CN115297875A

CN115297875A - 治疗炎症性肠病的方法ii

Info

Publication number: CN115297875A
Application number: CN202180020526.4A
Authority: CN
Inventors: S·伊茨库
Original assignee: Mesoblast International SARL
Current assignee: Mesoblast International SARL
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2021-03-11
Publication date: 2022-11-04
Also published as: BR112022018022A2; EP4117623A1; WO2021180851A1; US20230104108A1; CA3170918A1; AU2021235055A1; JP2023517641A; KR20220152240A

Abstract

本公开涉及治疗或预防有需要的受试者的炎症性肠病(IBD)的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物。

Description

治疗炎症性肠病的方法II

发明领域

本公开涉及用于治疗或预防有需要的受试者的炎症性肠病(IBD)的方法。

背景

炎症性肠病(IBD)是一种使人衰弱的复发性病况，其首先出现在青年期，并可能影响患者的一生。IBD涵盖了一组胃肠道发炎的病症。IBD的主要类型包括克罗恩氏病(Crohn’s disease)，其中炎症影响胃肠道任何地方的肠道壁的全部厚度，以及溃疡性结肠炎，其中炎症影响结肠和直肠的内层(粘膜)。

克罗恩氏病影响了美国近两百万人和全世界另外数百万人，并且由于未知原因，发病率继续增加。自2006年FDA批准英夫利昔单抗(infliximab)以来，单克隆抗体已成为中度至重度疾病药物治疗的基石。然而，它们的效用受到原发性和继发性无反应以及严重机会性感染风险的限制。此外，生物制剂可能需要很长时间才能证明临床改善。因此，在此期间，无反应的患者可能在很大程度上未得到治疗，并且在等待评估医疗反应的同时，变得越来越营养不良、贫血并罹患疾病并发症。

因此，患有IBD和/或其相关病况或症状的患者仍然存在未满足的治疗需求，需要新的治疗选择。

发明内容

本发明人出人意料地确定，可以在患有难以用至少一种生物疗法治疗的炎症性肠病的受试者中实现早期疾病缓解(第28天)。因此，在第一实例中，本公开涉及治疗或预防有需要的人类受试者的炎症性肠病的方法，所述方法包括向受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物，其中受试者难以用至少一种生物疗法治疗。在一个实例中，受试者难以用单一生物疗法治疗。换句话说，在一个实例中，受试者难以用多种生物疗法治疗。

本发明人还出人意料地确定，与难以用多种生物制剂治疗的炎症性肠病受试者相比，难以用单一生物疗法治疗的炎症性肠病受试者具有较低水平的炎症。因此，本发明人确定，难以用多种生物制剂治疗的炎症性肠病受试者往往需要更多的间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)，然后才能使CDAI评分至少降低100分。因此，在另一实例中，本公开包括治疗或预防难以用单一生物疗法治疗的人类受试者的炎症性肠病的方法，所述方法包括向受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物，其中所述组合物包含＜6亿个细胞。

在另一实例中，本公开的方法包括以下步骤：i)选择患有难以用单一生物疗法治疗的炎症性肠病的受试者，和ii)向受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)，其中所述组合物包含＜6亿个细胞。在另一实例中，本公开的方法包括以下步骤：i)选择患有C反应蛋白(CRP)水平＜25的的炎症性肠病的受试者，和ii)向受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物，其中向受试者施用的总剂量为＜6亿个细胞。在一个实例中，所述方法包括选择CRP水平＜23的受试者。在另一实例中，所述方法包括选择CRP水平＜20的受试者。在另一实例中，所述方法包括选择CRP水平介于15与25之间的受试者。在另一实例中，所述方法包括选择CRP水平介于20与23之间的受试者。

在一个实例中，生物制剂是抗TNF疗法。在另一实例中，生物疗法是英夫利昔单抗、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、维多珠单抗(vedolizumab)或乌司奴单抗(ustekinumab)。在另一实例中，生物疗法是英夫利昔单抗或阿达木单抗。在一个实例中，受试者也难以用硫唑嘌呤、巯基嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、环孢菌素或类固醇中的一者或多者治疗。

在一个实例中，炎症性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。在一个实例中，炎症性肠病是克罗恩氏病。在一个实例中，克罗恩氏病出现在受试者的直肠和/或结肠中。在一个实例中，受试者的C反应蛋白(CRP)水平＜23。在另一实例中，受试者的C反应蛋白(CRP)水平＜20。

在另一实例中，受试者在治疗后至少28天具有部分临床和/或内窥镜反应。在另一实例中，受试者在治疗后至少28至56天具有部分临床和/或内窥镜反应。在一个实例中，部分临床反应的特征在于以下一项或多项或全部：

-C反应蛋白(CRP)减少＞25％；

-CD活动指数(CDAI)降低＜100分；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

在一个实例中，部分内窥镜反应的特征在于以下一项或两项：

-克罗恩氏病(SES-CD)的简单内窥镜评分降低＞25％且SES-CD＜50％；

-SES-CD评分为10-15。

在另一实例中，受试者在治疗后至少28天具有临床和/或内窥镜反应。在另一实例中，受试者在治疗后至少28至56天具有临床和/或内窥镜反应。在一个实例中，临床反应的特征在于以下一项或多项或全部：

-CRP减少＞50％；

-CRP正常化；

-CDAI下降≥100分；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

在一个实例中，内窥镜反应的特征在于以下一项或两项：

-SES-CD降低＞25％但＜50％；

-SES-CD评分为5-10。

在另一实例中，受试者在治疗后至少28天处于临床和/或内窥镜缓解中。在另一实例中，受试者在治疗后至少28至56天处于临床和/或内窥镜缓解中。在一个实例中，临床缓解的特征在于以下一项或两项：

-CRP正常化至＜2.87mg/L；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

在一个实例中，内窥镜缓解的特征在于以下一项或两项：

-没有粘膜溃疡；

-SES-CD评分为0-5。

在另一实例中，将组合物施用于受试者的胃肠道壁。在一个实例中，将组合物施用于受试者胃肠道壁的粘膜下层。在一个实例中，将组合物施用于受试者胃肠道壁中的炎症部位。在另一实例中，将组合物施用于受试者的结肠和/或直肠。在另一实例中，组合物通过腔内注射施用。在一个实例中，将组合物施用于受试者结肠壁的粘膜下层。在一个实例中，将组合物施用于受试者胃肠道壁中的多个部位。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)通过内窥镜施用。

在另一实例中，组合物是静脉内施用的。在一个实例中，将组合物施用于受试者的胃肠道壁并且静脉内施用。

在一个实例中，MLPSC是间充质干细胞(MSC)。在另一实例中，MLPSC是同种异体的。例如，MLPSC可以是同种异体MSC。

在一个实例中，受试者克罗恩氏病是中度至重度。在一个实例中，受试者可能具有大于300的CDAI。在一个实例中，受试者克罗恩氏病是瘘管性克罗恩氏病。

在一个实例中，本公开的方法包括施用1×10⁷至2×10⁸个细胞。例如，可施用1×10⁷至2×10⁸个细胞的三个剂量。在一个实例中，本公开的方法包括在两个、三个、四个、五个、六个或更多个部位向受试者的胃肠道壁施用1×10⁷至2×10⁸个细胞。在一个实例中，施用7.5×10⁷个细胞。在另一实例中，施用1.5×10⁸个细胞。

在另一实例中，组合物进一步包含Plasma-Lyte A、二甲亚砜(DMSO)、人血清白蛋白(HSA)。在一个实例中，组合物进一步包含Plasma-Lyte A(70％)、DMSO(10％)、HSA(25％)溶液，所述HSA溶液包含5％HSA和15％缓冲液。

在一个实例中，组合物包含大于6.68×10⁶个活细胞/mL。

附图说明

图1：在第28天达到CDAI评分150或更低的患者百分比。FAS：全部随机化，至少一次治疗，至少一次基线后评估；PP：没有重大方案事件的所有FAS。

具体实施方式

在整个本说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的引用应理解为包括那些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和复数个(即一个或多个)。

本领域技术人员将理解，本文描述的公开内容容易受到除具体描述的那些之外的变化和修改。应当理解，本公开包括所有这样的变化和修改。本公开还包括在本说明书中单独或共同提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两者或更多者。

