CN115266881A - 一种光电化学生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种光电化学生物传感器，属于生物传感器技术领域。本发明的光电化学生物传感器包括电极、涂覆在电极表面的电极材料以及锚定在所述电极材料表面的核酸适配体；电极材料的制备方法包括：将聚合物‑金属有机框架材料和In3+盐在In3+盐的良溶剂中分散均匀后，去除溶剂，将所得固体在500～800℃进行碳化处理，即得；聚合物‑金属有机框架材料由Ce3+离子和配体自组装形成；配体包括均苯三甲酸以及重复单元含苯环的聚合物配体。光电化学生物传感器采用的电极材料具有更显著的光生电子和空穴的分离能力、分步更加均匀的金属纳米颗粒以及对适配体链的高生物亲和力，在检测致病性大肠杆菌等食源性致病菌方面表现出巨大的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种光电化学生物传感器，属于生物传感器技术领域。
背景技术
饮用水和生食中水传播病原体的流行是一个突出的健康负担，影响着全球发达国家和发展中国家的6亿人，因为它们更容易进入食物链。大肠杆菌(E.coli)O157：H7是一种众所周知的多宿主病原体，可通过入侵肠道上皮引起感染，导致胃肠炎和相关疾病。食源性致病菌的传统检测方法主要依赖于特定的生化和分子鉴定，通常涉及富集、分离和多步骤检测过程，导致耗时(最长达7天)此外，免疫传感策略依赖于抗体的使用，必须在体内合成，导致较多的缺点，如成本高，复杂的生产过程、捕获分子的新目标有限，并且物理和化学稳定性差。另外，在探索适配体的基础上，已经制造了多种生物传感器，即单链RNA或DNA聚核苷酸。由于适配体与大肠杆菌O157：H7的特异性结合，与传统方法和免疫传感器相比，适配体生物传感器(适配体传感器)往往表现出更高的特异性和亲和力。到目前为止，多种方法已被广泛用于大肠杆菌O157：H7的测定，包括化学发光，SERS、比色法、荧光法、电化学技术和光电化学法(PEC)方法。其中，PEC生物分析方法基于光作为激发源和电作为检测信号，灵敏度高、背景广泛，如抗生素、重金属离子、生物标记物、食源性细菌、疾病标记物和癌细胞。
光活性材料和生物受体是高效地构建PEC传感器的两个关键问题。光活性材料如氮化碳、多金属有机框架、新型金属、金属氧化物、金属硫化物等经常被用作PEC传感器电极材料。同时，固定在PEC电极上的不同生物受体，如抗体、DNA链、适配体或酶，被用于特异性识别和捕获分析物。研究者基于三维石墨烯水凝胶负载碳量子点(C-dots/3DGH)和类石墨烯氮化碳(g-C3N4)构建了不同的PEC生物传感器，AuNPs/BiOI/304SS、核壳结构上转换纳米磷酸粉(UCNPs)@SiO2@Ag和碳自掺杂石墨氮化碳(C-g-C3N4)和dWO3·H2O@N-GQD已被用于检测大肠杆菌O157：H7，但是由于这些材料通常由两组分或多组分构成，组分间接触松散或者制备过程复杂，这在某种程度上降低了所开发的PEC生物传感器的传感性能和稳定性，在检测大肠杆菌时普遍存在检测下限较高。再如，Xiuxiu Dong等人在《CdS quantum dots/Aunanoparticles/ZnO nanowire array for self-powered photoelectrochemicaldetection of Escherichia coli O157:H7》(Biosensors and Bioelectronics 149(2020)111843)提供了一种基于CdS量子点/Au NPs/ZnO的光电化学适配体传感器，该光电化学生物传感器采用的电极材料的制备方法及检测过程包括以下步骤：(1)将ZnO纳米线修饰到FTO导电玻璃上得到ZnO NWs/FTO电极；(2)将Au NPs复合到ZnO上得到Au NPs/ZnONWs/FTO电极；(3)以CdS改性aptamer得到CdS QDs@E.coli aptamer复合物；(4)将CdS QDs@aptamer复合物固定到Au NPs/ZnO NWs/FTO电极上；(5)采用blocking试剂进行封闭处理；(6)识别E.coli以光电流信号进行检测。该光电化学生物传感器采用AuNPs和CdS量子点进行有效的信号放大的优点，但电极材料构筑过程复杂，使得以其构建的光电化学生物传感器在检测大肠杆菌时检测下限较高(1.125CFU mL-1)，难以满足检测需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种光电化学生物传感器，能够显著降低光电化学生物传感器在检测大肠杆菌时的检测下限。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种光电化学生物传感器，包括电极、涂覆在电极表面的电极材料以及锚定在所述电极材料表面的核酸适配体；所述电极材料的制备方法，包括以下步骤：将聚合物-金属有机框架材料和In3+盐在In3+盐的良溶剂中分散均匀后，去除溶剂，然后将所得固体在500～800℃进行碳化处理，即得；所述聚合物-金属有机框架材料由Ce3+离子和配体在溶剂中进行自组装形成；所述配体包括聚合物配体和均苯三甲酸；所述聚合物配体的重复单元中含有苯环。
本发明光电化学生物传感器所采用的电极材料在制备时，将铟离子吸附在聚合物-金属有机框架材料中进行碳化处理，生成CeO2-In2O3和介孔碳的杂化材料，其中CeO2和In2O3嵌入碳网络中。与对苯二甲酸小分子配体合成的Ce-MOF相比，本发明采用的聚合物-金属有机框架化合物具有大比表面积、大的孔径和可调的结构，可使碳化后的电极材料具有更高的多孔碳含量，并且具有大比面积、大孔径、多功能性等优点，有利于金属氧化物颗粒的均匀分布，增强电极材料对可见光吸收能力和光电子转移性能。此外，由于In2O3和CeO2均是具有光学活性的n型半导体，可以于接触界面处形成新的异质结，展现出高效电荷分离和载流子寿命延长的协同效应，从而提高光电化学生物传感器对分析物的检测能力。
本发明的光电化学生物传感器所采用的电极材料具有更显著的光生电子和空穴的分离能力、分布更加均匀的金属纳米颗粒以及对适配体链的高生物亲和力，是一种性能优越的光活性材料，能够使光电化学生物传感器在检测致病性大肠杆菌等食源性致病菌方面具有巨大的潜力。在对食源性致病菌检测时，利用适配体链与类石墨烯结构的In2O3/CeO2@mNC电极材料之间的π-π堆叠和范德华力相互作用，以及通过适配体链骨架上荷负电的磷酸基团与In2O3/CeO2@mNC杂化材料上的带正电荷的N基团之间的静电作用使大量食源性致病菌被适配体靶向固定，显示了对大肠杆菌等食源性病原菌优异的检测性能。例如对致病性大肠杆菌(E.coli)检测时，其检测限可低至0.12CFU·mL-1，低于大多数报道的大肠杆菌生物传感器，具有较高的稳定性和选择性、良好的重现性和预期的再生能力。
均苯三甲酸作为共配体合成polyMOF材料，起到调节剂的作用，使得所形成的polyMOF(Ce)骨架中聚合物配体单元部分被均苯三甲酸所替代，从而形成丰富的缺陷位点。进而将polyMOF(Ce)吸附In3+后煅烧所制备的In2O3/CeO2@mNC含有丰富的缺陷位点，有利于光电化学活性的提高。
进一步地，所述聚合物配体的重复单元具有式I所示的结构：
式I中，x为5-12。
更进一步地，所述聚合物配体是将2,5-二羟基对苯二甲酸二酯与二卤代烷烃在碱的作用下于有机溶剂中进行酚羟基的醚化反应，再将醚化反应产物进行酯键的水解得到。所述醚化反应的温度为80～120℃，时间为18～36h。例如，所述的醚化反应的温度为100℃，时间为24h。所述碱为碳酸钾，每4.7mol的2,5-二羟基对苯二甲酸二酯对应采用19～20mol的碳酸钾和10～15mL的有机溶剂，例如每4.7mol的2,5-二羟基对苯二甲酸二酯对应采用19mol的碳酸钾和10mL的有机溶剂。
进一步地，所述2,5-二羟基对苯二甲酸二酯与二卤代烷烃的摩尔比为1:1～1.2，例如为1；所述二卤代烷烃为二溴代烷烃；所述二溴代烷烃为1,8-二溴代辛烷；所述2,5-二羟基对苯二甲酸二酯为2,5-二羟基对苯二甲酸二甲酯；醚化反应时采用有机溶剂为二氯甲烷。
进一步地，所述水解是将醚化反应产物溶解在有机溶剂中，然后加入碱液搅拌24h或至体系变清。水解时采用的有机溶剂是将四氢呋喃(THF)和水按照体积为1:1进行混合得到。所述碱液为氢氧化钠溶液。加入碱液中氢氧化钠的质量与醚化反应产物的体积之比为300g:60mL。水解反应结束后蒸发去除四氢呋喃，然后采用酸调整剩余液体的pH至1析出固体，再对固体进行洗涤、干燥。所采用的酸为盐酸，盐酸的浓度为4mol/L。
可以理解的是，In3+盐的良溶剂足以将In3+盐完全溶解。所述In3+盐的良溶剂为水。进一步地，所述聚合物-金属有机框架材料与In3+盐的质量比为1:2～3，例如为1:3；所述In3 +盐为InCl3。
