肌细胞中的胰岛素抵抗。
实施例5:SERCA2aThr484Ala突变通过FURIN损害心肌细胞前体蛋白加工
由于Ca2+转运能力受损的心肌细胞出现胰岛素抵抗，使得检查了胰岛素受体(IR)的表达，该受体由共同前体加工而成的α和β亚基组成。有趣的是，与WT细胞相比，SERCA2aThr484Ala和SERCA2a+/-心肌细胞中的IRβ降低(图4A-D)。SERCA2aThr484Ala和SERCA2a+/-心肌细胞IRβ的下调很可能是由SR Ca2+再摄取受到抑制引起的SR Ca2+降低而导致的。与这一观点一致的是，用TG或A23187处理也导致心肌细胞中IRβ的减少、IR前体的增加(图4G-H)。这些数据表明，SR中异常的Ca2+处理可能会损害心肌细胞中IR前体的处理。事实上，监测IR处理的脉冲追踪实验表明，TG处理显著抑制了IRβ从其前体的产生(图4I-J)。本领域技术人员应当了解，前蛋白转化酶FURIN是剪切IR前体以产生IRα和IRβ的关键酶，其成熟和酶活性取决于Ca2+。有趣的是，SERCA2aThr484Ala和SERCA2a+/-心肌细胞中的FURIN蛋白显著降低(图4A-D)。此外，随着IRβ的降低，在WD喂养小鼠的心脏中，FURIN蛋白也显著降低(图4E-F)。伴随IR处理受损，在用TG或A23187处理的HEK293细胞中，FURIN蛋白也减少了(图4G-H)。TG或A23187诱导的FURIN蛋白减少早在加入细胞后30分钟、抑制IR剪切成熟之前发生。FURIN的减少很可能是IR剪切成熟受损的原因，因为FURIN的过表达逆转了TG或A23187对IR剪切成熟的抑制(图4K-L)。
与IR类似，胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)也是FURIN的底物，其在FURIN加工后的β亚基(IGF1Rβ)在SERCA2aThr484Ala和SERCA2a+/-心肌细胞中也降低(图4A-D)。此外，TG和A23187降低了IGF1Rβ，但导致NRVC和HEK293细胞中IGF1R前体的积累(图4G-H)。FURIN的过表达缓解了TG或A23187引发的IGF1R剪切成熟抑制(图4K-L)。
SERCA2aThr484Ala突变对IRβ的影响表现出组织依赖性，并在心脏中表现出来，其中SERCA2a是SR Ca2+再摄取的主要Ca2+泵。相反，在SERCA2aThr484Ala小鼠的骨骼肌和白色脂肪组织(WAT)中，IRβ保持正常，其中SERCA1和SERCA3可能占主导地位。
综上，这些数据表明，SERCA2aThr484Ala突变导致的SR Ca2+再摄取抑制通过下调心肌细胞中的FURIN来损害前体蛋白加的工。
实施例6:抑制SERCA2a可以促进FURIN的溶酶体降解
然后，检查了通过抑制SERCA2a下调FURIN蛋白的可能机制。由于弗林蛋白酶(Furin)mRNA在SERCA2aThr484Ala和SERCA2a+/-心肌细胞中保持正常，因此心肌细胞中FURIN的减少很可能与其mRNA无关。此外，TG或A23187处理也不影响HEK293细胞中的弗林蛋白酶(Furin)mRNA。怀疑蛋白质稳定性的改变可能是由SERCA2a抑制引起的FURIN减少的原因。用蛋白酶体抑制剂MG-132处理不影响TG或A23187引发的FURIN减少(图4M-N)，表明这种FURIN减少不是由蛋白酶体介导的。相反，心肌细胞与溶酶体抑制剂巴弗洛霉素-A1(bafilomycin-A1)的孵育阻止了TG或A23187诱导的FURIN减少(图4M-N)，表明FURIN的下调可能是通过溶酶体依赖的降解途径而导致的。此外，发现在TG或A23187处理的心肌细胞中一部分的FURIN与溶酶体共定位。综上，这些数据表明由SERCA2a抑制诱导的FURIN减少很可能是由通过溶酶体的蛋白质降解介导的。
实施例7:SERCA2aThr484Ala敲入小鼠出现心肌病