本公开的范围不受本文描述的具体实施方案的限制，所述具体实施方案仅用于举例说明的目的。如本文所述，功能等效的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。

除非另有明确说明，否则本文公开的任何实例均应视为经适当变更后适用于任何其它实例。

除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应视为具有与本领域(例如细胞培养、分子遗传学、干细胞分化、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)普通技术人员通常所理解相同的含义。

除非另有说明，否则本公开中使用的外科技术是本领域技术人员熟知的标准程序。

获得和富集间充质谱系干细胞或前体细胞群体的方法是本领域已知的。例如，间充质谱系干细胞或前体细胞的富集群体可通过使用流式细胞术和基于使用在间充质谱系干细胞或前体细胞上表达的细胞表面标记物的细胞分选程序来获得。

本文引用或参考的所有文件，以及本文引用的文件中引用或参考的所有文件，连同本文或以引用方式并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商说明书、描述、产品规格和产品表，均特此以引用方式全部并入本文。

所选定义

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并应被视为对两种含义或任何一种含义提供明确支持。

如本文所用，除非有相反说明，否则术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选+/-5％。

在整个本说明书中，词语“包含(comprise)”或例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式将被理解为暗示包括所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤组。

除非上下文另有说明，否则如本文所用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括单数和复数个参考物。

“分离的”或“纯化的”意指已与其自然环境的至少一些组分分离的细胞。此术语包括细胞与其自然环境的总体物理分离(例如从供体中去除)。术语“分离的”包括通过例如解离改变细胞与其所直接的相邻细胞的关系。术语“分离的”不指组织切片中的细胞。当用于指细胞群时，术语“分离的”包括由本公开的分离的细胞的增殖产生的细胞群。

术语“传代(passage)”、“传代(passaging)”或“传代培养”在本公开的上下文中用于指已知的细胞培养技术，所述技术用于使细胞在培养条件下在长时间段内保持存活和生长，以便细胞数量可不断增加。一个细胞系的传代培养程度通常用“传代数”来表示，传代数一般用于指代细胞被传代培养的次数。在一个实例中，一次传代包括去除非贴壁细胞并留下贴壁的间充质谱系前体或干细胞。接着可将此类间充质谱系前体或干细胞从底物或烧瓶中解离(例如通过使用蛋白酶，如胰蛋白酶或胶原酶)，可添加培养基，可进行任选的洗涤(例如通过离心)，且接着间充质谱系前体或干细胞可重新铺板或重新接种至一个或多个总表面积更大的培养容器中。间充质谱系前体或干细胞接着可继续在培养中扩增。在另一实例中，去除非贴壁细胞的方法包括非酶处理步骤(例如用EDTA)。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞在汇合(例如约75％至约95％汇合)处或附近传代。在一个实例中，以约10％、约15％或约20％细胞/ml培养基的浓度接种间充质谱系前体或干细胞。

如在本公开的上下文中使用的术语“培养基(medium)”或“培养基(media)”包括培养中细胞周围环境的组分。设想培养基有助于和/或提供适合于允许细胞生长的条件。培养基可以是固体、液体、气体或各相和材料的混合物。培养基可包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。示例性气体培养基包括在培养皿或其它固体或半固体支持物上生长的细胞所暴露于的气相。

术语“胃肠道(gastrointestinal tract)”或“胃肠道(GI tract)”包括从口腔至肛门的人体器官系统。胃肠道包括口腔、食道、胃和肠。因此，在本公开中提及胃肠道壁包括口腔、食道、胃和肠的壁。为免生疑问，术语“肠”包括结肠和直肠。

如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括施用间充质谱系干细胞或前体细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子的群体，从而减少或消除炎症性肠病的至少一种症状。在一个实例中，治疗包括施用培养扩增的间充质谱系干细胞或前体细胞群。在一个实例中，治疗诱导部分临床和/或内窥镜反应。在一个实例中，部分临床和/或内窥镜反应在治疗后至少25天被诱导。在一个实例中，部分临床和/或内窥镜反应在治疗后至少28天被诱导。在一个实例中，部分临床和/或内窥镜反应在治疗后至少30天被诱导。在一个实例中，部分临床和/或内窥镜反应在治疗后至少35天被诱导。在另一实例中，部分临床和/或内窥镜反应在治疗后至少28至65天被诱导。在另一实例中，部分临床和/或内窥镜反应在治疗后至少28至56天被诱导。

在一个实例中，部分临床反应的特征在于以下一项或多项或全部：

-C反应蛋白(CRP)减少＞25％；

-CD活动指数(CDAI)降低＜100分；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

-克罗恩氏病的简单内窥镜评分(SES-CD)降低＞25％且SES-CD＜50％；

--SES-CD评分为10-15。

在一个实例中，治疗诱导临床和/或内窥镜反应。在一个实例中，临床和/或内窥镜反应在治疗后至少25天被诱导。在一个实例中，临床和/或内窥镜反应在治疗后至少28天被诱导。在一个实例中，临床和/或内窥镜反应在治疗后至少30天被诱导。在一个实例中，临床和/或内窥镜反应在治疗后至少35天被诱导。在另一实例中，临床和/或内窥镜反应在治疗后至少28至65天被诱导。在另一实例中，临床和/或内窥镜反应在治疗后至少28至56天被诱导。

在一个实例中，临床反应的特征在于以下一项或多项或全部：

-CRP减少＞50％；

-CRP正常化；

-CDAI下降≥100分；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

在一个实例中，内窥镜反应的特征在于以下一项或两项：

-SES-CD降低＞25％但＜50％；

-SES-CD评分为5-10。

在一个实例中，治疗诱导临床和/或内窥镜缓解。在一个实例中，临床和/或内窥镜缓解在治疗后至少25天被诱导。在一个实例中，临床和/或内窥镜缓解在治疗后至少28天被诱导。在一个实例中，临床和/或内窥镜缓解在治疗后至少30天被诱导。在一个实例中，临床和/或内窥镜缓解在治疗后至少35天被诱导。在另一实例中，临床和/或内窥镜缓解在治疗后至少28至65天被诱导。在另一实例中，临床和/或内窥镜缓解在治疗后至少28至56天被诱导。

在一个实例中，临床缓解的特征在于以下一项或多项或全部：

-CRP正常化至＜2.87mg/L；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

在一个实例中，内窥镜缓解的特征在于以下一项或两项：

-没有粘膜溃疡；

-SES-CD评分为0-5。

在一个实例中，治疗可诱导C反应蛋白(CRP)减少；CD活动指数(CDAI)降低；通过MR肠造影评估的射线照相愈合；与基线值(即对照或在施用间充质谱系干细胞或前体细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子之前)相比，克罗恩氏病的简单内窥镜评分(SES-CD)降低。

在一个实例中，治疗反应是相对于基线确定的。在一个实例中，基线是在单一生物疗法失败时或失败前后确定的水平。

如本文所用，术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”包括施用间充质谱系干细胞或前体细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子的群体，从而停止或抑制炎症性肠病的至少一种症状的发展。

术语“炎症性肠病”(IBD)在本公开的上下文中用于指胃肠道的炎症性疾病，例如溃疡性结肠炎(UC)、肠易激综合征、结肠易激综合征、克罗恩氏结肠炎和克罗恩氏病(CD)。

术语“溃疡性结肠炎(UC)”可包括轻度至中度溃疡性结肠炎。轻度至中度溃疡性结肠炎的特征可在于以下一项或多项或全部：

-溃疡性结肠炎-疾病活动指数(UC-DAI)评分为4-10；

-乙状结肠镜检查评分＞4；

-医师整体评估(PGA)评分＞2)。

“克罗恩氏病活动指数(CDAI评分)”是伊利诺伊州中西部地区卫生中心的WR Best和其同事于1976年开发的一种研究工具，用于量化克罗恩氏病患者的症状。所述指数是用于评估克罗恩氏病活动性的最广泛使用的工具(Sandborn等(2002)Gastroenterology.，122：512-530)并且由八个因素/变量组成。八个变量在用加权因子调整后相加。CDAI的组成部分和加权因子如下表所示：

总CDAI评分范围为0至大约600，其中评分越高，疾病越活跃。在一个实例中，低于150分的CDAI评分表示克罗恩氏病的“临床缓解”。在一个实例中，150至219分之间表示“活动性轻度克罗恩氏病”。在一个实例中，220至450分之间表示“活动性中度克罗恩氏病”。在一个实例中，超过450分表示“活动性重度克罗恩氏病”。