进一步地，所述去除溶剂是将聚合物-金属有机框架材料和In3+盐在In3+盐的良溶剂中分散均匀后的体系进行冷冻干燥。
进一步地，所述聚合物-金属有机框架材料是将混合溶液进行溶剂热反应得到的；所述混合溶液为聚合物配体、均苯三甲酸和Ce3+盐溶解在有机溶剂中形成的溶液；所述溶剂热反应的温度为100～120℃，时间为18～36h。例如所述溶剂热反应的温度为100℃，时间为24h。所述均苯三甲酸、Ce3+离子、聚合物配体中式I所示重复单元的摩尔比为0.3～0.6:1:0.2～0.5，例如为0.33:1:0.222。所述混合溶液中，有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺。为了减少溶剂热反应生成的聚合物-金属有机框架材料中的杂质，对溶剂热反应产物采用水和有机溶剂交替进行洗涤，然后真空干燥。洗涤时采用的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，真空干燥的温度为60℃。
进一步地，所述碳化处理在N2气氛中进行；在N2气氛中进行碳化处理，能够在形成的电极材料中掺入N元素，增加对适配体的生物亲和性，从而在材料表面固定更多的适配体。进一步地，所述碳化处理的温度为700℃。所述碳化处理的时间为2-3h，例如为2h；升温至碳化处理温度的升温速率为2-5℃/min，例如为2℃/min。进一步地，所述碳化处理是将聚合物-金属有机框架材料在N2气氛中于500～800℃进行保温处理2-3h。
进一步地，所述核酸适配体为大肠杆菌靶向适配体。所述大肠杆菌靶向适配体的核苷酸序列为5′-GCAATGGTACGGTACTCC-N45-CAAAAGTGTACTTTGCTAA-3′。所述电极为玻璃碳电极。
上述的光电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：将电极材料分散液涂覆在电极表面，干燥后浸入到核酸适配体溶液中进行孵育，即得。
进一步地，所述电极材料分散液中电极材料的浓度为1～7mg/mL；所述核酸适配体溶液的浓度为10～200nmol·L-1。
为了进一步地提高光电化学生物传感器的性能，所述的光电化学生物传感器用电极材料分散液的浓度为5～7mg/mL。所述核酸适配体溶液的浓度为100～200nmol·L-1。
进一步地，所述孵育的温度为4℃。所述孵育的时间为1h。
附图说明
图1：(a)为polyMOF(Ce)的低倍SEM图，(b)为polyMOF(Ce)的高倍SEM图，(c)为polyMOF(Ce)的TEM图，(d)为polyMOF(Ce)的EDS图像，(e)为polyMOF(Ce)的EDS能谱图，(f)为polyMOF(Ce)的有机配体L8和polyMOF(Ce)的FT-IR光谱图，(g)为polyMOF(Ce)的XRD图谱，(h)为polyMOF(Ce)的N2吸附-脱附等温线(插图是孔径分布曲线)；
图2：(a)为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的低倍SEM图，(b)为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的高倍SEM图像，(c)为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的EDS光谱，(d)为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的低倍SEM图，(e)为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的高倍SEM图像，(f)为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的EDS光谱，(g)为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的低倍SEM图，(h)为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的高倍SEM图像，(i)为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的EDS光谱；
图3：(a)为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的低分辨率TEM图，(b)为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的高分辨率TEM，(c)为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的EDS图像，(d)为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的低分辨率TEM图，(e)为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的高分辨率TEM，(f)为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的EDS图像，(g)为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的低分辨率TEM图，(h)为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的高分辨率TEM，(i)为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的EDS图像；
图4：(a)为(i)In2O3/CeO2@mNC500、(ii)In2O3/CeO2@mNC700、(iii)In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的XRD图，(b)为(i)In2O3/CeO2@mNC500、(ii)In2O3/CeO2@mNC700、(iii)In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的拉曼光谱图，(c)为(i)In2O3/CeO2@mNC500、(ii)In2O3/CeO2@mNC700、(iii)In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的N2吸附-解吸等温线(插图为孔径分布曲线)；
图5：(a)为(i)PolyMOF(Ce)、(ii)In2O3/CeO2@mNC500、(iii)In2O3/CeO2@mNC700、(iv)In2O3/CeO2@mNC800的XPS谱图，(b)为polyMOF(Ce)的高分辨(i)C 1s、(ii)Ce 3d、(iii)O 1s谱图，(c)为(i)In2O3/CeO2@mNC500、(ii)In2O3/CeO2@mNC700、(iii)In2O3/CeO2@mNC800的Ce 3d谱图，(d)为(i)In2O3/CeO2@mNC500、(ii)In2O3/CeO2@mNC700、(iii)In2O3/CeO2@mNC800的In 3d谱图，(e)为(i)In2O3/CeO2@mNC500、(ii)In2O3/CeO2@mNC700、(iii)In2O3/CeO2@mNC800的C1s谱图，(f)为(i)In2O3/CeO2@mNC500、(ii)In2O3/CeO2@mNC700、(iii)In2O3/CeO2@mNC800的O1s谱图；
图6：Apt/In2O3/CeO2@mNC700的高分辨率XPS光谱；
图7：(a)为(i)polyMOF(Ce)、(ii)In2O3/CeO2@mNC500、(iii)In2O3/CeO2@mNC700、(iv)In2O3/CeO2@mNC800的紫外-可见漫反射光谱，(b)为(i)polyMOF(Ce)，(ii)In2O3/CeO2@mNC500(iii)In2O3/CeO2@mNC700和(iv)In2O3/CeO2@mNC800的(αhν)2与光能(hν)的关系曲线，(c)为(i)polyMOF(Ce)，(ii)In2O3/CeO2@mNC500(iii)In2O3/CeO2@mNC700和(iv)In2O3/CeO2@mNC800的莫特-肖特基图(插图是In2O3/CeO2@mNC700的放图)，(d)为(i)polyMOF(Ce)，(ii)In2O3/CeO2@mNC500(iii)In2O3/CeO2@mNC700和(iv)In2O3/CeO2@mNC800的PL光谱，(e)为(i)polyMOF(Ce)，(ii)In2O3/CeO2@mNC500(iii)In2O3/CeO2@mNC700和(iv)In2O3/CeO2@mNC800的电化学阻抗谱图(插图：等效电路模型)，(f)为(i)polyMOF(Ce)，(ii)In2O3/CeO2@mNC500(iii)In2O3/CeO2@mNC700和(iv)In2O3/CeO2@mNC800的光电流响应曲线图；
