CN115335084A - 包含聚肌氨酸的rna颗粒 - Google Patents

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萨拉·诺盖拉
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Abstract

本公开内容涉及用于在施用之后，特别是在肠胃外施用例如静脉内、肌内、皮下或瘤内施用之后将RNA递送至靶组织的RNA颗粒，以及包含这样的RNA颗粒的组合物。在一个实施方案中，所述RNA颗粒包含单链RNA，例如编码目的肽或蛋白质(例如药物活性肽或蛋白质)的mRNA。RNA被靶组织的细胞吸收，并且RNA被翻译成可表现出其生理活性的编码的肽或蛋白质。

Description

包含聚肌氨酸的RNA颗粒
技术领域
本公开内容涉及用于在施用之后，特别是在肠胃外施用例如静脉内、肌内、皮下或瘤内施用之后将RNA递送至靶组织的RNA颗粒，以及包含这样的RNA颗粒的组合物。在一个实施方案中，所述RNA颗粒包含单链RNA，例如编码目的肽或蛋白质(例如药物活性肽或蛋白质)的mRNA。RNA被靶组织的细胞吸收，并且RNA被翻译成可表现出其生理活性的编码的肽或蛋白质。
背景技术
使用RNA将外来遗传信息递送到靶细胞中提供了DNA的有吸引力的替代方案。使用RNA的优点包括瞬时表达和非转化特征。RNA不需要进入细胞核以进行表达，而且此外RNA不会整合到宿主基因组中，从而消除肿瘤发生的风险。
可使用不同的递送载剂，主要基于与RNA一起形成纳米粒的阳离子聚合物或脂质将RNA递送至对象。纳米粒旨在保护RNA免于降解，使得能够将RNA递送至靶位点并促进细胞吸收和靶细胞的加工。对于递送效力，除分子组成之外，参数如颗粒尺寸、电荷或与分子部分(例如聚乙二醇(PEG)或配体)的接枝也发挥作用。可考虑与PEG接枝来降低血清相互作用，提高血清稳定性并延长循环时间，这可有助于某些靶向方法。在靶位点与受体结合的配体可帮助提高靶向效力。此外，聚乙二醇化(PEGylation)可用于颗粒工程化。例如，如果通过将RNA的水相与脂质的有机相混合来制造脂质纳米粒(Lipid Nanoparticle，LNP)，则在脂质混合物中需要一定分数的PEG-缀合的脂质，否则在混合步骤期间颗粒聚集。已表明通过改变包含不同摩尔质量的PEG的PEG-脂质的摩尔分数，可调节颗粒的尺寸。同样，可通过改变聚乙二醇化的脂质的PEG部分的摩尔质量来调节颗粒尺寸。可获得的典型尺寸为30至200nm(Belliveau et al,2012,Molecular Therapy–Nucleic Acids 1,e37)。如此形成的颗粒具有另外的优点，即，由于PEG部分，它们与血清组分的相互作用较少，并且具有更长的循环半衰期，这在许多药物递送方法中是期望的。没有PEG-脂质，就不能形成具有离散尺寸的颗粒；颗粒形成大的聚集体和沉淀。
因此，对于其中由乙醇和水相形成LNP的技术，PEG-脂质的主要作用之一是通过在新生颗粒表面处提供空间屏障而有助于颗粒自组装，所述新生颗粒在当核酸在包含脂质的乙醇溶液中快速混合以结合RNA时形成。PEG空间位阻阻止颗粒间融合并促进形成均匀LNP群，其中可实现直径<100nm的LNP。
PEG是药物递送中使用最广泛和金标准的“隐形(stealth)”聚合物。PEG-脂质由于其亲水空间位阻特性(PEG壳防止导致聚集的静电或范德华力吸引(Van der Waalsattraction))而通常被并入体系中来制备均匀且胶体稳定的纳米粒群。聚乙二醇化使得能够吸引聚合物周围的水壳，保护RNA复合物免于血清蛋白的调理作用，提高血清半衰期以及降低快速肾清除，这使得改善了药代动力学行为。脂质酰基链(C18、C16或C14)长度的变化改变了在颗粒中PEG-脂质并入的稳定性，这导致药代动力学的调节。在体内与半衰期<30分钟的LNP解离的包含短(C14)酰基链的PEG-脂质的使用导致最佳的肝细胞基因沉默效力(Chen et al,2014,J Control Release 196:106-12；Ambegia et al.,2005,Biochimicaet Biophysica Acta 1669:155–163)。另外，可通过改变PEG-脂质参数来获得对颗粒尺寸的严格控制：颗粒中较高的PEG MW或较高的PEG-脂质摩尔分数导致较小的颗粒。
尽管具有这些优点，但是纳米粒的聚乙二醇化也可导致不利于药物递送的预期用途的数种作用。已知脂质体和LNP的聚乙二醇化降低了细胞摄取和内体逃逸，从而最终降低整体转染效率。事实上，PEG壳为颗粒与细胞的有效结合提供了空间屏障，并且还通过阻止脂质体与内体膜之间的膜融合阻碍内体释放。这就是为什么必须始终仔细调整PEG-脂质的类型和所使用的PEG-脂质的量。它在一个方面应在体内和稳定方面提供足够的隐形作用，同时在另一个方面不阻碍转染。该现象被称为“PEG窘境(PEG Dilemma)”。
除降低转染效率之外，聚乙二醇化还与由抗PEG抗体和/或补体活化以及贮积病(storage disease)诱导的加速血液清除(accelerated blood clearance，ABC)现象相关(Bendele A et al.,1998,Toxicolocical Sciences 42,152-157；Young MA et al.,2007,Translational Research 149(6),333-342；S.M.Moghimi,J.Szebeni,2003,Progress in Lipid Research 42:463–478)。Ishida et al和Laverman et al报道，在大鼠中静脉内注射PEG接枝的脂质体可显著改变第二剂量(当该第二剂量在间隔数天之后施用时)的药代动力学行为(Laverman P et al.,2001,J Pharmacol Exp Ther.298(2),607-12；Ishida et al.,2006,J Control Release 115(3),251-8)。“加速血液清除”(ABC)现象显示与脂质体的PEG含量呈负相关。血浆中抗PEG抗体的存在通过单核吞噬细胞系统(Monophagocyte System，MPS)诱导了更高的颗粒清除，这最终降低了药物的效力。
PEG还被认为诱导补体活化，所述补体活化可导致超敏反应，也称为补体活化相关的假性变态反应(Complement-Activation Related Pseudo-Allergy，CARPA)。从文献中仍不清楚补体的活化一般是由于纳米粒还是特别是由于PEG的存在。
脂质纳米粒中PEG的存在还可诱导特异性免疫应答。Semple et al.报道了包含PEG-脂质衍生物和包封的反义寡脱氧核苷酸或质粒DNA的脂质体引发了强烈的免疫应答，导致小鼠中后续剂量的快速血液清除。该应答的量级足以诱导显著的发病率并且在一些情况下诱导显著的死亡率。从血液中快速消除脂质体包封的ODN取决于膜中PEG-脂质的存在，因为使用非聚乙二醇化的脂质体或包含可快速交换的PEG-脂质的脂质体消除了该应答。抗PEG抗体的产生和假定的补体活化是对囊泡从血液中快速消除的可能解释。(Semple etal.,2005,J Pharmacol Exp Ther.312(3),1020-6)。
由于PEG可诱导免疫应答，因此对于需要多次注射的某些应用需要避免它。一些实例是使用mRNA的治疗，例如用于蛋白质替代治疗。在此，由于RNA潜在的固有免疫原性，风险可能特别高。
因此，本领域中仍然需要用于将RNA引入细胞中的有效方法和组合物，其避免使用PEG所伴随的缺点。本公开内容解决了这些和其他需要。
本发明人出乎意料地发现本文中所述的RNA颗粒制剂满足以上提及的要求。特别是证明了聚肌氨酸-脂质缀合物是用于组装RNA纳米粒的合适组分。聚肌氨酸由天然氨基酸肌氨酸(N-甲基甘氨酸)的重复单元构成，并且是可生物降解的。聚肌氨酸-脂质缀合物能够用不同的技术制造RNA纳米粒，产生确定的表面特性和受控的尺寸范围。可通过符合药物制造要求的稳健方法来完成制造。可用不同部分对颗粒进行端基官能化以调节电荷或引入特定的分子部分如配体。
发明内容
在一个方面中，本发明涉及包含多个RNA颗粒的组合物，其中每个颗粒包含：
(i)RNA；
以及
(ii)与RNA缔合以形成RNA颗粒的一种或更多种组分，
其中聚肌氨酸与所述一种或更多种组分中的至少一种缀合。
在一个实施方案中，所述RNA颗粒是非病毒RNA颗粒。在一个实施方案中，与RNA缔合以形成颗粒的所述一种或更多种组分包含一种或更多种聚合物。在一个实施方案中，所述一种或更多种聚合物包含阳离子聚合物。在一个实施方案中，所述阳离子聚合物是含胺聚合物。在一个实施方案中，所述一种或更多种聚合物包含选自以下的一种或更多种聚合物：聚-L-赖氨酸、聚酰胺-胺、聚乙烯亚胺、壳聚糖和聚(β-氨基酯)。
在一个实施方案中，与RNA缔合以形成颗粒的所述一种或更多种组分包含一种或更多种脂质或类脂质(lipid-like)物质。在一个实施方案中，所述一种或更多种脂质或类脂质物质包含阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质。在一个实施方案中，所述阳离子可电离脂质或类脂质物质仅在酸性pH下带正电荷并且在生理pH下不保持阳离子性。在一个实施方案中，所述一种或更多种脂质或类脂质物质包含一种或更多种另外的脂质或类脂质物质。在一个实施方案中，所述聚肌氨酸与所述一种或更多种另外的脂质或类脂质物质中的至少一种缀合。
在另一个方面中，本发明涉及包含多个RNA-脂质颗粒的组合物，其中每个颗粒包含：
(a)RNA；
(b)阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质；
以及
(c)聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。
在一个实施方案中，每个颗粒还包含：
(d)非阳离子脂质或类脂质物质。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约20mol％至约80mol％。
在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约0mol％至约80mol％。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约0.25mol％至约50mol％。
在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质包含磷脂。在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质包含胆固醇或胆固醇衍生物。在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质包含磷脂与胆固醇或胆固醇衍生物的混合物。在一个实施方案中，所述磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)，或其混合物。在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质包含DSPC与胆固醇、DOPC与胆固醇、或DPPC与胆固醇的混合物。
在另一个方面中，本发明涉及包含多个RNA-脂质颗粒的组合物，其中每个颗粒包含：
(a)RNA；
(b)BNT9；
以及
(c)聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。
在一个实施方案中，每个颗粒还包含：
(d)非阳离子脂质或类脂质物质。
在一个实施方案中，所述BNT9占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约20mol％至约80mol％。
在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约0mol％至约80mol％。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约0.25mol％至约50mol％。
在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质包含磷脂。在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质包含胆固醇或胆固醇衍生物。在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质包含磷脂与胆固醇或胆固醇衍生物的混合物。在一个实施方案中，所述磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)，或其混合物。在一个实施方案中，所述非阳离子脂质或类脂质物质包含DSPC与胆固醇、DOPC与胆固醇、或DPPC与胆固醇的混合物。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(I)：
Figure BDA0003860602100000061
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(II)：
Figure BDA0003860602100000062
其中R1和R2之一包含疏水基团，并且另一个是H、亲水基团或任选地包含靶向部分的官能团。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(III)：
Figure BDA0003860602100000063
其中R是H、亲水基团或任选地包含靶向部分的官能团。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述颗粒不包含聚乙二醇-脂质缀合物或聚乙二醇与类脂质物质的缀合物，并且优选地不包含聚乙二醇。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述RNA是mRNA。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质包含：N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)，或其混合物。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述聚肌氨酸包含2至200个肌氨酸单元。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物，及其混合物。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述颗粒是纳米粒。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述颗粒包含纳米结构的核心。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述颗粒的尺寸为约30nm至约500nm。
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述聚肌氨酸缀合物抑制所述颗粒的聚集。
在另一个方面中，本发明涉及用于将RNA递送至对象的细胞的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的组合物。
在另一个方面中，本发明涉及用于将治疗性肽或蛋白质递送至对象的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的组合物，其中所述RNA编码所述治疗性肽或蛋白质。
在另一个方面中，本发明涉及用于在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的组合物，其中将所述RNA递送至所述对象的细胞有益于治疗或预防所述疾病或病症。
在另一个方面中，本发明涉及用于在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的组合物，其中所述RNA编码治疗性肽或蛋白质，并且其中将所述治疗性肽或蛋白质递送至所述对象有益于治疗或预防所述疾病或病症。
在一个实施方案中，所述对象是哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
在另一个方面中，本发明涉及用于肌内施用的组合物，其包含含有以下的RNA-脂质颗粒：
(a)RNA；
(b)阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质；
(c)磷脂；
(d)胆固醇；以及
(e)聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。
在一个实施方案中，所述颗粒不包含聚乙二醇-脂质缀合物或聚乙二醇与类脂质物质的缀合物，并且优选地不包含聚乙二醇。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约30mol％至约60mol％、约30mol％至约50mol％、或约35mol％至约45mol％。在多个实施方案中，所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约40mol％或约50mol％。
在一个实施方案中，所述磷脂占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约5mol％至约30mol％、约5mol％至约20mol％、或约5mol％至约15mol％。在一个实施方案中，所述磷脂占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约10mol％。
