CN115267192A - 一种多肿瘤标志物检测芯片及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请一方面，本申请提供了一种多肿瘤标志物检测芯片，包括可拆卸连接的上盖和芯片壳体，所述芯片壳体内自下而上依次设置有底板、弹性橡胶片和固相载体；所述弹性橡胶片上开设有多个孔，所述底板上对应开设有多个槽，所述上盖上也对应开设有多个孔；所述弹性橡胶片顶面与固相载体底面粘接固定，所述弹性橡胶片的底面与底板顶面固定连接；所述固相载体采用硝酸纤维素膜，在所述固相载体的顶面、与弹性橡胶片上多个孔对应的区域均设有蛋白点阵，所述蛋白点阵分布有18种检测物以及阴性质控点和阳性质控点。另一方面，本申请还提供了包含上述检测芯片的检测试剂盒。本申请检测指标多，检测精度高，同时不漏液、不存在样品交叉污染，产品性能稳定。

Description

一种多肿瘤标志物检测芯片及试剂盒

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种多肿瘤标志物检测芯片及试剂盒。

背景技术

肿瘤是一种常见病、多发病，恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。化学检测方法，如现有的ELISA、化学发光、荧光等检测方法，已经被广泛应用于肿瘤检测。这类方法以临床中已广泛运用的酶联免疫分析技术为基础，通过检测肿瘤标志物，从而实现肿瘤检测的目的。

在上述检测方法的基础上，目前已经开发出了蛋白芯片技术。蛋白芯片技术是根据蛋白质之间相互作用的原理而设计的高通量蛋白检测平台。利用微点阵技术将多种蛋白质结合在固相基质上，从而使传统的生物学分析手段能够在极小的范围内快速完成，达到一次实验同时分析多个生物标本或检测多种疾病的目的。其主要特点是将已知蛋白阵列固定在支持物表面，用来检测相配对的未知蛋白，这种技术使得研究人员可以在一次实验中比较生物样品中成百上千的蛋白质的相对丰度，相对于传统技术而言，效率大为提高。

目前的蛋白质芯片采用的固相基质主要有玻璃片、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、硅胶膜和尼龙膜等。玻璃片成本低，但是与蛋白质结合性能差，需要对表面进行复杂修饰。硝酸纤维素膜材料较脆，反复震荡和洗涤以破损，容易导致漏液和样品的交叉污染。醋酸纤维素膜与蛋白结合性能好，本身的机械性能也十分优异，但是不适于在荧光检测中应用。硅胶膜和尼龙膜的机械性能均十分优异，然而成本较高；同时，硅胶膜与蛋白质的结合性能相对较弱，而尼龙膜虽然与核酸的结合性能极强，十分适于分子印迹实验和杂交实验，但是与蛋白质的结合性能一般。

其次，目前的蛋白质芯片受限于结构和性能的问题，单个芯片的检测项十分有限，目前最多只能检测5～10种指标。而以胃食肠道恶性肿瘤为例，检测指标远远超出10项，对于肿瘤患者而言，相关检测的医疗费用仍然较高。频繁的检测，也会造成患者严重的心理负担，不利于患者的康复。

发明内容

为了解决上述至少一种技术问题，开发出一种检测指标数量多，检测精度高，同时产品性能稳定，不漏液、不存在样品交叉污染的蛋白质芯片，本申请提供一种多肿瘤标志物检测芯片及试剂盒。

一方面，本申请提供的一种多肿瘤标志物检测芯片，包括可拆卸连接的上盖和芯片壳体，所述芯片壳体内设置有用于容纳蛋白质芯片组件的容腔，所述芯片壳体内自下而上依次设置有底板、弹性橡胶片和固相载体；所述弹性橡胶片上开设有多个孔，所述底板上开设有与弹性橡胶片上多个孔对应的槽，所述上盖上开设有与弹性橡胶片上多个孔对应的孔；所述弹性橡胶片顶面与固相载体底面粘接固定，所述弹性橡胶片的底面与底板顶面固定连接；所述固相载体采用硝酸纤维素膜，在所述固相载体的顶面、与弹性橡胶片上多个孔对应的区域均设有蛋白点阵，所述蛋白点阵分别负载有检测βHCG、PGI、PGII、CA72-4、CA19-9、CA50、CA242、CA15-3、CA125、CEA、S100、β2-MG、FER、NSE、Cyfra21-1、SCC、proGRP和HE4的检测物。