图8：(a)为改性玻璃碳电极In2O3/CeO2@mNC500/GCE、光电化学生物传感器Apt/In2O3/CeO2@mNC500/GCE在检测大肠杆菌前(Apt/In2O3/CeO2@mNC500/GCE)后(E.coli/Apt/In2O3/CeO2@mNC500/GCE)的光电曲线，(b)为改性玻璃碳电极In2O3/CeO2@mNC700/GCE、光电化学生物传感器Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE在检测大肠杆菌的前(Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE)后(E.coli/Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE)的光电曲线，(c)为不同浓度的In2O3/CeO2@mNC700(制备时采用的In2O3/CeO2@mNC700浓度分别为1、1.5、3、5和7mg·mL-1)在检测大肠杆菌时前后的光电流变化图，(d)为不同适配体浓度的光电化学生物传感器(制备时采用的核酸适配体溶液浓度分别为10、20、50、100和200nmol·L-1)在检测大肠杆菌时前后的光电流变化曲线；
图9：(a)为In2O3/CeO2@mNC700/GCE、Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE、E.coli/Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE在检测大肠杆菌的光电曲线，(b)为针对采用In2O3/CeO2@mNC500、In2O3/CeO2@mNC700、In2O3/CeO2@mNC800的改性玻璃碳电极的(Imaterial-IGCE)、(Imaterial-Iaptamer)、(Iaptamer-IE.coli)的光电流差值柱状图，IGCE、Imaterial、Iaptamer、IE.coli依次为裸玻璃碳电极、涂覆电极材料改性玻璃碳电极、改性玻璃碳电极锚定核酸适配体后、光电化学生物传感器检测大肠杆菌后的光电流，(c)为光电化学生物传感器Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE的检测不同浓度大肠杆菌的光电响应(大肠杆菌浓度10、100、1000、1×104、1×105、1×106和1×107CFU·mL-1)曲线，(d)为光电化学生物传感器Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE在检测大肠杆菌前后光电流强度的变化与大肠杆菌浓度的关系曲线图，(插图：光电流密度差值与大肠杆菌浓度对数之间的关系，n＝3)；
图10：(a)为实施例5中制备的基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器检测枯草芽孢杆菌(1000CFU·mL-1)、金黄色葡萄球菌(1000CFU·mL-1)、鼠伤寒沙门菌(1000CFU·mL-1)、大肠杆菌(10CFU·mL-1)和前述4种菌的混合物(枯草芽孢杆菌1000CFU·mL-1、金黄色葡萄球菌1000CFU·mL-1、鼠伤寒沙门菌1000CFU·mL-1、大肠杆菌10CFU·mL-1)的选择性，(b)为实施例5中制备的基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器检测大肠杆菌的重现性(10CFU·mL-1)结果图，(c)为实施例5中制备的基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器在15天内对大肠杆菌(10CFU·mL-1)的存储稳定性结果图，(d)为实施例5中制备的基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器检测10CFU·mL-1大肠杆菌的再生性的结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
以下实施例以及对比例中采用的均苯三甲酸和Ce(NO3)3·6H2O购自KaishuChemical Technology Co Ltd.(中国上海)。InCl3、N,N-二甲基甲酰胺购自上海阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)。K2CO3、1,8-二溴辛烷(THF)购自洛阳昊华化学试剂有限公司(中国河南)。四氢呋喃由天津富宇精细化工有限公司(中国天津)提供。所有其他化学品均为分析试剂级，无需进一步纯化即可使用。大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌以及大肠杆菌的适体购自Solarbio Sciences Co.，在整个实验中使用超纯水在25℃时电阻率为18.2Ωcm，采用的核酸适配体为大肠杆菌核酸适配体，核苷酸序列为5′-GCAATGGTACGGTACTCC-N45-CAAAAGTGTACTTTGCTAA-3′。
实施例以及对比例以PBS 0.1mol·L-1，pH＝7.4的磷酸盐缓冲液为生物缓冲液，制备时在适量的超纯水中溶解0.242g KH2PO4、1.445g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl和8.003gNaCl，然后加入0.1mol·L-1的盐酸调整溶液pH为7.4。测试使用的电解液现配现用，配制时将1.65g K3Fe(CN)6、2.11g K4Fe(CN)6·3H2O和7.5g KCl溶于PBS(1.0L)中即得到测试电解液；大肠杆菌适配体原液(100nmol·L-1)、不同浓度的大肠杆菌溶液(10、100、1000、104、105、106、107CFU·mL-1)和其他溶液(其他干扰物细菌溶液)用0.1mol·L-1PBS(pH 7.4)制备，4℃储存。
实施例以及实验例中采用的有机配体L8采用包括以下步骤的方法获得：
1)将2,5-二羟基对苯二甲酸(1.98g，10mmol)加入250mL圆底烧瓶中，然后加入100mL甲醇和4mL浓硫酸(95％)，得到反应混合物。将该反应混合物在80℃下回流12小时，然后减压蒸发溶剂，得到浓缩物。
2)在所得浓缩物中加水进行溶解，然后加入碳酸氢钠的饱和溶液进行中和，得到中和溶液。随后用二氯甲烷(DCM)对中和溶液中的有机物萃取两次，将两次萃取的有机相进行混合，然后蒸发掉二氯甲烷，得到黄色的固体化合物(即2,5-二羟基对苯二甲酸二甲酯)；
3)取制得的2,5-二羟基对苯二甲酸二甲酯1.06g(4.7mmol)溶解20mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加热至100℃，在100℃下加入2.6g K2CO3(19mmol)和1,8-二溴辛烷(4.7mmol)，然后在惰性条件下于100℃加热反应24小时。反应结束后，将反应所得体系进行离心，将离心所得液相溶解在60mL混合溶剂(所采用的混合溶剂是将四氢呋喃(THF)和水按照体积为1:1进行混合得到)中。然后加入300mg氢氧化钠(溶于水中)。将混合物搅拌24h，或直到溶液变清。蒸发去除四氢呋喃，再使用4mol·L-1的盐酸将蒸发去除四氢呋喃后剩余溶液酸化至pH值为1析出固体，然后通过真空过滤收集所得固体。随后用大量的4mol·L-1的盐酸和水交替洗涤真空过滤收集所得固体，以去除未反应的盐。再将所得固体在40℃的真空烘箱中干燥4小时，得到聚合物配体(有机配体L8)。所得有机配体L8的重复单元如下式所示：
实施例1
本实施例的光电化学生物传感器用电极材料的制备方法，包括以下步骤：
1)将75.03mg有机配体L8(重复单元含量为0.222mmol)、69.34mg均苯三甲酸(0.33mmol)和291.07mg Ce(NO3)3·6H2O(1mmol)分别溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后将得到的三种溶液混合，得到混合液。
2)将所得的混合液进行超声处理10min后转移到聚四氟乙烯内衬的钢制高压釜中，并在100℃下加热24小时，反应结束后过滤，再将得到的固体粉末分别用DMF和无水乙醇各洗涤3次(交替进行)。最后，将洗涤后的白色固体在60℃的真空干燥箱中干燥，得到polyMOF(Ce)；
3)取100mg制得的polyMOF(Ce)和300mg InCl3同时分散到10mL的Milli-Q水中，然后搅拌6h混合均匀，对混合物进行冷冻干燥。然后将冷冻干燥得到的粉末装入坩埚中，并放置在位于管式炉内的流式石英管的中心。随后在石英管中通入纯氮气，流速为200mL·min-1。然后以2℃·min-1升温速率将石英管加热至500℃并保温2h，随后将石英管式炉冷却至室温，得到黑色粉末(标记为In2O3/CeO2@mNC500)，即得。
