CN115337324A - 人脐带源间充质干细胞在nmosd中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，涉及医疗技术领域，其技术方案要点是：将人脐带源间充质干细胞应用于视神经脊髓炎谱系疾病的治疗。本发明将人脐带源间充质干细胞应用于视神经脊髓炎谱系疾病的治疗，具有良好的安全性和显著的治疗效果，能够克服现有的视神经脊髓炎谱系疾病的治疗仍有较高复发率、明显副作用以及严重后遗症的问题，减少NMOSD复发次数，减轻NMOSD神经功能损害，提高NMOSD治疗的耐受性，改善NMOSD患者依从性，同时增加了人脐带源间充质干细胞的疾病适应症。

Description

人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，更具体地说，它涉及人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用。

背景技术

视神经脊髓炎谱系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是一种主要由B细胞和AQP4抗体介导的中枢神经系统炎性疾病，特征为免疫介导的严重脱髓鞘及轴突损伤，主要累及视神经和脊髓。NMOSD在人群中的患病率高达十万分之十，主要影响年轻女性，复发性和致残性是NMOSD患者病情逐步恶化的棘手问题。超过60％的NMOSD患者在首次症状出现的第一年内复发，超过90％的患者在三年内复发。在反复发作的疾病过程中，部分患者散失行动能力或发生失明等严重结局。有超过1/3的患者处于长期失业，大部分患者日常生活无法完全自理。因此，减少NMOSD复发同时改善NMOSD后遗症是目前NMOSD治疗的重中之重。

现有NMOSD的治疗根据疾病的阶段而有所不同。在复发急性期，初始治疗包括大剂量静脉注射甲强龙和血浆置换。缓解期治疗包括硫唑嘌呤和吗替麦考酚酯等免疫抑制剂以减少复发。但现有的糖皮质激素和免疫抑制剂存在较为明显的副作用，如股骨头坏死、血糖升高、白细胞减少等，导致患者使用依从性欠佳、疾病预后不佳。

综上所述，现有技术存在的问题是：

1)现有NMOSD患者治疗方案仍有较高的复发率。

2)现有NMOSD治疗方案下，患者仍有较为严重的后遗症，极大影响了患者的日常生活。

3)现有NMOSD患者治疗方案存在较为明显的副作用，导致患者不能使用依从性欠佳，影响治疗效果。

因此，针对上述技术问题，本发明旨在提供人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，以解决上述问题。。

发明内容

本发明的目的是提供人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，提供人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，本发明将人脐带源间充质干细胞通过静脉输注应用于视神经脊髓炎谱系疾病的治疗，具有良好的安全性和显著的治疗效果，能够克服现有的视神经脊髓炎谱系疾病的治疗仍有较高复发率、明显副作用以及严重后遗症的问题，减少NMOSD复发次数，减轻NMOSD神经功能损害，提高NMOSD治疗的耐受性，改善NMOSD患者依从性，同时增加了人脐带源间充质干细胞的疾病适应症。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，包括将所述的人脐带源间充质干细胞用于视神经脊髓炎谱系疾病的治疗。

本发明进一步设置为：所述人脐带源间充质干细胞用于制备注射用的干细胞药物。

本发明进一步设置为：所述人脐带源间充质干细胞通过调节免疫系统，实现治疗自身免疫疾病的作用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明将人脐带源间充质干细胞通过静脉输注应用于视神经脊髓炎谱系疾病的治疗，具有良好的安全性和显著的治疗效果，能够克服现有的视神经脊髓炎谱系疾病的治疗仍有较高复发率、明显副作用以及严重后遗症的问题，减少NMOSD复发次数，减轻NMOSD神经功能损害，提高NMOSD治疗的耐受性，改善NMOSD患者依从性，同时增加了人脐带源间充质干细胞的疾病适应症。