在一个实施方案中，所述胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约30mol％至约60mol％、约40mol％至约60mol％、或约45mol％至约55mol％。在一个实施方案中，所述胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约48mol％。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约1mol％至约10mol％、约1mol％至约7.5mol％、或约2mol％至约7.5mol％。在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约2.5mol％或约5mol％。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质包含：BNT9、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)，或其混合物。在一个实施方案中，所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质包含BNT9。
在一个实施方案中，所述磷脂选自磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。在一个实施方案中，所述磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine，DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine，DPPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine，DMPE)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine，DLPE)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dilauroylphosphatidylcholine)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，DTPC)、二木脂酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，DLPC)和棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine，POPC)。在一个实施方案中，所述磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸包含2至200个肌氨酸单元。在一个实施方案中，所述聚肌氨酸包含10至100个肌氨酸单元。在一个实施方案中，所述聚肌氨酸包含20至50个肌氨酸单元。在一个实施方案中，所述聚肌氨酸包含约23个肌氨酸单元。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(I)：
Figure BDA0003860602100000101
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(II)：
Figure BDA0003860602100000102
其中R1和R2之一包含疏水基团，并且另一个是H、亲水基团或任选地包含靶向部分的官能团。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(III)：
Figure BDA0003860602100000103
其中R是H、亲水基团或任选地包含靶向部分的官能团。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含下式：
Figure BDA0003860602100000111
其中n为23。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物，及其混合物。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质是DODMA并且所述磷脂是DOPE或DSPC。
在一个实施方案中，所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质是BNT9并且所述磷脂是DOPE或DSPC。
在一个实施方案中，所述颗粒包含：
(a)RNA；
(b)DODMA；
(c)磷脂，其选自DOPE、DSPE、DOPC和DSPC，优选选自DOPE和DSPC；
(d)胆固醇；以及
(e)下式化合物：
Figure BDA0003860602100000112
其中m选自10、11、12、13和14，并且优选地为12，并且n选自20、21、22、23、24和25，并且优选地为23。
DODMA、磷脂、胆固醇和化合物(e)优选以30至60:5至30:30至60:1至10(例如40:10:47.5:2.5)的摩尔分数存在。
在一个实施方案中，所述颗粒包含：
(a)RNA；
(b)BNT9；
(c)磷脂，其选自DOPE、DSPE、DOPC和DSPC，优选选自DOPE和DSPC；
(d)胆固醇；以及
(e)下式化合物：
Figure BDA0003860602100000121
其中m选自10、11、12、13和14，并且优选地为12，并且n选自20、21、22、23、24和25，并且优选地为23。
BNT9、磷脂、胆固醇和化合物(e)优选以30至60:5至30:30至60:1至10(例如40:10:45:5)的摩尔分数存在。
在一个实施方案中，所述RNA是mRNA。
在一个实施方案中，所述颗粒是纳米粒。
在一个实施方案中，所述颗粒包含纳米结构的核心。
在一个实施方案中，所述颗粒的尺寸为约30nm至约500nm。
在一个实施方案中，所述聚肌氨酸-缀合物抑制所述颗粒的聚集。
在另一个方面中，本发明涉及用于将RNA递送至对象的细胞的方法，所述方法包括向对象肌内施用本文中所述的组合物。
在另一个方面中，本发明涉及用于在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象肌内施用本文中所述的组合物，其中将所述RNA递送至所述对象的细胞有益于治疗或预防所述疾病或病症。
在另一个方面中，本发明涉及用于将治疗性肽或蛋白质递送至对象的方法，所述方法包括向对象肌内施用本文中所述的组合物，其中所述RNA编码所述治疗性肽或蛋白质。
在另一个方面中，本发明涉及用于在对象的肌肉中表达治疗性肽或蛋白质的方法，所述方法包括向对象肌内施用本文中所述的组合物，其中所述RNA编码所述治疗性肽或蛋白质。
在另一个方面中，本发明涉及用于在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象肌内施用本文中所述的组合物，其中所述RNA编码治疗性肽或蛋白质，并且其中将所述治疗性肽或蛋白质递送至所述对象有益于治疗或预防所述疾病或病症。
在一个实施方案中，所述RNA编码疫苗肽或蛋白质，例如抗原。
在一个实施方案中，所述疫苗肽或蛋白质是来自感染原的肽或蛋白质或者其免疫学上等同的片段或变体。
在一个实施方案中，本文中所述的方法是用于肌内疫苗接种的方法。
在一个实施方案中，所述对象是哺乳动物。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
附图说明
图1：聚肌氨酸化(pSarcosylated)LNP的颗粒尺寸与摩尔分数之间的关系。脂质纳米粒使用包含摩尔分数提高的C14PSarc20的脂质混合物制造。在合适的条件下可获得胶体稳定的颗粒。尽管在非常低的PSarc分数(0.5和1％)的情况下没有形成可测量尺寸的颗粒，但在2.5mol％和高于2.5mol％下，获得了具有离散尺寸和低多分散性指数(polydispersity index)的颗粒。可通过改变PSarc分数来精确地微调颗粒尺寸。颗粒尺寸从约200至250nm(PSarc为2.5mol％)单调降低至约50nm(PSarc为20mol％)。
图2：用于LNP形成的PSarc脂质的聚肌氨酸长度(聚合单元)与不同细胞系中萤光素酶编码mRNA LNP的体外蛋白质表达之间的关系。在肺肿瘤细胞(TC-1)肌细胞(C2C12)、肝细胞(Hep-G2)和巨噬细胞(RAW 264.7)中测试了用编码萤光素酶的mRNA配制的LNP。在转染之后24小时，测量生物发光信号。独立于细胞系，聚肌氨酸中聚合单元数目的提高没有导致蛋白质表达水平的降低，如通常针对PEG-脂质所观察到的那样。
图3：包含恒定分数的PSarc脂质(5％)的LNP的体内效力，其中聚肌氨酸长度在11至65个单元之间变化。将用编码萤光素酶的mRNA配制的LNP静脉内注射到小鼠(10μg RNA，n＝3)中。测量体内和离体生物发光。在所有情况下均在肝中发现最强的信号。在图中示出了来自在注射之后6小时提取的肝的离体测量的数据。不能确定聚肌氨酸长度对肝中蛋白质表达水平的显著影响。这允许在不降低转染效率的情况下使用广泛多种尺寸的PSarc对颗粒进行工程化。
图4：不同聚肌氨酸端基对颗粒尺寸和ζ电位的影响。在直接比较中测试了由20个具有胺基、羧化端基或乙酰化端基的重复单元组成的PSarc。所有其他制剂参数均维持恒定。成功形成了具有所有受试端基的LNP，其中PSarc分数与颗粒特征(尺寸和ζ电位)之间的相关性类似。
图5：包含如图4中所述的具有不同端基的聚肌氨酸脂质的LNP的体外表征。使用摩尔分数为5％且长度为20个单元的PSarc脂质。在肝细胞(Hep-G2)、巨噬细胞(RAW 264.7)、肌细胞(C2C12)和胚胎肾细胞(HEK 293T)中测试了用编码萤光素酶的mRNA配制的LNP。在转染之后24小时，测量生物发光信号。对于所有LNP和细胞系均获得了生物发光信号。对于所有端基，信号强度作为细胞系的函数的依赖性均类似。
图6：用如图4和5中所述的不同端基配制的LNP的体内效力。使用摩尔分数为5％且长度为20个单元的PSarc脂质。静脉内注射用编码萤光素酶的mRNA配制的LNP(10μg RNA，n＝3)。测量体内和离体生物发光。在所有情况下均在肝中发现最强的信号。在图中示出了来自在注射之后6小时提取的肝的离体测量的数据。对于所有端基均确定了类似的信号强度，表明所有端基均适合于在体内获得类似的高转染。
图7：聚乙二醇化和聚肌氨酸化对脂质体尺寸的作用。脂质体用单独的DOTMA和DOPE(2:1mol/mol)来制备，或者使用包含摩尔分数为2％的pSar或PEG-脂质的脂质混合物。尽管PEG和pSarc二者均导致测量尺寸的显著降低，但是多分散性指数更高(多峰)。
图8：使用如图7中所述的包含PEG和PSarc的脂质体的脂质复合物(lipoplex)形成。由所有三种类型的脂质体(单独的DOTMA和DOPE(2:1mol/mol)，或者包含摩尔分数为2％的pSarc或PEG-脂质)形成具有有限尺寸和低多分散性指数的脂质复合物。与其中PDI值大的脂质体前体相比，来自聚乙二醇化和聚肌氨酸化脂质体的脂质复合物出人意料地显示出低的多分散性指数。这表明具有高多分散性指数的pSarc脂质体也可适合于形成良好限定的RNA-脂质复合物，其具有相当小的50nm尺寸和约0.2的PDI。
图9：由脂质体构成的脂质复合物的体外表征，所述脂质体由单独的DOTMA和DOPE(2:1mol/mol)或者包含摩尔分数为2％的pSarc或PEG-脂质的相同脂质混合物组成。在肝细胞(Hep-G2)中测试用编码萤光素酶的mRNA配制的脂质复合物。在转染之后24小时，测量生物发光信号。尽管聚乙二醇化显著降低了信号，但这种降低在存在PSarc的情况下要不明显得多。PSarc显示出比PEG降低转染效力的程度要小得多。
图10：由脂质体构成的脂质复合物的体外表征，所述脂质体由单独的DOTMA和DOPE(2:1mol/mol)或者包含摩尔分数为2％的pSarc或PEG-脂质的相同脂质混合物组成。在肌细胞(C2C12)中测试用编码萤光素酶的mRNA配制的脂质复合物。在转染之后24小时，测量生物发光信号。尽管聚乙二醇化显著降低了信号，但这种降低在存在PSarc的情况下要不明显得多。PSarc显示出比PEG降低转染效力的程度要小得多。
图11：制剂中颗粒尺寸与聚肌氨酸链长度和摩尔比之间的关系。
图12：聚肌氨酸化脂质纳米粒的散射曲线(SAXS)。
图13：通过Quant-It Ribogreen测定评价的RNA可及性(accessibility)。
图14：加载到用PSarc或PEG缀合脂质配制的LNP中的不同剂量的EPO(促红细胞生成素)编码mRNA的静脉内施用。
图15：在注射用链长度提高的PSarc配制的LNP之后作为肝毒性的早期标志物的肝酶的释放。
图16：在理论人血浆浓度下通过聚乙二醇化和聚肌氨酸化的LNP的C3a复合物的补体的活化。
图17：用相应mol％为40:45:10:5的DODMA:胆固醇:DSPC:PSarc 23配制的LNP的冷冻-TEM图像。比例尺＝200nm。
图18.相对于原始DODMA制剂归一化的LNP的萤光素酶表达的倍数变化的体外比较。萤光素酶表达是在肝细胞癌(HepG2)细胞系中在用25ng加载mRNA的LNP转染之后24小时测得的。数据表示萤光素酶的倍数变化(RLU(相对发光)±标准偏差。
图19.注射2μg包含不同阳离子脂质的加载mRNA的PSar-LNP之后6小时，肝中萤光素酶表达的图形显示。数据表示为总通量(光子(p)/秒(s))的平均值±标准偏差，n＝4。使用统计检验方法“单因素方差分析”(ANOVA)以及Tukey校正以用于多重比较来计算统计学显著性。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图20.包含不同隐形组分的加载mRNA的LNP的翻译动力学(translationalkinetics)。在Balb/C小鼠(5只/组)中静脉内施用3μg配制成LNP的Epo编码mRNA之后，对促红细胞生成素(EPO)水平进行量化。
图21.包含不同隐形组分的加载mRNA的LNP的翻译动力学。在Balb/C小鼠(5只/组)中肌内施用3μg配制成LNP的Epo编码mRNA之后，对促红细胞生成素(EPO)水平进行量化。
图22.用不同隐形部分制备的LNP的肝酶释放谱。将加载mRNA的LNP以30、3和0.3μg的mRNA四次IV注射到健康Balb/C小鼠(n＝5只/组)中的最后一次之后48小时之后确定丙氨酸转氨酶(Alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(Aspartate transaminase，ALT)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)和总胆红素酶。数据表示为平均值±标准偏差。
图23.全血中的人血浆细胞因子谱。使用来自三个供体的血液对细胞因子进行分析。显示的分析包括IL-6、IL-8、IL-1B、IL-10，显示出整体低表达或微小变化(治疗后)的另一些细胞因子是IL-4、IL-5、IL-2、GM-CSF、IFN-γ、TNF-α(数据未示出)。脂多糖(LPS)和瑞喹莫德(Resiquimod)(R-848)用作阳性对照。(数据显示为平均值±标准偏差。
图24.包含不同隐形部分的PSAR LNP和PEG LNP的生物分布和效力。在Balb/C小鼠(4只/组)中静脉内施用2μg加载有萤光素酶编码mRNA的LNP之后6和24的代表性IVIS图像。
图25.包含不同隐形组分的加载mRNA的LNP的翻译动力学。在Balb/C小鼠(5只/组)中静脉内施用3μg加载有EPO编码mRNA的LNP之后，对促红细胞生成素(EPO)水平进行量化。
图26.本文中使用的可电离阳离子脂质的结构。
图27.在IM施加之后接枝LNP的萤光素酶表达的生物分布。肌内施用2μg mRNA-LNP之后24小时萤光素酶表达的生物分布的代表性图像。
图28.在IM施加之后接枝LNP的注射区域中的萤光素酶表达。
在IM施用2μg mRNA-LNP之后9天内，通过以总通量(光子(p)/秒(s))表示的发光(表示为总曲线下面积(AUC))的注射区域(肌肉)中萤光素酶表达的图形显示。平均值±标准偏差，每组3只小鼠。
图29.在IM施加之后接枝LNP的血清IgG水平。
用制剂以10μg的H1N1-HA编码mRNA或仅缓冲溶液(PBS)对BALB/c小鼠进行IM免疫接种。在50天之后通过ELISA在血清中测量特异性IgG抗体。数据表示为平均值(光密度)±SEM。
图30.在IM施加之后接枝LNP的病毒中和(VNT)滴度。
用制剂以10μg的H1N1-HA编码mRNA或仅缓冲溶液(PBS)对BALB/c小鼠进行IM免疫接种。在IM施加之后50天，通过ELISA在血清中测量病毒中和滴度。数据由平均值±SEM表示。
图31.在IM施加之后接枝LNP的T细胞应答。
用制剂以10μg的H1N1-HA编码mRNA或仅缓冲溶液(PBS)对BALB/c小鼠进行IM免疫接种。在免疫后50天之后测量T细胞应答，其中每组5只小鼠。数据由平均值±SEM表示。
图32.在IM施加之后的蛋白质分泌。
用mRNA-LNP制剂以3μg EPO mRNA对BALB/c小鼠进行肌内注射。数据由平均值±SEM表示。
具体实施方式
尽管以下详细描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可改变。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些具体实施方案的目的，而不旨在限制将仅受所附权利要求书限制的本公开内容的范围。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
优选地，将本文中使用的术语定义为如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel和H.