接下来试图找出SERCA2aThr484Ala敲入突变如何影响心脏功能。从2月龄开始，雄性SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的射血分数(EF)和缩短分数(FS)显著低于WT同窝小鼠(图5A-B，5I)。在收缩和舒张条件下，这些动物的LV(左心室)体积都大于WT同窝鼠仔(图5C-D、5I)。在收缩期和舒张期，SERCA2aThr484Ala心脏的前壁和后壁都比WT心脏薄(图5E-H、5I)。SERCA2aThr484Ala敲入突变在雌性小鼠中发挥了类似的作用，并且也从2个月大的时候开始出现心肌病。这些数据表明，SERCA2aThr484Ala敲入突变导致小鼠扩张型心肌病。分子分析显示SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的心脏发生了重塑。A型利钠肽(ANP)和B型利钠肽(BNP)是从扩张心脏的心室释放的心脏神经激素，它们的mRNA水平在SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的心脏中显著增加(图5J)。在SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的心脏中，ATP水平增加了2倍以上，表明这些小鼠的心脏功能下降不是由于能量缺乏，而是由于Ca2+转运能力受损。
这些数据表明，SERCA2a-Thr484磷酸化对正常喂养条件下的心脏功能至关重要。
实施例8:SERCA2a-Thr484磷酸化的下降是WD诱导的糖尿病性心肌病早期发病的机制
接下来试图找出SERCA2a-Thr484磷酸化在糖尿病心肌病发病机制中的潜在作用。为此，SERCA2aThr484Ala敲入小鼠及其WT同窝小鼠被喂食WD以诱导糖尿病性心肌病。与预期一致，WD饲喂在WT小鼠中诱导肥胖，且其空腹血糖水平升高。SERCA2aThr484Ala敲入小鼠在WD体重增加方面与它们的WT同窝小鼠没有区别。它们的空腹血糖升高到与WT小鼠相似的水平。与CD相比，WT和SERCA2aThr484Ala敲入小鼠在喂食WD时都出现了葡萄糖不耐受，并且在给予葡萄糖丸剂后它们的血糖清除率没有差异。这些数据表明SERCA2aThr484Ala敲入突变可能不会影响小鼠的全身葡萄糖稳态。如前所述，WD饲喂导致心脏功能逐渐下降，前4个月内WT小鼠的EF和FS证明了这一点(图6A-B)。WD喂养后4到6个月的EF和FS没有进一步下降(图6A-B)。在喂食WD之前，SERCA2aThr484Ala敲入小鼠的EF和FS低于其WT同窝小鼠(图6A-B)。有趣的是，他们的EF和FS在WD饲喂的前2个月内没有变化。之后，这两个参数在SERCA2aThr484Ala敲入小鼠中开始下降，直到WD饲喂4个月后达到平台期(图6A-B)。
测量了从WD饲喂后期的小鼠中分离的原代心肌细胞Ca2+瞬变。当从喂食WD的小鼠中分离心肌细胞时，两种基因型之间Ca2+瞬变的峰值、FDHM和Tau没有差异(图6C)。相反，当从喂食CD的小鼠中分离细胞时，SERCA2aThr484Ala敲入心肌细胞的Ca2+瞬变比WT心肌细胞的峰更小，而FDHM和Tau更大(图6D)。再次观察到SERCA2aThr484Ala敲入突变导致喂食CD的小鼠的心肌细胞出现胰岛素抵抗。WD饲喂导致WT心肌细胞中的胰岛素抵抗水平与来自CD喂养或WD喂养小鼠的SERCA2aThr484Ala心肌细胞相似(图6E)。
综上，这些数据表明SERCA2a-Thr484磷酸化受损是WD诱导的糖尿病心肌病早期发病的机制。
尽管糖尿病性心肌病在大约40年前被发现，但其发病机制仍未得到很好的解析。糖尿病心脏中葡萄糖、脂质和Ca2+的生理转运能力受损，联合氧化应激、炎症和线粒体功能障碍可能导致糖尿病性心肌病的发生发展。这些改变对糖尿病性心肌病发展的相对贡献需要特别在时间背景下进行定义。SERCA2aThr484Ala敲入小鼠使能够就受损的Ca2+转运能力的在糖尿病性心肌病发生发展中可能作用进行解析。对这些SERCA2aThr484Ala小鼠的数据证明了SERCA2a-Thr484磷酸化在维持心脏功能中的重要性，这与之前的研究一致，即糖尿病心脏的心功能不全与心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力受损相关。重要的是，使用这种SERCA2aThr484Ala小鼠模型揭示了糖尿病心肌病发病具有不同阶段。由于胰岛素抵抗导致的SERCA2a-Thr484磷酸化和Ca2+转运能力受损是糖尿病性心肌病早期发病的机制。