通过采用上述技术方案，本申请筛选了18项检测指标，以点阵方式集成到单个蛋白质芯片中，极大的丰富了检测项，一次取样能够实现18项检测指标的检测，而且各检测项之间互不干扰，能够保证检测结果的精确；本申请采用硝酸纤维素膜作为固相载体，在背面粘附多孔的弹性橡胶片，可以充分利用弹性橡胶片的密封性能，确保不漏液、不存在样品的交叉污染的同时，粘附弹性橡胶片后，还能有效对硝酸纤维素膜提供辅助支撑，在弹性橡胶片的支撑下，可以有效解决硝酸纤维素膜存在脆性、震荡和洗涤易破损等问题；本申请设有多个孔，可以实现同时多样品的检测，能够进一步提升检测效率，降低检测成本，降低患者的医疗费用。

可选的，所述弹性橡胶片开设有6×8共48个孔，所述底板上对应开设有48个槽，所述上盖上对应开设有48个孔。

进一步可选的，所述弹性橡胶片上开设的孔为圆形或方形，所述底板上对应开设的槽和所述上盖上对应开设的孔的形状与所述弹性橡胶片上开设的孔的形状相同。

通过采用上述技术方案，可以最大程度的布置样品孔，有效提升单次检测的样品量，最大限度的提升检测效率，降低检测成本。

可选的，所述每个检测项的检测物设有2～4个重复的点位，所述蛋白点阵还设有阴性质控点NC阳性质控点PC。

进一步可选的，所述点阵分布采用下述列表的分布方式，

采用7×7分布，每个检测项的检测物设有3个重复的点位,阳性质控和阴性质控点设有3个重复点。

通过采用上述技术方案，每个检测项设置重复点位，可以有效提升检测精度，避免检测误差。而采用特定的点阵分布方式，可以有效克服多指标间可能的相互干扰，信噪比较低，本底值较高，信号均一性，质控问题等技术问题，进一步提升定量检测的检测精度。

可选的，所述底板设有凸出面，所述凸出面的面积小于底板。

进一步可选的，所述底板、弹性橡胶片和固相载体的边角处设有位置标识。

通过采用上述技术方案，设计凸出面，除了能够便于和上盖的装配，还能配合弹性橡胶片，使每个孔形成有效封边，保证密封性。而设置位置标识后，能够便于芯片的装配。

可选的，所述检测物采用小牛血清封闭剂，小牛血清和/或明胶封闭剂中的一种进行封闭处理。

通过采用上述技术方案，采用含小牛血清的封闭剂，可以有效避免干扰物质的再吸附，降低因干扰物质导致的检测误差。而且，使用本申请的封闭剂，可以有效延长产品的保存时间，封闭好的硝酸纤维素膜干燥后放入密封袋中，在低温下可以保存数月甚至一年。

可选的，所述芯片壳体和/或上盖上设有用于标识样品的标识符号。

通过采用上述技术方案，设置标识符号后，可以便于检测读数时对读数的记录，利用标识符号，可以很容易在读数和样品之间准确的建立一对一的联系。

另一方面，本申请还提供了一种多肿瘤标志物检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的多肿瘤标志物检测芯片，还包括洗涤液、反应液、复溶剂、检测液、质控品和校准品。

通过采用上述技术方案，添加了复溶剂、检测液、质控品和校准品，不但方便定量检测操作，能够保证检测的精度，同时还能监测整个检测系统的CV值，保证每次检测结果的有效性。