Figure BDA0003860602100000171
编辑,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)中所述。
除非另外指出，否则本公开内容的实践将采用本领域的文献中阐明的常规化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术方法(参见例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,J.Sambrook et al.编辑,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中，将描述本公开内容的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任意数量组合以产生另外的实施方案。多种不同描述的实例和实施方案不应被解释为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。本说明书应理解为公开和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则所有描述的要素的任何排列和组合应认为被本说明书公开。
术语“约”意指大约或接近，并且在一个实施方案中在本文中所列的数值或范围的情况下意指所列举或要求保护的数值或范围的±20％、±10％、±5％、或±3％。
除非本文中另外指出或者明显与上下文相矛盾，否则在描述本公开内容的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为表示一个/种和/或更多个/种。本文中值的范围的记载仅旨在用作单独提及落在所述范围内的各个单独值的速记法。除非本文中另外指出，否则各个单独值被并入本说明书中，就像其在本文中被单独记载。除非本文中另外指出或者明显与上下文相矛盾，否则本文中所述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，而不对权利要求的范围提出限制。本说明书中的语言均不应被解释为指明对实施本公开内容必需的任何未要求保护的要素。
除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中使用术语“包含/包括”以表示除由“包含/包括”所引入的列表的成员之外还可任选地存在其他成员。然而，考虑了作为本公开内容的具体实施方案，术语“包含/包括”涵盖不存在其他成员的可能性，即，出于这个目的，实施方案“包含/包括”应理解为具有“由...组成”的含义。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文献。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、用法指导等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容均不应解释为承认本公开内容无权早于这些公开内容。
定义
下面将提供适用于本公开内容的所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其本领域公认的含义。
本文中使用的术语例如“降低”或“抑制”意指引起水平总体降低例如约5％或更多、约10％或更多、约20％或更多、约50％或更多、或约75％或更多的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上至零。
在一个实施方案中，术语例如“提高”或“增强”涉及提高或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％、或至少约100％。
本文中使用的“生理pH”是指约7.4的pH。在一个实施方案中，本文中使用的“生理pH”是指中性pH，即约7.0的pH。
本公开内容中使用的“％w/v”是指按体积计的重量百分比，其是测量溶质的量(以克(g)计)的浓度单位，表示为溶液总体积(以毫升(mL)计)的百分比。
本公开内容中使用的“mol％”被定义为一种组分的摩尔数与所有组分的总摩尔数的比值乘以100。
术语“离子强度”是指特定溶液中不同种类的离子物质的数量与其各自电荷之间的数学关系。因此，离子强度I在数学上由下式表示
Figure BDA0003860602100000191
其中c是特定离子物质的摩尔浓度，并且z是其电荷的绝对值。总和Σ取自溶液中所有不同种类的离子(i)。
根据本公开内容，在一个实施方案中，术语“离子强度”涉及单价离子的存在。关于二价离子，特别是二价阳离子的存在，在一个实施方案中，其浓度或有效浓度(游离离子的存在)由于螯合剂的存在而足够低以防止RNA的降解。在一个实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于用于水解RNA核苷酸之间磷酸二酯键的催化水平。在一个实施方案中，游离二价离子的浓度为20μM或更小。在一个实施方案中，不存在或基本上不存在游离二价离子。
“渗量浓度(Osmolality)”是指溶质的浓度，表示为每千克溶剂的溶质的渗透压摩尔数。
术语“冷冻”涉及从液态到固态的相变。其通常在将系统温度降低低于临界温度时发生，并伴有系统焓的特征性变化。
术语“冻干”是指通过将物质冷冻并随后降低周围压力以使物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相而进行的物质的冷冻干燥。
术语“喷雾干燥”是指通过将(加热的)气体与在容器(喷雾干燥器)内雾化(喷雾)的流体混合来使物质喷雾干燥，其中来自所形成的液滴的溶剂蒸发，产生干燥粉末。
术语“冷冻保护剂”涉及添加至制剂以在冷冻阶段期间保护活性成分的物质。
术语“冻干保护剂”涉及添加至制剂以在干燥阶段期间保护活性成分的物质。
术语“重构”涉及向干燥产品添加溶剂(例如水)以使其返回液体状态，例如其原始液体状态。
在本公开内容的上下文中的术语“重组”意指“通过遗传改造制备的”。在一个实施方案中，在本公开内容的上下文中的“重组物质”不是天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从天然来源分离且没有在实验室中被人故意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”意指“存在于自然界中”并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源发现和/或分离的物体。
在本公开内容的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如分散在介质中的微米或纳米尺寸的密实结构。
在本公开内容的上下文中，术语“RNA颗粒”涉及包含RNA的颗粒。带正电荷的分子(例如聚合物和脂质)与带负电荷的RNA之间的静电相互作用涉及颗粒形成。这导致RNA颗粒的复合和自发形成。在一个实施方案中，RNA颗粒是纳米粒。
本公开内容中使用的“纳米粒”是指具有适合于静脉内施用的平均直径的颗粒。
“RNA颗粒”可用于将核酸递送至目的靶部位(例如，细胞、组织、器官等)。RNA颗粒包括基于脂质纳米粒(LNP)的制剂和基于脂质复合物(LPX)的制剂。
术语“平均直径”是指如通过动态激光光散射(DLS)以及使用所谓的累积量算法(cumulant algorithm)进行数据分析而测量的颗粒的平均流体动力学直径，所述累积量算法的结果是提供具有长度维度的所谓的Z平均值和无量纲的多分散性指数(PI)(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,pp 4814-4820,ISO 13321)。在此，颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与Z平均值的值同义使用。
“多分散性指数”优选基于动态光散射测量通过如在“平均直径”的定义中提及的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，可将其作为对纳米粒系综(ensemble)的尺寸分布的量度(measure)。
通常来说，本文中所述的RNA-脂质颗粒可通过将含RNA的相与含脂质的相混合来获得。这可以是将醇相或包含脂质(例如阳离子脂质如DODMA和另外的脂质)的其他水混溶性溶剂与包含RNA的水相进行混合。另一选择是将包含脂质(例如包含脂质体或其他类型脂质分散体形式的脂质)的水相与包含RNA的另一水相进行混合。
用于制备本文中所述的RNA-脂质颗粒的方法可涉及获得包含至少一种阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质的胶体，以及将该胶体与RNA混合以获得核酸颗粒。
本文中使用的术语“胶体”涉及一种类型的均匀混合物，其中分散的颗粒不发生相分离。混合物中的胶体颗粒是亚微观的，其中颗粒尺寸为1至1000纳米。该混合物可称为胶体或胶体混悬液。有时，术语“胶体”仅指混合物中的颗粒，而不是整个混悬液。
LNP通常由四种组分：可电离阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇(PEG)-脂质组成。各组分均有助于载荷保护，并能够实现有效的胞内递送。LNP可通过将溶解在乙醇中的脂质(包括聚肌氨酸-脂质缀合物)与核酸在水性缓冲液中快速混合来制备。
包含RNA的颗粒
先前已描述了不同类型的包含RNA的颗粒适合于以颗粒形式递送RNA(例如，Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒RNA递送载剂，RNA的纳米粒包封物理保护RNA免于降解并且，根据特定的化学，可协助细胞摄取和内体逃逸。
本公开内容描述了包含RNA和与RNA缔合以形成RNA颗粒的一种或更多种组分的颗粒以及包含这样的颗粒的组合物。RNA颗粒可包含通过非共价相互作用以不同形式与颗粒复合的RNA。本文中所述的颗粒不是病毒颗粒，特别不是感染性病毒颗粒，即它们不能病毒性地感染细胞。包含RNA的颗粒可以是例如蛋白质颗粒的形式、包含聚合物的颗粒的形式或包含脂质的颗粒的形式。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”包括合适的蛋白质、聚合物或脂质。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与RNA缔合以形成RNA颗粒的任何组分。这样的组分包括可以是RNA颗粒的一部分的任何组分。
蛋白质、聚合物、脂质以及其他亲水、疏水或两亲化合物是RNA颗粒制剂的典型成分。
鉴于聚合物的高度化学柔性，其是用于基于纳米粒的递送的常用物质。通常，阳离子聚合物用于将带负电荷的RNA静电凝聚成纳米粒。这些带正电荷的基团通常由胺组成，所述胺在5.5至7.5的pH范围内改变其质子化状态，被认为导致离子失衡从而导致内体破裂。聚合物例如聚-L-赖氨酸、聚酰胺-胺、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺以及天然存在的聚合物例如壳聚糖均已应用于RNA递送。另外，一些调查人员已合成了专门用于核酸递送的聚合物。特别地，聚(β-氨基酯)由于其易于合成和可生物降解性而在核酸递送中获得了广泛的应用。
本文中使用的“聚合物”具有其通常的含义，即包含通过共价键连接的一个或更多个重复单元(单体)的分子结构。重复单元可全部相同，或者在一些情况下，聚合物内可存在多于一种类型的重复单元。在一些情况下，聚合物是生物来源的，即生物聚合物(例如蛋白质)。在一些情况下，聚合物中也可存在另外的部分，例如靶向部分，例如本文中所述的那些。
如果聚合物内存在多于一种类型的重复单元，则该聚合物被称为“共聚物”。应理解，在使用聚合物的任何实施方案中，所使用的聚合物在一些情况下可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何方式排列。例如，重复单元可以以随机顺序、以交替顺序排列或者作为“嵌段”共聚物，即包含每个均包含第一重复单元的一个或更多个区域(例如，第一嵌段)，和每个均包含第二重复单元的一个或更多个区域(例如，第二嵌段)，等。嵌段共聚物可具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数目的不同嵌段。
在某些实施方案中，聚合物是生物相容性的。生物相容性聚合物是在中等浓度下通常不导致显著细胞死亡的聚合物。在某些实施方案中，生物相容性聚合物是可生物降解的，即该聚合物能够在生理环境内(例如体内)化学和/或生物降解。
在某些实施方案中，颗粒形成聚合物可以是鱼精蛋白或聚亚烷基亚胺，例如聚乙烯亚胺。
术语“鱼精蛋白”是指多种相对低分子量的强碱性蛋白质中的任一种，其富含精氨酸并且被发现特别是与DNA相关联以代替不同动物(例如鱼)的精细胞中的体细胞组蛋白。特别地，术语“鱼精蛋白”是指存在于鱼精液中的蛋白质，其是强碱性的，可溶于水，不被热凝结并且在水解之后主要产生精氨酸。以纯化的形式，其用于胰岛素的长效制剂并且用于中和肝素的抗凝作用。
根据本公开内容，本文中使用的术语“鱼精蛋白”意指包含获自或来源于天然或生物学来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列包括其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式以及(合成的)多肽，所述多肽是人工的并且是为特定目的而专门设计的，并且不能从天然或生物学来源中分离。
在一个实施方案中，聚亚烷基亚胺包括聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)。PEI的平均分子量优选为0.75·102至107Da，优选1000至105Da，更优选10000至40000Da，更优选15000至30000Da，甚至更优选20000至25000Da。
根据本公开内容优选的是线性聚亚烷基亚胺，例如线性聚乙烯亚胺(PEI)。
包含脂质的颗粒
在一个实施方案中，本文中所述的RNA颗粒包含至少一种脂质或类脂质物质作为颗粒形成剂。考虑在本文中使用的脂质载体包括可与RNA缔合(例如通过与RNA形成复合物或者形成其中围住(enclose)或包封RNA的囊泡)的任何物质。
术语“脂质”和“类脂质物质”在本文中被广泛定义为包含一个或更多个疏水部分或基团以及任选地还包含一个或更多个亲水部分或基团的分子。包含疏水部分和亲水部分的分子也经常被称为两亲体。脂质通常难溶于水。在水性环境中，两亲性质允许分子自组装成有组织的结构和不同的相。那些相之一由脂质双层组成，因为它们存在于囊泡、多层/单层脂质体或水性环境中的膜中。可通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基团以及被一个或更多个芳族、脂环族或杂环基团取代的这样的基团。亲水基团可包含极性和/或带电荷基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他相似基团。
本文中使用的术语“两亲的”是指具有极性部分和非极性部分二者的分子。两亲化合物通常具有与长疏水尾连接的极性头。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。另外，极性部分可具有形式正电荷或形式负电荷。或者，极性部分可具有形式正电荷和负电荷二者，并且可以是两性离子或内盐。出于本公开内容的目的，两亲化合物可以是但不限于一种或多种天然或非天然的脂质和类脂质化合物。
术语“类脂质物质”、“类脂质化合物”或“类脂质分子”涉及与脂质在结构上和/或功能上相关但在严格意义上不能视为脂质的物质。例如，该术语包括当其存在于囊泡、多层/单层脂质体或水性环境中的膜时能够形成两亲层的化合物，并且包括表面活性剂或具有亲水和疏水部分二者的合成化合物。一般而言，该术语是指这样的分子，其包含亲水和疏水部分，其具有可以与或可以不与脂质类似的不同结构组织。除非本文中另外指出或明显与上下文相矛盾，否则本文中使用的术语“脂质”应被解释为包括脂质和类脂质物质二者。
可包含在两亲层中的两亲化合物的一些具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。
在某些实施方案中，两亲化合物是脂质。术语“脂质”是指特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂的一组有机化合物。通常来说，脂质可分为八种类别：脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(来源于酮酯酰亚基的缩合)、固醇脂质和孕烯醇酮脂类(来源于异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称为甘油三酯的脂质亚组。脂质还包括分子，例如脂肪酸类及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂)，以及包含固醇的代谢物，例如胆固醇。
脂肪酸或脂肪酸残基是不同的分子基团，其由以羧酸基团终止的烃链构成；这种排列赋予分子极性的亲水端和不溶于水的非极性疏水端。通常长为4至24个碳的碳链可以是饱和的或不饱和的，并且可与包含氧、卤素、氮和硫的官能团连接。如果脂肪酸包含双键，则可能出现顺式或反式几何异构，这显著影响分子构型。顺式双键导致脂肪酸链弯曲，这是与链中的更多双键复合的作用。脂肪酸类别中的其他主要脂质种类是脂肪酯和脂肪酰胺。
甘油脂质由单取代甘油、双取代甘油和三取代甘油构成，最著名的是甘油脂肪酸三酯，称为甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常各自被不同的脂肪酸酯化。另外的甘油脂质亚类以糖基甘油为代表，其特征在于存在通过糖苷键联与甘油连接的一个或更多个糖残基。
甘油磷脂是两亲分子(包含疏水区和亲水区二者)，其包含通过酯键联与两个脂肪酸来源的“尾”连接并且通过磷酸酯键联与一个“头”基连接的甘油核心。甘油磷脂(通常称为磷脂(尽管鞘磷脂也被归类为磷脂))的一些实例是磷脂酰胆碱(也称为PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。
鞘脂是享有共同的结构特征-鞘氨醇碱(sphingoid base)骨架的复杂的化合物家族。哺乳动物中主要的鞘氨醇碱通常被称为鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱)是具有酰胺连接脂肪酸的鞘氨醇碱衍生物的主要亚类。脂肪酸通常是饱和的或单不饱和的，链长度为16至26个碳原子。哺乳动物的主要鞘磷酸脂(phosphosphingolipid)是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要包含神经酰胺磷酸乙醇胺并且真菌具有植物神经酰胺磷酸肌醇和含甘露糖的头基。鞘糖脂是由通过糖苷键与鞘氨醇碱连接的一个或更多个糖残基构成的不同分子家族。这些中的一些实例是简单和复杂的鞘糖脂，例如脑苷脂和神经节苷脂。
固醇脂质(例如胆固醇及其衍生物或者生育酚及其衍生物)与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。
糖脂描述的是其中脂肪酸与糖骨架直接连接从而形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖替代了存在于甘油脂质和甘油磷脂中的甘油骨架。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性菌中脂多糖的脂质A组分的酰化氨基葡萄糖前体。典型的脂质A分子是氨基葡萄糖的二糖，其被多达七个脂肪酰基链衍生化。大肠杆菌(E.coli)中生长所需的最小脂多糖是Kdo2-脂质A，其为被两个3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸(Kdo)残基糖基化的氨基葡萄糖的六酰化二糖。
聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合酶共享机械特征的迭代和多模块酶通过对乙酰基和丙酰基亚基进行聚合而合成的。它们包含来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次级代谢产物和天然产物，并且具有大的结构多样性。许多聚酮是其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他过程进一步修饰的环状分子。
根据本公开内容，脂质和类脂质物质可以是阳离子的、阴离子的或中性的。中性脂质或类脂质物质在选定的pH下以不带电荷或中性两性离子的形式存在。
优选地，本文中所述的RNA颗粒包含阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质。阳离子脂质和类脂质物质或者阳离子可电离脂质和类脂质物质可用于与RNA静电结合。阳离子可电离脂质和类脂质物质是优选地仅在酸性pH下带正电荷的物质。与在生理pH下保持阳离子性的颗粒相比，这种可电离行为被认为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。颗粒还可包含非阳离子脂质或类脂质物质。阴离子脂质或类脂质物质以及中性脂质或类脂质物质在本文中统称为非阳离子脂质或类脂质物质。通过添加除可电离/阳离子脂质或类脂质物质之外的其他疏水部分(例如胆固醇和脂质)对RNA颗粒的制剂进行优化增强了颗粒稳定性并且可显著增强RNA递送的效力。
在一个实施方案中，阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质包含头基，所述头基包含至少一个带正电荷或能够被质子化的氮原子(N)。
聚肌氨酸缀合物
本文中所述的一种或更多种颗粒形成组分，例如用于本文中所述颗粒中的聚合物、脂质或类脂质物质包含聚肌氨酸(聚(N-甲基甘氨酸))。聚肌氨酸可包含乙酰化的(中性端基)或其他官能化的端基。在RNA-脂质颗粒的情况下，在一个实施方案中聚肌氨酸与颗粒中包含的非阳离子脂质或类脂质物质缀合，优选与其共价结合。
在某些实施方案中，聚肌氨酸的端基可用以下来官能化：赋予某些特性(例如正电荷或负电荷)的一种或更多种分子部分，或者将颗粒定向到特定细胞类型、细胞群(collection)或组织的靶向剂。
本领域中已知多种合适的靶向剂。靶向剂的一些非限制性实例包括肽、蛋白质、酶、核酸、脂肪酸、激素、抗体、碳水化合物、单糖、寡糖或多糖、肽聚糖、糖肽等等。例如，可使用与靶细胞表面上的抗原结合的多种不同物质中的任一种。靶向细胞表面抗原的抗体通常会表现出对靶标的必要特异性。除抗体之外，还可使用合适的免疫反应性片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2或者scFv片段或单结构域抗体(例如，骆驼科动物VHH片段)。本领域中已获得适合用于形成靶向机制的许多抗体片段。类似地，可适当使用靶细胞表面上任何受体的配体作为靶向剂。这些包括与存在于所期望的靶细胞表面处的细胞表面受体、蛋白质或糖蛋白特异性结合的任何天然或合成的小分子或生物分子。
在某些实施方案中，聚肌氨酸包含2至200、2至190、2至180、2至170、2至160、2至150、2至140、2至130、2至120、2至110、2至100、2至90、2至80、2至70、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、5至70、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、10至80、或10至70个肌氨酸单元。
在某些实施方案中，所述聚肌氨酸包含以下通式(I)：
Figure BDA0003860602100000271
其中x是指肌氨酸单元的数目。通过一个键的聚肌氨酸可与颗粒形成组分或疏水组分连接。通过另一个键的聚肌氨酸可与H、亲水基团、可电离基团，或接头、功能部分(例如靶向部分)连接。
阳离子脂质