在一个实例中，治疗诱导CDAI下降≥50分。在另一实例中，治疗诱导CDAI下降≥75分。在另一实例中，治疗诱导CDAI下降≥90分。在另一实例中，治疗诱导CDAI下降≥100分。在另一实例中，治疗诱导CDAI下降≥150分。在另一实例中，治疗诱导CDAI下降50至150分。在另一实例中，治疗诱导CDAI下降75至125分。在另一实例中，治疗诱导CDAI下降90至110分。

“C反应蛋白”或“CRP”是一种炎症介质，其水平在急性炎症复发的情况下会升高，并且一旦炎症消退就会迅速恢复正常。在一个实例中，根据本公开治疗的受试者的初始CRP水平＜25。在另一实例中，受试者的初始CRP水平＜23。在另一实例中，受试者的初始CRP水平＜20。在另一实例中，受试者的初始CRP水平为18至25。在另一实例中，受试者的初始CRP水平为20至23。例如，单次生物疗法失败的受试者在根据本公开进行治疗之前可具有上述CRP水平。例如，单次生物疗法失败的受试者在根据本公开进行治疗之前可具有＜23的CRP水平。

在一个实例中，治疗使CRP相比于基线降低＞20％。在另一实例中，治疗使CRP相比于基线降低＞30％。在另一实例中，治疗使CRP相比于基线降低＞40％。在另一实例中，治疗使CRP相比于基线降低＞50％。在另一实例中，治疗使CRP相比于基线降低＞60％。在另一实例中，治疗使CRP相比于基线降低20％至60％。在另一实例中，治疗使CRP相比于基线降低30％至50％。在另一实例中，治疗将CRP降至低于2.95mg/L。在另一实例中，治疗将CRP降至低于2.87mg/L。在另一实例中，治疗使受试者的CRP水平正常化。

在一个实例中，治疗提供0-5的SES-CD评分。在另一实例中，治疗提供5-10的SES-CD评分。在另一实例中，治疗提供10-15的SES-CD评分。在另一实例中，治疗提供0-15的SES-CD评分。

在一个实例中，本公开的方法抑制受试者的疾病进展或疾病并发症。“抑制”受试者的疾病进展或疾病并发症意指预防或减少受试者的疾病进展和/或疾病并发症。

如本文所用，术语“受试者”是指人类受试者。例如，受试者可以是成年人。在另一实例中，受试者可以是儿童。在另一实例中，受试者可以是青少年。诸如“受试者”、“患者”或“个体”的术语是在本公开的上下文中可互换使用的术语。

根据本公开治疗的受试者可具有指示炎症性肠病的症状。例如，受试者可具有指示炎症性肠病的胃肠道症状。示例性胃肠道症状包括腹泻、便秘、恶心、呕吐、胀气、痉挛、腹胀、腹痛、脂肪泻、直肠出血。在一个实例中，根据本公开治疗的受试者可能出现一种或多种选自由以下组成的组的症状：疲劳、虚弱和嗜睡、缺铁、贫血、维生素和矿物质缺乏、发育停滞、青春期延迟、体重减轻、骨和关节疼痛、复发性口腔溃疡和/或口腔或舌头肿胀、精神警觉性和易怒性改变、皮疹，如皮炎、疱疹样皮疹、皮肤容易瘀伤和经常性反流。在一个实例中，受试者先前已经历至少一种抗TNF疗法失败。在一个实例中，受试者具有生物疗法的禁忌症。

在另一实例中，受试者是18-75岁。在另一实例中，受试者患有克罗恩氏病。在另一实例中，受试者患有溃疡性结肠炎。在另一实例中，受试者患有克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。在另一实例中，受试者克罗恩氏病出现在受试者的肠中。在另一实例中，受试者克罗恩氏病出现在受试者的直肠和/或结肠中。

在另一实例中，受试者患有克罗恩氏病至少6个月。在另一实例中，受试者克罗恩氏病是中度至重度。在另一实例中，受试者克罗恩氏病是瘘管性克罗恩氏病(参见例如Gecse等2013United European Gastroenterol J.，1：206-213)。

在另一实例中，受试者的CDAI大于200。在另一实例中，受试者的CDAI大于250。在另一实例中，受试者的CDAI大于300。在另一实例中，受试者的CDAI为200至450。在另一实例中，受试者的CDAI为250至400。在另一实例中，受试者的CDAI为300至400。

在另一实例中，本公开的方法预防或治疗患有活动性轻度克罗恩氏病的受试者。在另一实例中，本公开的方法预防或治疗患有活动性中度克罗恩氏病的受试者。在另一实例中，本公开的方法预防或治疗患有活动性重度克罗恩氏病的受试者。在另一实例中，本公开的方法预防或治疗患有活动性中度或重度克罗恩氏病的受试者。

在一个实例中，根据本公开的方法治疗的受试者难以用至少一种生物疗法治疗。在一个实例中，根据本公开的方法治疗的受试者难以用单一生物疗法治疗。例如，本公开的方法可用于预防或治疗患有难以用生物疗法治疗的活动性中度克罗恩氏病的受试者。例如，受试者克罗恩氏病可能难以用TNF-α拮抗剂治疗。

在某些实例中，受试者也可能难以用炎症性肠病的其它治疗来治疗。在一个实例中，受试者可能难以用至少一种生物疗法和硫唑嘌呤、巯基嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、环孢菌素或类固醇中的一者或多者治疗。在另一实例中，受试者可能难以用单一生物疗法和硫唑嘌呤、巯基嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、环孢菌素或类固醇中的一者或多者治疗。

如本文所用，术语“难治的”在本公开的上下文中用于指某种治疗，例如“生物疗法”，例如用诸如英夫利昔单抗或阿达木单抗的生物制剂进行的治疗失败或对所述治疗抵抗的受试者。在一个实例中，如果医疗管理的下一步是医疗管理的升级，则受试者难以用生物疗法治疗。在一个实例中，如果医疗管理的下一步是替代生物疗法，则受试者难以用生物疗法治疗。在另一实例中，如果医疗管理的下一步是结肠次全切除术，则受试者难以用生物疗法治疗。在一个实例中，受试者难以用单一生物疗法治疗。在此实例中，受试者没有接受过超过一种生物疗法的治疗。

在本公开的上下文中使用的术语“生物疗法”是指衍生自或合成自活的生物有机体的重组蛋白。在一个实例中，生物疗法用于治疗炎症性病况，例如炎症性肠病，例如克罗恩氏结肠炎。在一个实例中，生物疗法是抗体。例如，生物疗法可以是单克隆抗体。在另一实例中，生物疗法是抗TNF疗法。本公开所涵盖的生物疗法的实例包括英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、维多珠单抗或乌司奴单抗。因此，在一个实例中，本公开所涵盖的受试者可能难以用英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、维多珠单抗或乌司奴单抗治疗。

如本文所用，术语“遗传上未修饰的”是指未通过用核酸转染修饰的细胞。为避免疑义，在本公开的上下文中，用编码Ang1的核酸转染的间充质谱系前体或干细胞将被认为是遗传修饰的。

术语“总剂量”在本公开的上下文中用于指根据本公开治疗的受试者接受的细胞总数。在一个实例中，总剂量由一次细胞施用组成。在另一实例中，总剂量由两次细胞施用组成。在另一实例中，总剂量由三次细胞施用组成。在另一实例中，总剂量由四次或更多次细胞施用组成。例如，总剂量可由两到四次细胞施用组成。

间充质谱系前体细胞

如本文所用，术语“间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)”是指具有自我更新能力同时保持多能性和分化成多种细胞类型的能力的未分化多能细胞，所述细胞类型为间充质来源，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和肌腱，或非中胚层来源，例如肝细胞、神经细胞和上皮细胞。为免生疑问，“间充质谱系前体细胞”是指可分化成间充质细胞的细胞，例如骨、软骨、肌肉和脂肪细胞以及纤维结缔组织。

术语“间充质谱系前体或干细胞”包括亲本细胞和其未分化的后代。所述术语还包括间充质前体细胞、多能基质细胞、间充质干细胞(MSC)、血管周围间充质前体细胞和其未分化的后代。