综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

1.本申请的检测指标能够达到18种，仅需一份样品就能实现18种指标的检测，不但样品用量大幅减少，而且能够大幅降低成本，有效降低患者的医疗费用。

2.本申请采用多孔设计，能够一次检测多份样品，检测效率高，检测成本低。

3.本申请采用特定的结构设计，采用底板+弹性橡胶片+硝酸纤维素膜的结构，使用开槽的底板和开孔的弹性橡胶片配合，对硝酸纤维素膜上的多个点阵区实现了有效密封，能够确保检测过程中不漏液、不混样；同时，弹性橡胶片的设置，还能有效对硝酸纤维素膜提供加强支撑，有效克服因硝酸纤维素膜的脆性等特性导致的震荡、洗涤易破损的问题，具有预料不到的技术效果。

4.本申请能够实现对多种检测指标的定性和定量检测，且经过精心筛选的18种检测指标之间相互干扰小，具有较高的检测精度。

5.本申请的试剂盒试剂丰富，所提供的试剂能够实现定性、定量的精确检测，同时还能监测整个检测系统的CV值，且试剂盒使用的试剂成本相对低廉。

附图说明

图1是本发明的结构示意图；

图2是本发明的装配结构示意图；

图3是本发明带标识符号的实施例的结构示意图；

图4是本发明检测结果示意图。

图中：

1、上盖，2、固相载体，3、弹性橡胶片，4、底板，5、芯片壳体，6、位置标识，7、标识符号。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本申请作进一步详细说明。

名词解释：

βHCG-人绒毛膜促性腺激素，PGI-胃蛋白酶原I，PGII-胃蛋白酶原II，CA72-4-糖类抗原72-4，CA19-9-糖类抗原19-9，CA50-糖类抗原50，CA242-糖类抗原242[3，4，5，19]，CA15-3-糖类抗原15-3，CA125-糖类抗原125，CEA-癌胚抗原，S100-S100蛋白，β2-MG-β2-微球蛋白，FER-铁蛋白，NSE-神经元特异性烯醇化酶，Cyfra21-1-细胞角蛋白19片段，SCC-鳞状上皮细胞癌抗原，proGRP-胃泌素释放肽前体，HE4-人附睾蛋白4。

如图1和图2所示，本申请设计了一种多肿瘤标志物检测芯片，包括可拆卸连接的上盖1和芯片壳体5，所述芯片壳体5内设置有用于容纳蛋白质芯片组件的容腔。所述上盖1和芯片壳体5用于封装和保护内设的蛋白质芯片组件。

所述芯片壳体5内自下而上依次设置有底板4、弹性橡胶片3和固相载体2。所述弹性橡胶片3上开设有多个孔，所述底板4上对应开设有多个槽，所述上盖1上也对应开设有多个孔。所述弹性橡胶片3顶面与固相载体2底面粘接固定，所述弹性橡胶片3的底面与底板4顶面固定连接。上述的孔即为制备完成的检测芯片的样品槽，而设置开孔的弹性橡胶片3和开槽的底板4，其目的是检测时注入样品后，样品的液体透过固相载体后，能够进入到底板4开的槽内，避免样品互混，而开孔的弹性橡胶片3能够提供极佳的密封。

所述固相载体2采用硝酸纤维素膜，在所述固相载体2的顶面、与弹性橡胶片3上多个孔对应的区域均设有蛋白点阵。即每个样品槽内均设置有一个蛋白点阵，用于对样品的相应指标进行检测。所述蛋白点分别负载有检测βHCG、PGI、PGII、CA72-4、CA19-9、CA50、CA242、CA15-3、CA125、CEA、S100、β2-MG、FER、NSE、Cyfra21-1、SCC、proGRP和HE4的检测物，共对应18种检测指标。还可以配置阴性质控点NC阳性质控点PC，以进一步提高精确性。