在一个实施方案中，本文中所述的RNA-脂质颗粒包含至少一种阳离子脂质。本文中使用的“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过与脂质基质的静电相互作用与带负电荷的RNA结合。通常来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如固醇、酰基链、二酰基链或更多个酰基链，并且脂质的头基通常带有正电荷。在某些实施方案中，阳离子脂质仅在特定pH，特别是酸性pH下具有净正电荷，而在不同的优选更高的pH例如生理pH下，其优选地不具有净正电荷，优选地不具有电荷，即它是中性的。除非与情况相矛盾，否则出于本公开内容的目的，术语“阳离子脂质”包含这样的“阳离子可电离”脂质。阳离子脂质的一些实例包括但不限于：N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(DODMA)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基氨
Figure BDA0003860602100000281
(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9’,12’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺
Figure BDA0003860602100000282
(DMRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四烯基氧基)-1-溴化丙胺
Figure BDA0003860602100000283
(GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1-溴化丙胺
Figure BDA0003860602100000284
(GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺
Figure BDA0003860602100000285
(GAP-DMRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺
Figure BDA0003860602100000286
(βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-胺
Figure BDA0003860602100000287
(DOBAQ)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-甲基铵-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、2,3-双(十二烷氧基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-溴化铵(DLRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙烷-1-溴化铵
Figure BDA0003860602100000291
(DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8’-((((2(二甲基氨基)乙基)硫基)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)丙烷-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙烷-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(lipidoid 98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(lipidoid C12-200)。优选的是DODMA、DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在一些具体实施方案中，所述至少一种阳离子脂质是DODMA。
在一个实施方案中，用于本文中的阳离子脂质是BNT9或包含BNT9。
本文中使用的“BNT9”是包含以下通式的脂质：
Figure BDA0003860602100000292
在一些实施方案中，阳离子脂质可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％。
另外的脂质
本文中所述的RNA颗粒还可包含一种或更多种另外的脂质，即除了阳离子脂质或阳离子可电离脂质之外的脂质，即非阳离子脂质(包括非阳离子可电离脂质)。阴离子脂质和中性脂质在本文中被统称为非阳离子脂质。通过添加除可电离/阳离子脂质之外的其他疏水部分(例如，胆固醇和脂质)对RNA颗粒的制剂进行优化可增强颗粒稳定性以及核酸递送的效力。另外的脂质可影响或可不影响RNA颗粒的总电荷。在某些实施方案中，另外的脂质是非阳离子脂质。非阳离子脂质可包含例如一种或更多种阴离子脂质和/或中性脂质。本文中使用的“中性脂质”是指在选定pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在的多种脂质物质中的任一种。在一些优选实施方案中，所述另外的脂质包含以下中性脂质组分之一：(1)磷脂；(2)胆固醇或其衍生物；或者(3)磷脂与胆固醇或其衍生物的混合物。胆固醇衍生物的一些实例包括但不限于胆甾烷醇(cholestanol)、胆甾烷酮(cholestanone)、胆甾烯酮(cholestenone)、粪甾烷醇(coprostanol)、胆甾醇基-2’-羟乙基醚、胆甾醇基-4’-羟丁基醚、生育酚及其衍生物，及其混合物。
可使用的特定磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这样的磷脂特别是包括二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)，例如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、二木脂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(diphytanoyl-phosphatidylethanolamine，DPyPE)，以及具有不同疏水链的磷脂酰乙醇胺脂质。
在某些优选实施方案中，另外的脂质是DSPC或DSPC和胆固醇。在某些优选实施方案中，另外的脂质是DOPC或DOPC和胆固醇。在某些优选实施方案中，另外的脂质是DPPC或DPPC和胆固醇。
在某些实施方案中，RNA颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DODMA并且另外的脂质是DSPC或DSPC和胆固醇。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是BNT9并且另外的脂质是DSPC或DSPC和胆固醇。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DODMA并且另外的脂质是DOPC或DOPC和胆固醇。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是BNT9并且另外的脂质是DOPC或DOPC和胆固醇。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DODMA并且另外的脂质是DPPC或DPPC和胆固醇。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是BNT9并且另外的脂质是DPPC或DPPC和胆固醇。
不希望受到理论的束缚，与所述至少一种另外的脂质的量相比，所述至少一种阳离子脂质的量可影响重要的RNA颗粒特征，例如电荷、颗粒尺寸、稳定性、组织选择性和RNA的生物活性。因此，在一些实施方案中，所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、或约3:1至约1:1。
在一些实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质(例如，一种或更多种磷脂和/或胆固醇)可占颗粒中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约20mol％至约80mol％、约25mol％至约75mol％、约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、或约40mol％至约60mol％。
在某些优选实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质包含磷脂(例如，DSPC、DOPC和/或DPPC)，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％。
在某些优选实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质包含胆固醇或其衍生物，所述胆固醇或其衍生物为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。
在某些优选实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质包含以下的混合物：(i)磷脂(例如，DSPC、DOPC和/或DPPC)，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％；以及(ii)胆固醇或其衍生物例如胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。作为一个非限制性实例，包含磷脂与胆固醇的混合物的脂质颗粒可包含DSPC、DOPC和/或DPPC，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％，以及胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。
聚肌氨酸-脂质缀合物
本文中所述的RNA颗粒(例如上述包含阳离子脂质和另外的脂质的RNA颗粒)还包括聚肌氨酸缀合物，例如聚肌氨酸-脂质缀合物。聚肌氨酸可与任何颗粒形成组分例如脂质或类脂质物质缀合，特别是与其共价结合或连接。聚肌氨酸-脂质缀合物是其中聚肌氨酸与本文中所述的脂质(例如阳离子脂质或阳离子可电离脂质或另外的脂质)缀合的分子。或者，聚肌氨酸与不同于阳离子脂质或阳离子可电离脂质或另外的脂质的脂质或类脂质物质缀合。
在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(II)：
Figure BDA0003860602100000321
其中R1和R2之一包含疏水基团并且另一个是H、亲水基团、可电离基团或任选地包含靶向部分的官能团。在一个实施方案中，疏水基团包含线性或支链烷基或芳基，其优选地包含10至50、10至40或12至20个碳原子。在一个实施方案中，包含疏水基团的R1或R2包含与一个或更多个线性或支链烷基连接的部分，例如杂原子，特别是N。
在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(III)：
Figure BDA0003860602100000322
其中R是H、亲水基团、可电离基团或任选地包含靶向部分的官能团。
本文中通式例如通式(II)和(III)中的符号“x”是指肌氨酸单元的数目，并且可以是本文中限定的数目。
在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物，及其混合物。
在某些情况下，聚肌氨酸-脂质缀合物可占颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。
通常，聚肌氨酸部分具有2至200、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、10至80、10至50、10至30、或10至25个肌氨酸单元。
RNA-脂质颗粒
“RNA-脂质颗粒”包括可用于将RNA递送至目的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的脂质制剂。RNA-脂质颗粒通常由阳离子脂质(例如DODMA)、一种或更多种非阳离子脂质(例如磷脂(例如，DSPC))、胆固醇或其类似物，以及聚肌氨酸-脂质缀合物形成。
不旨在受任何理论的束缚，认为阳离子脂质和另外的脂质与RNA组合在一起以形成聚集体，其中核酸与脂质基质结合，并且该自发聚集导致胶体稳定的颗粒。
在一些实施方案中，RNA-脂质颗粒包含多于一种类型的RNA分子，其中RNA分子的分子参数可彼此类似或不同，如关于摩尔质量或基本结构要素，例如分子结构、加帽、编码区或其他特征。
在一些实施方案中，RNA-脂质颗粒除RNA之外还包含(i)阳离子脂质，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％；(ii)非阳离子脂质，特别是中性脂质(例如，一种或更多种磷脂和/或胆固醇)，其可占颗粒中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约20mol％至约80mol％、约25mol％至约75mol％、约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、或约40mol％至约60mol％；以及(iii)聚肌氨酸-脂质缀合物，其可占颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。
在某些优选实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质包含磷脂，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％。
在某些优选实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质包含胆固醇或其衍生物，所述胆固醇或其衍生物为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。
在某些优选实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质包含以下的混合物：(i)磷脂(例如，DSPC、DOPC和/或DPPC)，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％；以及(ii)胆固醇或其衍生物例如胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。作为一个非限制性实例，包含磷脂与胆固醇的混合物的脂质颗粒可包含DSPC、DOPC和/或DPPC，其为颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％，以及胆固醇，其为颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。
通常，聚肌氨酸部分具有2至200、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、10至80、10至50、10至30、或10至25个肌氨酸单元。
在一些实施方案中，RNA-脂质颗粒除RNA之外还包含(i)DODMA，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％；(ii)DSPC，其可占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％；(iii)胆固醇，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％，以及(iv)聚肌氨酸-脂质缀合物，其可占颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。
在某些实施方案中，RNA颗粒包含根据通式(II)或(III)的聚肌氨酸-脂质缀合物、DODMA、DSPC和胆固醇。
在一些实施方案中，RNA-脂质颗粒除RNA之外还包含(i)BNT9，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％；(ii)DSPC、DOPC和/或DPPC，其可占颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％；(iii)胆固醇，其可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％，以及(iv)聚肌氨酸-脂质缀合物，其可占颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。
在某些实施方案中，RNA颗粒包含根据通式(II)或(III)的聚肌氨酸-脂质缀合物、BNT9、DSPC和胆固醇。在另一些实施方案中，RNA颗粒包含根据通式(II)或(III)的聚肌氨酸-脂质缀合物、BNT9、DOPC和胆固醇。在另一些实施方案中，RNA颗粒包含根据通式(II)或(III)的聚肌氨酸-脂质缀合物、BNT9、DPPC和胆固醇。
RNA颗粒直径
在一个实施方案中，本文中所述的RNA颗粒的平均直径为约30nm至约1000nm、约30nm至约800nm、约30nm至约700nm、约30nm至约600nm、约30nm至约500nm、约30nm至约450nm、约30nm至约400nm、约30nm至约350nm、约30nm至约300nm、约30nm至约250nm、约30nm至约200nm、约30nm至约190nm、约30nm至约180nm、约30nm至约170nm、约30nm至约160nm、约30nm至约150nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm、约50nm至约350nm、约50nm至约300nm、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约50nm至约190nm、约50nm至约180nm、约50nm至约170nm、约50nm至约160nm、或约50nm至约150nm。
在某些实施方案中，本文中所述的RNA颗粒的平均直径为约40nm至约800nm、约50nm至约700nm、约60nm至约600nm、约70nm至约500nm、约80nm至约400nm、约150nm至约800nm、约150nm至约700nm、约150nm至约600nm、约200nm至约600nm、约200nm至约500nm、或约200nm至约400nm。
本文中所述的(例如通过本文中所述的方法产生的)RNA颗粒表现出小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2或约0.1或更低的多分散性指数。举例来说，RNA颗粒可表现出约0.1至约0.3的多分散性指数。
RNA
在本公开内容中，术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’-位具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA(例如部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰的RNA。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA末端。本文中还考虑了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的RNA被认为是天然存在RNA的类似物。在一些具体实施方案中，根据本发明的RNA包含不同RNA分子的群，例如任选地编码不同肽和/或蛋白质的不同RNA分子的混合物。因此，根据本发明，术语“RNA”可包括RNA分子的混合物。
在本公开内容的某些实施方案中，RNA是与编码肽或蛋白质的RNA转录物相关的信使RNA(messenger RNA，mRNA)。如本领域中认可的，mRNA通常包含5’非翻译区(5’-UTR)、肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。在一些实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，mRNA通过使用DNA模板的体外转录产生，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
在一个实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可通过合适DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得。cDNA可通过RNA的反转录获得。
在本公开内容的某些实施方案中，RNA是复制子RNA或简称“复制子”，特别是自复制RNA。在一个特别优选的实施方案中，复制子或自复制RNA来源于或包含这样的元件，该元件来源于ssRNA病毒，特别是正链ssRNA病毒(例如甲病毒)。甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒在受感染细胞的细胞质中复制(对于甲病毒生命周期的综述，参见Joséet al.,Future Microbiol.,2009,第4卷,第837至856页)。许多甲病毒的总基因组长度通常为11,000至12,000个核苷酸，并且基因组RNA通常具有5’帽和3’poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(open reading frame，ORF)。四种非结构蛋白(nsP1至nsP4)通常由在基因组5’末端附近开始的第一ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由存在于第一ORF下游并延伸到基因组3’末端附近的第二ORF一起编码。通常，第一ORF大于第二ORF，比例为约2:1。在被甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，所述亚基因组转录物是类似于真核信使RNA(mRNA)的RNA分子(Gould et al.,2010,Antiviral Res.,第87卷第111至124页)。在感染之后，即在病毒生命周期的早期，(+)链基因组RNA直接充当信使RNA用于翻译编码非结构多蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已提出了将甲病毒来源的载体用于将外来遗传信息递送到靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，将编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框替换为编码目的蛋白质的开放阅读框。基于甲病毒的反式复制系统依赖于两个分开的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，并且另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此称为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许通过甲病毒复制酶进行识别和RNA合成。
在本公开内容的某些实施方案中，本文中所述RNA颗粒中的RNA的浓度为约0.002mg/mL至约5mg/mL、约0.002mg/mL至约2mg/mL、约0.005mg/mL至约2mg/mL、约0.01mg/mL至约1mg/mL、约0.05mg/mL至约0.5mg/mL、或约0.1mg/mL至约0.5mg/mL。在一些具体实施方案中，RNA的浓度为约0.005mg/mL至约0.1mg/mL、约0.005mg/mL至约0.09mg/mL、约0.005mg/mL至约0.08mg/mL、约0.005mg/mL至约0.07mg/mL、约0.005mg/mL至约0.06mg/mL、或约0.005mg/mL至约0.05mg/mL。