实施例2
本实施例的光电化学生物传感器用电极材料的制备方法，与实施例1的光电化学生物传感器用电极材料的制备方法的区别仅在于：本实施例的步骤3)中，是以2℃·min-1升温速率将石英管加热至700℃并保温2h。随后将石英管式炉冷却至室温。本实施例制得的光电化学生物传感器用电极材料标记为In2O3/CeO2@mNC700。
实施例3
本实施例的光电化学生物传感器用电极材料的制备方法，与实施例1的光电化学生物传感器用电极材料的制备方法的区别仅在于：本实施例的步骤3)中，是以2℃·min-1升温速率将石英管加热至800℃并保温2h。随后将石英管式炉冷却至室温。本实施例制得的电化学生物传感器电极材料标记为In2O3/CeO2@mNC800。
实施例4
本实施例的光电化学生物传感器用电极材料的制备方法，包括以下步骤：
1)将实施例1制备的光电化学生物传感器用电极材料(In2O3/CeO2@mNC500)分别分散在超纯水形成均匀分散的In2O3/CeO2@mNC500浓度为5mg·mL-1的电极材料分散液。
2)然后将10μL的步骤1)中制备的电极材料分散液涂覆在玻璃碳电极(GCE)上，然后自然干燥6h，得到改性玻璃碳电极(标记为In2O3/CeO2@mNC500/GCE)；
3)将构建的改性玻璃碳电极放入核酸适配体溶液(核酸适配体浓度100nmol·L-1)中，在4℃下孵育1h，通过堆叠作用、范德华力、氢键以及静电吸附作用力使足够的、饱和的核酸适配体固定在In2O3/CeO2@mNC500网络上，得到光电化学生物传感器(标记为Apt/In2O3/CeO2@mNC500/GCE)。使用前，将制备的光电化学生物传感器在4℃下保存。
步骤2)中构建的改性玻璃碳电极在使用前在4℃储存。
实施例5
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例4的制备方法的区别仅在于：本实施例所采用的光电化学生物传感器用电极材料为实施例2制备的光电化学生物传感器用电极材料。本实施例制得的改性玻璃碳电极标记为In2O3/CeO2@mNC700/GCE，最终制得的光电化学生物传感器标记为Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE。
实施例6
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例4的制备方法的区别仅在于：本实施例所采用的光电化学生物传感器用电极材料为实施例3制备的光电化学生物传感器用电极材料。本实施例制得的改性玻璃碳电极标记为In2O3/CeO2@mNC800/GCE，最终制得的电化学生物传感器标记为Apt/In2O3/CeO2@mNC800/GCE。
实施例7
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例5的制备方法的区别仅在于：本实施例的步骤1)中制备的电极材料分散液中In2O3/CeO2@mNC700浓度为1mg·mL-1；步骤2)中是将该浓度的电极材料涂覆在玻璃碳电极上。本实施例制得的改性玻璃碳电极标记为In2O3/CeO2@mNC700-1/GCE，最终制得的光电化学生物传感器标记为Apt/In2O3/CeO2@mNC700-1/GCE。
实施例8
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例5的制备方法的区别仅在于：本实施例的步骤1)中制备的电极材料分散液中In2O3/CeO2@mNC700浓度为1.5mg·mL-1；步骤2)中是将该浓度的电极材料涂覆在玻璃碳电极上。本实施例制得的改性玻璃碳电极标记为In2O3/CeO2@mNC700-1.5/GCE，最终制得的光电化学生物传感器标记为Apt/In2O3/CeO2@mNC700-1.5/GCE。
实施例9
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例5的制备方法的区别仅在于：本实施例的步骤1)中制备的电极材料分散液中In2O3/CeO2@mNC700浓度为3mg·mL-1；步骤2)中是将该浓度的电极材料涂覆在玻璃碳电极上。本实施例制得的改性玻璃碳电极标记为In2O3/CeO2@mNC700-3/GCE，最终制得的光电化学生物传感器标记为Apt/In2O3/CeO2@mNC700-3/GCE。
实施例10
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例5的制备方法的区别仅在于：本实施例的步骤1)中制备的电极材料分散液中In2O3/CeO2@mNC700浓度为7mg·mL-1；步骤2)中是将该浓度的电极材料涂覆在玻璃碳电极上。本实施例制得的改性玻璃碳电极标记为In2O3/CeO2@mNC700-7/GCE，最终制得的光电化学生物传感器标记为Apt/In2O3/CeO2@mNC700-7/GCE。
实施例11
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例5的制备方法的区别仅在于：本实施例采用的核酸适配体溶液浓度为10nM。本实施例制得的光电化学生物传感器标记为Apt10/In2O3/CeO2@mNC700/GCE。
实施例12
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例5的制备方法的区别仅在于：本实施例采用的核酸适配体溶液浓度为20nM。本实施例制得的光电化学生物传感器标记为Apt20/In2O3/CeO2@mNC700/GCE。
实施例13
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例5的制备方法的区别仅在于：本实施例采用的核酸适配体溶液浓度为50nM。本实施例制得的光电化学生物传感器标记为Apt50/In2O3/CeO2@mNC700/GCE。
实施例14
本实施例的光电化学生物传感器的制备方法，与实施例5的制备方法的区别仅在于：本实施例采用的核酸适配体溶液浓度为200nM。本实施例制得的光电化学生物传感器标记为Apt200/In2O3/CeO2@mNC700/GCE。
以下实验例中的PEC检测采用三电极系统，以Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极。所有电化学测试都是在光电化学反应池中进行的，使用300W氙灯光源并配备波长400nm的截止滤光片，在室温下进行测量。使用PBS(0.1mol·L-1，pH 7.4)作为电解质，偏置电压为0V(相对于Ag/AgCl)。
实验例
1)实施例1中制备的polyMOF(Ce)的基础表征
a)采用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)对polyMOF(Ce)的表面形貌和纳米结构进行表征，结果见图1a～1c。
图1a表明polyMOF(Ce)由不同长度的不规则纳米棒组成，它们组装成大量的块体结构(图1b)。polyMOF(Ce)的TEM图像(图1c)可以进一步证明这一发现。
b)对polyMOF(Ce)进行能谱分析(EDS)，结果如图1d～1e所示。
从图1d和1e可以看出，Ce、C、O和N元素在整个区域内均匀分布，Ce元素含量为58.49％、C元素含量为16.4％、O元素含量为23.78％、N元素含量为1.33％。
c)对有机配体L8和polyMOF(Ce)进行FT-IR表征，结果见图1f。
从图1f可以看出，polyMOF(Ce)在2854cm-1和2940cm-1处的峰为来自有机配体L8中-CH2和-CH3的吸收峰，表明polyMOF(Ce)的成功制备。
d)通过粉末X射线衍射(PXRD)表征polyMOF(Ce)的晶体结构，结果见图1g。
从图1g可以看出，在2θ＝13.76°处出现特征衍射峰。根据Scherrer方程，衍射峰较宽并且存在小晶体结构，为MOF的形成提供了证据。聚合物链的表面官能团化，高分子量和半结晶的特征通过衍射峰(19.06°和23.22°)得到证实。
e)分别在N2，77K条件下测试样品的吸脱附曲线和孔径分布，然后绘制polyMOF(Ce)的N2吸附-解吸等温线，结果见图1h。
图1h中polyMOF(Ce)的N2吸附-解吸等温线显示出H3滞后回线。结果观察到，polyMOF(Ce)的比表面积为146.46m2·g-1，孔径为18.99nm(图1h的插图)。相比之下，polyMOF(Ce)的比表面积低于普通MOF，这主要是由于使用了聚合物配体，并且孔被亚甲基链所填充。
2)光电化学生物传感器用电极材料的基础表征