制备例

如图2所示，本申请的多肿瘤标志物检测芯片可以采用本制备例的方法制备，具体包括以下步骤。

步骤1，根据蛋白点阵的尺寸、检测芯片的样品槽数量、形状，以及芯片组件的厚度，设计检测芯片的上盖1和芯片壳体5的尺寸参数，通过注塑方式制备上盖1和芯片壳体5。

步骤2，根据样品槽的数量、形状参数，通过注塑方式制备底板4，然后通过裁剪和打孔的方式制备弹性橡胶片3，所述弹性橡胶片可以选择天然橡胶或普通橡胶或弹性硅胶。

步骤3，根据弹性橡胶片3的尺寸，以硝酸纤维素膜为原料，通过裁剪制备出对应尺寸的膜片。然后用点样仪，按照设计的蛋白点阵和弹性橡胶片3的开孔分布，在硝酸纤维素膜片上完成检测物的点样，点样后，可以用封闭剂再次点喷封闭检测点位，然后干燥，完成固相载体2的制备。

步骤4，在弹性橡胶片3双侧涂胶，通过粘接的方式将弹性橡胶片3与固相载体2和底板4粘接固定。

步骤5，将粘接固定的固相载体2、弹性橡胶片3和底板4装入芯片壳体5内，然后安装上盖1，完成多肿瘤标志物检测芯片的制备。

而本申请还提供了对应的试剂盒，所述试剂盒除了包括上述多肿瘤标志物检测芯片外，还包括洗涤液、反应液、复溶剂、检测液、质控品和校准品。

在本申请之前，本领域的检测芯片一般只能检测4～6项检测指标，最多不会超过10项检测指标。发明人经过研究发现，之所以本领域无法实现更多检测项的集成主要基于两方面因素。首先，是固相载体的材质；其次，是检测项之间存在相互干扰的问题。

材质问题，主要缘于目前蛋白质芯片能够使用的材质均要求是对蛋白质具有特异性吸附能力的材质。目前常用的有玻璃片、硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、硅胶膜和尼龙膜等。不同的材质对不同的检测物的吸附性能存在差异，因此无法适应多检测项的需要。成本相对低廉的硝酸纤维素膜对多检测项的吸附性能较为优异，但是多检测项存在需要反复洗涤、震荡等操作上的问题，而硝酸纤维素膜在反复洗涤、震荡时，受限于材料脆性问题，极易破损。

干扰问题，主要缘于蛋白质芯片采用的是酶联免疫原理，每个检测项大多以双抗夹心法实现检测，最终是通过精确检测发光底物发出的光来实现定性和/或定量检测的，检测精度与光检测的精度密切相关。而受限于目前检测读取设备的限制，蛋白质芯片的尺寸相对固定，如果检测项过多，检测时，各检测项的点位距离较近，发出的光存在干扰的问题；其次，不同检测项的发光底物有的相同，有的不同，发出的光的波长等参数也存在相同或不同的问题，因此检测项之间会因发出的光的参数问题导致干扰，从而导致定量检测的精度存在较大误差。

本申请在设计时，基于密封的考虑，采用开孔的弹性橡胶片3，通过粘接的方式，将固相载体2和底板4密封、固定连接。而发明人发现，使用这种结构后，除了解决了密封问题外，在反复洗涤和震荡操作时，硝酸纤维素膜并不会破损，有效解决了材料缺陷问题。发明人推测，可能是由于弹性橡胶片3对硝酸纤维素膜起到了辅助支撑的作用，从而提高了材料性能。同时，发明人还对各种肿瘤标志物的检测进行了详细的研究，发现并筛选除了一批检测项，这批检测项在集成检测时，相互干扰极低，检测的精度能够较高，能够满足目前定量检测的精度要求。