附图说明

图1是本发明实施例中hUC-MSCs表面抗原的表达结果；

图2是本发明实施例中hUC-MSCs细胞增殖曲线图；

图3是本发明实施例中hUC-MSCs细胞周期检查结果；

图4是本发明实施例中hUC-MSCs细胞成骨诱导分化实验结果；

图5是本发明实施例中hUC-MSCs细胞成脂肪诱导分化实验结果；

图6是本发明实施例中hUC-MSCs细胞成软骨诱导分化实验结果；

图7是本发明实施例中hUC-MSCs细胞对免疫细胞的影响；

图8是hUC-MSCs治疗NMOSD的疗效效果图；

图9是hUC-MSCs治疗NMOSD临床研究受试者相关数据表。

具体实施方式

以下结合附图1-9对本发明作进一步详细说明。

实施例：人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，如图1-9所示。将所述的人脐带源间充质干细胞用于视神经脊髓炎谱系疾病的治疗。

进一步设置为：所述人脐带源间充质干细胞用于制备注射用的干细胞药物。

进一步设置为：所述人脐带源间充质干细胞通过调节免疫系统，实现治疗自身免疫疾病的作用。

间充质干细胞对视神经脊髓炎等自身免疫性疾病治疗的潜在机制是通过调节机体免疫，从而阻止疾病的进展。

在固有免疫中，MSC可通过PGE2、TSG-6、糖皮质激素受体等通路，促进巨噬细胞由促进炎症的M1型转化为抑制炎症的M2型。MSC能够抑制树突状细胞的分化和迁徙，影响成熟树突状细胞的形成，从而产生无免疫功能的T细胞。在MSC细胞作用下，树突状细胞TNF-α、IFN-β、IL-12的分泌减少，MHCⅡ类分子的表达能力下降[14]。通过PGE2、IDO、TGF-β等通路，MSC可抑制自然杀伤细胞(NK)IFN-γ的分泌和NK细胞的细胞杀伤功能。

在获得性免疫中，MSC能够通过PGE2通路，抑制B细胞的增殖和抗体的产生。MSC细胞可通过多种途径调节T细胞的免疫作用。BM-MSC可抑制Th1细胞产生的TNF-α和IFN-γ；抑制TH17细胞产生的IL-17；促进TH2细胞产生的IL-4等免疫抑制细胞因子。AT-MSC也可以抑制如IL-17、IFN-γ等炎症因子的产生，并增加TGF-β的分泌。在与外周来源的单核细胞共培养时，MSC可促进Treg细胞的产生，发挥免疫调节作用。

为评价人脐带源间充质干细胞在治疗NMOSD患者中的安全性和有效性进行前瞻性、多中心、随机对照实验。选择30个受试者分为3组，第1～10例为低剂量组(1×106/个MSC/公斤体重)，第11～20例为中剂量组(2×106/个MSC/公斤体重)，第21～30例为高剂量组(5×106/个MSC/公斤体重)。每个受试者只接受一个相应的剂量，不得再次使用其他剂量。从低剂量开始，每个剂量观察结束后，才可进入下一剂量。如剂量递增过程中出现了不可接受的毒性反应，即使未达到最大剂量，也应停止试验。在第一阶段正式入组前，增加1例受试者给予中等剂量(2×106/个MSC/公斤体重)单次给药，观察随访至少3个月。该受试者单次给药后直接进入为期1年的跟踪随访。

根据分组信息以及受试者体重，计算出所需要的MSC剂量(即1或2或5×106/个MSC/公斤体重)，并向干细胞提供公司发出申请。干细胞提供公司将制剂运送至医院，经质检合格后，才能用于受试者。

干细胞制剂的使用方法、剂量、时间及疗程如下：

1hUC-MSC输注前准备

(1)制剂运输及贮存：

hUC-MSC置于便携式液氮罐中并交接给第三方冷链物流公司进行液氮运输，冷链运输过程中，实时采集、记录液氮罐及运输车内的温度数据，并实现实时通过GPS定位查阅物流运输状态，直至细胞制剂运输至目的地并派送至接收医院。制剂接收后，如不立即使用，需及时放至液氮罐中或-80℃冰箱中长期保存。

(2)制剂复苏：

提前开启水浴锅预热至37℃，提前在液氮中预冷金属夹，用金属夹从液氮罐中取出冻存袋或冻存管，冻存袋置于水浴锅中迅速摇晃约3s，待外层套袋软化后将其取出，内部的冻存袋继续在水浴锅中来回摇晃，动作轻柔，使其在2min内解冻，完全解冻后置于4℃冰箱内暂存；冻存管直接浸入水浴内，来回摇晃，动作轻柔，使其在2min内解冻。