a)采用扫描电子显微镜对实施例1～3中制备的光电化学生物传感器用电极材料并进行能谱分析(EDS)，结果见图2a～2i。
从图2a和2b可以看出，在N2气氛下，于500℃保温2h后，In2O3/CeO2@mNC500杂化材料中纳米棒部分破碎。从图2d和2e可以看出，In2O3/CeO2@mNC700杂化材料具有相对分散的结构，其中产生了大量的小纳米颗粒。然而从图2g和2h可以看出，在In2O3/CeO2@mNC800杂化材料中产生了大的固体纳米结构，并被组装成大尺寸的结构。结果表明，polyMOF(Ce)的聚合物网络在适当温度下热解，碳化为介孔碳纳米片。在较高的温度(800℃)下，大部分的碳成分被氧化成小分子。金属氧化物颗粒产生了显著堆叠现象，导致了致密的金属合金结构。由图2c、2f和2i可知，In2O3/CeO2@mNC500,In2O3/CeO2@mNC700,和In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的Ce原子比随着煅烧温度的升高而降低，分别为53.21％,51.28％和32.62％,三种In2O3/CeO2@mNC杂化材料中In的原子含量在1.94–3.09％之间。
b)采用透射电子显微镜分析对实施例1～3中制备的光电化学生物传感器用电极材料，结果见图3a、3b、3d、3e、3g和3h。
图3a为In2O3/CeO2@mNC500的透射电镜图像，显示了多孔的海绵状结构，其中没有观察到明显的大的纳米颗粒。这表明，由聚合物链衍生的介孔碳网络可以防止形成的金属氧化物聚集成大颗粒，这与由小分子配体制备的MOFs衍生的过渡金属氧化物有所不同。此外，在高分辨率透射电镜图像(图3b)中，存在间距分别为0.31和0.29nm的清晰晶格条纹，分别归于CeO2和In2O3。此外，在HR-TEM图像中也观察到明显的褶皱，证明了石墨碳的形成。
图3d和3e为In2O3/CeO2@mNC700的TEM图像，与In2O3/CeO2@mNC500类似，多孔和松散结构中没有得到明显的颗粒。氧化铈和In2O3的晶格条纹也可以在In2O3/CeO2@mNC700的HR-TEM图像中找到。相比之下，In2O3/CeO2@mNC700中金属颗粒的尺寸小于In2O3/CeO2@mNC500中金属颗粒的尺寸，表明金属颗粒将会更加均匀分布在介孔碳结构中。
从In2O3/CeO2@mNC800的透射电镜图像(图3g)可以看出，材料颜色深，结构较密，但孔隙大。从高倍率的透射电镜图像(图3h)可以看到，In2O3/CeO2@mNC800具有多孔网络以及一些明显的颗粒。此外，HR-TEM图像可以看到明显的CeO2晶格条纹。
c)对实施列1～3中制备的光电化学生物传感器用电极材料进行能谱分析(EDS)，各电极材料的EDS图分别见图3c、3f和3i，各电极材料中各元素的含量见表1。
In2O3/CeO2@mNC500的EDS图像(图3c)表明Ce、In、C、O和N元素均匀分布，其中氮和铟的存在进一步证明了杂原子掺杂的成功。In2O3/CeO2@mNC700的EDS图像(图3f)显示Ce元素只在纳米颗粒中存在，而In、C、N、O存在于整个区域内。In2O3/CeO2@mNC800的EDS图像(图3i)显示Ce和In元素的均匀分布，并且C、N和O元素也均匀分布。
从表1中可以看出，In2O3/CeO2@mNC500、In2O3/CeO2@mNC700和In2O3/CeO2@mNC800中Ce的元素含量比随着煅烧温度的升高而降低，分别为53.21％、51.28％和32.62％。相反，三种杂化材料的C含量均有所增加，分别为20.62％、22.91％和30.48％。这表明，样品的碳化程度随着煅烧温度的增加而增加。此外，随着煅烧温度的升高，In2O3/CeO2@mNC杂化材料中O元素的含量从20.6％增加到31.96％。由于In离子通过吸附被掺杂到polyMOF(Ce)中，三种材料煅烧后的In含量约为2％-3％。
表1各材料中各元素的含量
d)采用铜辐射Kα射线衍射法(λ＝0.15406nm)(XRD,D/MAX-2500V/PC,Rigaku,Japan)对实施例1～3中制备的光电化学生物传感器用电极材料的晶体结构进行表征，结果见图4a。
In2O3/CeO2@mNC系列杂化材料的XRD图(图4a)显示了2θ＝28.6°，33.2°，47.6°，56.4°，59.1°，和69.4°处的衍射峰，分别归属于立方相氧化铈的(111)，(200)，(220)，(311)，(222)和(400)晶面(JCPDS No.34–0394)，而2θ＝为30.6°、35.6°、51.1°和60.6°处的峰值分别为In2O3的(222)、(400)、(440)和(622)(JCPDS No.06-0416)。结果表明，Ce离子被氧化成相应的金属氧化物。CeO2和In2O3都能显著增强材料对可见光的吸收，从而提高PEC响应。此外，In2O3/CeO2@mNC500在2θ＝21.5°处有一个弱而宽的峰，这是由于非晶碳引起的。这一结果表明，polyMOF(Ce)中含有的聚合物网络在500℃时发生热解碳化。然而，相比之下，以均苯三甲酸为配体的Ce-MOF在高温热解制备的杂化材料中没有形成无定形碳。明显地，金属氧化物纳米晶体可以嵌入介孔碳网络中，有效地阻碍电子空穴的复合，提高光电化学电流响应。在In2O3/CeO2@mNC700杂化材料中，可以观察到CeO2和In2O3衍射峰。然而，宽峰的峰值中心出现在2θ＝14.2°处，是由于CeO2和In2O3之间的碳片(非晶碳)所致，而In2O3/CeO2@mNC500样品中峰值在2θ＝21.5°是由于碳层与CeO2或In2O3之间的层间距离所致。然而，对于In2O3/CeO2@mNC800杂化材料，只出现了CeO2纳米颗粒的衍射峰，这与HR-TEM结果一致。
e)分别对实施例1～3制备的光电化学生物传感器用电极材料进行拉曼测试，各材料的拉曼光谱见图4b。
图4b中In2O3/CeO2@mNC系列杂化材料的拉曼光谱，显示了在1390和1590cm-1处的两个峰，分别是由D峰与G峰引起的。D峰与G峰的相对强度(ID/IG)的比值表示石墨化的程度、缺陷。结果表明，三种材料的ID/IG值相似，约为1.0，表明所有材料都存在相似的缺陷，可以显著增强电子转移，提高光电响应。
f)在超高真空条件下，采用Belsorp MAX比表面额孔隙度分析仪在77K下分别对实施例1～3制备的光电化学生物传感器用电极材料进行N2吸附/脱附等温线分析实验，得到的N2吸附-解吸等温线以及孔径分布曲线见图4c，并测量了三种材料的BET表面积、孔径和孔体积，结果见表2。
由图4c可以看出，所有材料均显示出典型的IV型等温线和H3滞后回线，表明具有介孔结构。由表2可以看出，In2O3/CeO2@mNC700具有大的比表面积(448.6m2·g-1)，大于In2O3/CeO2@mNC800(420.2m2·g-1)和In2O3/CeO2@mNC500(339.1m2·g-1)，以及polyMOF(Ce)(146.4m2·g-1)，较大的比表面积可增加适配体链的固定量。在图4c的插图中，可以清楚地观察到，三个杂化材料的孔径在5-10nm范围内下降。这意味着In2O3/CeO2@mNC的介孔结构，提供了适配体链进入孔结构的渗透能力。从而有望提高构建的适体传感器对大肠杆菌的检测灵敏度。
表2 In2O3/CeO2@mNC杂化材料的BET表面积、孔径和孔体积。
| 样品 | BET比表面积(m<sup>2</sup>·g<sup>-1</sup>) | 孔径(nm) | 孔体积(cm<sup>3</sup>·g<sup>-1</sup>) |
| polyMOF(Ce) | 146.4 | 18.99 | 0.526 |
| In<sub>2</sub>O<sub>3</sub>/CeO<sub>2</sub>@mNC<sub>500</sub> | 339.1 | 8.90 | 0.415 |
| In<sub>2</sub>O<sub>3</sub>/CeO<sub>2</sub>@mNC<sub>700</sub> | 448.6 | 9.15 | 0.449 |
| In<sub>2</sub>O<sub>3</sub>/CeO<sub>2</sub>@mNC<sub>800</sub> | 420.2 | 9.25 | 0.493 |
g)分别对实施例1中制备的polyMOF(Ce)、实施例1～3制备的光电化学生物传感器用电极材料的表面化学组成和结构进行X射线光电子能谱(XPS)分析，结果如图5a～5f所示。
在图5a中，i为PolyMOF(Ce)的X射线光电能谱曲线，ii为In2O3/CeO2@mNC500的X射线光电能谱曲线，iii为In2O3/CeO2@mNC700的X射线光电能谱曲线，(iv)为In2O3/CeO2@mNC800的X射线光电能谱曲线。在polyMOF(Ce)的X射线光电能谱曲线上可以同时找到Ce 3d(886.1eV)、C 1s(284.6eV)和O1s(526.1eV)三个信号。In2O3/CeO2@mNC杂化材料中由于含量低，未观察到明显的Ce 3d XPS信号。