基于上述预料不到的技术效果，本申请的发明人设计了本申请，在单个蛋白质芯片上，实现18种肿瘤标志物的检测。

在本申请上述设计的基础上，可选的，所述每个检测项的检测物设有2～4个重复的点位。

进一步可选的，所述点阵分布采用下述列表的分布方式，

采用7×7分布，每个检测项的检测物设有2个重复的点位，阳性质控和阴性质控点设有3个重复点。

采用上述设计，是基于发明人的实验研究，以上述点阵分布时，利用不存在干扰的检测项将有可能存在干扰的检测项隔开，精确的设计了各个检测项的分布点位。能够进一步提升检测精度。

在本申请上述设计的基础上，可选的，所述检测物采用小牛血清封闭剂，小牛血清和/或明胶封闭剂中的一种进行封闭处理。

优选可以采用以下几种封闭剂，0.05～0.5％小牛血清、10％小牛血清或1％明胶。

采用含小牛血清的封闭剂或明胶封闭剂，可以有效延长产品的保存时间，封闭好的硝酸纤维素膜干燥后放入密封袋中，在低温下可以保存数月甚至一年之久。

以下为本申请的具体实施例。

实施例1

本实施例采用制备例的制备方法制备，使用10％的小牛血清封闭剂。

本实施例的所述弹性橡胶片3开设有6×8共48个孔，所述底板4上对应开设有48个槽，所述上盖1上对应开设有48个孔。采用正方形孔设计。

本实施例为了便于装配，所述底板4、弹性橡胶片3和固相载体2的边角处设有位置标识6。具体的，可以采用在底板4、弹性橡胶片3和固相载体2的一角打一个小圆孔作为标识。

如图3所示，由于本实施例设计了48个样品槽，为了便于检测结果的统计，本实施例在芯片壳体5的上表面的边缘处，设计了用于标识样品的标识符号7。纵向采用1～6数字符号，横向采用A～H字母符号。这样，第一个样品槽的样品可以以样品1A标记，便于检测结果统计。

本实施例每个检测项的检测物采用4个重复的点位设计，具体的点阵分布如表1所示。

表1实施例1点阵分布表

采用9×8分布，每个检测项的检测物设有4个重复的点位，没有设置阳性质控和阴性质控点。

实施例2

本实施例采用制备例的制备方法制备，使用1％的明胶封闭剂。

本实施例同样采用6×8共48个孔的样品槽设计，采用长方形方孔。

本实施例的底板4上设计凸出面，所述凸出面凸出3～5mm。底板4的凸出面的形状与弹性橡胶片3相适配。

本实施例同样设计了用于标识样品的标识符号7。同样采用纵向采用1～6数字符号，横向采用A～H字母符号。

本实施例每个检测项的检测物采用3个重复的点位设计，具体的点阵分布如表2所示。

表2实施例2点阵分布表

采用7×7分布，每个检测项的检测物设有2个重复的点位，阳性质控和阴性质控点设有3个重复点。

实验例

以本申请实施例1和实施例2的检测芯片，配以本申请的检测试剂盒，进行样品检测。以ELISA检测方法作为对比例进行精度比较。具体检测结果见表4～表7。

配液：模拟人体血样，分别配制含有4种、8种、12种、18种肿瘤标志物的标准样品，记为样品1、样品2、样品3和样品4。配制的各样品的标志物标准浓度见表3。

表3样品标准浓度表检测：采用实施例1和实施例2的检测芯片，配以本申请的检测试剂盒分别对上述样品进行检测。设备：生物芯片阅读仪(型号：GL-BR-01)。

检测方法：依照检测试剂盒说明书分别用试剂盒标准品对样品1、样品2、样品3、样品4进行浓度定量测定。

对照检测：以目前ELISA检测方法对上述样品进行检测，采用标准的ELISA检测流程操作。

表4样品1检测数据表

表5样品2检测数据表

表6样品3检测数据表

表7样品4检测数据表将表4～表7的检测数据与表3的配液标准浓度数据进行对比，以判断本申请的检测精度。

通过将实施例1的检测数据和ELISA单项检测的数据进行对比，可以看出，本申请集成了18项检测指标后，检测误差与ELISA单项检测的检测误差较为接近，总体检测误差基本上能够控制在15％以内，基本能够满足医学检测的需要。