间充质谱系前体或干细胞可为自体的、同种异体的、异种的、同基因的或等基因的。自体细胞是从它们将被重新植入的同一个体中分离出来的。同种异体细胞是从同一物种的供体中分离出来的。异种细胞是从另一物种的供体中分离出来的。同基因或等基因细胞是从基因相同的生物体，例如双胞胎、克隆或高度近交的研究动物模型中分离出来的。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞是同种异体的。在一个实例中，同种异体间充质谱系前体或干细胞被培养扩增并冷冻保存。

间充质谱系前体或干细胞主要存在于骨髓中，但也显示存在于多种宿主组织中，包括例如脐带血和脐带、成人外周血、脂肪组织、骨小梁和牙髓。它们也存在于皮肤、脾脏、胰腺、脑、肾、肝、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、韧带、肌腱、骨骼肌、真皮和骨膜中；并且能够分化成种系，例如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，间充质谱系前体或干细胞能够分化成大量细胞类型，包括但不限于脂肪、骨、软骨、弹性、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特定谱系定型和分化途径取决于机械影响和/或内源性生物活性因子的各种影响，例如生长因子、细胞因子和/或宿主组织建立的局部微环境条件。

术语“富集(enriched)”、“富集(enrichment)”或其变化形式在本文中用于描述与未处理的细胞群(例如在其原生环境中的细胞)相比时，一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例增加的细胞群。在一个实例中，富集间充质谱系前体或干细胞的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的间充质谱系前体或干细胞。在这方面，将采用术语“富集间充质谱系前体或干细胞的细胞群”来明确支持术语“包含X％间充质谱系前体或干细胞的细胞群”，其中X％是如本文所述的百分比。在一些实例中，间充质谱系前体或干细胞可形成克隆形成集落，例如CFU-F(成纤维细胞)或其子集(例如50％或60％或70％或70％或90％或95％)可具有此活性。

在本公开的一个实例中，间充质谱系前体或干细胞是间充质干细胞(MSC)。MSC可为均质组合物或可为富集MSC的混合细胞群。可通过培养贴壁的骨髓或骨膜细胞获得均质的MSC组合物，且可通过用独特的单克隆抗体鉴定的特定细胞表面标记物来鉴定MSC。例如，在美国专利第5,486,359号中描述了一种用于获得富集MSC的细胞群的方法。MSC的替代来源包括但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨骼和软骨膜。在一个实例中，MSC是同种异体的。在一个实例中，MSC被冷冻保存。在一个实例中，MSC被培养扩增并冷冻保存。

在另一实例中，间充质谱系前体或干细胞是CD29+、CD54+、CD73+、CD90+、CD102+、CD105+、CD106+、CD166+、MHC1+MSC。

分离或富集的间充质谱系前体或干细胞可通过培养在体外进行扩增。分离或富集的间充质谱系前体或干细胞可冷冻保存、解冻且随后通过培养在体外扩增。

在一个实例中，分离或富集的间充质谱系前体或干细胞以50,000个活细胞/cm²接种在培养基(无血清或补充血清)，例如补充有5％胎牛血清(FBS)和谷氨酰胺的α最低必需培养基(αMEM)中，并使其在37℃、20％O₂下粘附在培养容器上过夜。随后根据需要更换和/或改变培养基，并将细胞在37℃、5％O₂下再培养68至72小时。

如本领域技术人员将理解的，培养的间充质谱系前体或干细胞在表型上不同于体内细胞。例如，在一个实施方案中，它们表达一种或多种以下标记物：CD44、NG2、DC146和CD140b。培养的间充质谱系前体或干细胞在生物学上也不同于体内细胞，与体内的大部分非循环(静止)细胞相比具有更高的增殖率。

在一个实例中，细胞群从包含可选择形式的STRO-1+细胞的细胞制备物中富集。在这点上，术语“可选择形式”将被理解为意指细胞表达允许选择STRO-1+细胞的标记物(例如细胞表面标记物)。标记物可以是但不一定是STRO-1。例如，如本文所述和/或例示的，表达STRO-2和/或STRO-3(TNAP)和/或STRO-4和/或VCAM-1和/或CD146和/或3G5的细胞(例如间充质前体细胞)也表达STRO-1(并且可以是STRO-1明亮的)。因此，细胞为STRO-1+的指示并不意味着细胞仅通过STRO-1表达来选择。在一个实例中，至少基于STRO-3表达来选择细胞，例如，它们是STRO-3+(TNAP+)。

提及细胞或其群体的选择不一定需要从特定组织来源中进行选择。如本文所述，STRO-1+细胞可选自或分离自或富集自多种来源。也就是说，在一些实例中，这些术语为从包含STRO-1+细胞(例如间充质前体细胞)的任何组织或血管化组织或包含周细胞(例如STRO-1+周细胞)的组织或本文所述的任何一种或多种组织中进行选择提供支持。

在一个实例中，本公开中使用的细胞表达一种或多种单独地或共同地选自由以下组成的组的标记物：TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、STRO-4+(HSP-90β)、CD45+、CD146+、3G5+或其任何组合。

“单独地”意指本公开分别包括所述标记物或标记物组，并且尽管单独的标记物或标记物组可能未在本文中单独列出，但所附权利要求书可彼此分开且可分割地定义此类标记物或标记物组。

“共同地”意指本公开包括所述标记物或标记物组的任何数量或组合，并且尽管本文可能未具体列出此类标记物或标记物组的数量或组合，但所附权利要求可与标记物或标记物组的任何其它组合分开且可分割地定义此类组合或子组合。

如本文所用，术语“TNAP”旨在包括组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，所述术语包括肝同种型(LAP)、骨同种型(BAP)和肾同种型(KAP)。在一个实例中，TNAP是BAP。在一个实例中，如本文所用的TNAP是指可结合STRO-3抗体的分子，所述抗体由根据布达佩斯条约的规定于2005年12月19日以保藏登记号PTA-7282保藏于ATCC的杂交瘤细胞系产生。

此外，在一个实例中，STRO-1+细胞能够产生克隆形成CFU-F。

在一个实例中，显著比例的STRO-1+细胞能够分化成至少两种不同的种系。STRO-1+细胞可定型的谱系的非限制性实例包括骨前体细胞；对胆管上皮细胞和肝细胞具有多能性的肝细胞祖细胞；可产生进展为少突胶质细胞和星形胶质细胞的胶质细胞前体的神经受限细胞；进展为神经元的神经元前体；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖反应性胰岛素分泌胰腺β细胞系。其它谱系包括但不限于成牙本质细胞、产生牙本质的细胞和软骨细胞，以及以下的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞(例如角质形成细胞)、树突细胞、毛囊细胞、肾导管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱、韧带、软骨、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管细胞、上皮细胞、胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞从单个供体或多个供体获得，其中供体样品或间充质谱系前体或干细胞随后被汇集，且接着培养扩增。

本公开所包括的间充质谱系前体或干细胞也可在施用于受试者之前冷冻保存。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞在施用于受试者之前进行培养扩增和冷冻保存。

在一个实例中，本公开包括间充质谱系前体或干细胞以及其后代、源自其的可溶性因子和/或从中分离的细胞外囊泡。在另一实例中，本公开包括间充质谱系前体或干细胞以及从中分离的细胞外囊泡。例如，有可能在适合将细胞外囊泡分泌至细胞培养基中的条件下培养扩增本公开的间充质前体谱系或干细胞一段时间。随后可从培养基中获得分泌的细胞外囊泡用于疗法。

如本文所用，术语“细胞外囊泡”是指脂质颗粒，所述脂质颗粒从细胞中自然释放并且尺寸在约30nm到大至10微米范围内，尽管典型地它们的尺寸小于200nm。它们可含有来自释放细胞(例如间充质干细胞；STRO-1⁺细胞)的蛋白质、核酸、脂质、代谢物或细胞器。

如本文所用，术语“外泌体”是指一种细胞外囊泡，其尺寸通常在约30nm至约150nm范围内，并起源于哺乳动物细胞的内体区室，它们所述该区室运输到细胞膜并释放。它们可含有核酸(例如RNA；微RNA)、蛋白质、脂质和代谢物，并通过从一个细胞分泌并被其它细胞吸收以递送其货物而在细胞间通信中发挥作用。