图5b为polyMOF(Ce)的高分辨XPS谱图，其中i为高分辨率C1s谱图，ii为高分辨率Ce 3d谱图，iii为高分辨O1s谱图。由图5b可知，polyMOF(Ce)中存在Ce3+/Ce4+的混合化学价态，C 1s可分为C–C(284.7eV)、C–O(286.1eV)和COO(288.6eV)组分，O 1s中包含C＝O(531.3eV),C–O(532.0eV),吸附O(533.1eV)三种组分。
图5c为In2O3/CeO2@mNC系列杂化材料的高分辨率XPS谱图，其中，i为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的高分辨Ce 3d谱图，ii为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的高分辨Ce 3d谱图，iii为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的高分辨Ce 3d谱图；如图5c所示，高分辨率Ce 3d XPS谱可以分为两类峰(v和u)。v(882eV),v″(886.5eV),u(900.5eV),and u″(906.2eV)四个峰归属于Ce4+，而v′(885.0eV)和u′(903.6eV)两个峰对应Ce3+，此外908.4eV为Ce4+的卫星伴峰。这一发现表明，In2O3/CeO2@mNC三个杂化材料中都存在Ce3+/Ce4+的混合化学价态，不同温度煅烧对材料中Ce的化学环境变化不显著，Ce4+/Ce3+可有效促进电子的转移。
图5d中，i为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的高分辨In 3d谱图，ii为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的高分辨In 3d谱图，iii为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的高分辨In 3d谱图；图5d显示了三个杂化材料的In 3d XPS谱，445.5和453.0eV处分别出现In3d5/2和In3d3/2两个峰，表明In物种成功掺杂入三个杂化材料网络结构中。
图5e中，i为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的高分辨C1s谱图，ii为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的高分辨C1s谱图，iii为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的高分辨C1s谱图；在In2O3/CeO2@mNC500和In2O3/CeO2@mNC700的C1s XPS谱中观察到四个峰，包括C-C(284.4eV)、C-O(285.6eV)、COO(288.5eV)和π-π*(290.8eV)。π-π*部分的出现揭示了由于在高温下的煅烧而引起的部分共轭介孔碳网络。对于In2O3/CeO2@mNC800的C1s XPS谱中，除了C-C、C-O和COO组份外，在BE为282.9eV的强峰归属于C＝C，这进一步验证了在800℃的高温下煅烧后形成了高共轭碳网络结构。
图5f中，i为In2O3/CeO2@mNC500杂化材料的高分辨O1s谱图，ii为In2O3/CeO2@mNC700杂化材料的高分辨O1s谱图，iii为In2O3/CeO2@mNC800杂化材料的高分辨O1s谱图；在In2O3/CeO2@mNC500、In2O3/CeO2@mNC700和In2O3/CeO2@mNC800的O1s XPS谱中，除了观测到C＝O(531.3eV)和C-O(532.04eV)外，还发现了M-O(529.4eV)和氧空位(530.9eV)。明显地，M-O可以来自氧化铈或In2O3，而高温煅烧导致氧化铈或In2O3晶格中氧原子的分离可以产生氧空位。结合CeO2和In2O3，同时氧空位的存在可以促进电子的转移。
这些结果与TEM和XRD的结果一致，进一步证明了polyMOF(Ce)网络向金属氧化物和介孔碳杂化材料的转变。此外，在实施例5中制备的光电化学生物传感器进行光电化学测量之前，我们还对核酸适配体固定化后的In2O3/CeO2@mNC700杂化材料(记为Apt/In2O3/CeO2@mNC700)的化学结构和组分进行X射线光电子能谱(XPS)分析，结果如图6所示。
由图6可知，Apt/In2O3/CeO2@mNC700的Ce 3d，In 3d，和O1s XPS谱图与In2O3/CeO2@mNC700相似，C1 XPS Apt/In2O3/CeO2@mNC700被分成C-C，C-O和COO的284.2,285.2,288.2eV。除此之外，在292.7eV处还有一个峰，这是由于磷酸盐缓冲液(PBS)的残留K+造成的。值得注意的是，发现了明显的P 2p信号，XPS谱分为P 2p3/2和P 2p1/2P2p，结合能分别为132.9和133.9eV。这来自于DNA链上的磷酸基，这些结果表明，核酸适配体链在In2O3/CeO2@mNC700网络上成功固定。
3)光电化学生物传感器的光生电子空穴分离和转移
a)利用紫外-可见漫反射光谱(DRS)分别对实施例1中制备的polyMOF(Ce)、实施例1～3中制备的In2O3/CeO2@mNC杂化材料的光学吸收特性进行了表征，结果见图7a～7f。
图7a中，i为polyMOF(Ce)的紫外-可见漫反射光谱，ii为In2O3/CeO2@mNC500的紫外-可见漫反射光谱，iii为In2O3/CeO2@mNC700的紫外-可见漫反射光谱，iv为In2O3/CeO2@mNC800的紫外-可见漫反射光谱。图7a显示In2O3/CeO2@mNC杂化材料在可见光区具有明显的吸收。CeO2、In2O3、氧空位和多孔石墨碳网络的生成和形成可以显著提高光吸收。可以根据
方程计算带隙能量，其中α吸收系数，h是普朗克常数，ν是光频率，α是一个常数，n等于1(直接间隙半导体)或4(间接间隙半导体)。
图7b中，i为polyMOF(Ce)的(αhν)2与光能(hν)的关系曲线图，ii为In2O3/CeO2@mNC500的(αhν)2与光能(hν)关系曲线，iii为In2O3/CeO2@mNC700的(αhν)2与光能(hν)关系曲线，iv为In2O3/CeO2@mNC800的(αhν)2与光能(hν)关系曲线。polyMOF(Ce)、In2O3/CeO2@mNC500、In2O3/CeO2@mNC700和In2O3/CeO2@mNC800的带隙能量(Eg)值分别为3.00、1.75、2.32和2.44eV。
图7c中，i为polyMOF(Ce)的莫特-肖特基图，ii为In2O3/CeO2@mNC500的莫特-肖特基图，iii为In2O3/CeO2@mNC700的莫特-肖特基图，iv为In2O3/CeO2@mNC800的莫特-肖特基图，插图是放大的In2O3/CeO2@mNC700的莫特-肖特基图。由图7c可知，所有样品的莫特-肖特基曲线斜率都是正值，表明它们是n型半导体。polyMOF(Ce)、In2O3/CeO2@mNC500、In2O3/CeO2@mNC700和In2O3/CeO2@mNC800的平带电位分别为-0.42、-0.08、-0.20和-0.14eV。
图7d中，i为polyMOF(Ce)的稳态光致发光(PL)光谱，ii为In2O3/CeO2@mNC500的稳态光致发光光谱，iii为In2O3/CeO2@mNC700的稳态光致发光光谱，iv为In2O3/CeO2@mNC800的稳态光致发光光谱。In2O3/CeO2@mNC系列杂化材料的稳态光致发光光谱显示它们具有显著的PL猝灭(图7d)。相比之下，In2O3/CeO2@mNC700的峰值强度最低，表明其电子空穴复合率最低。因此，In2O3/CeO2@mNC700杂化材料实现了有效的界面电荷迁移和分离性能。
图7f中，i为polyMOF(Ce)的光电流响应曲线，ii为In2O3/CeO2@mNC500的光电流响应曲线，iii为In2O3/CeO2@mNC700的光电流响应曲线，iv为In2O3/CeO2@mNC800的光电流响应曲线。瞬态光电流测量结果(图7f)表明，In2O3/CeO2@mNC700具有较高的光电流响应，高于In2O3/CeO2@mNC500、In2O3/CeO2@mNC800和polyMOF(Ce)。揭示了促进的光电子转移能力。这些结果表明，In2O3/CeO2@mNC700可以大大提高光生电荷的产生、分离和传输，从而有望得到较高的目标物检测效率。