基于这一结果，提出了糖尿病心肌病发病的“串联打击”假说，其中胰岛素抵抗导致的Ca2+转运能力受损是糖尿病心肌病早期的主要损伤。心脏功能在中期持续下降，直到在晚期达到平台期。糖尿病心肌病中晚期的病因分子和特征变化均不清楚，值得未来研究。糖尿病性心肌病各个阶段的分子标志物的鉴定对于诊断具有临床意义。的数据表明，单独的异常Ca2+处理可能不足以在SERCA2aThr484Ala敲入小鼠中引起糖尿病性心肌病中期的早期发作。中间阶段的开始可能需要一些未知因素，在SERCA2aThr484Ala敲除小鼠及其WT同窝小鼠中，在WD喂养时，这些因素的积累可能需要相似的时间。或者，由于研究的时间分辨率低，可能错过了中间阶段的起始点，这可能在SERCA2aThr484Ala敲入小鼠中比在WT同窝小鼠中更早。未来需要进一步的研究来解决这些悬而未决的问题。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。
Claims (17)
1.用于产生一种动物模型的方法，其中所述动物模型的心肌细胞中SERCA2a的磷酸化受损；和/或动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力受损。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，SERCA2a的磷酸化受损为所述SERCA2a的磷酸化靶点有突变导致和/或SERCA2a的磷酸化受损为所述SERCA2a的磷酸化依赖靶点有突变导致。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述磷酸化靶点为以下位点中的一个或者多个：SERCA2a-Thr484、SERCA2a-Thr499、SERCA2a-Ser495和SERCA2a-Ser488；所述磷酸化依赖靶点为SERCA2a-Lys480和/或SERCA2a-Lys481。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述磷酸化靶点SERCA2a-Thr484突变为丙氨酸(Ala)或者甘氨酸(Gly)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，SERCA2a的磷酸化受损为心肌细胞中PKB和/或SPEG磷酸化受损导致，或者为心肌细胞中的弗林蛋白酶(FURIN)含量降低和/或所述动物模型的心肌细胞中胰岛素受体(IR)含量降低导致。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述IR为IRβ。
7.根据权利要求1所述的方法，包括：通过以下基因功能技术手段中的一种或多种抑制心肌细胞中SERCA2a的磷酸化和/或破坏动物模型的心肌细胞中SERCA2a的Ca2+转运能力：CRISPR/Cas9技术、TALEN技术和RNA i技术。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述动物模型为小鼠。
9.如权利要求1-8中任一产生的动物模型在模拟动物心肌病方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，所述心肌病为糖尿病性心肌病。
11.根据权利要求9所述的应用，所述心肌病为早期的糖尿病性心肌病。
12.如权利要求1-8中任一产生的动物模型在心肌病病理研究方面的应用。
13.一种利用如权利要求1-8中任一产生的动物模型筛选一种或多种候选物质的方法，所述方法包括向所述动物模型施用所述一种或多种候选物质。
14.一种利用如权利要求1-8中任一产生的动物模型测定一种或多种药物的给药方案的功效和/或安全性的非治疗方法。
15.一种如权利要求1-8中任一所产生的分离的动物模型的细胞在心肌病病理研究方面的应用。
16.一种利用如权利要求1-8中任一产生的分离的动物模型的细胞筛选一种或多种候选物质的方法，所述方法包括向所述动物模型的细胞施用所述一种或多种候选物质。
17.一种利用如权利要求1-8中任一产生的分离的动物模型的细胞测定一种或多种药物的给药方案的功效和/或安全性的非治疗方法。
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