细胞的培养扩增

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增。“培养扩增的”间充质谱系前体或干细胞培养基与新鲜分离的细胞的区别在于它们已在细胞培养基中培养并传代(即传代培养)。在一个实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4-10代。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10代。例如，间充质谱系前体或干细胞可培养扩增至少5代。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可培养扩增至少5-10代。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可培养扩增至少5-8代。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可培养扩增至少5-7代。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可培养扩增超过10代。在另一实例中，间充质谱系前体或干细胞可培养扩增超过7代。在这些实例中，干细胞可在冷冻保存之前进行培养扩增，以提供中间冷冻保存的MLPSC群体。在一个实例中，本公开的组合物由中间冷冻保存的MLPSC群体制备。例如，中间冷冻保存的MLPSC群体可在施用之前进一步培养扩增，如下文进一步论述的。因此，在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增并冷冻保存。在这些实例的一个实施方案中，间充质谱系前体或干细胞可从单个供体或多个供体获得，其中供体样品或间充质谱系前体或干细胞随后被汇集，且接着进行培养扩增。在一个实例中，培养扩增方法包括：

-i.通过传代扩增来扩增活细胞的数量以提供至少约10亿个活细胞的制备物，其中传代扩增包括建立分离的间充质谱系前体或干细胞的原代培养物，且接着从先前培养物中连续建立分离的间充质谱系前体或干细胞的第一非原代(P1)培养物；

-ii.通过传代扩增将分离的间充质谱系前体或干细胞的P1培养物扩增至间充质谱系前体或干细胞的第二非原代(P2)培养物；和

-iii.制备和冷冻保存从间充质谱系前体或干细胞的P2培养物中获得的过程中的中间间充质谱系前体或干细胞制备物；以及

-iv.将冷冻保存的过程中的中间间充质谱系前体或干细胞制备物解冻并通过传代扩增来扩增过程中的中间间充质谱系前体或干细胞制备物。

在一个实例中，扩增的间充质谱系前体或干细胞制备物具有抗原谱和活性谱，其包括：

-i.少于约0.75％CD45+细胞；

-ii.至少约95％CD105+细胞；

-iii.至少约95％CD166+细胞。

在一个实例中，相对于对照，扩增的间充质谱系前体或干细胞制备物能够抑制CD3/CD28活化的PBMC的IL2Ra表达至少约30％。

在一个实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4-10代，其中间充质谱系前体或干细胞在至少2或3代后被冷冻保存，随后进行进一步培养扩增。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少1、至少2、至少3、至少4、至少5代，冷冻保存，且接着进一步培养扩增至少1、至少2、至少3、至少4、至少5代，随后进行施用或进一步冷冻保存。

在一个实例中，本公开的组合物中的大多数间充质谱系前体或干细胞具有大约相同的代数(即，它们在彼此的约1或约2或约3或约4个细胞倍增内)。在一个实例中，本公开组合物中细胞倍增的平均数量为约20至约25倍。在一个实例中，本公开组合物中的细胞倍增的平均数量为由原代培养物产生的约9至约13(例如约11或约11.2)倍，加上每代约1、约2、约3或约4倍(例如每代约2.5倍)。当分别通过约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9和约10次传代产生时，本公开组合物中的示例性平均细胞倍增为约13.5、约16、约18.5、约21、约23.5、约26、约28.5、约31、约33.5和约36中的任一者。

可使用本领域已知的任何设备和细胞处理方法进行间充质谱系前体或干细胞分离和离体扩增的过程。本公开的各种培养扩增实施方案采用需要对细胞进行操作的步骤，例如接种、补料、解离贴壁培养物或洗涤的步骤。任何操作细胞的步骤都有可能损伤细胞。尽管间充质谱系前体或干细胞在制备过程中通常可承受一定量的损伤，但细胞优选通过充分执行给定步骤的处理程序和/或设备进行操作，同时最小化对细胞的损伤。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞在包括以下各者的装置中洗涤：细胞源袋、洗涤溶液袋、再循环洗涤袋、具有入口和出口端口的旋转膜过滤器、滤液袋、混合区、用于经洗涤细胞的最终产品袋和合适的管，例如，如US 6,251,295中所述，所述专利以引用方式并入本文。

在一个实例中，根据本公开的间充质谱系前体或干细胞组合物在CD105阳性和CD166阳性以及CD45阴性方面是95％均质的。在一个实例中，这种均质性通过离体扩增，即通过多次群体倍增而持续存在。在一个实例中，组合物包含至少一个治疗剂量的间充质谱系前体或干细胞，并且间充质谱系前体或干细胞包含小于约1.25％的CD45+细胞、至少约95％的CD105+细胞和至少约95％的CD166+细胞。在一个实例中，这种均质性在低温储存和解冻后持续存在，其中细胞通常也具有约70％或更高的活力。

在一个实例中，本公开的组合物包含间充质谱系前体或干细胞，其表达大量的TNFR1，例如每百万个间充质谱系前体或干细胞大于13pg TNFR1。在一个实例中，这种表型在整个离体扩增和低温储存过程中是稳定的。在一个实例中，每百万个间充质谱系前体或干细胞在约13至约179pg(例如约13pg至约44pg)范围内的TNFR1水平的表达与期望的治疗潜力相关，所述期望的治疗潜力也通过离体扩增和冷冻保存而持续存在。

在一个实例中，培养扩增的间充质谱系前体或干细胞以至少110pg/ml的量表达肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)。例如，间充质谱系前体或干细胞可以至少150pg/ml、或至少200pg/ml、或至少250pg/ml、或至少300pg/ml、或至少320pg/ml、或至少330pg/ml、或至少340pg/ml、或至少350pg/ml的量表达TNFR1。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞以至少13pg/10⁶个细胞的量表达TNFR1。例如，间充质谱系前体或干细胞以至少15pg/10⁶个细胞、或至少20pg/10⁶个细胞、或至少25pg/10⁶个细胞、或至少30pg/10⁶个细胞、或至少35pg/10⁶个细胞、或至少40pg/10⁶个细胞、或至少45pg/10⁶个细胞、或至少50pg/10⁶个细胞的量表达TNFR1。

在另一实例中，本文公开的间充质谱系前体或干细胞抑制T细胞上的IL-2Rα表达。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可抑制IL-2Rα表达至少约30％，或者至少约35％，或者至少约40％，或者至少约45％，或者至少约50％，或者至少约55％，或者至少约60％。

在一个实例中，本公开的组合物包含至少一个治疗剂量的间充质谱系前体或干细胞，其例如可包含至少约1亿个细胞或约1.25亿个细胞。

细胞的修饰

本公开的间充质谱系前体或干细胞可以在施用时，细胞的裂解被抑制的方式改变。抗原的改变可诱导免疫无反应性或耐受性，从而防止诱导免疫反应的效应阶段(例如细胞毒性T细胞生成、抗体产生等)，所述阶段最终导致在正常免疫反应中排斥外来细胞。可被改变以实现此目标的抗原包括例如MHC I类抗原、MHC II类抗原、LFA-3和ICAM-1。

间充质谱系前体或干细胞也可被遗传修饰以表达对横纹骨骼肌细胞的分化和/或维持重要的蛋白质。示例性蛋白质包括生长因子(TGF-β、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、FGF)、生肌因子(例如myoD、生肌素、生肌因子5(Myf5)、生肌调节因子(MRF))、转录因子(例如GATA-4)、细胞因子(例如心肌营养素(cardiotropin)-1)、神经调节素家族成员(例如神经调节素1、2和3)和同源盒基因(例如Csx、tinman和NKx家族)。

本公开的组合物

在本公开的一个实例中，间充质谱系前体或干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子以组合物的形式施用。在一个实例中，此类组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。因此，在一个实例中，本公开的组合物可包含培养扩增的间充质谱系前体或干细胞。

术语“载体”和“赋形剂”是指在本领域中惯常用于促进活性化合物的储存、施用和/或生物活性的物质组合物(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Mac Publishing Company(1980)。载体还可减少活性化合物的任何不良副作用。合适的载体例如是稳定的，例如不能与载体中的其它成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下不会在受体中产生显著的局部或全身副作用。

适用于本公开的载体包括常规使用的那些，例如水、盐水、右旋糖水溶液、乳糖、林格氏溶液(Ringer′s solution)、缓冲溶液、透明质酸和二醇是示例性液体载体，特别是(当等渗时)用于溶液。合适的药物载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