b)采用电化学阻抗谱(EIS)技术分别对实施例1中制备的polyMOF(Ce)、实施例1～3中制备的In2O3/CeO2@mNC杂化材料的电化学活性进行了研究，结果见(图7e)。测试条件为：频率范围0.1Hz至100kHz；电位0.21V；电解液0.1mol·L-1PBS(pH＝7.4)含5mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-。
图7e中，i为polyMOF(Ce)的电化学阻抗谱图，ii为In2O3/CeO2@mNC500的电化学阻抗谱图，iii为In2O3/CeO2@mNC700的电化学阻抗谱图，iv为In2O3/CeO2@mNC800的电化学阻抗谱图，插图为等效电路模型。根据等效电路，得到的In2O3/CeO2@mNC700的电荷转移电阻(Rct)值是所有样品中最小的(90.7Ω)。这揭示了其具有优越的电化学性能，在光催化反应中大大促进了电子的转移。相比之下，polyMOF(Ce)的Rct为200.0Ω，表明其电化学活性最差。证明与Ce节点配位的聚合物配体实质上阻碍了电子转移。在500℃下煅烧时，杂化物的电导率得到了提高，得到了比polyMOF(Ce)更小的Rct(133.7Ω)。然而，In2O3/CeO2@mNC800表现出较大的Rct值(155.6Ω)，证明聚集的金属氧化物可以削弱电子转移。
4)光电化学生物传感器对大肠杆菌的性能分析
使用相同强度的可见光分别照射实施例4～6中制备改性玻璃碳电极，通过光电流响应变化，验证光电化学生物传感器的构建过程，结果见图8～9。
如图8和图9所示，In2O3/CeO2@mNC700/GCE具有高光电流(I＝1.9μA)(图9a)略高于In2O3/CeO2@mNC500/GCE(I＝1.5μA)(图8a)，明显高于In2O3/CeO2@mNC800/GCE(I＝0.7μA)(图8b)。如上所述，介孔碳网络对于改善光电响应至关重要。然而，在改性玻璃碳电极上固定核酸适配体后，Apt/In2O3/CeO2@mNC500/GCE、Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE和Apt/In2O3/CeO2@mNC800/GCE的光电流响应分别从1.5μA降到1.4μA、从1.9μA降到1.6μA，以及从0.7μA降到0.6μA(图8a、9a和8b)。由于高共轭纳米片结构，大比表面积，大孔径和多孔网络，具有埃水平长度的适配体链不仅可以吸附在复合材料表面，还可以渗透到多孔网络的内部孔道中，通过π-π堆叠作用、范德华力和静电相互作用。在水溶液中，适配体链寡核苷酸链上的磷酸基团带负电荷，与[Fe(CN)6]3-/4-氧化还原电对产生排斥作用，因此，它阻碍了电极/电解质界面上的电子转移，降低了修饰电极的光电流响应。相比之下，In2O3/CeO2@mNC700/GCE在适体固定后的光电流响应变化值(ΔI)最大(图9b)，表明适体链固定的量最多。如上所述，多孔和二维纳米片状结构使In2O3/CeO2@mNC700杂化材料具有大量的活性位点，用于固定链适配体，当检测到目标大肠杆菌时，可以发现电极的光电流密度下降。固定在杂化材料上的适体链与大肠杆菌特异性结合，这进一步阻碍了电子从电极到电解质的转移。其中，基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器在检测大肠杆菌后的光电流响应变化最大，表明其具有出色的检测能力，这主要是由于修饰电极上吸附了大量的适配体链分子，以及由于高光吸收能力和优越的光电子转移性能而产生放大的光电化学信号。因此，在三个不同温度煅烧所得的In2O3/CeO2@mNC杂化材料中，In2O3/CeO2@mNC700杂化材料可作为检测大肠杆菌的最佳PEC电极材料。
对实施例5、6～14中构建的光电化学生物传感器对大肠杆菌的最佳检测性能进行比较，如图8c-8d所示，比较可知：实施例5中光电化学生物传感器对大肠杆菌的检测性能最佳。
通过采用实施例5中制备的光电化学生物传感器分别检测不同浓度(10、100、1000、1×104、1×105、1×106、1×107CFU·mL-1)的大肠杆菌，评价大肠杆菌检测用生物传感器的检测能力，结果如图9c所示。从图9c可以看出，E.coli/Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE电极的光电流密度随着大肠杆菌浓度的增加而逐渐降低。实施例5制备的基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器对不同大肠杆菌的光电流响应，在10～1×107CFU·mL-1范围内，光电流强度的变化与大肠杆菌浓度的对数呈良好的线性关系(图9d)。因此，可以利用线性回归方程ΔI(μA)＝0.052logconE来定量检测大肠杆菌，线性相关系数R2为0.9933。根据LOD＝3SD/k的方程(SD表示空白的标准差，k表示线性回归方程的斜率，推导出最低检测限为0.12CFU·mL-1(S/N＝3)。与其他种类的检测大肠杆菌的生物传感器相比(表3)相比，所构筑的光电化学生物传感器优于报道的传感器传感性能，同时具有宽的检测范围。
表3与其他报告的基于其他方法的大肠杆菌检测方法的比较
[1]J.R.Branen,M.J.Hass,E.R.Douthit,W.C.Maki,A.L.Branen,Detection ofEscherichia coli O157,Salmonella enterica serovar Typhimurium,andstaphylococcal enterotoxin B in a single sample using enzymatic bio-nanotransduction,Journal of food protection 70(4)(2007)841-850.
[2]R.Hua,N.Hao,J.Lu,J.Qian,Q.Liu,H.Li,K.Wang,A sensitivepotentiometric resolved ratiometric photoelectrochemical aptasensor forEscherichia coli detection fabricated with non-metallic nanomaterials,Biosensors and Bioelectronics 106(2018)57-63.
[3]M.Yin,C.Liu,R.Ge,Y.Fang,J.Wei,X.Chen,Q.Chen,X.Chen,Paper-supportednear-infrared-light-triggered photoelectrochemical platform for monitoringEscherichia coli O157:H7 based on silver nanoparticles-sensitized-upconversion nanophosphors,Biosensors and Bioelectronics 203(2022)114022.
[4]I.-H.Cho,L.Mauer,J.Irudayaraj,In-situ fluorescent immunomagneticmultiplex detection of foodborne pathogens in very low numbers,Biosensors andbioelectronics 57(2014)143-148.
[5]L.Wang,C.-S.Wu,X.Fan,A.Mustapha,Detection of Escherichia coliO157:H7 and Salmonella in ground beef by a bead-free quantum dot-facilitatedisolation method,International Journal of Food Microbiology 156(1)(2012)83-87.
[6]N.Hao,X.Zhang,Z.Zhou,R.Hua,Y.Zhang,Q.Liu,J.Qian,H.Li,K.Wang,AgBrnanoparticles/3D nitrogen-doped graphene hydrogel for fabricating all-solid-state luminol-electrochemiluminescence Escherichia coli aptasensors,Biosensors and Bioelectronics 97(2017)377-383.
[7]S.Díaz-Amaya,L.-K.Lin,A.J.Deering,L.A.Stanciu,Aptamer-based SERSbiosensor for whole cell analytical detection of E.coli O157:H7,Analyticachimica acta 1081(2019)146-156.