在一个实施方案中，RNA可具有经修饰核糖核苷酸。经修饰核糖核苷酸的实例包括但不限于5-甲基胞苷、假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-帽。在一个实施方案中，本公开内容的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。在一个实施方案中，RNA可被5’-帽类似物修饰。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’-端的结构，并且通常由通过5’至5’三磷酸键联与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7位被甲基化。提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA可通过体外转录来实现，其中5’-帽共转录表达到RNA链中，或者可使用加帽酶转录后与RNA连接。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含5’-UTR和/或3’-UTR。术语“非翻译区”或”UTR”涉及DNA分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。5’-UTR(如果存在的话)位于5’端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’-UTR位于5’-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽相邻。3’-UTR(如果存在的话)位于3’端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3’-UTR”优选不包含poly(A)尾。因此，3’-UTR位于poly(A)序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。
在一些实施方案中，根据本公开内容的RNA包含3’-poly(A)序列。术语“poly(A)序列”涉及通常位于RNA分子的3’端的腺苷酸(A)残基的序列。根据本公开内容，在一个实施方案中，poly(A)序列包含至少约20个、至少约40个、至少约80个、或至少约100个，并且多至约500个、多至约400个、多至约300个、多至约200个、或多至约150个A核苷酸，并且特别是约120个A核苷酸。
在本公开内容的上下文中，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可翻译成肽或蛋白质。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及通过其mRNA的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质之在细胞的核糖体中的过程。
RNA可以是编码RNA，即编码肽或蛋白质的RNA。所述RNA可表达编码的肽或蛋白质。例如，所述RNA可以是编码并表达药物活性肽或蛋白质的RNA。或者，RNA可以是非编码RNA，例如反义RNA、微RNA(micro RNA，miRNA)或siRNA。
本文中使用的RNA可以是药物活性RNA。“药物活性RNA”是编码药物活性肽或蛋白质或者本身具有药物活性的RNA，例如，其具有一种或更多种药物活性，例如对于药物活性蛋白质所描述的那些，例如免疫刺激活性。例如，RNA可以是一条或更多条RNA干扰(RNAinterference，RNAi)链。这样的试剂包括短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)或短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)或者siRNA或微RNA样RNA的前体，其靶向靶转录物，例如，对象的内源性疾病相关转录物的转录物。
本公开内容的一些方面涉及将本文中公开的RNA靶向递送至某些细胞或组织。在一个实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。如果施用的RNA是编码用于诱导免疫应答的抗原或表位的RNA，则特别优选的是靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的重要部分，其包含运送淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。原发性或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
基于脂质的RNA递送系统对肝具有固有的偏好。肝积聚是由肝血管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。在一个实施方案中，靶器官是肝并且靶组织是肝组织。优选递送至这样的靶组织，特别是如果期望在该器官或组织中存在RNA或编码的肽或蛋白质和/或如果期望表达大量编码的肽或蛋白质和/或如果期望或需要全身性(特别是以显著的量)存在编码的肽或蛋白质。
在一个实施方案中，在施用本文中所述的RNA颗粒之后，至少一部分RNA被递送至靶细胞或靶器官。在一个实施方案中，至少一部分RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA是编码肽或蛋白质的RNA，并且RNA被靶细胞翻译以产生肽或蛋白质。在一个实施方案中，靶细胞是肝中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肌细胞。在一个实施方案中，靶细胞是内皮细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是血细胞。在一个实施方案中，靶细胞是淋巴结中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肺中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是血细胞。在一个实施方案中，靶细胞是皮肤中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。在一个实施方案中，靶细胞是T细胞。在一个实施方案中，靶细胞是B细胞。在一个实施方案中，靶细胞是NK细胞。在一个实施方案中，靶细胞是单核细胞。因此，本文中所述的RNA颗粒可用于将RNA递送至这样的靶细胞。因此，本公开内容还涉及用于在对象中将RNA递送至靶细胞的方法，所述方法包括向对象施用本文中所述的RNA颗粒。在一个实施方案中，RNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，RNA是编码肽或蛋白质的RNA，并且RNA被靶细胞翻译以产生肽或蛋白质。
在一个实施方案中，RNA编码药物活性肽或蛋白质。
根据本公开内容，术语“RNA编码”意指，如果存在于合适环境中，例如靶组织的细胞内，则RNA可在翻译过程中指导氨基酸的组装以产生其编码的肽或蛋白质。在一个实施方案中，RNA能够与细胞翻译机器相互作用，从而允许肽或蛋白质的翻译。细胞可在细胞内(例如在胞质中)产生编码的肽或蛋白质，可分泌编码的肽或蛋白质，或者可使其在表面上产生。
根据本公开内容，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的约2个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但是术语“肽”和“蛋白质”在本文中通常作为同义词使用。
“药物活性肽或蛋白质”或“治疗性肽或蛋白质”当以治疗有效量提供给对象时，对该对象的状况或疾病状态具有积极或有利的作用。在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质具有治愈性或姑息治疗性(palliative)特性并且可施用以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症的发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。药物活性肽或蛋白质可具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“药物活性肽或蛋白质”包括完整的蛋白质或多肽，并且也可以是指其药物活性片段。其还可包括肽或蛋白质的药物活性类似物。
药物活性蛋白质的一些实例包括但不限于细胞因子及其衍生物，例如细胞因子融合体(如白蛋白-细胞因子融合体)和免疫系统蛋白，例如免疫活性化合物(例如，白介素、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony stimulating factor，G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、干扰素、整联蛋白、地址素(addressin)、选择蛋白(seletin)、归巢受体(homing receptor)、T细胞受体、嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)、包括抗体或双特异性抗体的免疫球蛋白(例如在病毒/细菌感染的情况下用于免疫刺激或产生中和抗体)、可溶性主要组织相容性复合体抗原、免疫活性抗原(例如细菌、寄生物或病毒抗原、变应原、自身抗原、抗体)、激素(胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素(trophic hormone)、催乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、瘦素等)、生长激素(例如，人生长激素)、生长因子(例如，表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子等)、生长因子受体、酶(组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成性或降解性、类固醇生成酶(steriodogenic enzyme)、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、脱甲基酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经酰胺酶(neuramidase)、溶酶体酶等)、受体(类固醇激素受体、肽受体)、结合蛋白(生长激素或生长因子结合蛋白等)、转录和翻译因子、肿瘤生长抑制蛋白(例如，抑制血管生成的蛋白质)、结构蛋白(例如胶原蛋白、丝心蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)、血蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰岛素、因子IX、因子X、组织纤溶酶原激活物、蛋白C、冯·维勒布兰德因子(von Wilebrand factor)、抗凝血酶III、葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)或经修饰的因子VIII、抗凝剂等)。
术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答，例如通过诱导和/或抑制免疫细胞的成熟、诱导和/或抑制细胞因子生物合成和/或通过刺激B细胞产生抗体改变体液免疫来改变免疫应答的任何化合物。免疫活性化合物具有强效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可以下调免疫应答的其他方面，例如将免疫应答从TH2免疫应答转移，这可用于治疗广泛多种TH2介导的疾病。免疫活性化合物可用作疫苗佐剂。
在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质包含细胞因子。术语“细胞因子”是指一类在细胞信号传导中重要的小蛋白质(约5至20kDa)。它们的释放对它们周围细胞的行为有影响。细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，但通常不包括激素或生长因子(尽管在该术语上有一些重叠)。细胞因子由广泛多种的细胞产生，所述细胞包括免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和多种基质细胞。给定的细胞因子可由多于一种类型的细胞产生。细胞因子通过受体起作用，并且在免疫系统中尤为重要；细胞因子调节体液免疫应答与基于细胞的免疫应答之间的平衡，并且它们调节特定细胞群的成熟、生长和反应性。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制另一些细胞因子的作用。
在一个实施方案中，根据本发明的药物活性蛋白是参与调节淋巴稳态的细胞因子，优选参与并且优选地诱导或增强T细胞的发生、致敏、扩增、分化和/或存活的细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子是白介素。在一个实施方案中，根据本发明的药物活性蛋白是选自IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21的白介素。
在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质包含替代蛋白质。在该实施方案中，本发明提供了用于治疗患有需要蛋白质替代(protein replacement)的病症(例如，蛋白质缺乏症)的对象的方法，所述方法包括向对象施用编码替代蛋白质的如本文中所述的RNA。术语“蛋白质替代”是指将蛋白质(包括其功能性变体)引入到缺乏这样的蛋白质的对象中。该术语还指以其他方式将蛋白质引入需要或受益于提供蛋白质的对象(例如患有蛋白质不足的对象)中。术语“以蛋白质缺乏为特征的病症”是指表现出由缺乏蛋白质或蛋白质的量不足而引起的病理学的任何病症。该术语涵盖导致生物上无活性的蛋白质产物的蛋白质折叠病症，即构象病症。蛋白质不足可涉及感染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺体问题、放射病、营养缺乏、中毒或其他环境或外部损伤(insult)。
在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白质包含一种或更多种抗原或者一种或更多种表位，即向对象施用所述肽或蛋白质在对象中引发针对所述一种或更多种抗原或者一种或更多种表位的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的。
本文中使用的术语“疫苗肽”或“疫苗蛋白质”是指提高针对特定病原体的免疫力并且优选地导致部分或完全的保护而免受由特定病原体引起的疾病的肽或蛋白质。这样的“疫苗肽或蛋白质”可以是来源于病原体(例如，病毒或细菌)的抗原。
术语“抗原”涉及包含这样的表位的物质：针对该表位可产生免疫应答。特别地，术语“抗原”包含蛋白质和肽。在一个实施方案中，抗原由免疫系统的细胞(例如抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞)呈递。在一个实施方案中，抗原或其加工产物例如T细胞表位，通过T或B细胞受体或通过免疫球蛋白分子例如抗体结合。因此，抗原或其加工产物可与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，并且表位来源于这样的抗原。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。因此，疾病相关抗原或其表位可用于治疗性目的。疾病相关抗原可与微生物(通常是微生物抗原)感染相关或者与癌症(通常是肿瘤)相关。
术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于细胞质、细胞表面和细胞核。特别地，它是指在细胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何细菌成分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。
术语“表位”是指分子(例如抗原)被免疫系统识别的部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可包含抗原的连续或不连续部分，并且长度可为约5至约100，例如约5至约50，更优选约8至约30，最优选约10至约25个氨基酸，例如表位可优选长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指当在MHC分子的背景下存在时被T细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)”和缩写“MHC”包括I类MHC和II类MHC分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入微生物的片段)二者。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)。术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及识别T细胞所靶向的抗原的T细胞，特别是当在MHC分子的情况下呈现在抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)的表面上时，并且优选地发挥T细胞的效应物功能。如果T细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则认为该T细胞对抗原具有特异性。可使用例如在铬释放测定或增殖测定内的多种标准技术中的任一种来评价T细胞特异性。或者，可测量淋巴因子(例如干扰素γ)的合成。在本公开内容的某些实施方案中，RNA编码至少一个表位。
在某些实施方案中，表位来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，通常已知其在多种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新抗原”，它对个体的肿瘤具有特异性，并且之前未被免疫系统识别。新抗原或新表位可以是由癌细胞基因组中导致氨基酸变化的一种或更多种癌症特异性突变导致的。肿瘤抗原的一些实例包括但不限于：p53，ART-4，BAGE，β-联蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，密蛋白家族的细胞表面蛋白例如密蛋白-6、密蛋白-18.2和密蛋白-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap 100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、或MAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1，MUM-2，MUM-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，pl90小BCR-abL，Pml/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，存活蛋白，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT和WT-1。
癌症突变因个体而异。因此，编码新表位的癌症突变在疫苗组合物和免疫治疗的开发中代表有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力取决于能够在宿主内诱导强效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。RNA可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。驻留于脾中的树突细胞(dendritic cell，DC)代表对免疫原性表位或抗原(例如肿瘤表位)的RNA表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已示出多种表位的使用促进肿瘤疫苗组合物中的治疗效力。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位，其可以由本文中所述的RNA编码，例如作为单一多肽，在其中表位任选地被接头分开。在本公开内容的某些实施方案中，RNA编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。一些示例性实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位(pentatope)”)的RNA、编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的RNA、编码至少二十个表位(称为“二十表位(eicosatope)”)的RNA。
包含RNA颗粒的组合物
术语“多个RNA颗粒”或“多个RNA-脂质颗粒”是指一定数目的颗粒的群。在某些实施方案中，该术语是指多于10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022、或1023个或更多个颗粒的群。
对本领域技术人员将明显的是，所述多个颗粒可包括前述范围的任何分数或其中的任意范围。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物是液体或固体。固体的一些非限制性实例包括冷冻形式、冻干形式或喷雾干燥形式。在一个优选实施方案中，组合物是液体。
根据本公开内容，本文中所述的组合物可包含盐，例如有机盐或无机盐，包括但不限于氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、乙酸钾、磷酸二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、乙酸钠、氯化锂、氯化镁、磷酸镁、氯化钙和乙二胺四乙酸(EDTA)钠盐和氨基酸。
本文中所述的组合物还可包含稳定剂以在储存、冷冻、冻干和/或喷雾干燥期间避免产品品质的实质性损失并且，特别是避免RNA活性的实质性损失，例如以降低或防止聚集、颗粒塌缩(collapse)、RNA降解和/或其他类型的损坏。
在一个实施方案中，稳定剂是冷冻保护剂或冻干保护剂。
在一个实施方案中，稳定剂是碳水化合物。本文中使用的术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
在一个实施方案中，稳定剂是氨基酸或表面活性剂(例如，泊洛沙姆(poloxamer))。
根据本公开内容，本文中所述的RNA颗粒组合物具有适合于RNA颗粒的稳定性并且，特别是适合于RNA的稳定性的pH。在一个实施方案中，本文中所述的RNA颗粒组合物的pH为约4.0至约8.0或约5.0至约7.5。不希望受到理论的束缚，缓冲剂的使用在组合物的制造、储存和使用期间维持组合物的pH。在本公开内容的某些实施方案中，缓冲剂可以是碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、[三(羟甲基)甲基氨基]丙烷磺酸(TAPS)、2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸(Bicine)、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)、N-(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸(Tricine)、3-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]-2-羟基丙烷-1-磺酸(TAPSO)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸(HEPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙烷磺酸(TES)、1,4-哌嗪二乙烷磺酸(PIPES)、二甲基次胂酸、2-吗啉-4-基乙烷磺酸(MES)、3-吗啉-2-羟基丙烷磺酸(MOPSO)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。另一些合适的缓冲体系可以是单独的或在盐中的乙酸、单独的或在盐中的柠檬酸、单独的或在盐中的硼酸以及单独的或在盐中的磷酸，或氨基酸及氨基酸衍生物。