(3)制剂检测：

取样进行细胞计数、细胞活率、内毒素以及革兰氏染色检测，制剂的检测结果满足如下条件可使用。

A、细胞总量符合(5*107±10％)个细胞/袋，细胞活率大于≥85％；

B、制剂内毒素检测结果为阴性，革兰染色结果为阴性。

2hUC-MSC输注过程

(1)hUC-MSC治疗组患者在服用原来药物的基础上，间隔3个月给予静脉注射hUC-MSC。每个病人按1或2或5×106个MSC/公斤体重的标准，外周静脉注射，制剂使用前应用输液器建立良好静脉通道，0.9％氯化钠溶液充分冲管；制剂使用的前15分钟滴注速度为30滴/min，15-30分钟滴注速度可增加为45滴/min，如患者无不适可逐渐提高滴速，最高不超过70滴/min，在1小时内输完；滴注过程中每5～10min轻轻晃动输液瓶，避免细胞沉降堆积，为了防止细胞堵塞输血器的管腔或黏附管壁，应轻弹输血器的管壁并保持输液通畅，直至滴完。输注MSC后静脉滴注500ml生理盐水。回输结束拔针后按压穿刺点10min以上。

(2)对照组：按照患者既往服药规律，在原药物基础上，间隔3个月给予对照安慰剂(无干细胞的基液，由干细胞制剂公司提供，外包装与MSC制剂相同)治疗，方法同上。

3hUC-MSC输注过程的安全性措施：

(1)每次注射患者需提前住院；

(2)注射前15分钟，每个病人先静脉注射5mg地塞米松预防免疫反应；

(3)输注期间进行常规心电监护，观察患者生命特征及血氧饱和度的变化。注射中至少1名临床医师严密观察患者的神志，生命体征，皮肤颜色等，如有不良事件，快速处理；临床医师应按规范在输注当天于输注前、输注后30min、输注后1h、输注后6h记录患者生命体征(体温、呼吸频率、心率、血压)以及是否有任何不良反应。输注后每日应记录2次生命体征以及是否有任何不良反应，直至出院；

(4)注射后观察3±1天方可出院。

纳入病例在基线以及每隔3个月均进行主要、次要及探索性终点事件评估和远期副作用检查，在基线以及每隔1年进行1次MRI和光学相干断层成像(OCT)检查。副作用监测指标每隔3个月检测，期间如有症状加重或其他病情变化，由医生判断是否入院接受进一步评估及必要的治疗。在研究第一阶段中，出于安全性考虑，受试者第一次完成MSC注射后的1周内需要电话随访一次，之后每隔2周随访一次(至少为电话随访)直至第二次注射，随访内容为询问受试者病情变化情况、症状是否改善、是否有不良反应等，随访内容记录在CRF表中。设定筛选时间窗为30天，随访及治疗时间有±7天窗口期。同时记录不良事件进行安全性评估。根据不良事件常用术语评定标准(CTCAE 5.0)标准进行评价。

(1)主要终点事件：第一次复发发作时间(包括视神经、脊髓、脑症状复发)。

复发事件必须符合以下4个条件：

①新的症状出现，或原有症状突然加重；

②症状持续24h以上；

③距离上次复发30天以上；

④无其他原因可解释此次新的症状或症状加重。

(2)次要终点事件：

复发次数，EDSS评分，MRI病灶数目，病情加重的视神经脊髓炎损伤评分(OSIS)，Hauser步行指数，生活质量量表(quality of life Short Form-36,SF-36)等。