在另一实例中，载体是培养基组合物，例如细胞在其中生长或悬浮。例如，此类培养基组合物不会在其所施用的受试者中引起任何不利影响。

示例性载体和赋形剂不会不利地影响细胞的活力和/或细胞减轻、预防或延迟代谢综合征和/或肥胖症的能力。

在一个实例中，载体或赋形剂提供缓冲活性以将细胞和/或可溶性因子维持在合适的pH下，从而发挥生物活性，例如，载体或赋形剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS代表有吸引力的载体或赋形剂，因为它与细胞和因子的相互作用最小并且允许细胞和因子的快速释放，在这种情况下，本公开的组合物可生产为液体，用于直接应用至血流或应用至组织或组织周围或附近的区域中，例如通过注射。

间充质谱系前体或干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子也可掺入或包埋在与受体相容且降解成对受体无害的产物的支架内。这些支架为要移植到受体受试者中的细胞提供支持和保护。天然和/或合成的可生物降解的支架是此类支架的实例。

在本公开的实践中可成功地使用多种不同的支架。示例性支架包括但不限于生物可降解支架。天然可生物降解支架包括胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白支架。适用于细胞移植支架的合成材料应该能够支持广泛的细胞生长和细胞功能。此类支架也可以是可再吸收的。合适的支架包括聚乙醇酸支架(例如由Vacanti等J.Ped.Surg.23：3-91988；Cima等Biotechnol.Bioeng.38：1451991；Vacanti等Plast.Reconstr.Surg.88：753-9 1991所述)；或合成聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。

在另一实例中，间充质谱系前体或干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子可在凝胶支架(例如来自Upjohn Company的Gelfoam)中施用。

本文所述的组合物可单独施用或作为与其它细胞的混合物施用。不同类型的细胞可在即将或快要施用前与本公开的组合物混合，或者它们可在施用前一起共培养一段时间。

在一个实例中，组合物包含有效量或治疗或预防有效量的间充质谱系前体或干细胞和/或其后代和/或源自其的可溶性因子。例如，组合物包含约1×10⁵个干细胞至约1×10⁹个干细胞或约1.25×10³个干细胞至约1.25×10⁷个干细胞/kg(80kg受试者)。要施用的细胞的确切数量取决于多种因素，包括受试者的年龄、体重和性别，以及所治疗疾病的范围和严重程度。

在一个实例中，施用50×10⁶至200×10⁷个细胞。在其它实例中，施用60×10⁶至200×10⁶个细胞或75×10⁶至150×10⁶个细胞。在一个实例中，施用75×10⁶个细胞。在另一实例中，施用150×10⁶个细胞。

在一个实例中，组合物包含大于5.00×10⁶个活细胞/mL。在另一实例中，组合物包含大于5.50×10⁶个活细胞/mL。在另一实例中，组合物包含大于6.00×10⁶个活细胞/mL。在另一实例中，组合物包含大于6.50×10⁶个活细胞/mL。在另一实例中，组合物包含大于6.68×10⁶个活细胞/mL。

在一个实例中，本公开的方法包括施用6亿个细胞的总剂量。例如，根据本公开治疗的受试者可接受多个剂量的上述组合物，只要细胞的总剂量不超过6亿个细胞。例如，受试者可接受3个剂量的2亿个细胞。在一个实例中，细胞的总剂量是5亿个细胞。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞占组合物的细胞群体的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％。

本公开的组合物可被冷冻保存。可使用本领域已知的慢速冷却方法或‘快速’冷冻方案进行间充质谱系前体或干细胞的冷冻保存。优选地，与未冷冻细胞相比，冷冻保存的方法维持冷冻保存细胞的类似表型、细胞表面标记物和生长速率。

冷冻保存的组合物可包含冷冻保存溶液。冷冻保存溶液的pH典型地为6.5至8，优选7.4。

冷冻保存溶液可包含无菌、非热原等渗溶液，例如PlasmaLyte A^TM。100mLPlasmaLyte A^TM含有526mg氯化钠，USP(NaCl)；502mg葡萄糖酸钠(C₆H₁₁NaO₇)；368mg三水合乙酸钠，USP(C₂H₃NaO₂·3H₂O)；37mg氯化钾，USP(KCl)；和30mg氯化镁，USP(MgCl₂·6H₂O)。它不含抗菌剂。用氢氧化钠调节pH。pH为7.4(6.5至8.0)。

冷冻保存溶液可包含Profreeze^TM。冷冻保存溶液可另外或替代地包含培养基，例如αMEM。

为了促进冷冻，通常将冷冻保护剂，例如二甲亚砜(DMSO)添加至冷冻保存溶液中。理想情况下，冷冻保护剂应该对细胞和患者无毒、无抗原性、化学惰性、解冻后提供高存活率并允许移植而无需清洗。然而，最常用的冷冻保护剂DMSO显示出一些细胞毒性。羟乙基淀粉(HES)可用作替代物或与DMSO结合使用，以降低冷冻保存溶液的细胞毒性。

冷冻保存溶液可包含DMSO、羟乙基淀粉、人血清组分和其它蛋白质填充剂中的一者或多者。在一个实例中，冷冻保存的溶液包含约5％人血清白蛋白(HSA)和约10％DMSO。冷冻保存溶液还可包含甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和海藻糖中的一者或多者。

在一个实施方案中，将细胞悬浮在42.5％Profreeze^TM/50％αMEM/7.5％DMSO中并在控速冷冻机中冷却。

可将冷冻保存的组合物解冻并直接施用于受试者或添加至例如包含HA的另一溶液中。或者，可将冷冻保存的组合物解冻并将间充质谱系前体或干细胞在施用前重新悬浮在替代载体中。

在一个实例中，本公开的细胞组合物可包含Plasma-Lyte A、二甲亚砜(DMSO)和人血清白蛋白(HSA)。例如，本公开的组合物可包含Plasma-Lyte A(70％)、DMSO(10％)、HSA(25％)溶液，所述HSA溶液包含5％HSA和15％缓冲液。

在一个实例中，本文所述的组合物可作为单一剂量施用。

在一些实例中，本文所述的组合物可以多个剂量施用。例如，至少2、至少3、至少4个剂量。在其它实例中，本文所述的组合物可以至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10个剂量施用。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可在施用于受试者之前进行培养扩增。本领域已知各种细胞培养方法。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增约4-10代。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10代。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞被培养扩增至少5代。在这些实例中，干细胞可在冷冻保存之前进行培养扩增。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞在施用之前在无血清培养基中进行培养扩增。

在一些实例中，细胞包含在不允许细胞进入受试者循环但允许细胞分泌的因子进入循环的腔室中。以这种方式，可通过允许细胞将因子分泌至受试者的循环中来将可溶性因子施用于受试者。这样的腔室同样可植入受试者体内的部位以增加可溶性因子的局部水平，例如植入胃肠壁中或附近。

在一个实例中，可将间充质谱系前体或干细胞施用于受试者胃肠道壁。在一个实例中，将间充质谱系前体或干细胞局部施用于胃肠道腔内壁。在另一实例中，可局部施用间充质谱系前体或干细胞。例如，可将间充质谱系前体或干细胞施用于受试者胃肠道壁中。例如，可将间充质谱系前体或干细胞施用于受试者胃肠道壁的粘膜下层中。在一个实例中，可将间充质谱系前体或干细胞施用于受试者胃肠道壁中的炎症部位。例如，可将间充质谱系前体或干细胞施用于受试者胃肠道壁中的炎症部位中。在这些实例中，炎症部位可在施用前通过内窥镜进行确认。例如，内窥镜确认可基于受过训练的医生的目视检查和/或内窥镜活检的组织学分析。在一个实例中，胃肠道壁是肠壁。例如，可将间充质谱系前体或干细胞施用于受试者结肠壁和/或肠道壁。在一个实例中，可将间充质谱系前体或干细胞直接施用于受试者结肠壁和/或肠道壁的粘膜下层中。在一个实例中，可将间充质谱系前体或干细胞直接施用于受试者结肠壁和/或直肠壁的粘膜下层中。在另一实例中，本公开的组合物可通过腔内注射施用。在另一实例中，本公开的组合物是静脉内施用的。在另一实例中，组合物是静脉内和局部施用的。