本公开内容的某些实施方案考虑在本文中所述的组合物中使用螯合剂。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键从而产生稳定的水溶性络合物的化合物。不希望受到理论的束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，其在本公开内容中可另外诱导加速的RNA降解。合适的螯合剂的一些实例包括但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA盐、去铁敏B(desferrioxamine B)、去铁胺(deferoxamine)、二硫代氨基甲酸钠(dithiocarbsodium)、青霉胺、戊酸钙、戊酸钠盐、琥巯酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、氨三乙酸、反式-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、双(氨基乙基)乙二醇醚-N,N,N’,N’-四乙酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸，或其盐。在某些实施方案中，螯合剂是EDTA或EDTA盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是EDTA二水合二钠。
在一些实施方案中，EDTA的浓度为约0.05mM至约5mM、约0.1mM至约2.5mM、或约0.25mM至约1mM。
药物组合物
本文中所述的包含RNA颗粒的组合物可用作用于治疗性或预防性治疗的药物组合物或药物，或者用于制备所述药物组合物或药物。
在一个方面中，本文中所述的RNA颗粒存在于药物组合物中。在另一个方面中，本文中所述的组合物是药物组合物。
本公开内容的颗粒可以以任何合适的药物组合物的形式施用。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的制剂。通过将所述药物组合物施用于对象，所述药物组合物可用于治疗、预防或减轻疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开内容的上下文中，药物组合物包含本文中所述的RNA颗粒。
本公开内容的药物组合物可包含一种或更多种佐剂或可与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包含化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、矿物质(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的一些实例包括但不限于：LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFa、INF-γ、GM-CSF、LT-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如
Figure BDA0003860602100000481
ISA51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽例如Pam3Cys，以及亲脂组分例如皂苷、海藻糖-6,6-二山嵛酸酯(TDB)、单磷酰脂质-A(MPL)、单分枝酰甘油(monomycoloyl glycerol，MMG)、或吡喃葡萄糖基脂质佐剂(glucopyranosyl lipid adjuvant，GLA)。
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学上有效的量”和“可药用制剂”应用。
术语“可药用的”是指物质的无毒性，其不与药物组合物活性组分的作用相互作用。
术语“药学上有效的量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的作用的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选地涉及对疾病进程的抑制。这包括减缓疾病的进展并且，特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是所述疾病或所述病症的发作延迟或发作预防。本文中所述的颗粒或组合物的有效量将取决于：待治疗的病症，疾病的严重程度，患者的个体参数包括年龄、生理状况、大小和体重，治疗的持续时间，伴随治疗(如果有的话)的类型，具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述的颗粒或组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在患者对初始剂量的反应不足的情况下，可使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的施用途径有效地获得更高的剂量)。
本公开内容的药物组合物可包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或冲淡剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任何一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
用于治疗用途的可药用载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaro编辑.1985)中。
可根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
药物组合物的施用途径
在一个实施方案中，本文中所述的药物组合物可静脉内、动脉内、皮下、皮内、皮肤(dermally)、肌内或瘤内施用。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道以外的任何方式施用，例如通过静脉内注射。在一个优选实施方案中，将药物组合物配制成用于全身性施用。在另一个优选实施方案中，全身性施用通过静脉内施用。
药物组合物的用途
本文中所述的RNA颗粒可用于多种疾病的治疗性或预防性治疗，特别是其中向对象提供肽或蛋白质导致治疗性或预防性作用的疾病。例如，提供来源于病毒的抗原或表位可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗癌症疾病，在所述癌症疾病中癌细胞表达所述肿瘤抗原。提供功能性蛋白质或酶可用于治疗以例如溶酶体贮积病(例如，黏多糖贮积症)或因子缺乏中功能异常性蛋白质为特征的遗传性病症。提供细胞因子或细胞因子融合体可用于调节肿瘤微环境。
术语“疾病”(在本文中也称为“病症”)是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于指引起以下的任何病症：痛苦、功能障碍、困扰、社会问题、或所折磨个体死亡、或与接触个体的那些类似的问题。从广义上讲，疾病有时包括伤害、残疾、病症、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些背景下和出于其他目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上影响个体而且在情感上影响个体，因为感染多种疾病和在有多种疾病的情况下生活可改变人对生活的看法和人的性格。
在本发明背景中，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病或障碍目的的对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，缓解或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可消除个体中的疾病，阻止或减缓个体中疾病的发展，抑制或减缓个体中疾病的发展，降低个体中症状的频率或严重程度，和/或降低当前或以前患有疾病的个体中的复现性。
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病或病症(例如，癌症、感染性疾病)折磨或易于患有所述疾病或病症(例如，癌症、感染性疾病)但是可患有或可未患有所述疾病或病症或者可能需要预防性干预(例如疫苗接种)或者可能需要进行干预(例如通过蛋白质替代)的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)或任何其他非哺乳动物，包括鸟类(鸡)、鱼或任何其他动物物种。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年、老年、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是通过疫苗接种提供针对感染性疾病的保护。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是向对象，特别是有此需要的对象提供分泌的治疗性蛋白质，例如抗体、双特异性抗体、细胞因子、细胞因子融合蛋白、酶。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是向对象，特别是有此需要的对象提供蛋白质替代治疗，例如产生促红细胞生成素、因子VII、冯·维勒布兰德因子、β-半乳糖苷酶、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。
在本公开内容的一个实施方案中，目的是调节/重新编程血液中的免疫细胞。
本领域技术人员将知道免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位对对象进行免疫来产生针对疾病的免疫保护性反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文中所述的药物组合物可应用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了以诱导免疫应答为目的例如出于治疗性或预防性的原因而向个体施用抗原的过程。
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
呈现以下描述以使本领域普通技术人员能够制造和使用多种实施方案。特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多种实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
实施例
实施例1：材料和方法
材料
编码萤光素酶或分泌型
Figure BDA0003860602100000521
萤光素酶(secNLuc)的mRNA由RNABiochemistry unit(BioNTech RNA Pharmaceuticals,Mainz,Germany)提供(水中或10mMHepes中mRNA的浓度为2至5mg/mL；0.1mM EDTA；pH 7.0)。
可电离阳离子脂质DODMA(1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷)和辅助脂质DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)购自Merck。辅助脂质DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)获自Avanti Polar Lipids。胆固醇来自Sigma Aldrich。十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)获自Sigma Adlrich。
在制备之前，将脂质在无水乙醇(Carl Roth)中溶解至浓度为5至100mM，并将乙醇脂质溶液储存在-20℃下。
在制备之前，在室温下使乙醇脂质溶液、无菌柠檬酸盐缓冲液100mM pH 5.4和RNA平衡。
用于制备脂质纳米粒的方案1
使用微流控混合装置NanoAssemblrTM Benchtop Instrument(PrecisionNanoSystems,Vancouver,BC)，通过将包含脂质的乙醇相与包含RNA的水相混合来制备脂质纳米粒。通过微流控盒(microfluidic cartridge)将一体积的包含总脂质为9mM的脂质混合物的乙醇与3体积的在柠檬酸盐缓冲液(100mM pH 5.4)中的0.15mg/mL的RNA以12mL/分钟的组合流量混合。将所得混合物与2体积的柠檬酸盐缓冲液(100mM，pH 5.4)直接混合。如果没有另外提及，则将颗粒在10K MWCO透析盒(dialysis cassette)(Slide-A-Lyser,ThermoFisher Scientific)中针对磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析2.5小时。然后通过使用
Figure BDA0003860602100000531
超离心过滤器(30kDa NMWL,Merck Millipore)进行超滤使颗粒重浓缩至理论RNA浓度为约0.2至0.5mg/mL。在制备当天进行物理化学表征(尺寸、多分散性、ζ电位、RNA可及性和总RNA浓度)。在完成表征之后，将制剂在4℃下储存不多于2天。在体外测试或体内注射之前，将脂质纳米粒在PBS中溶解至期望的RNA浓度。
用于制备脂质纳米粒的方案2
通过将包含脂质的水相与包含RNA的水相混合来制备脂质纳米粒。通过在搅拌下将600μl总脂质为75mM的乙醇(包含不同摩尔分数的阳离子脂质、辅助脂质、pSarc(在含有的情况下，或者不含pSarc))注射到总体积为14.4ml的水中持续30分钟来制备pSarc-脂质体。然后将脂质体以N/P为4添加至水中的RNA，随后迅速涡旋形成最终RNA浓度为0.05mg/ml的pSarc-LPX。在制备当天进行物理化学表征(尺寸、多分散性、RNA可及性和总RNA浓度)。在完成表征之后，将制剂在4℃下储存不多于2天。在体外测试之前，将脂质纳米粒在水中溶解至期望的RNA浓度。
颗粒尺寸测量
通过动态光散射测量脂质纳米粒的颗粒尺寸和多分散性(PDI)。将制剂在PBS中稀释至最终RNA浓度为0.005mg/mL。在96孔板中一式三份测量120μL稀释的样品。通过来自WYATT technology GmbH(Dernbach,Germany)的DynaPro读板仪II仪器来测量尺寸。
ζ电位(电泳迁移率)的测量
将RNA脂质纳米粒在1ml 0.1×PBS中稀释至RNA浓度为0.01mg/mL。在塑料比色皿中制备每种制剂的三个1.05ml样品。用ζ-Wallis仪器(Corduan technologies,France)通过激光多普勒电泳测量颗粒的电泳迁移率。每个样品使用具有1个10次运行序列的中等分辨率测量。从最终分析中排除具有低信噪比或极端迁移率μ(>3或<-3μm*cm/V*S)的测量。
用于RNA可及性和总RNA浓度的RiboGreen测定
RNA脂质纳米粒始终以约0.2至0.5mg/mLRNA的最终浓度浓缩。Quant-iTRiboGreen RNA测定(Thermo Fischer Scientific)用于量化RNA可及性以及制剂中的总RNA浓度。简言之，使用RNA结合染料RiboGreen通过比较在存在和不存在2％Triton X-100的情况下样品之间的荧光来确定包封效率。在不存在洗涤剂的情况下，荧光可从仅可获得的游离RNA测量，而在存在洗涤剂的情况下，荧光从总RNA量测量。在存在洗涤剂Triton X-100的情况下样品的荧光也用于基于校准曲线计算总RNA浓度。
将脂质纳米粒样品或PBS(阴性对照)用1×TE缓冲液(Thermo Fisher Scientist)稀释低至mRNA浓度为2至5μg/mL。
将每个稀释的样品的等分试样进一步在1×TE缓冲液(测量可获得的mRNA)中1:1稀释或者在包含2％Triton-X100的1×TE缓冲液(测量可在颗粒内获得的mRNA和游离mRNA二者的总mRNA)中1:1稀释。一式两份制备样品。将样品在37℃下孵育10分钟以确保充分的脂质解离。然后将Quant-iT RiboGreen RNA试剂(来自TE缓冲液中的储备溶液的1:100稀释物)1.1添加至每个样品，并在485nm的激发波长和535nm的发射波长下测量染料的荧光(Tecan Infinite M200 Pro多模式读板仪)。
如下确定RNA可及性：
Figure BDA0003860602100000541
使用RNA校准曲线在含有2％Triton X-100的1×TE缓冲液中确定总RNA浓度。
琼脂糖凝胶电泳
进行琼脂糖凝胶电泳以评价游离RNA。通过使用以下来倾倒凝胶：1g琼脂糖，其溶解于100mL 1×TAE缓冲液(Tris-乙酸盐-EDTA)(ThermoFisher)、1mL 5％次氯酸钠和10μLGelRed核酸凝胶染料(Biotium)。使凝胶在室温下凝固至少25分钟。然后将凝胶放入凝胶电泳槽中，并使用1×TAE运行缓冲液(ThermoFisher)。在上样之前，对于总RNA和游离RNA，将样品分别在有或没有2％Triton X-100的情况下在40℃下孵育。凝胶在80V下运行40分钟。在Chemidoc XRS成像系统(Bio-Rad)上拍摄凝胶图像。
体外转染测定和细胞生存力测定
将细胞接种到白色96孔板(平底)中：C2C12细胞以5000个细胞/孔的浓度，HepG2和TC1细胞以20 000个细胞/孔的浓度。除C2C12为7.5％CO2之外，将细胞维持在37℃和5％CO2下。在18至24小时之后，将上清液弃去并替换为90μL补充有10％未灭活FCS的相应培养基。在PBS中将制剂稀释至最终浓度为1至10μg/mL。然后将10μl脂质纳米粒溶液添加至细胞以获得100μl的最终培养基体积。孔中的最终RNA量为33至100ng。将板在室温下以500g离心5分钟。在与细胞一起孵育24小时之后，根据手册说明进行Bright-GloTM萤光素酶测定(Cat.#E260,Promega GmbH,Mannheim,Germany)。使用Tecan Infinite M200 Pro多模式读板仪测量生物发光信号(RLU)，并通过减去未转染细胞的背景(使用PBS作为空白)来计算萤光素酶表达。
对于细胞生存力测量，遵循相同的程序。在制剂与细胞一起孵育24小时之后，根据手册说明进行CellTiter-GloTM测定(Cat.G9242,Promega GmbH,Mannheim,Germany)。包括用于毒性的DMSO和用于100％生存力的PBS的对照。如下计算生存力：
Figure BDA0003860602100000551
小鼠体内转染
将小鼠用异氟烷麻醉并用预先配备有尺寸为30G的套管的胰岛素注射器将200μl所调查制剂(萤光素酶编码mRNA为0.05mg/mL)静脉内注射到眶后窦(retro-orbitalsinus)中。观察小鼠直至其恢复对疼痛、痛苦和窘迫迹象的意识。
在测量时(给药之后6小时和24小时)用D-萤光素溶液以100mg/kg体重对小鼠进行腹膜内注射。随后，将小鼠用异氟烷麻醉并置于
Figure BDA0003860602100000552
Spectrum(Perkin Elmer)成像室内的热垫(37℃)上，通过单独的麻醉面罩恒定供应异氟烷/氧气。在注射萤光素之后5分钟，进行通过照相机在一分钟内检测生物发光。然后通过颈伸长处死小鼠，收集器官，如肝、肺、脾、心脏、肾、脑、淋巴结，并用
Figure BDA0003860602100000561
Spectrum成像装置再次进行离体测量。使用软件“LivingImage”(Perkin Elmer)对所得图像进行分析。在器官周围绘制目的区域(regionof interest，ROI)以量化光子的总通量[p/s]。抽取血液，并通过将全血以1000×g离心3分钟获得血清。通过Thermo Scientific临床化学分析仪-Indiko来确定肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的水平以及LDH水平。
对于EPO实验，将剂量范围为30至3μg的mRNA静脉内施用于Balb/c小鼠(n＝5)。在3、6、24和48小时之后抽取全血，并通过以13000×rpm离心3分钟来获得血浆。使用小鼠促红细胞生成素DuoSet ELISA(R&D systems)确定EPO分泌。
小角X射线散射
在German Synchrotron-EMBL(DESY)Hamburg[P12]上进行小角X射线散射(SmallAngle X-Ray Scattering，SAXS)实验。可将样品至检测器的距离调节为1.6至6m，以允许从
Figure BDA0003860602100000562
到
Figure BDA0003860602100000563
的测量。使用注射器将浓缩的LNP悬浮液原位加载到石英毛细管中。
补体活化
使用人C3a EIA试剂盒(Quidel)确定体外C3a水平。简言之，将LNP和对照(阳性(聚氧乙烯蓖麻油(Cremophore El))和阴性(1×PBS和EDTA(18mM))与正常人血清补体(NormalHuman Serum Complement，NHS,Quide)以20:80(试样:NHS)的比例在37℃下一起孵育1小时。基于1mg/kg mRNA剂量的理论血浆浓度以5×、1×和0.02×对LNP进行了测试。C3a EIA试剂盒根据制造商方案进行。
冷冻TEM
将样品保存在200目铜网格(
Figure BDA0003860602100000564
R2/1)上由多孔(holey)碳膜支撑的玻璃化冰中。在-180℃下用Leica EM GP在液态乙烷中进行玻璃化。将网格在液氮下储存直至转移到电子显微镜以进行成像。用Zeiss
Figure BDA0003860602100000565
120在液态N2冷冻条件下在多孔碳涂层的铜网格上进行冷冻TEM成像。在120kV加速电压下使用显微镜，并用Gatan
Figure BDA0003860602100000566
ccd相机获取图像。以多个标度(scale)获取每个网格的图像以评估试样的总体分布。
实施例2：包含pSarc的RNA脂质纳米粒的产生
使用基于氨基酸的多肽脂质-聚肌氨酸缀合的脂质来制备mRNA脂质纳米粒。
通过将包含摩尔比为40:50-X:10:X的脂质DODMA、胆固醇、DSPC和C14pSarc20的乙醇相与3体积的在柠檬酸盐缓冲液(100mM pH 5.4)中的0.15mg/mLRNA混合来制备LNP。
表1：用不同摩尔分数(％)的C14pSarc20制备的RNA脂质纳米粒的物理化学表征。
Figure BDA0003860602100000571
图1示出了聚肌氨酸化LNP的颗粒尺寸与摩尔分数之间的关系。脂质纳米粒使用包含摩尔分数提高的C14PSarc20的脂质混合物制造。在合适的条件下，可获得胶体稳定的颗粒。尽管在非常低的PSarc分数(0.5和1％)的情况下没有形成可测量尺寸的颗粒，但在2.5mol％和高于2.5mol％下，获得了具有离散尺寸和低多分散性指数的颗粒。可通过改变PSarc分数来精确地微调颗粒尺寸。颗粒尺寸从约200至250nm(PSarc为2.5mol％)单调降低至约50nm(PSarc为20mol％)。