(3)探索性终点事件：

淋巴细胞亚群、细胞因子、补体等。

本实验共筛入组31例NMOSD受试者。其中一例受试者为第一阶段研究正式开始前的安全性观察病例，仅纳入安全性数据分析，不纳入有效性数据分析。在31例患者中，女性占83.9％(n＝26)。入组受试者的年龄由18至61岁不等，平均年龄为41岁。所有患者均血清抗AQP4抗体阳性。所有受试者均在入组前已接受免疫抑制剂(硫唑嘌呤或吗替麦考酚酯)治疗预防复发。30例纳入有效性分析的受试者中有1例受试者脱落，故最终有29例受试者的数据纳入有效性分析。所有29例患者在接受治疗前均有高复发率，平均年复发率为0.72，入组前平均复发次数为4.0次，平均病程为6.9年。

实验结果显示，低剂量组10名受试者在干细胞治疗开始后有4名受试者复发；中剂量组脱落一名受试者，其余9名受试者干细胞治疗开始后有3名受试者复发；高剂量组10名受试者在干细胞治疗开始后有2名受试者复发。

低剂量组入组前的平均年复发率为0.81，入组后为0.33；中剂量组入组前的平均年复发率为0.85，入组后为0.34；高剂量组入组前的平均年复发率为0.51，入组后为0.21；所有29名受试者入组前的平均年复发率为0.72，入组后为0.30(P＝0.002)。因此，受试者经过干细胞治疗后年复发率显著降低。

低剂量组入组基线时的平均EDSS为3.0，末次随访时为2.35；中剂量组入组基线时的平均EDSS为1.8，末次随访时为1.6；高剂量组入组基线时的平均EDSS为3.7，末次随访时为3.7；所有29名受试者入组入组基线时的平均EDSS为2.9，末次随访时为2.6。因此，受试者经过干细胞治疗后神经功能残障轻度改善。

本实验将人脐带源间充质干细胞应用于NMOSD缓解期的治疗。间充质干细胞对免疫细胞具有调节作用，从而抑制自身免疫反应、减少NMOSD复发。NMOSD患者年复发率降低，残疾功能评分改善，表明人脐带源间充质干细胞在预防NMOSD复发方面可能具有一定作用，同时避免了大剂量使用糖皮质激素的副作用。未发生与干细胞输注相关的不良事件，表明人脐带源间充质干细胞应用于NMOSD患者的安全性良好。结果表明，人脐带源间充质干细胞可能是NMOSD患者的有效治疗选择。

总之，这是人脐带源间充质干细胞在NMOSD中首次应用研究，是一种全新的治疗方法，同时拓宽了人脐带源间充质干细胞的适应病症。这项探索性研究表明，人脐带源间充质干细胞在NMOSD患者中具有良好的耐受性，减少NMOSD患者的年复发次数，减轻NMOSD神经功能损害。

本发明的人脐带源间充质干细胞质量符合中国食品药品检定研究院规定：

1.采用流式细胞术进行细胞表面抗原检测，CD73、CD90、CD105的表达水平均高于95％，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达水平均低于2％，细胞表面抗原检测结果符合规定(图1)；

2.采用细胞计数仪对消化后的细胞进行计数，计数后计算细胞群体倍增时间为22.74小时(图2)；

3.采用流式细胞术分析细胞周期，其中72.80％处于G0/G1期，12.20％处于S期，14.10％处于G2/M期(图3)；

4.采用诱导分化培养基对细胞进行成骨、成脂、成软骨诱导分化。茜素红染色阳性说明细胞具有成骨诱导分化的能力(图4)。油红O染色阳性说明细胞具有成脂诱导分化的能力(图5)。番红O染色阳性说明细胞具有成软骨诱导分化的能力(图6)；

5.细胞与PBMC数量以1:5比例孵育后采用流式细胞术鉴定PBMC的增殖情况及各亚群的表面标志物表达情况，结果说明细胞具有抑制PBMC增殖和抑制Th1和Th17亚群增殖的能力(图7)。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (3)

1.人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，其特征是：包括，将所述的人脐带源间充质干细胞用于视神经脊髓炎谱系疾病的治疗。

2.根据权利要求1所述的人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，其特征是：所述人脐带源间充质干细胞用于制备注射用的干细胞药物。

3.根据权利要求1所述的人脐带源间充质干细胞在NMOSD中的应用，其特征是：所述人脐带源间充质干细胞通过调节免疫系统，实现治疗自身免疫疾病的作用。

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