在各种实例中，可能需要将一定剂量的细胞施用于受试者胃肠道中的多个部位。每个剂量所需的施用部位的数量可能取决于所施用的细胞数量。例如，可能需要将大约7500万个细胞的剂量施用于胃肠道中的五个部位。在另一实例中，可能需要将大约1.5亿个细胞的剂量施用于胃肠道中的15个部位。在其它实例中，可能需要将剂量施用于受试者胃肠道的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个部位。在这些实例的一个实施方案中，将剂量施用于受试者盲肠、近端横结肠、远端横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠壁。在此实施方案中，可将剂量施用于受试者盲肠、近端横结肠、远端横结肠、降结肠、乙状结肠和直肠壁的一个、两个、三个、四个、五个或更多个部位。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞通过内窥镜施用。例如，间充质谱系前体或干细胞可通过内窥镜注入受试者胃肠道壁的粘膜下层中。在一个实例中，在将间充质谱系前体或干细胞直接施用于炎症部位中之前，使用内窥镜在视觉上识别炎症部位。

在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞每周施用一次。例如，间充质谱系前体或干细胞可每两周每周施用一次。在一个实例中，间充质谱系前体或干细胞可每月施用一次。在一个实例中，在两周内每周一次地施用两剂间充质谱系前体或干细胞。在另一实例中，每两周每周一次地施用两剂间充质谱系前体或干细胞。在另一实例中，在两周内施用四剂间充质谱系前体或干细胞，随后每月一次地施用后续剂量。在一个实例中，可每两周每周一次地施用两剂间充质谱系前体或干细胞，随后每月一次地施用后续剂量。

本领域技术人员将理解，可对上述实施方案进行多种改变和/或修改，而不背离本公开的广泛一般范围。因此，本实施方案在所有方面都被视为说明性而不是限制性的。

以下具体实施例应被解释为仅仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的其余部分。无需进一步详细说明，相信本领域技术人员可根据本文的描述充分利用本发明。

本申请要求2020年3月11日提交的澳大利亚临时专利申请2020900743的优先权，所述申请的全部内容以引用方式并入本文。

实施例

离体培养扩增的成人同种异体骨髓源性间充质干细胞(MSC)，用于治疗医学难治性克罗恩氏结肠炎

组合物

组合物由从健康成人供体的骨髓中分离出来的培养扩增的间充质基质细胞(ceMSC)构成。最终组合物包含在Plasma-Lyte A(70％)、二甲亚砜(DMSO，10％)和人血清白蛋白(HSA)(25％)溶液(20％，包含5％HSA和15％缓冲液)中以≥6.68×10⁶个活细胞/mL的浓度配制的ceMSC。每个剂量小瓶含有3.8mL冷冻保存的细胞悬浮液(每小瓶的总细胞数≥25×10⁶)。

目标

主要目标

为确定内窥镜递送MSC(离体扩增的同种异体骨髓源性MSC)治疗医学难治性克罗恩氏结肠炎的安全性。

次要目标

为了初步评估由内窥镜递送MSC(离体扩增的同种异体骨髓源性MSC)治疗难治性克罗恩氏结肠炎诱导的腔内愈合反应。

临床上

-24小时排便次数减少；

-便血减少；

-C反应蛋白血清水平降低；

-克罗恩氏病活动指数(CDAI评分)降低。

射线照相

-使用磁共振(MR)肠造影的横截面成像。

内窥镜和组织病理学

-结肠镜检查中的克罗恩氏病的简单内窥镜评分(SES-CD)改善；

-与MSC递送前的内窥镜活检相比，内窥镜活检或手术病理学的组织学愈合改善。

受试者

24名患者将用7500万(n＝12；8例治疗，4例对照)或1.5亿(n＝12；8例治疗，4例对照)剂量的MSC治疗其管腔疾病。MSC将在手术室通过靶向内窥镜递送被递送至结肠壁的粘膜下层。MSC剂量递增将在两个剂量组的患者中进行，所述患者将以2∶1的方式分配至治疗：对照四次(每个剂量组的比率为8∶4)。12名患者将接受7500万个细胞，且12名患者将接受1.5亿个细胞。

纳入标准：

-18-75岁的男性和女性；

-克罗恩氏结肠炎病程至少6个月，具有医学难治性症状，一次抗TNF治疗已失败，下一步将进行结肠次全切除术或医疗管理升级；

-允许接触皮质类固醇、5-ASA药物、硫嘌呤、甲氨蝶呤、抗TNF治疗、抗整合素和抗白细胞介素，但皮质类固醇、5-ASA、硫嘌呤、甲氨蝶呤将进行2周的清除期，且任何生物疗法将进行4周的清除期；

-MSC递送后30天内结肠镜检查未排除结肠发育不良和恶性肿瘤；

-必须至少有一种抗TNF已失败或有生物疗法的禁忌症。

主要终点

本研究的主要终点是确定内窥镜注射MSC治疗克罗恩氏结肠炎的安全性和可行性。

次要终点

临床和内窥镜缓解：

-临床愈合：

оCRP正常化至＜2.87mg/L；

оCDAI下降至＜150。

-射线照相愈合：

о炎症改善的MR肠造影。

-内窥镜愈合：

о无粘膜溃疡，且SES-CD评分为0-5。

临床和内窥镜反应：

-临床愈合：

оCRP减少＞50％或正常化；

оCDAI下降＞100分。

-射线照相愈合：

о炎症改善的MR肠造影。

-内窥镜愈合：

оSES-CD降低＞50％或降至评分为5-10。

部分临床和内窥镜反应：

-临床愈合：

оCRP减少＞25％；

оCDAI降低＜100分。

-射线照相愈合：

о炎症改善的MR肠造影。

-内窥镜愈合：

оSES-CD降低＞25％但<50％或降至评分为10-15。

缺乏反应：

-临床愈合：

о没有改善。

-射线照相愈合：

о没有炎症消退的MR肠造影。

-内窥镜愈合：

оSES-CD没有改善。

治疗方案

受试者在随机分至MSC治疗组与生理盐水对照组后接受7500万个细胞或1.5亿个细胞(每3.8mL补充有人血清白蛋白(5％)和二甲亚砜(10％)的

A 2500万个细胞)。第一组接受7500万个MSC或生理盐水，下一组12名患者接受1.5亿个MSC或生理盐水。对于7500万剂量，7500万个细胞悬浮在11.4mL中，在盲肠、近端横结肠、远端横结肠、降结肠、乙状结肠、直肠中递送，每个位置1.9mL。对于1.5亿剂量，22.8mL在前面提到的每个位置进行递送，作为3次注射(每次1.3mL)在结肠/直肠壁的12、6和9点钟位置递送。在所述过程中，将使用成人结肠镜。将使用23号一次性硬化治疗针将细胞递送至粘膜下层中，如粘膜下层中长出的小泡所示。在每个注射部位，MSC注射后将注射0.5mL P1asma-Lyte A，以冲洗任何剩余MSC的硬化治疗针。)

就诊1(筛选/基线)MSC治疗的受试者

患者将在此次就诊时完成以下测试和程序：

-在胃肠病学或外科会诊时关于医学难治性克罗恩氏结肠炎的生物疗法或结肠次全切除术变化的资格(纳入/排除清单)；

-书面知情同意书；

-以下药物的清除期：

о5-ASA、皮质类固醇、免疫调节剂疗法，包括硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和6-巯基嘌呤，持续2周；

о以下生物制剂，持续4周：抗TNF、抗整合素和白细胞介素。

-病史和手术史；

-一般检查，包括腹部检查和生命体征(BP、脉搏、呼吸率和体温)；

-克罗恩氏病活动指数(CDAI)评分；

-将获得炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-磁共振肠造影(MRE)，如果在过去30天内未进行过的话；

-结肠镜检查与活检，如果在过去30天内未进行过的话；

-排除巨细胞病毒结肠炎(CMV结肠炎)；

-克罗恩氏病的简单内窥镜评分(SES-CD)；

-实验室研究，包括：

о将仅对有生育能力的女性(WOCBP)进行尿妊娠测试

о肝功能测试，AST/ALT

о急性肝炎小组

о人类免疫缺陷病毒(HIV)

о全血细胞计数(CBC)

о完全代谢小组(CMP)

о前白蛋白

оC反应蛋白(CRP)