实施例3：具有不同肌氨酸聚合单元长度的pSarc-脂质的颗粒
通过将一体积的包含摩尔比为40:45:10:5的脂质DODMA、胆固醇、DSPC和具有不同聚合物长度的C14pSarcX(X＝11、20、34或65)的乙醇相与3体积的在柠檬酸盐缓冲液(100mMpH 5.4)中的0.15mg/mL RNA混合来制备LNP。
表2：用5摩尔分数(％)的具有不同聚合长度的C14pSarc制备的RNA脂质纳米粒的物理化学表征。
Figure BDA0003860602100000581
图2示出了用于LNP形成的PSarc脂质的聚肌氨酸长度(聚合单元)与不同细胞系中萤光素酶编码mRNA LNP的体外蛋白质表达之间的关系。在肺肿瘤细胞(TC-1)肌细胞(C2C12)、肝细胞(Hep-G2)和巨噬细胞(RAW 264.7)中测试了用编码萤光素酶的mRNA配制的LNP。在转染之后24小时，测量生物发光信号。独立于细胞系，聚肌氨酸中聚合单元数目的提高没有导致蛋白质表达水平的降低，如通常针对PEG-脂质所观察到的那样。
图3示出了包含恒定分数的PSarc脂质(5％)的LNP的体内效力，其中聚肌氨酸长度在11至65个单元之间变化。将用编码萤光素酶的mRNA配制的LNP静脉内注射到小鼠(10μgRNA，n＝3)中。测量体内和离体生物发光。在所有情况下，均在肝中发现最强的信号。在图中示出了来自在注射之后6小时提取的肝的离体测量的数据。没有确定聚肌氨酸长度对肝中蛋白质表达水平的显著影响。这允许在不降低转染效率的情况下使用广泛多种尺寸的PSarc对颗粒进行工程化。
实施例4：聚肌氨酸-脂质端基的影响
通过将一体积的包含摩尔比为40:50-x:10:x的脂质DODMA、胆固醇、DSPC和具有不同端基(NH2、COOH和C2H3O)的C14pSarc20的乙醇相与3体积的在柠檬酸盐缓冲液(100mM pH5.4)中的0.15mg/mLRNA混合来制备LNP。
表3：用不同摩尔分数(％)的具有3个不同端基的C14pSarc20制备的RNA脂质纳米粒的物理化学表征。
Figure BDA0003860602100000591
图4示出了不同聚肌氨酸端基对颗粒尺寸和ζ电位的影响。在直接比较中测试了由20个具有胺基、羧化端基或乙酰化端基的重复单元组成的PSarc。所有其他制剂参数均维持恒定。成功形成了具有所有受试端基的LNP，其中PSarc分数与颗粒特征(尺寸和ζ电位)之间的相关性类似。
图5示出了包含如图4中所述的具有不同端基的聚肌氨酸脂质的LNP的体外表征。使用摩尔分数为5％且长度为20个单元的PSarc脂质。在肝细胞(Hep-G2)、巨噬细胞(RAW264.7)、肌细胞(C2C12)和胚胎肾细胞(HEK 293T)中测试了用编码萤光素酶的mRNA配制的LNP。在转染之后24小时，测量生物发光信号。对于所有LNP和细胞系均获得了生物发光信号。对于所有端基，信号强度作为细胞系的函数的依赖性均类似。
图6示出了用如图4和5中所述的不同端基配制的LNP的体内效力。使用摩尔分数为5％且长度为20个单元的PSarc脂质。静脉内注射用编码萤光素酶的mRNA配制的LNP(10μgRNA，n＝3)。测量体内和离体生物发光。在所有情况下，均在肝中发现最强的信号。在图中示出了来自在注射之后6小时提取的肝的离体测量的数据。对于所有端基均确定了类似的信号强度，表明所有端基均适合于在体内获得类似的高转染。
实施例5：具有多种阳离子脂质的PSarc RNA脂质纳米粒的制备
以下实验的结果证明了聚肌氨酸形成具有不同类型的阳离子部分的RNA脂质纳米粒的通用性。
表4.用不同阳离子部分以及非常规摩尔比的DOPE制备的聚乙二醇化或聚肌氨酸化RNA脂质纳米粒的物理化学表征。
Figure BDA0003860602100000601
Figure BDA0003860602100000602
实施例6：pSarc-脂质体和RNA-脂质复合物
以下实验的结果表明，包含聚肌氨酸缀合的脂质适合于脂质体和隐形RNA-脂质复合物的形成。在适当的条件下，配制具有高转染效率的小颗粒。
通过在搅拌下将600μl总脂质为75mM的脂质乙醇溶液(包含阳离子脂质、辅助脂质和pSarc或PEG)注射到总体积为14.4ml的水中持续30分钟来制备pSarc-脂质体。然后将脂质体以N/P为4添加至水中的RNA，随后迅速涡旋形成pSarc-LPX。
图7示出了聚乙二醇化和聚肌氨酸化对脂质体尺寸的作用。脂质体用单独的DOTMA和DOPE(2:1mol/mol)来制备，或者使用包含摩尔分数为2％的pSar或PEG-脂质的脂质混合物。尽管PEG和pSarc二者均导致测量尺寸的显著降低，但是多分散性指数更高(多峰)。
图8示出了使用如图7中所述的包含PEG和PSarc的脂质体的脂质复合物形成。由所有三种类型的脂质体(单独的DOTMA和DOPE(2:1mol/mol)，或者包含摩尔分数为2％的pSarc或PEG-脂质)形成了具有有限尺寸和低多分散性指数的脂质复合物。与其中PDI值大的脂质体前体相比，来自聚乙二醇化和聚肌氨酸化脂质体的脂质复合物出人意料地显示出低的多分散性指数。这表明具有高多分散性指数的pSarc脂质体也可适合于形成良好限定的RNA-脂质复合物，其具有相当小的50nm尺寸和约0.2的PDI。
图9描述了由脂质体构成的脂质复合物的体外表征，所述脂质体由单独的DOTMA和DOPE(2:1mol/mol)或者包含摩尔分数为2％的pSarc或PEG-脂质的相同脂质混合物组成。在肝细胞(Hep-G2)中测试用编码萤光素酶的mRNA配制的脂质复合物。在转染之后24小时，测量生物发光信号。尽管聚乙二醇化显著降低了信号，但这种降低在存在PSarc的情况下要不明显得多。PSarc显示出比PEG降低转染效力的程度要小得多。
图10描述了由脂质体构成的脂质复合物的体外表征，所述脂质体由单独的DOTMA和DOPE(2:1mol/mol)或者包含摩尔分数为2％的pSarc或PEG-脂质的相同脂质混合物组成。在肌细胞(C2C12)中测试用编码萤光素酶的mRNA配制的脂质复合物。在转染之后24小时，测量生物发光信号。尽管聚乙二醇化显著降低了信号，但这种降低在存在PSarc的情况下要不明显得多。PSarc显示出比PEG降低转染效力的程度要小得多。
实施例7：pSarc颗粒的进一步测试
图11示出了制剂中颗粒尺寸与聚肌氨酸链长度和摩尔比之间的关系。虽然在短聚肌氨酸链长度下，仅在较高摩尔比的情况下才可形成颗粒，但是在长聚肌氨酸链长度下，在摩尔比为1％下可形成颗粒。一般来说，颗粒尺寸随制剂中存在的聚肌氨酸链长度或摩尔比的提高而降低。
图12举例说明了聚肌氨酸化脂质纳米粒的散射曲线(SAXS)。用具有不同链长度(11至34个单元)和不同摩尔比(2.5至10％)的聚肌氨酸配制LNP。LNP散射曲线表明LNP的特征在于低的内部组织，其随pSar链长度或摩尔比的提高而降低。两个峰的存在表明单独的脂质双层的形状因素(form factor)正在做出相当大的贡献。
图13示出了通过Quant-It Ribogreen测定评价的RNA可及性。PSarc-LNP示出独立于聚肌氨酸链长度和摩尔比的高的RNA可及性。
图14是由不同剂量的EPO(促红细胞生成素)编码mRNA的静脉内施用获得的，所述mRNA被加载到用PSarc或PEG缀合脂质配制的LNP中。在3、6、24和48小时之后抽取血浆，并通过ELISA量化EPO蛋白。结果表明，聚肌氨酸可直接替代其他隐形部分(如PEG缀合的脂质)而不损害效力。PSarc甚至可促进持续的蛋白质分泌，这将是蛋白质替代治疗的优势。
图15示出了作为肝毒性的早期标志物的肝酶的释放。在注射用链长度提高的PSarc配制的LNP之后6和24小时，在血清中测量肝酶如丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)以及LDH。数据表明，PSarc链长度提高没有触发任何肝酶的释放(水平线示出对于健康小鼠获得的值的范围)，表明该基于生物的聚合物是使用安全的。
图16举例说明了在理论人血浆浓度下通过聚乙二醇化和聚肌氨酸化LNP的C3a复合物的补体的活化。将脂质制剂和对照(阳性和阴性)与人血清以20:80(样品:血清)的比例在37℃下一起孵育1小时。
数据显示，与较高剂量(即建议人剂量的五倍)的PEG-LNP相比时，具有PSarc-LNP的C3a复合物的水平降低。与PBS(制剂缓冲液)相比，较低剂量没有触发C3a复合物的形成。这些结果表明，PSarc的免疫原性可比PEG缀合的脂质的免疫原性小。
图17示出了用相应mol％为40:45:10:5的DODMA：胆固醇：DSPC：PSarc 23配制的LNP的冷冻-TEM图像。聚肌氨酸化LNP的形态由小的多层囊泡组成，在该多层囊泡中mRNA可驻留在紧密并置的双层之间的界面处。比例尺＝200nm。
总之，结果再次证明pSarc是用于配制小RNA纳米粒以用于有效RNA递送的独立于方法的通用平台。
实施例8：包含聚肌氨酸和阳离子脂质BNT9的RNA颗粒
方法：
用于制备脂质纳米粒的方案
使用微流控混合装置NanoAssemblrTM Benchtop Instrument(PrecisionNanoSystems,Vancouver,BC)，通过将包含脂质的乙醇相与包含RNA的水相混合来制备脂质纳米粒。通过微流控盒将一体积的包含总脂质为13.5mM的脂质混合物的乙醇与3体积的在柠檬酸盐缓冲液(100mM pH 5.4)中的0.15mg/mL的RNA以12mL/分钟的组合流量混合。将所得混合物与2体积的柠檬酸盐缓冲液(100mM，pH 5.4)直接混合。如果没有另外提及，则将颗粒在10K MWCO透析盒(Slide-A-Lyser,ThermoFisher Scientific)中针对磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析2.5小时。然后通过使用
Figure BDA0003860602100000631
超离心过滤器(30kDa NMWL,MerckMillipore)进行超滤使颗粒重浓缩至理论RNA浓度为约0.2至0.5mg/mL。将制剂在4℃下储存不多于1周。在体外测试或体内注射之前，将脂质纳米粒在PBS中溶解至期望的RNA浓度。
颗粒尺寸测量
通过动态光散射测量脂质纳米粒的颗粒尺寸和多分散性(PDI)。将制剂在PBS中稀释至最终RNA浓度为0.005mg/mL。在96孔板中一式两份测量120μL稀释的样品。通过来自WYATT technology GmbH(Dernbach,Germany)的DynaPro读板仪II仪器来测量尺寸。
ζ电位(电泳迁移率)的测量
将RNA脂质纳米粒在1ml 0.1×PBS中稀释至RNA浓度为0.01mg/mL。在塑料比色皿中制备每种制剂的三个1.05ml样品。用ζ-Wallis仪器(Corduan technologies,France)通过激光多普勒电泳测量颗粒的电泳迁移率。每个样品使用具有1个10次运行序列的中等分辨率测量。从最终分析中排除具有低信噪比或极端迁移率μ(>3或<-3μm*cm/V*S)的测量。
用于RNA可及性和总RNA浓度的RiboGreen测定
RNA脂质纳米粒始终以约0.2至0.5mg/mL RNA的最终浓度浓缩。Quant-iTRiboGreen RNA测定(Thermo Fischer Scientific)用于量化RNA可及性以及制剂中的总RNA浓度。简言之，使用RNA结合染料RiboGreen通过比较在存在和不存在2％Triton X-100的情况下样品之间的荧光来确定包封效率。在不存在洗涤剂的情况下，荧光可从仅可获得的游离RNA测量，而在存在洗涤剂的情况下，荧光从总RNA量测量。在存在洗涤剂Triton X-100的情况下样品的荧光也用于基于校准曲线计算总RNA浓度。
将脂质纳米粒样品或PBS(阴性对照)用1×TE缓冲液(Thermo Fisher Scientist)稀释低至mRNA浓度为2至5μg/mL。
将每个稀释的样品的等分试样进一步在1×TE缓冲液(测量可获得的mRNA)中1:1稀释或者在包含2％Triton-X100的1×TE缓冲液(测量可在颗粒内获得的mRNA和游离mRNA二者的总mRNA)中1:1稀释。一式两份制备样品。将样品在37℃下孵育10分钟以确保充分的脂质解离。然后将Quant-iT RiboGreen RNA试剂(来自TE缓冲液中的储备溶液的1:100稀释物)1.1添加至每个样品，并在485nm的激发波长和535nm的发射波长下测量染料的荧光(Tecan Infinite M200 Pro多模式读板仪)。
如下确定RNA可及性：
Figure BDA0003860602100000641
使用RNA校准曲线在含有2％Triton X-100的1×TE缓冲液中确定总RNA浓度。
细胞转染
将细胞以20 000个细胞/孔(对于HepG2)的浓度接种到白色96孔板(平底)中。将细胞维持在37℃和5％CO2下。在18至24小时之后，将上清液弃去并替换为90μL补充有10％未灭活FCS的相应培养基。在PBS中将制剂稀释至最终浓度为1至10μg/mL。然后将10μl脂质纳米粒溶液添加至细胞以获得100μl的最终培养基体积。将板在室温下以500g离心5分钟。在与细胞一起孵育24小时之后，根据手册说明进行ONE-GloTM+Tox萤光素酶报道基因和细胞生存力测定(Cat.#E7110,Promega GmbH,Mannheim,Germany)。使用Tecan Infinite M200Pro多模式读板仪测量生物发光信号(RLU)和荧光。通过减去未转染细胞的背景(使用PBS作为空白)来计算萤光素酶表达。如下计算生存力：
生存力％＝[(RLU样品-RLU空白)/(RLU PBS-RLU空白)]×100
生物发光成像研究
将小鼠用2.5％异氟烷麻醉。之后，用预先配备有尺寸为30G的套管的胰岛素注射器将200μl的与2μg萤光素酶编码mRNA复合的LNP静脉内注射到眶后窦中。观察小鼠直至其恢复对疼痛、痛苦和窘迫迹象的意识。在测量时(给药之后6小时和24小时)用D-萤光素溶液以100mg/kg体重对小鼠进行腹膜内注射。随后，将小鼠用异氟烷麻醉并置于
Figure BDA0003860602100000651
Spectrum(Perkin Elmer)成像室内的热垫(37℃)上，通过单独的麻醉面罩恒定供应异氟烷/氧气。在注射萤光素之后5分钟，进行通过照相机在一分钟内检测生物发光。然后通过颈伸长处死小鼠，收集器官，如肝、肺、脾、心脏、肾、脑、淋巴结，并用
Figure BDA0003860602100000652
Spectrum成像装置再次进行离体测量。使用软件“LivingImage”(Perkin Elmer)对所得图像进行分析。在器官周围绘制目的区域(ROI)以量化光子的总通量[p/s]。
Epo水平
将小鼠用2.5％异氟烷麻醉。之后，用预先配备有尺寸为30G的套管的胰岛素注射器将200μl的与3μg EPO编码mRNA复合的LNP静脉内注射到眶后窦中。观察小鼠直至其恢复对疼痛、痛苦和窘迫迹象的意识。在各时间点之后，通过尾静脉收集血液并通过以13,000×g离心3分钟来分离血浆。使用ELISA测定(小鼠促红细胞生成素
Figure BDA0003860602100000653
ELISA Cat#DY959，R&D Systems，UK)测量血浆EPO水平。
Tox实验
在麻醉之后，对小鼠以RNA浓度为30、3μg进行四次静脉内注射加载mRNA的LNP，每周一次。在第四次注射之后48小时之后，将血液抽取到Microvette 500Capillary BloodCollection Tube Serum-Gel(Sarstedt Inc,Fisher Scientific,USA)中。通过将全血以10000×g离心3分钟获得血清。通过IndikoTM(Thermo Scientific)测量ALT、AST、LDH和总胆红素。
全血测定
将来自三个健康供体的人全血收集在Li-肝素真空采血管(BD
Figure BDA0003860602100000661
Li-heparin，Becton Dickinson GmbH)中。用包含10％FBS(热灭活)的RPMI培养基(RPMI 1640–GlutaMAXTM–I，Thermo Fisher Scientific)将全血稀释4×，并以180μL/孔置于平底96孔板中。然后，将20μL对照或理论血浆浓度为0.0125mg/mL的LNP添加至全血，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。分别以10mM和20ng/mL的测定浓度添加阳性对照例如瑞喹莫德(R848)(Sigma-Aldrich)和LPS(Lipossacharide)(Invivogen)。然后收集血浆并储存在-80℃下直至分析。使用Luminex(Bio-rad,Bio-Plex 200)和Cytokine Human UltrasensitiveMagnetic 10-Plex Pane(Thermo Fisher Scientific)测量细胞因子水平，分析包括：GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α。
实验结果
为了优化LNP效力，分别使用数种可电离阳离子脂质与胆固醇、磷脂1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)和Psar23组合以40:45:10:5的摩尔比来制备LNP。LNP用萤光素酶编码mRNA来配制，并在体外和体内进行了测试。表明萤光素酶表达的结果在图18(体外)和19(体内)中示出。
图18和19中示出的结果表明了配制成Psar-LNP的不同可电离阳离子脂质(其结构在图26中示出)的效力。与原始DODMA以及标准MC3脂质相比，包含BNT9的Psar-LNP在HepG2细胞系中显示出更高的萤光素酶。当将Psar-LNP静脉内注射到小鼠中时，观察到了类似的趋势，其中BNT9在肝中表现出更高的萤光素酶表达。
此外，将与作为隐形脂质的Psar组合的BNT9的潜力与包含PEG部分(例如，PEG-DMG和C16PEG2000神经酰胺)的制剂进行了比较。表5中示出了受试制剂。
表5.LNP的物理化学和结构表征。通过将包含mRNA的水相和分别包含以下的乙醇相混合来制备脂质纳米粒：摩尔比为40:48-Y:10:Y的可电离脂质(BNT9)、磷脂1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇-20001,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DSPC)、胆固醇和隐形组分。使用了以下隐形组分(Y)：1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油基-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG-DMG)(1.5％)、N-棕榈酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰基[甲氧基(聚乙二醇)2000]}(C16 PEG2000神经酰胺)(2％)和聚肌氨酸(PSar 23)(5％)。
Figure BDA0003860602100000671
表5示出了用不同接枝部分，即Psar、PEG-DMG和C16 PEG2000神经酰胺制备的LNP的物理化学表征。该数据表明Psar-LNP表现出与聚乙二醇化制剂类似的颗粒特征，但RNA可及性除外。与其他受试制剂相比，PSar-LNP显示出显著更高的RNA可及性。
为了进一步研究这些制剂的效力，静脉内或肌内注射如表5中示出的复合到LNP中的Epo编码mRNA，并确定EPO血浆水平。结果在图20(静脉内)和图21(肌内)中示出。
图20和图21中示出的结果显示了加载有EPO编码mRNA的不同接枝脂质纳米粒的翻译动力学。在静脉内和肌内施加下，所有接枝脂质纳米粒均促进EPO分泌，其中PSar-LNP促进比聚乙二醇化LNP更高的蛋白质表达。
在进一步的实验中，在多次注射之后将Psar-LNP的毒性与PEG-LNP的毒性进行了比较。研究了整体毒性生物标志物，即肝酶例如丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)和总胆红素。结果在图22中示出。
图22中示出的结果表明了将接枝LNP以mRNA浓度为30、3和0.3μg的mRNA四次IV注射到健康Balb/C小鼠中之后的肝酶谱。Psar接枝LNP诱导较低的肝酶释放，因此表明更安全的谱。
在进一步的实验中，使用全血测定在体外研究促炎细胞因子谱。脂多糖(LPS)和瑞喹莫德(R-848)用作阳性对照。PBS用作阴性对照和载剂缓冲液。结果在图23中示出。
图23中示出的结果表明，与用PEG配制的那些相比，PSar-LNP诱导更低的促炎细胞因子分泌，因此表明更安全的谱。
图24表明了包含不同隐形部分的PSAR LNP和PEG LNP的高生物分布和效力。
图25示出了包含不同隐形组分的加载mRNA的LNP的翻译动力学。与PEG-DMG和C16PEG2000 LNP的血浆水平相比，由PSAR LNP诱导的EPO血浆水平更高并且在时间上保持更恒定。
实施例9：包含聚肌氨酸的RNA颗粒的肌内施用
实施例9.1.方法
用于制备脂质纳米粒的方案
使用微流控混合装置NanoAssemblrTM Benchtop Instrument(PrecisionNanoSystems,Vancouver,BC)，通过将包含脂质的乙醇相与包含RNA的水相混合来制备脂质纳米粒。通过微流控盒将一体积的包含总脂质为13.5mM的脂质混合物的乙醇与3体积的在柠檬酸盐缓冲液(100mM pH 5.4)中的0.15mg/mL的RNA以12mL/分钟的组合流量混合。将所得混合物与2体积的柠檬酸盐缓冲液(100mM，pH 5.4)直接混合。将LNP溶液在10K MWCO透析盒(Slide-A-Lyser,ThermoFisher Scientific)中针对磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析2.5小时。然后通过使用
Figure BDA0003860602100000681
超离心过滤器(30kDa NMWL,Merck Millipore)进行超滤使颗粒重浓缩至理论RNA浓度为约0.2至0.5mg/mL。将制剂在4℃下储存不多于1周。
生物发光成像研究
对用2.5％异氟烷麻醉的小鼠用脂质制剂以mRNA剂量为1μg进行肌内注射(双腿)。观察小鼠直至其恢复对疼痛、痛苦和窘迫迹象的意识。在测量时(9天内)，用D-萤光素溶液以100mg/kg体重对小鼠进行腹膜内注射。随后，将小鼠用异氟烷麻醉并置于
Figure BDA0003860602100000682
Spectrum(Perkin Elmer)成像室内的热垫(37℃)上，通过单独的麻醉面罩恒定供应异氟烷/氧气。在注射萤光素之后5分钟，进行通过照相机在一分钟内检测生物发光。使用软件“LivingImage”(Perkin Elmer)对所得图像进行分析。在注射区域周围绘制目的区域(ROI)以量化光子的总通量[p/s]。
免疫原性研究
HA疫苗接种
对用2.5％异氟烷麻醉的小鼠用LNP制剂以mRNA剂量为10μg通过肌内注射(双腿)进行免疫接种。观察小鼠直至其恢复对疼痛、痛苦和窘迫迹象的意识。在免疫接种之后50天收集血液样品。
IgG ELISA
使用EZ-Link Sulfor-NHS-LC-生物素化试剂盒根据供应商的方案(ThermoFisher Scientific,Germany)对重组Cf4/H1N1-HA蛋白(Life Sciences,Idstein,Germany)进行生物素化。将96孔链霉亲和素板(VWR,Darmstadt,Germany)用100ng/100μL在DPBS中稀释的生物素化HA蛋白包被，并在4℃下孵育过夜。在使用Hydrospeed板洗涤器(Tecan,
Figure BDA0003860602100000691