5)实施例5制备的光电化学生物传感器的选择性、重现性和再生能力
为了探索实施例5中制备的基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器的选择性，分别以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球杆菌(S.aureus)和鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)等食源性疾病病原体作为干扰物，并以枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球杆菌、鼠伤寒沙门菌与大肠杆菌(E.coli)的混合物作为干扰物(将各干扰物的浓度设置为1000CFU·mL-1，是大肠杆菌浓度的100倍)。通过光电化学传感的方法测定光电流密度，PEC检测采用三电极系统，包括改性GCE(直径3mm)作为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极。所有电化学测试都是在光电化学反应池中进行的，使用300W氙灯光源并配备波长400nm的截止滤光片，在室温下进行测量。使用PBS(0.1mol·L-1，pH 7.4)作为电解质，偏置电压为0V(相对于Ag/AgCl)。
结果如图10a所示，光电流响应ΔI(ΔI＝I0–I)、I0、I分别为检测各细菌前的光电流密度和检测各细菌后光电流密度，而大肠杆菌检测引起的光电流达0.22μA，与混合样品比较，这一结果表明，实施例5制备的基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器即使在复杂介质中也表现出良好的选择性。这主要归因于大肠杆菌与适配体链之间的特异性识别能力，即固定在多孔网络上的大量适配体可以占据大部分活性位点，从而避免了干扰组分与传感平台之间的非特异性吸附。
除了检测选择性外，还对实施例5构建的光电化学生物传感器的重现性进行了研究。为此，在相同的实验条件下，使用5个相同的实施例5中制备的基于In2O3/CeO2@mNC700的光电化学生物传感器分析大肠杆菌(10CFU·mL-1)。图10b显示了五个光电化学生物传感器的光电流响应，他们具有较低的相对标准差(RSD)，约为2.03％。可见，实施例5制备的光电化学生物传感器具有良好的重现性。
此外，过将实施例5中制备的一个光电化学生物传感器Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE在4℃下连续保存15天，每一天通过光电流密度的测试来测定其稳定性。图10c显示，检测大肠杆菌(10CFU·mL-1)的光电流响应仍保持在初始响应的98.6％左右，表明其具有较高的稳定性。
为了提高对检测对象的检测效率，光电化学生物传感器具有再生性能是很重要的。实施例5中制备的光电化学生物传感器检测完大肠杆菌后，将使用过的光电化学生物传感器浸入25mmol·L-1甘氨酸盐酸(pH＝2.4)中3分钟，然后用PBS洗涤再次进行测试，由图10d可以看出，再生后的Apt/In2O3/CeO2@mNC700/GCE的光电流响应约为0.17μA，接近原始值。再次检测到大肠杆菌(10CFU·mL-1)后，得到的光电流信号下降到0.14μA，接近于第一检测值。整个过程，包括光电化学生物传感器的再生和检测，可以重复6次，这表明所开发的生物传感器具有良好的再生能力。
6)光电化学生物传感器对实际样品的适应性
评价实施例5制备的光电化学生物传感器在牛奶和面包等不同食品中检测大肠杆菌方面的实际应用效果。在测量之前，将面包磨碎并转移到一个15mL的离心管中，经超声波震荡1h后，在室温下以1000rpm离心5min，取上清液作为面包处理液。分别将面包处理液和牛奶作为待处理液，在10mL待处理液中加入0.2mL氢氧化钠溶液(浓度为0.1mol·L-1)和0.8mL乙腈混匀后，在室温下以5000rpm离心5min。收集上清液，用PBS(0.1mol·L-1)稀释50倍，4℃保存即可使用。
将稀释液分成若干份，然后在每份中加入大肠杆菌悬浮液，得到不同大肠杆菌浓度的待测液，然后采用实施例5制备的光电化学生物传感器对各待测液中大肠杆菌进行检测，用校准曲线分析测定出的光电流密度，得到检测到的大肠杆菌浓度，并与加标量进行比较。所有结果汇总在表4中。结果表明，添加的大肠杆菌的平均回收率分别为93.68-106.42％(牛奶样品)和91.22-104.39％(面包样品)，RSD分别为0.51～4.27％(牛奶样品)和0.19～2.26％(面包样品)。这些结果表明，所构建的光电化学生物传感器在分析不同样本的大肠杆菌方面具有巨大的应用潜力。
表4 In2O3/CeO2@mNC700基生物传感器测定牛奶中的大肠杆菌(n＝3)
| 加入量(CFU·mL<sup>-1</sup>) | 检出量(CFU·mL<sup>-1</sup>) | 回收率(％) | 相对标准偏差(％) |
| 10 | 9.8484 | 98.48 | 0.51 |
| 100 | 106.4199 | 106.42 | 1.06 |
| 1000 | 958.1264 | 95.81 | 2.72 |
| 10000 | 9835.9364 | 98.36 | 1.49 |
| 100000 | 103673.5937 | 103.67 | 4.27 |
| 1000000 | 936842.9163 | 93.68 | 0.65 |
| 10000000 | 9401687.3215 | 94.02 | 1.18 |
表5 In2O3/CeO2@mNC700基生物传感器测定面包中的大肠杆菌(n＝3)
| 加入量(CFU·mL<sup>-1</sup>) | 检出量(CFU·mL<sup>-1</sup>) | 回收率(％) | 相对标准偏差(％) |
| 10 | 9.1222 | 91.22 | 1.53 |
| 100 | 100.925 | 100.92 | 1.57 |
| 1000 | 1011.2534 | 101.12 | 2.26 |
| 10000 | 10193.4221 | 101.93 | 0.89 |
| 100000 | 96493.9311 | 96.49 | 1.16 |
| 1000000 | 976112.7824 | 97.61 | 1.64 |
| 10000000 | 10439988.0126 | 104.39 | 0.19 |
综上所述，本发明构建的光电化学生物传感器可以实现对食源性疾病病原体之一大肠杆菌进行灵敏检测。在In掺杂的polyMOF(Ce)网络中，通过高温热解碳化得到了In2O3/CeO2@mNC杂化材料。由于polyMOF(Ce)中聚合物链的含碳量高，700℃碳化后形成的氧化铈和In2O3纳米晶体嵌入在介孔碳纳米片的结构，提供了优越的光吸收能力，快速的电子转移性能，高的光生电子-孔穴分离能力，以及对大肠杆菌靶向适配体高的生物亲和性。因此，基于In2O3/CeO2@mNC700构建的光电化学生物传感器对大肠杆菌检测的传感性能更好，得到超低的检测限，为0.12CFU·mL-1，同时具有高选择性、良好的稳定性和可接受的重现性。值得注意的是，本发明构建的光电化学生物传感器在不同的真实样品中显示出了良好的实际应用适用性。这些优异的检测能力主要是由于比表面积和孔径大，光电化学性能高，化学结构稳定性好。因此，目前的光电化学生物传感器可以作为一种通用的PEC传感策略，用于从复杂环境样品中检测食源性病原体。
Claims (10)
1.一种光电化学生物传感器，其特征在于：包括电极、涂覆在电极表面的电极材料以及锚定在所述电极材料表面的核酸适配体；
所述电极材料的制备方法，包括以下步骤：将聚合物-金属有机框架材料和In3+盐在In3+盐的良溶剂中分散均匀后，去除溶剂，然后将所得固体在500～800℃进行碳化处理，即得；所述聚合物-金属有机框架材料由Ce3+离子和配体在有机溶剂中进行自组装形成；所述配体包括聚合物配体和均苯三甲酸；所述聚合物配体的重复单元中含有苯环。
2.根据权利要求1所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述聚合物配体的重复单元具有式I所示的结构：
式I中，x为5～12。
3.根据权利要求2所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述聚合物配体是将2,5-二羟基对苯二甲酸二酯与二卤代烷烃在碱的作用下于有机溶剂中进行酚羟基的醚化反应，再将醚化反应产物进行酯键的水解得到；所述醚化反应的温度为80～120℃，时间为18～36h；所述碱为碳酸钾，每4.7mol的2,5-二羟基对苯二甲酸二酯对应采用19～20mol的碳酸钾和10～15mL的有机溶剂。
4.根据权利要求3所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述2,5-二羟基对苯二甲酸二酯与二卤代烷烃的摩尔比为1:1～1.2；所述二卤代烷烃为二溴代烷烃；所述二溴代烷烃为1,8-二溴代辛烷；所述2,5-二羟基对苯二甲酸二酯为2,5-二羟基对苯二甲酸二甲酯；所述有机溶剂为二氯甲烷。
5.根据权利要求1或2或3所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述碳化处理在N2气氛中进行；所述碳化处理的温度为700℃；所述碳化处理的时间为2-3h；升温至碳化处理温度的升温速率为2-5℃/min。
6.根据权利要求1所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述聚合物-金属有机框架材料与In3+盐的质量比为1:2～3；所述In3+盐为InCl3。
7.根据权利要求1或2或3或4或6所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述聚合物-金属有机框架材料是将混合溶液进行溶剂热反应得到的；所述混合溶液为聚合物配体、均苯三甲酸和Ce3+盐溶解在有机溶剂中形成的溶液；所述溶剂热反应的温度为100～120℃，时间为18～36h；所述均苯三甲酸、Ce3+离子、聚合物配体中式I所示重复单元的摩尔比为0.3～0.6:1:0.2～0.5。
8.根据权利要求1或2或3或4或6所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述核酸适配体为大肠杆菌靶向适配体；所述电极为玻璃碳电极。
9.根据权利要求1或2或3或4或6所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述光电化学生物传感器采用包括以下步骤的制备方法制得：将电极材料分散液涂覆在电极表面，干燥后浸入到核酸适配体溶液中进行孵育，即得。
10.根据权利要求9所述的光电化学生物传感器，其特征在于：所述电极材料分散液中电极材料的浓度为1～7mg/mL；所述核酸适配体溶液的浓度为10～200nmol·L-1。
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