通过将实施例2的检测数据和ELISA单项检测的数据进行对比，可以看出，本申请集成了18项检测指标后，并且采用本申请特定设计的蛋白点阵布局后，检测误差与ELISA单项检测的检测误差十分接近，18项检测指标的每项检测误差均能够控制在10％以内，完全能够满足医学检测的需要。

本申请可以一次性检测18项指标，单人样本的检测耗时，与目前的ELISA单项检测相比能够节省20倍以上；而多人样本的检测耗时，与目前的ELISA单项检测相比能够节省上百倍，极大缩短了检测时间，大幅提升了检测效率。同时，本申请单人即可操作，一次可以检测最多48人，与目前的ELISA单项检测相比，能够极大的降低人工成本。

以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多肿瘤标志物检测芯片，包括可拆卸连接的上盖(1)和芯片壳体(5)，所述芯片壳体(5)内设置有用于容纳蛋白质芯片组件的容腔，其特征在于，所述芯片壳体(5)内自下而上依次设置有底板(4)、弹性橡胶片(3)和固相载体(2)；所述弹性橡胶片(3)上开设有多个孔，所述底板(4)上对应开设有多个槽，所述上盖(1)上也对应开设有多个孔；所述弹性橡胶片(3)顶面与固相载体(2)底面粘接固定，所述弹性橡胶片(3)的底面与底板(4)顶面固定连接；所述固相载体(2)采用硝酸纤维素膜，在所述固相载体(2)的顶面、与弹性橡胶片(3)上多个孔对应的区域均设有蛋白点阵，所述蛋白点阵分别负载有检测βHCG、PGI、PGII、CA72-4、CA19-9、CA50、CA242、CA15-3、CA125、CEA、S100、β2-MG、FER、NSE、Cyfra21-1、SCC、proGRP和HE4的检测物。

2.根据权利要求1所述的多肿瘤标志物检测芯片，其特征在于，所述弹性橡胶片(3)开设有6×8共48个孔，所述底板(4)上对应开设有48个槽，所述上盖(1)上对应开设有48个孔。

3.根据权利要求2所述的多肿瘤标志物检测芯片，其特征在于，所述弹性橡胶片(3)上开设的孔为圆形或方形，所述底板(4)上对应开设的槽和所述上盖(1)上对应开设的孔的形状与所述弹性橡胶片(3)上开设的孔的形状相同。

4.根据权利要求1所述的多肿瘤标志物检测芯片，其特征在于，所述每个检测项的检测物设有2～4个重复的点位，所述蛋白点阵还设有阴性质控点NC阳性质控点PC。

5.根据权利要求4所述的多肿瘤标志物检测芯片，其特征在于，所述点阵分布采用下述列表的分布方式，

采用7×7分布，每个检测项的检测物设有2个重复的点位，阳性质控NC和阴性质控PC设有3个重复点。

6.根据权利要求1所述的多肿瘤标志物检测芯片，其特征在于，所述底板(4)设有凸出面，所述凸出面的面积小于底板(4)。

7.根据权利要求1所述的多肿瘤标志物检测芯片，其特征在于，所述底板(4)、弹性橡胶片(3)和固相载体(2)的边角处设有位置标识(6)。

8.根据权利要求1所述的多肿瘤标志物检测芯片，其特征在于，所述检测物采用小牛血清封闭剂，小牛血清和/或明胶封闭剂中的一种进行封闭处理。

9.根据权利要求1所述的多肿瘤标志物检测芯片，其特征在于，所述芯片壳体(5)和/或上盖(1)上设有用于标识样品的标识符号(7)。

10.一种多肿瘤标志物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～9所述的多肿瘤标志物检测芯片，还包括洗涤液、反应液、复溶剂和检测液、质控品和校准品。

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