Switzerland)用PBS-T(在DPBS中稀释的0.05％吐温20)以300μl/孔洗涤3次之后，将板在摇动器中在37℃下用250μl 1×BB封闭1小时。重复洗涤程序，并且然后通过在板上在37℃下孵育1小时来针对HA特异性抗体对血清样品进行筛选。在孵育并包括测定对照之后，将板与经HRP标记的第二抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)抗体一起在37℃下孵育另外45分钟，随后。施加3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，一种底物(BIOTREND,Cologne,Germany)。监测比色检测，并在微板阅读仪Infinite M200 PRO(Tecan,
Figure BDA0003860602100000692
Switzerland)中读取450nm处的光密度，相对于620nm的波长参考进行计算(Δ450-620nm)。
病毒中和测试
将血清与限定量的A/California/04/2009病毒一起孵育，随后用病毒-血清混合物接种MDCK-II-病毒细胞，持续3天。随后在经典血细胞凝集测定(hemagglutinationassay，HAI)中分析感染细胞的上清液，并检测到未被小鼠血清中的抗体灭活的感染性子代病毒。
为了确定动物血清中抗HA的中和抗体的水平，根据流感实验室诊断和病毒学监测手册(Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance ofinfluenza)(WHO全球流感监测网络)进行VNT。将从1:10开始进行系列稀释的血清样品与100TCID50的感染性流感病毒(A/California/04/2009)一起孵育2小时。如果没有指明使用了延长滴定方案，则最终血清稀释度和因此该测定的检测上限为1:1280(从96孔板的A行滴定至H行)。然后将血清-病毒混合物施加到在Greiner U底96孔板(Greiner Bio-One GmbH,Frickenhausen,Germany)中的汇合MDCK单层上并孵育另外3天。随后将50μl上清液与50μl0.5％鸡RBC(Lohmann Tierzucht GmbH,Cuxhaven,Germany)一起孵育，并评价RBC凝集。将VNT滴度记录为抑制凝集的最低稀释度的倒数(VNT/50μl)。如果使用延长滴定方案(从96孔板的孔1至12滴定)，则血清样品已被滴定直至最终检测限为1:10240。
酶联免疫斑点测定(ELISpot)
对于IFN-γELISpot测定，将预包被的96孔板(mAb AN18；Mabtech,Nacka Strand,Sweden)用300μl无菌DPBS洗涤3次，并用RPMI培养基(200μl/孔)在37℃下调节1小时。之后，每孔接种5×105个新鲜分离的脾细胞，并用6μg/ml进行刺激，其中肽伴刀豆球蛋白A(SigmaAldrich,St.Louis,Missouri,U.S:)(2μg/ml)和6μg/ml的AH1(JPT,Berlin,Germany)分别用作阳性和阴性对照。在37℃下和5％CO2下过夜培养之后，弃去细胞悬液，并将板用300μl未灭菌DPBS洗涤3次。通过添加50μl/孔的在补充有0.5％BSA的DPBS中稀释至1μg/ml的生物素化INF-γ抗体R4-6A2(Mabtech,Nacka Strand,Sweden)，并在37℃下孵育2小时来检测细胞因子分泌。在用300μl DPBS洗涤6次之后，添加100μl/孔的在补充有0.5％BSA的DPBS中1/1000v/v稀释的链霉亲和素-ALP(Mabtech,Nacka Strand,Sweden)，并在室温下在黑暗中孵育1小时。将板洗涤六次，并以100μl/孔添加BCIP/NBT(Mabtech,Nacka Strand,Sweden)溶液。在5分钟之后，通过用水彻底洗涤来终止反应。使用CTLImmunospot S6 Macro分析仪(CTL,Shaker Heights,OH,USA)捕获单个孔的图像，并使用ImmunoSpot软件(CTL,ShakerHeights,OH,USA)分析斑点数目和尺寸。
EPO水平
对用2.5％异氟烷麻醉的小鼠用200μl的LNP制剂以mRNA剂量为3μg进行静脉内注射(眶后窦)。观察小鼠直至其恢复对疼痛、痛苦和窘迫迹象的意识。在各时间点之后，通过尾静脉收集血液并通过以13,000×g离心3分钟来分离血浆。使用ELISA测定(小鼠促红细胞生成素
Figure BDA0003860602100000701
ELISA Cat#DY959，R&D Systems，UK)测量血浆EPO水平。
实施例9.2.在本实验中，测定了与具有PEG-DMG或C16PEG2000神经酰胺的PEG部分相比，pSar LNP制剂用于肌内递送mRNA的潜力。为了研究蛋白质表达的生物分布，通过商业微流控技术使用DODMA:Chol:DOPE:C16 PEG cer(40:48:10:2)、DODMA:Chol:DOPE:pSar23(40:47.5:10:2.5)和DODMA:Chol:DOPE:PEG-DMG(40:48.5:10:1.5)以N/P为4配制萤光素酶编码mRNA。将mRNA-LNP制剂肌内注射到BalB/C中。
图27和28表明了不同接枝脂质介导蛋白质表达的效力。包含pSar的制剂介导注射区域(肌肉)中的萤光素酶表达，而聚乙二醇化制剂促进注射区域、肝和脾区域中的蛋白质表达。这些结果表明，包含聚肌氨酸的LNP介导了提高的蛋白质表达，并且降低了脱靶效应。
实施例9.3.在这些实验中，将pSar LNP的免疫原性潜力与聚乙二醇化制剂进行了比较。为此，通过商业微流控技术使用DODMA:Chol:DOPE:C16 PEG cer(40:48:10:2)、DODMA:Chol:DOPE:PEG-DMG(40:48.5:10:1.5)和DODMA:Chol:DOPE:pSar23(40:47.5:10:2.5)以N/P为4配制HA编码mRNA。将mRNA-LNP制剂肌内注射到BalB/C中。
图29、30和31示出了用于疫苗接种目的的pSar LNP的潜在免疫原性。与聚乙二醇化制剂相比，pSar制剂诱导轻微升高的IgG和中和效价，以及T细胞应答(CD8+和CD4+)。这些结果表明pSar LNP是用于疫苗接种目的的有前景的候选物。
实施例9.4.在本实验中，使用替代的可电离脂质评价了pSar LNP的效力。
通过商业微流控技术将包含BNT9:Chol:DSPC:C16 PEG cer(40:48:10:2)和BNT9:Chol:DSPC:pSar23(40:45:10:5)的制剂与鼠EPO编码mRNA以N/P为4混合。
图32表明，与聚乙二醇化制剂相比，pSar LNP介导提高的EPO分泌。

Claims (87)

1.包含多个RNA颗粒的组合物，其中每个颗粒包含：
(i)RNA；
以及
(ii)与RNA缔合以形成RNA颗粒的一种或更多种组分，
其中聚肌氨酸与所述一种或更多种组分中的至少一种缀合。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述RNA颗粒是非病毒RNA颗粒。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中与RNA缔合以形成颗粒的所述一种或更多种组分包含一种或更多种聚合物。
4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种聚合物包含阳离子聚合物。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述阳离子聚合物是含胺聚合物。
6.权利要求3至5中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种聚合物包含选自以下的一种或更多种聚合物：聚-L-赖氨酸、聚酰胺-胺、聚乙烯亚胺、壳聚糖和聚(β-氨基酯)。
7.权利要求1或2所述的组合物，其中与RNA缔合以形成颗粒的所述一种或更多种组分包含一种或更多种脂质或类脂质物质。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述一种或更多种脂质或类脂质物质包含阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质。
9.权利要求8所述的组合物，其中所述阳离子可电离脂质或类脂质物质仅在酸性pH下带正电荷并且在生理pH下不保持阳离子性。
10.权利要求8或9所述的组合物，其中所述一种或更多种脂质或类脂质物质包含一种或更多种另外的脂质或类脂质物质。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述聚肌氨酸与所述一种或更多种另外的脂质或类脂质物质中的至少一种缀合。
12.包含多个RNA-脂质颗粒的组合物，其中每个颗粒包含：
(a)RNA；
(b)阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质；以及
(c)聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。
13.权利要求12所述的组合物，其中每个颗粒还包含：
(d)非阳离子脂质或类脂质物质。
14.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述颗粒不包含聚乙二醇-脂质缀合物或聚乙二醇与类脂质物质的缀合物，并且优选地不包含聚乙二醇。
15.权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约20mol％至约80mol％。
16.权利要求13至15中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约0mol％至约80mol％。
17.权利要求12至16中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约0.25mol％至约50mol％。
18.权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述RNA是mRNA。
19.权利要求8至18中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质包含：BNT9、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)，或其混合物。
20.权利要求13至19中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质包含磷脂。
21.权利要求13至20中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质包含胆固醇或胆固醇衍生物。
22.权利要求13至21中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质包含磷脂与胆固醇或胆固醇衍生物的混合物。
23.权利要求20至22中任一项所述的组合物，其中所述磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)，或其混合物。
24.权利要求13至23中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质包含DSPC与胆固醇、DOPC与胆固醇、或DPPC与胆固醇的混合物。
25.包含多个RNA-脂质颗粒的组合物，其中每个颗粒包含：
(a)RNA；
(b)BNT9；
以及
(c)聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。
26.权利要求25所述的组合物，其中每个颗粒还包含：
(d)非阳离子脂质或类脂质物质。
27.权利要求25或26所述的组合物，其中所述颗粒不包含聚乙二醇-脂质缀合物或聚乙二醇与类脂质物质的缀合物，并且优选地不包含聚乙二醇。
28.权利要求25至27中任一项所述的组合物，其中所述BNT9占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约20mol％至约80mol％。
29.权利要求26至28中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约0mol％至约80mol％。
30.权利要求25至29中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约0.25mol％至约50mol％。
31.权利要求25至30中任一项所述的组合物，其中所述RNA是mRNA。
32.权利要求26至31中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质包含磷脂。
33.权利要求26至32中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质包含胆固醇或胆固醇衍生物。
34.权利要求26至33中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质包含磷脂与胆固醇或胆固醇衍生物的混合物。
35.权利要求32至34中任一项所述的组合物，其中所述磷脂选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)，或其混合物。
36.权利要求26至35中任一项所述的组合物，其中所述非阳离子脂质或类脂质物质包含DSPC与胆固醇、DOPC与胆固醇、或DPPC与胆固醇的混合物。
37.权利要求1至36中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸包含2至200个肌氨酸单元。
38.权利要求12至37中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(I)：
Figure FDA0003860602090000041
39.权利要求12至38中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(II)：
Figure FDA0003860602090000042
其中R1和R2之一包含疏水基团，并且另一个是H、亲水基团或任选地包含靶向部分的官能团。
40.权利要求12至39中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(III)：
Figure FDA0003860602090000051
其中R是H、亲水基团或任选地包含靶向部分的官能团。
41.权利要求1至40中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物，及其混合物。
42.权利要求1至41中任一项所述的组合物，其中所述颗粒是纳米粒。
43.权利要求1至42中任一项所述的组合物，其中所述颗粒包含纳米结构的核心。
44.权利要求1至43中任一项所述的组合物，其中所述颗粒的尺寸为约30nm至约500nm。
45.权利要求1至44中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-缀合物抑制所述颗粒的聚集。
46.用于将RNA递送至对象的细胞的方法，所述方法包括向对象施用权利要求1至45中任一项所述的组合物。
47.用于将治疗性肽或蛋白质递送至对象的方法，所述方法包括向对象施用权利要求1至45中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码所述治疗性肽或蛋白质。
48.用于在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用权利要求1至45中任一项所述的组合物，其中将所述RNA递送至所述对象的细胞有益于治疗或预防所述疾病或病症。
49.用于在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用权利要求1至45中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码治疗性肽或蛋白质，并且其中将所述治疗性肽或蛋白质递送至所述对象有益于治疗或预防所述疾病或病症。
50.权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
51.权利要求50所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
52.用于肌内施用的组合物，其包含含有以下的RNA-脂质颗粒：
(a)RNA；
(b)阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质；
(c)磷脂；
(d)胆固醇；以及
(e)聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物。
53.权利要求52所述的组合物，其中所述颗粒不包含聚乙二醇-脂质缀合物或聚乙二醇与类脂质物质的缀合物，并且优选地不包含聚乙二醇。
54.权利要求52或53所述的组合物，其中所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约30mol％至约60mol％。
55.权利要求52至54中任一项所述的组合物，其中所述磷脂占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约5mol％至约30mol％。
56.权利要求52至55中任一项所述的组合物，其中所述胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约30mol％至约60mol％。
57.权利要求52至56中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物占所述颗粒中存在的总脂质和类脂质物质的约1mol％至约10mol％。
58.权利要求52至57中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质包含：BNT9、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)，或其混合物。
59.权利要求52至58中任一项所述的组合物，其中所述磷脂选自磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。
60.权利要求52至59中任一项所述的组合物，其中所述磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、二木脂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)和棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)。
61.权利要求52至60中任一项所述的组合物，其中所述磷脂选自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
62.权利要求52至61中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸包含2至200个肌氨酸单元。
63.权利要求52至62中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸包含10至100个肌氨酸单元。
64.权利要求52至63中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸包含20至50个肌氨酸单元。
65.权利要求52至64中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸包含约23个肌氨酸单元。
66.权利要求52至65中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(I)：
Figure FDA0003860602090000071
67.权利要求52至66中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(II)：
Figure FDA0003860602090000081
其中R1和R2之一包含疏水基团，并且另一个是H、亲水基团或任选地包含靶向部分的官能团。
68.权利要求52至67中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含以下通式(III)：
Figure FDA0003860602090000082
其中R是H、亲水基团或任选地包含靶向部分的官能团。
69.权利要求52至68中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物包含下式：
Figure FDA0003860602090000083
其中n为23。
70.权利要求52至65中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与类脂质物质的缀合物是选自以下的成员：聚肌氨酸-二酰甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物，及其混合物。
71.权利要求52至70中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质是DODMA并且所述磷脂是DOPE或DSPC。
72.权利要求52至70中任一项所述的组合物，其中所述阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质是BNT9并且所述磷脂是DOPE或DSPC。
73.权利要求52至72中任一项所述的组合物，其中所述RNA是mRNA。
74.权利要求52至73中任一项所述的组合物，其中所述颗粒是纳米粒。
75.权利要求52至74中任一项所述的组合物，其中所述颗粒包含纳米结构的核心。
76.权利要求52至75中任一项所述的组合物，其中所述颗粒的尺寸为约30nm至约500nm。
77.权利要求52至76中任一项所述的组合物，其中所述聚肌氨酸-缀合物抑制所述颗粒的聚集。
78.用于将RNA递送至对象的细胞的方法，所述方法包括向对象肌内施用权利要求52至77中任一项所述的组合物。
79.用于在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象肌内施用权利要求52至77中任一项所述的组合物，其中将所述RNA递送至所述对象的细胞有益于治疗或预防所述疾病或病症。
80.用于将治疗性肽或蛋白质递送至对象的方法，所述方法包括向对象肌内施用权利要求52至77中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码所述治疗性肽或蛋白质。
81.用于在对象的肌肉中表达治疗性肽或蛋白质的方法，所述方法包括向对象肌内施用权利要求52至77中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码所述治疗性肽或蛋白质。
82.用于在对象中治疗或预防疾病或病症的方法，所述方法包括向对象肌内施用权利要求52至77中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码治疗性肽或蛋白质，并且其中将所述治疗性肽或蛋白质递送至所述对象有益于治疗或预防所述疾病或病症。
83.权利要求78至82中任一项所述的方法，其中所述RNA编码疫苗肽或蛋白质。
84.权利要求83所述的方法，其中所述疫苗肽或蛋白质是来自感染原的肽或蛋白质或者其免疫学上等同的片段或变体。
85.权利要求78至84中任一项所述的方法，其是用于肌内疫苗接种的方法。
86.权利要求78至85中任一项所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。
87.权利要求86所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
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