о红细胞沉降率(ESR)

о粪便艰难梭菌(C.diff)

о粪便钙卫蛋白

о伴随用药

-不良事件(包括医疗管理或手术管理的变化，并报告药物的任何副作用，以及任何术后并发症)

就诊2(第0天-治疗)

在就诊2之前的7天内，患者将在此次就诊时完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-CDAI评分；

-随机分至治疗组或对照组；

-结肠镜检查(将用于施用MSC)；

-伴随药物；

-不良事件；

-MSC或生理盐水的递送。

就诊3(第1天)

次日将完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-自上次就诊以来的病史和手术史；

-CDAI评分；

-伴随药物；

-不良事件。

就诊4(第4周+/-3天)

在此次就诊中完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-自上次就诊以来的病史和手术史；

-可屈性乙状结肠镜检查与活检；

-炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-CDAI评分；

-伴随药物；

-不良事件。

就诊5(第6周+/-3天)

在此次就诊中完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-自上次就诊以来的病史和手术史；

-可屈性乙状结肠镜检查与活检；

-炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-CDAI评分；

-伴随药物；

-不良事件。

就诊6(3个月+/-7天)

在此次就诊中完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-自上次就诊以来的病史和手术史；

-结肠镜检查与SES-CD和活检；

-炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-CDAI评分；

-MRE；

-实验室检查：

оCBC；

оCMP；

о前白蛋白；

оCRP；

оESR；

о粪便钙卫蛋白。

-伴随药物；

-不良事件。

就诊7(6个月；+/-7天)

在此次就诊中完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-自上次就诊以来的病史和手术史；

-炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-CDAI评分；

-MRE；

-实验室检查：

оCBC；

оCMP；

о前白蛋白；

оCRP；

оESR；

о粪便钙卫蛋白。

-伴随药物；

-不良事件。

就诊8(第9个月，+/-14天)

在此次就诊中完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-自上次就诊以来的病史和手术史；

-炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-CDAI评分；

-MRE；

-实验室检查：

оCBC；

оCMP；

о前白蛋白；

оCRP；

оESR；

-粪便钙卫蛋白。

-伴随药物；

-不良事件。

就诊9(第12个月，+/-14天)

在此次就诊中完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-自上次就诊以来的病史和手术史；

-炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-CDAI评分；

-MRE；

-结肠镜检查与活检(仅限治疗患者)。

-实验室检查：

оCBC；

оCMP；

о前白蛋白；

оCRP；

оESR；

о粪便钙卫蛋白。

-伴随药物；

-不良事件。

就诊10(15个月，+/-14天)

在此次就诊中完成以下测试和程序：

-一般检查，包括腹部检查和生命体征；

-自上次就诊以来的病史和手术史；

-炎症性肠病问卷(IBDQ)评分；

-CDAI评分；

-MRE；

-对照组中的结肠镜检查与活检(MSC治疗后12个月)；

-实验室检查：

оCBC；

оCMP；

о前白蛋白；

оCRP；

оESR；

о粪便钙卫蛋白。

-伴随药物；

-不良事件。

中期分析

进行亚组分析以探索对疗法最具反应性的患者组的可能识别，包括单生物制剂难治性和多生物制剂难治性克罗恩氏病以及瘘管病。这些数据汇总在下表1和2以及图1中。

在常规疗法、类固醇和TNF-α抑制剂已失败的中度至重度活动性克罗恩氏病患者中，有早期(第28天)缓解的明显证明，与对照组相比，反应率具有统计显著性(p＝0.02；图1)。在比较第28天至第56天的反应率时，证明了持续缓解的证据。

用一种生物制剂治疗的人群中的第28天主要终点。

表1：

第28天至第56天的反应率。

表2：

进一步的分析

在患有单生物制剂难治性和多生物制剂难治性克罗恩氏病的受试者中也评估了CRP水平。出人意料的是，单生物制剂难治性受试者的CRP水平相对于多生物制剂难治性克罗恩氏病较低(CRP水平示于表3中)。此外，在CDAI评分降低100分之前，患有多生物制剂难治性克罗恩氏病的受试者倾向于需要两剂细胞(p＝0.055；数据示于表4中)。总之，这些发现表明单生物制剂难治性受试者可用较少数量的细胞进行治疗。

表3：

表4：

Claims

1.一种治疗或预防有需要的人类受试者的炎症性肠病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物，其中所述受试者难以用至少一种生物疗法治疗。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者难以用单一生物疗法治疗。

3.一种治疗或预防难以用单一生物疗法治疗的人类受试者的炎症性肠病的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)的组合物，其中所述方法包括施用少于6亿个间充质谱系前体或干细胞的总剂量。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生物疗法是抗TNF疗法。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述生物疗法是英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、维多珠单抗或乌司奴单抗。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述生物疗法是英夫利昔单抗或阿达木单抗。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述受试者也难以用硫唑嘌呤、巯基嘌呤(6-MP)、甲氨蝶呤、环孢菌素或类固醇中的一者或多者治疗。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述炎症性肠病是克罗恩氏病。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述克罗恩氏病出现在所述受试者的直肠和/或结肠中。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述受试者具有＜23的C反应蛋白(CRP)水平。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述受试者具有＜20的C反应蛋白(CRP)水平。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗后至少28天具有部分临床和/或内窥镜反应。

14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗后至少28至56天具有部分临床和/或内窥镜反应。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中部分临床反应的特征在于以下一项或多项或全部：

-C反应蛋白(CRP)减少＞25％；

-CD活动指数(CDAI)降低＜100分；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

16.如权利要求13或14所述的方法，其中部分内窥镜反应的特征在于以下一项或两项：

-SES-CD评分为10-15。

17.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗后至少28天具有临床和/或内窥镜反应。

18.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗后至少28至56天具有临床和/或内窥镜反应。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中临床反应的特征在于以下一项或多项或全部：

-CRP减少＞50％；

-CRP正常化；

-CDAI下降≥100分；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

20.如权利要求17或18所述的方法，其中内窥镜反应的特征在于以下一项或两项：

-SES-CD降低＞25％但＜50％；

-SES-CD评分为5-10。

21.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗后至少28天处于临床和/或内窥镜缓解中。

22.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述受试者在治疗后至少28至56天处于临床和/或内窥镜缓解中。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中临床缓解的特征在于以下一项或两项：

-CRP正常化至＜2.87mg/L；

-通过MR肠造影评估的射线照相愈合，伴有炎症改善。

24.如权利要求21或22所述的方法，其中内窥镜缓解的特征在于以下一项或两项：

-没有粘膜溃疡；

-SES-CD评分为0-5。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者的胃肠道壁。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者胃肠道壁的粘膜下层。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者胃肠道壁中的炎症部位。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者的结肠和/或直肠。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述组合物通过腔内注射施用。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者结肠壁的粘膜下层。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中将所述组合物施用于所述受试者胃肠道壁中的多个部位。

32.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述组合物是静脉内施用的。

33.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述组合物也是静脉内施用的。

34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述MLPSC是间充质干细胞(MSC)。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述MLPSC是同种异体的。

36.根据权利要求9至35中任一项所述的方法，其中所述克罗恩氏病是中度至重度的。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述受试者具有大于300的CDAI。

38.根据权利要求9至37中任一项所述的方法，其中所述克罗恩氏病是瘘管性克罗恩氏病。

39.根据权利要求1至31和33至38中任一项所述的方法，其中所述间充质谱系前体或干细胞(MLPSC)通过内窥镜施用。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，所述方法包括施用1×10⁷至2×10⁸个细胞。

41.根据权利要求1至31和33至40中任一项所述的方法，所述方法包括在两个、三个、四个、五个、六个或更多个部位向所述受试者的胃肠道壁施用1×10⁷至2×10⁸个细胞。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含Plasma-Lyte A、二甲亚砜(DMSO)、人血清白蛋白(HSA)。

43.根据权利要求1至39或42中任一项所述的方法，所述方法包括施用7.5×10⁷个细胞。

44.根据权利要求1至39或42中任一项所述的方法，所述方法包括施用1.5×10⁸个细胞。

45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述组合物还包含Plasma-Lyte A(70％)、DMSO(10％)、HSA(25％)溶液，所述HSA溶液包含5％HSA和15％缓冲液。

46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述组合物包含大于6.68×10⁶个活细胞/mL。